Полиморфный анализ генов, ассоциированных с шизофренией

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Полиморфный анализ генов, ассоциированных с шизофренией

Оглавление

1. Литературный обзор

1.1 Полиморфизм: сущность, виды, значение

1.2 Основные классы вариабельных участков ДНК

1.3 Генетика шизофрении

1.3.1 Общие сведения о шизофрении

1.3.2 Дофамиергическая теория

2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.2.1 Выделение нуклеиновых кислот из крови

2.2.2 Полимеразная Цепная Реакция

2.2.3 Электрофорез

2.2.4 ПЦР в режиме реального времени

3. Результаты

Выводы

Литература

Введение

Шизофрения является широко распространенным психическим заболеванием. Она затрагивает когнитивную, эмоциональную и социальную сферу жизни заболевшего, снижая качество жизни, приводя к ранней инвалидизации и смерти. Экономические последствия этого заболевания также существенны, т. к. заболевший человек надолго теряет работоспособность, зачастую нуждается в госпитализации. Несмотря на постоянное изучение данного заболевания, до сих пор нет единой концепции этиологии и патогенеза шизофрении (ШЗ). На сегодняшний день накоплено большое количество данных, объясняющих развитие и проявление заболевания с точки зрения молекулярной биологии и генетики. Поиск генов-кандидатов, причастных к развитию шизофрении, а также связь их полиморфизмов с развитием патологии является перспективным направлением молекулярной диагностики и психиатрии.

Объектом исследования в данной работе является изучение влияния генетических полиморфизмов определённых генов на склонность к развитию шизофрении.

АСЕ - ген, кодирующий ангиотензин превращающий фермент (АПФ). Этот фермент играет важную роль в регуляции кровяного давления, карбоксилируя неактивный ангиотензин I до активного ангиотензина II.

DRD2 -- ген, кодирующий D2-рецептор дофамина. Трансмембранный рецептор, локализующийся как на пре- так и на постсинаптических мембранах дофаминергических нейронов. Является рецептором-мишенью при лекарственной антипсихотической терапии шизофрении.

PGC-1б -- является универсальным белком-коактиватором. Он связывается с транскрипционными факторами и вызывает изменения структуры хроматина, инициирует транскрипцию и элонгацию, а также регулирует сплайсинг, тем самым усиливая экспрессию генов. PGC-1б запускает каскад реакций, препятствующих возникновению оксидативного сресса в клетках. Нарушения редокс-регуляции в нейронах приводит к снижению функций рецепторов

глутамата, как следствие, снижается функция парвальбумин-содержащие ГАМК- интернейронов. Дисфункция NMDA-рецепторов и ГАМК-нейронов наблюдается при шизофрении и лежит в основе негативной симптоматики заболевания. Высокая активность PGC-1б препятствует патологическим процессам, повреждающим нейроны.

Предметом исследования являются ассоциация генов DRD2, PGC-1б и АСЕ с шизофренией.

Актуальность

Шизофрения затрагивает когнитивную, эмоциональную и социальную сферу жизни заболевшего, снижая качество жизни, приводя к ранней инвалидизации и смерти. Экономические последствия этого заболевания также существенны. Работа заключается в изучении влияния полиморфизмов указанных генов на ключевые процессы, приводящие к развитию ШЗ. Таким образом, тема работы сопряжена с неврологическими патологиями, механизмом их развития и биологическими маркерами, отражающими эти глубинные процессы. Выявление связей полиморфизмов в указанных генах с развитием ШЗ и связанных патологий актуально с точки зрения возможностей ранней диагностики, определения риска возникновения заболевания, более точного подбора лечения, а также профилактики.

Цель: полиморфный анализ генов-кандидатов, ассоциированных с шизофренией (ШЗ), с целью выявления объективных эффективных биомаркеров патологии для ранней диагностики и возможных подходов к терапии.

Задачи:

1. Собрать биологический материала пациентов с диагнозом ШЗ и контрольной здоровой популяции. Выделение препаратов ДНК для последующих геномных исследований.

2. Освоить методики полиморфного анализа, включая SNP анализ гена DRD2, полиморфизма вставки/делеций в гене ACE и исследование их связи с ШЗ.

3. Провести компьютерный анализ ассоциаций изученных полиморфизмов с фенотипическими признаками ШЗ.

полиморфизм ген шизофрения

Введение

Современный набор молекулярно-генетических методов исследования широк и стремительно развивается. Методики становятся быстрее и дешевле, а объем данных, получаемых в ходе исследований, ежедневно пополняется. Огромный вклад вносит возможность полногеномного секвенирования, давшая начало геномной эре в биологии в двухтысячных годах. Эта методика позволяет изучать функции генов на уровне генома, выявляет специфические локусы на хромосомах, ассоциирует их с развитием различных заболеваний, помогает понять метаболические и генетические пути, стоящие за патологиями. Поиск генетических полиморфизмов, оценка эпигенетических модификаций, оценка экспрессии генов также вносят свой вклад в поиск эффективных биомаркеров патологии и понимание молекулярно-генетической составляющей заболеваний. Для современной медицины актуален поиск и разработка биомаркеров, свидетельствующих о той или иной патологии. Это дает возможность точной и своевременной диагностики, профилактики, а также способствует более эффективной терапии заболевания, с учетом индивидуальных особенностей конкретного человека.

Шизофрения является гетерогенным заболеванием, встречается во всех странах и культурах и поражает в среднем одного человека из ста. В ее возникновении и развитии играют роль не только биологические причины, но также большой вклад имеют факторы внешней среды. Среди социальных факторов и факторов внешней среды наиболее часто упоминаются: миграция, проживание в городах, внутриутробные вирусные инфекции и инфекционные заболевания, перенесенные в раннем детстве, алкоголизм и употребление конопли, недостаток питания в раннем детстве, а также рождение в зимне-весенний период (когда риск заразиться инфекцией более велик), социальный стресс и низкое социальное происхождение (Masaki Nishioka, 2012). Однако миграция, проживание в неблагоприятных районах и низкий социальный статус, по-видимому, являются не причиной, а следствием заболевания, т. к. для ШЗ свойственна склонность к изоляции и общее снижение когнитивных способностей, приводящее к ухудшению социального статуса.

О том, что ШЗ является генетическим заболеванием, свидетельствует множество семейных и близнецовых исследований, а также исследования усыновлений. Традиционно считается, что риск развития ШЗ у ребёнка, чьи родители имеют такой диагноз, составляет 46%, у монозиготных близнецов этот показатель достигает 48% и выше, чем у гетерозиготных (Masaki Nishioka, 2012). Более глубокое понимание стало возможно благодаря развитию молекулярной биологии. Одно из последних широкомасштабных полногеномных исследований выявило 108 генов-кандидатов для этого заболевания. Исследование действительно широкомасштабное, в нем приняли участие 36 тысяч больных ШЗ и 113 тысяч здоровых испытуемых, в т.ч. по 500 наших соотечественников в каждой группе. Некоторые выводы подтверждают сложившиеся патофизиологические теории заболевания, в числе прочих, подтвердилась связь между ШЗ и геном DRD2, а также некоторыми генами, вовлеченными в глутаматергическую систему. Большинство находок имеет потенциал для совершенно нового подхода и понимания этиологии болезни. (Schizophrenia Working Group of the PGC, 2014).

1. Литературный обзор

1.1 Полиморфизм: сущность, виды, значение

Уникальность каждого организма заключена в уникальности его генетического кода. Между геномами представителей одного вида существует множество различий, которое в конечном итоге приводит к индивидуальным особенностям каждого. Генетический полиморфизм -- это сосуществование в пределах популяции двух или нескольких различных наследственных форм, находящихся в динамическом равновесии в течение нескольких и даже многих поколений (Тимофеев-Ресовский, 1967). Полиморфными считают те варианты последовательностей ДНК, которые представлены не менее чем в одном проценте популяции. Генетические полиморфизмы возникают благодаря мутациям и рекомбинации генов при скрещивании, а частота встречаемости во многом регулируется эволюционными процессами. Чем больше полиморфных вариантов встречается в полуляции, тем легче происходит её адаптация к изменяющимся условиям.

Существует классификация полиморфизмов, согласно которой выделяют:

· качественные полиморфизмы, при которых теряются или заменяются одиночные нуклеотиды.

· количественные полиморфизмы, выражающиеся в количественных повторах нуклеотидных последовательностей в одном локусе.

И те и другие полиморфизмы могут проявляться как в смысловых (кодирующих), так и в регуляторных (некодирующих) участках ДНК. Изменения в кодирующих участках, как правило, приводят к изменениям свойств закодированных белков, и встречаются относительно нечасто, именно поэтому пользуются большим вниманием у исследователей.

Молекулярно-генетические маркеры.

Молекулярно-генетические маркёры (МГМ, по другому их называют ДНК- маркёры) -- генетические маркёры, выявляемые и анализируемые на уровне нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. МГМ предшествовали классические генетические маркеры -- гены, аллели которых имеют чётко выраженные различия на уровне фенотипа (классические примеры с цветом семян гороха или окраской цветков вьюнка). На смену изучению классических генетических маркеров в 60-х годах прошлого века пришло использование белковых маркеров, показывающих, разницу молекулярной массы белкового продукта различных аллелей при помощи электрофореза. МГМ имеют самую высокую разрешающую способность и способны уловить мельчайшие различия в геноме, вплоть до одного нуклеотида. В популяционно-генетическом анализе МГМ обязательно должен обладать уникальной последовательностью, для того чтобы безошибочно маркировать интересующий участок хромосомы, а также там должен располагаться какой-либо элемент полиморфизма. На сегодняшний день существует немало методик, позволяющих искать МГМ и обладающих высокой специфичностью. Выделяют три основные группы методов:

· Блот-гибридизация (Саузерн-блоттинг) назван в честь своего изобретателя Эдварда Саузерна и широко применялся в 80-х годах. Используется для определения числа копий генов в геномной ДНК.

· Полимеразная цепная реакция (ПЦР) лежит в основе целого ряда методик. Активно развивается с конца 80-х годов и по сей день. Применяется как в монолокусном, так и в мультилокусном поиске МГМ.

· ДНК-чипы -- наиболее молодая группа методов, возникшая на рубеже 90-х - 2000-х годов, с наибольшей разрешающей способностью, вплоть до точечных мутаций. Для поиска монолокусных МГМ применяют методику поиска однонуклеотидных полиморфизмов (SNP -- single-nucleotide polymorphism), если же МГМ находится в разных локусах, применяют DArT (diversity array technology). Эту методику в основном применяют для создания генетических карт и в селекции, в диагностике заболеваний широкого применения не имеет. (Хлесткина, 2013).

· Секвенирование ДНК (частичное или полное). Постепенно вытесняет ПЦР в клинических исследованиях. Постоянное снижение стоимости процедуры и необходимого оборудования а также упрощение технологии позволили такой сложной и прежде доступной только крупным исследовательским центрам методике занять новую и значительно более широкую нишу. Многие клиники, лаборатории судебной экспертизы, частные генетические лаборатории во втором десятилетии XXI в. стали переходить на частичное секвенирование взамен менее производительной методики ПЦР.

Поиск молекулярно-генетических маркеров актуален не только в молекулярной диагностике и генетической консультации, но также широко применяется в селекции и генетическом картировании, в филогенетических исследованиях. Для поиска МГМ и молекулярной диагностики заболеваний часто применяются методики поиска и анализа SNP, коротких тандемных повторов (STR) и полиморфных инсерций ретроэлементов (Alu-повторов (RIP)).

Благодаря технологиям полногеномного секвенирования стала возможной реализация грандиозного проекта «The International HapMap Project» (https://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/), стартовавшего в 2002 году. В рамках этого проекта прочитаны геномы 270 человек из стран Европы, Америки, Африки и Азии. База данных HapMap дает возможность создавать системы поиска и идентификации МГМ, данные применяются в генотипировании индивидов, стал доступен функциональный геномный анализ. В результате анализа данных, полученных в ходе проекта, было выявлено более десяти миллионов однонуклеотидных полиморфизмов. Прочитать геном такого количества людей - лишь первая половина дела. В генетической эпидемиологии для оценки и интерпретации полученной информации применяют геномное исследование ассоциаций (GWA исследования, или GWAS). Обычно оценивают SNP, для чего создают выборку здоровых и больных определенным заболеванием людей, после чего сравнивают из геномы. В результате таких исследований определенные полиморфизмы были ассоциированны с рядом заболеваний: диабет первого и второго типа, болезнь Альцгеймера, тромбоз глубоких вен нижних конечностей, гипертриглицеринемия, астма, инсульт, инфаркт миокарда и шизофрения.

Другой масштабный проект, стартовавший в 2008 году, и закочившийся в 2015, носит название “The 1000 Genomes Project». Размер выборки участников больше, чем заявлено в названии и составляет порядка 2500 человек. Авторы проекта ставили перед собой задачу обеспечить доступ к информации, полученной в ходе прочтения геномов тысячи людей. Более того, данные, полученные в других исследованиях, также были включены в проект, а для удобства исследователей вся информация представлена в единой универсальной форме. Для более глубокого анализа данных в исследовании приняли участие семьи: два родителя и одна взрослая дочь. Понятно, что несколько тысяч геномов не дают полного представления о всей популяции, поэтому базы данных продолжают пополняться.

Столь масштабные проекты невозможно реализовать силами одного института и даже одной страны, поэтому для реализации создаются рабочие группы ученых со всего мира. GWAS-исследования на основе полученных данных в будущем позволят ускорить разработку новых медикаментов и диагностических методик. В перспективе при разработке любых лекарств данные популяционной геномики должны будут составлять методический каркас всей проектной работы и интенсивно использоваться ещё на этапе компьютерного моделирования молекулы-кандидата действующего вещества. Это позволит существенно снизить затраты на более поздних этапах разработки и внедрения, так как будет значительно ниже риск возникновения побочных эффектов у определённой части популяции, имеющей какие-либо особенности метаболизма, вытекающие из наличия полиморфизмов генов. Удачным примером применения такого подхода может послужить разработка терапевтической системы для лечения вируса гепатита C. Было показано, что в зависимости от замены лишь одного нуклеотида в районе гена IL28B принципиально меняется ответ организма пациента на медикаментозную терапию (Ge D et al 2009).

Для диагностических целей знание о роли SNP также чрезвычайно важно. Несмотря на пока ещё недостаточный объём накопленных данных, даже уже имеющейся информации достаточно для установления значения многих полиморфизмов в патофизиологии. Например, уже через два года после запуска проекта GWAS, в 2007 г., была опубликована отчётная статья, освещающая корреляции множества полиморфизмов с семью важными заболеваниями -- коронарной недостаточностью, диабетом 1-го и 2-го типа, ревматоидным артритом, болезнью Крона, биполярным расстройством и артериальной гипертензией

1.2 Основные классы вариабельных участков ДНК

Вариабельные участки ДНК могут быть разделены на три основных класса, с точки зрения первичной структуры :

Однонуклеотидные замены, или SNP (от англ. Single Nucleotide Polymorphism). Точечные замены лишь одного нуклеотида без изменения соседних. Не приводят к изменению рамки считывания гена. SNP, не изменяющие структуру кодируемого белка (как правило третьи нуклеотиды в триплетах), называют синонимическими. Они встречаются в геноме значительно чаще, т. к. не являются фактором отбора. По этой причине они представляют гораздо меньший интерес, чем полиморфизмы, меняющие трансляцию триплетов -- несинонимические. Несинонимические SNP подразделяют на миссенс- и нонсенс-полиморфизмы (Северин Е.С., 2003).

Миссенс-полиморфизмы (от англ. missense -- потеря смысла) приводят к изменению одного аминокислотного остатка в полипептидной цепи. Биологическое значение такого полиморфизма может быть различным -- от нейтрального до выражено отрицательного или положительного. В некоторых случаях такая мутация приводит к развитию заболевания, в других -- создаёт, напротив, преимущество. В последнем случае такая удачная мутация как правило закрепляется в популяции и постепенно вытесняет другие аллельные формы.

При нонсенс-полиморфизмах замена одного нуклеотида приводит не просто к изменению аминокислотного остатка, а к превращению кодона в стоп-кодон, на котором синтез полипептидной цепи обрывается. Это приводит к изменению длины и всей структуры кодируемого белка. Такие мутации как правило дают наиболее радикальные результаты в плане изменения активности этого белка, наиболее часто приводя к частичной или полной её потере. Большинство SNP имеют только две аллельные формы, хотя встречаются и более вариативные случаи.

Инсерции и делеции, или indels (от англ. Insertions and Deletions). При мутациях по типу indel происходит укорочение или удлинение гена за счёт вставки или выпадения фрагмента генетического кода. В этом состоит их отличие от рассмотренных выше мутаций с заменой нуклеотида, когда длина гена остаётся неизменной. Если длина изменённого участка не кратна трём нуклеотидам, то происходит изменение рамки считывания. По этой причине такие мутации редко встречаются в кодирующей части гена. Ведь изменение рамки считывания приведёт к превращению всей последующей части полипептида в бессмыслицу. И такие мутации в популяции в основном не закрепляются в силу, как правило, существенного снижения жизнеспособности их носителя (Williams, 2013). В некодирующей части гена (внутри интронов) такие мутации гораздо более распространены. Хотя в некоторых случаях они, пока ещё не до конца установленным образом, влияют на функционирование гена. Чаще всего это влияние осуществляется за счёт изменения транскрипционной активности гена. Происходит это вследствие изменения уровня экспрессии затрагиваемого гена, а не последовательности кодируемого им белка.

Тандемные повторяющиеся последовательности. Как и мутации типа indel, ведут к изменению длины гена. Но механизм возникновения и информационная структура этого типа мутаций совершенно иные. Тандемные повторы представляют собой регулярно повторяющиеся фрагменты генетического кода. Размеры «мономера» таких повторов варьируют от двух нуклеотидов до нескольких десятков. Тандемные повторы составляют около 3% всего генома человека, при этом большая часть их находится в некодирующих областях. Тем не менее вариации числа повторов даже за пределами экзонов оказывают влияние на фенотип носителя. Как правило, это происходит за счёт изменения транскрипционной активности. Протяжённые участки повторяющегося генетического кода могут оказывать влияние на физические свойства молекулы ДНК (Usdin, 2008).

Некоторые последовательности изменяют способность ДНК к расплетанию, что может существенно облегчать или затруднять считывание ферментами её участков при транскрипции и репликации. В отдельных случаях очень большие тандемные повторы могут деформировать структуру хромосом, делать их «хрупкими», существенно повышая риск разрыва и спонтанных транслокаций участков (например, синдром ломкой X- хромосомы, или синдром Мартина -- Белл). Причины изменения числа повторов до конца не установлены. Их укорочение, по крайней мере в части случаев, связано с ошибками ДНК-полимераз, «проскакивающих» регулярно повторяющиеся мотивы. Увеличение числа повторов также отчасти происходит вследствие ошибок фермента, но, очевидно, существуют и специальные молекулярные механизмы «наращивания» тандемных повторов (Рядовая Л.А. с соавт. 2009).

Инсерции ретроэлементов (Alu-повторы). Повторяющиеся элементы генома, имеющие длину около 300 п.н. По современным оценкам составляют более 10% генома человека. Структурно сходны с цитоплазматическими 7SL РНК, что позволяет предполагать общность их происхождения (Барякин Д.Н. с соавт. 2013). Являясь по своей сути ретротранспозонами, различные Alu-повторы в разной степени способны к миграции в пределах генома. Как правило эти перестроения не затрагивают открытые рамки считывания белков. Но даже находясь в некодирующих областях, вызванные таким перестроением инсерции или делеции могут влиять на транскрипционную активность генов. Примером такого эффекта может послужить рассматриваемая в данном исследовании мутация, находящаяся в одном из интронов гена АПФ (ACE). Не изменяя рамку считывания сплайсированной мРНК, мутация, тем не менее, оказывает влияние на развитие ряда заболеваний (в том числе и нервной системы).

1.3 Генетика шизофрении

Шизофрения является комплексным психиатрическим заболеванием с серьезной генетической составляющей. Существует немалое число генетических полиморфизмов, ассоциированных с развитием шизофрении. Тем не менее, какой- то один ген нельзя обвинить в возникновении заболевания. Идентификация генов, вовлеченных в механизм психиатрических заболеваний, пробудила интерес к эндофенотипам и количественным признакам, которые связаны с основными биологическими процессами. Их изучение обеспечивает более серьезный и согласованный подход к данному вопросу.

1.3.1 Общие сведения о шизофрении

Шизофрения как отдельное заболевание известна с 1908 года. За время исследование причин и механизмов развития шизофрении было получено большое количество эмпирических данных. В этих исследованиях применялись различные электрофизиологические, молекулярно-генетические и биохимические методы, а также нейровизуализация. Накопленные и обобщенные знания сформировались в теории развития заболевания, которые служат сегодня фундаментом для новых, более глубоких и детальных исследований. Основополагающими и доминирующими являются теории, в центре которых рассматривается нарушение обмена того или иного нейромедиатора.

1.3.2 Дофамиергическая теория

Появилась в 60-х годах ХХ в., благодаря ученым Ван Россуму и Арвиду Карлссону. Было установлено, что в основе психоза лежит повышение уровня дофамина в субкортикальных структурах. Избыток дофамина успешно блокируется нейролептиками, связывающими D1 и D2-рецепторы дофамина, снижая проявления психоза и другой позитивной симптоматики (галлюцинации, бред), и наоборот: применение психостимуляторов увеличивает выброс дофамина, что может приводить к усилению психотической симптоматики. Но дофаминовая теория не давала полного объяснения многообразных симптомов шизофрении, в частности, блокирование дофаминовых рецепторов не лечило нарастающую негативную симптоматику (апатия, ангедония, бедность речи, когнитивные ухудшения). Эти симптомы относятся к нарушениям высшей нервной деятельности, с помощью методов функциональной визуализации показано, что недостаток дофамина в префронтальной коре (ПФК) является частью механизма их развития (Knable and Weinberger, 1997). Сегодня дофаминовая гипотеза звучит так: существует дисбаланс дофамина, выражающийся в гиперактивации субкортикальных мезолимбических проекций (что ведет к гиперстимуляции D2- рецепторов и позитивным симптомам), сопровождающейся гипоактивностью мезокортикальных дофаминовых проекций к ПФК (это приводит к гипостимуляции D1-рецепторов, негативным симптомам и когнитивным нарушениям) (Tzschentke, 2001).

Существует ряд свидетельств, говорящих в пользу дофаминергической теории:

1. Фармакологические свидетельства психотических эффектов фармпрепаратов. Применение психостимуляторов (амфетамин, метамфетамин) у здоровых людей приводит к параноидному психозу. Это было показано еще в середине двадцатого века Koннелом и его последователями. В дальнейшем, при помощи нейровизуализации, были получены результаты, доказывающие повышенный выброс дофамина у пациентов с шизофренией, в ответ на применение амфетамина (Lieberman et al., 1987). Под действием психостимуляторов у больных шизофренией либо усиливаются уже имеющиеся симптомы, либо проявляются симптомы, которые до применения препарата были скрыты. Психотическая реакция на применение психостимуляторов является предиктором рецидива, в случае отмены антипсихотических препаратов.

2. Фармакологическое действие антипсихотиков в терапевтических целях. Все антипсихотические препараты (галоперидол, клозапин, раклоприд и т.д.) являются антагонистами D2-рецепторов.

3. Применение антипсихотических препаратов в ходе лечения шизофрении изменяет плотность дофаминовых рецепторов. По понятным причинам не существует возможности получить материал для посмертных исследований от людей, не подвергавшихся лечению. Однако существует возможность изучить дофаминовую функцию в различных отделах мозга до начала лекарственной терапии с помощью методов нейровизуализации. Позитронно- эммиссионная томография (ПЭТ) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) позволяют оценить плотность интересующих рецепторов. Как правило, в подобных исследованиях принимает участие небольшое количество человек, однако благодаря мета- анализу было установлено, что в стриатуме у лиц, страдающих шизофренией, плотность D2-рецепторов выше на 12% (Yang et al., 2004). Кроме того, сообщается, что в при шизофрении в стриатуме увеличивается активность дофа-декарбоксилазы (фермент, превращающий диоксифенилаланин в дофамин). Существует связь между слабой активацией префронтальной коры при выполнении теста на сотрировку карточек и увеличением накопления [18F]DOPA в полосатом теле. Предполагается, что изменения в работе префронтальной коры связаны с увеличениев дофаминовой активности в стриатуме при шизофрении (Meyer-Lindenberg et al., 2002).

4. Нормальное функционирование дофаминовой системы в префронтальной коре необходимо для успешного осуществления когнитивных функций (Goldman-Rakic et al., 2000; Goldberg and Weinberger, 2004), которые страдают при шизофрении.

5. В передней части поясной извилины и некоторых участках таламуса отмечено снижение плотности D2-рецепторов дофамина у лиц, страдающих шизофренией (Suhara et al. 2002). Также существует коррелляция между количеством D2-рецепторов во фронтальной коре и проявлениями продуктивной симптоматики у мужчин (Glenthoj et al., 2006).

6. Изучается занятость дофаминовых рецепторов антипсихотическими препаратами при терапии. Предполагается, что D2-рецепторы за пределами стриатума не играют важной роди в терапии заболевания (Agid et al., 2006).

Нарушения дофаминовой регуляции соотносится с остальными гипотезами развития шизофрении. Гипофункция NMDA-рецепторов приводит к изменениям дофаминовой системы: подкорковому избытку дофамина и повышению D1-рецепторов в коре (Narendran et al., 2005). Нарушения регуляции основных нейромедиаторных систем не являются взаимоисключающими, напротив, взаимосвязаны и друг друга. Нарушения глутаматной и ГАМК системы связаны с неэффективным контролем входящих сигналов в подкорковую дофаминовую систему, а также с недостаточсной кортико-кортикальной функцией этих систем. Дисбаланс в дофаминовой системе является прямым следствием нарушения ГАМК- и глутаматергической системы, и наиболее тесно связан с симптоматикой и лечением заболевания.

Глутаматергическая теория

Появилась в 80-х годах, благодаря работам Кима Корнхаубера и его коллег, она ставит во главу угла нарушение работы N-метил-D-аспартатных рецепторов (NMDA) и изменения в метаболизме глутамата.

Глутамат -- основной возбуждающий нейротрансмиттер, а рецепторы к нему играют ключевую роль в генерации постсинаптических возбуждающих потенциалов. Правильная работа глутаматергической системы мозга критически важна для памяти, обучения и внимания. Сам глутамат обладает эксайтотоксическим действием и нарушение его утилизации из межклеточного пространства приводит к гибели нейронов. При шизофрении наблюдается дисбаланс глутамата и когнитивных функций.

NMDA-рецепторы - основной подтип ионотропных глутаматных рецепторов, их особенностью является тот факт, что они открываются только при сочетании двух «ключей»: глутамата и деполяризации мембраны (Преображенская И.С. 2014). Эти рецепторы представлены во всех отделах нервной системы и участвуют в генерации медленных возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП), которые играют ключевую роль в процессах высшей нервной деятельности, как правило, нарушенных при шизофрении (рабочая память, внимание, ассоциативное обучение, поведенческая гибкость) .

В пользу глутаматергической теории шизофрении свидетельствуют следующие факты:

1. Применение у здоровых лиц NMDA-антагонистов (фенилциклидин, кетамин) вызывает симптомы, подобные симптомам шизофрении. У лиц, страдающих шизофренией, эти препараты усиливают существующую симптоматику. Симптомами, проявляющимися или усиливающимися при применении небольших доз антагонистов глутаматовых рецепторов были галлюцинации, бред, апатия, абулия, эмоциональная тупость, снижение внимания, памяти, преимпульсного ингибировани. По-видимому, недостаток активации NMDA- рецепторов является ключевым компонентом в когнитивных нарушениях при шизофрении (Murray, 2002).

2. Ряд генов, ассоциированных с развитием шизофрении, тем или иным образом имеют отношение к работе NMDA-рецепторов, воздействуя на модуляторные сайты рецепторов снаружи клетки, рецептор-связанные белки внутри, или же на сигнальные пути, вызываемые работой глутаматных рецепторов (Harrison PJ, 2003; Moghaddam, 2003).

3. В посмертных исследованиях, в срезах, полученных из префронтальной коры, гиппокампа и таламуса больных шизофренией, наблюдаются изменения со стороны глутаматной системы мозга. Зафиксировано изменение уровня транскрипции и экспрессии субъединиц глутаматовых рецепторов, изменение уровня их афинности (сродства) (Clinton and Meador- Woodruff, 2004).

4. В спинномозговой жидкости и посмертных образцах тканей наблюдается снижение уровня двух аминокислот: N-ацетиласпартата (NAA) и N- ацетиласпартилглутамата (NAAG), которые являются эндогенными лигандами mGlu3-рецептора глутамата. Также снижен уровень фермента, участвующего в обмене NAA, NAAG и глутамата (Tsai et al., 1995).

5. В гиппокампе пациентов, не подвергающихся лечению, показано сниженное связывание NMDA-рецепторов. Данное исследование проводилось при помощи нейровизуализационной методики ОФЭКТ (Pilowsky et al., 2005).

6. Глутаматные нейроны тесно связаны с работой других нейронов, в частности высвобождение глутамата активирует ГАМКергические и дофаминергические нейроны, роль которых в патогенезе шизофрении описана в этой работе.

Обобщенные данные приводят к сегодняшнему представлению глутаматергической теории развития шизофрении: нарушения, воздействующие на NMDA-рецепторы могут нарушать поведение и вызывать симптомы, сходные с симптомами шизофрении. Эта теория согласуется с представлениями о наследственном характере предрасположенности к ШЗ, т. к. с глутаматовыми рецепторами и их сигнальными путями связано большое количество генов- кандидатов, ассоциированных с развитием заболевания. На процесс развития болезни серьезное влияние оказывает окружающая среда, т. к. открытие каналов NMDA-рецептора осуществляется только под воздействием двух факторов: связывание с лигандом и деполяризация мембраны клетки. На уровне организма это отражается в том, что обработка контекстно-связанной информации может нарушить слаженность работы этих двух факторов, что приведет к недостаточной активации NMDA-рецепторов (Moghaddam 2012).

ГАМК-ергическая теория

Также была высказана в 80-х годах Робертсом и ван Камменом, и рассматривает недостаток ингибиторных систем мозга как основной компонент механизма развития заболевания. Данная теория долгое время не пользовалась популярностью, но на сегодняшний день накоплено большое количество данных, позволяющих рассматривать ГАМКергическую теорию наравне с остальными двумя нейрохимическими «китами», лежащими в основе развития заболевания.

ГАМК -- гамма-аминомасляная кислота -- основной тормозный медиатор нервной системы. Согласно ГАМК-теории, дисбаланс дофаминергической и глутаматергической системы вызывается недостатком торможения со стороны ГАМК-системы. Дефицит ингибирования лежит в основе позитивной симптоматики (галлюцинации, бред), аномалий сенсорных процессов (якобы слышащиеся голоса), нарушения преимпульсного ингибирования (Cadenhead, 2000).

ГАМКергическая теория включает две гипотезы. Согласно первой, гипофункция NMDA-рецепторов на ГАМКергических парвальбумин-содержащих интернейронах (PV-нейронах) приводит к снижению ингибиторного контроля над сетями пирамидных нейронов. Из-за этого нарушается гамма-синхронизация нейросетей. Возможно, гамма-синхронизация нарушается опосредовано, из-за эксайтотоксической гибели пирамидных нейронов. В поддержку этой гипотезы говорят следующие наблюдения:

1. Экспрессия парвальбумина и глутаматдекарбоксилазы (GAD67, фермента, превращающего глутамат в ГАМК) находится под влиянием NR2A- субъединицы NMDA-рецептора. Селективные антагонисты NR2A (но не NR2B) снижают экспрессию мРНК парвальбумина и продукцию самого белка, а также экспрессию GAD67 в PV-содержащих интернейронах (Kinney et al., 2006). Кроме того, при шизофрении выборочное снижение экспрессии мРНК GAD67 наблюдается в PV-содержащих нейронах (Hashimoto et al., 2003).

2. В передней части поясной извилины и префронтальной коре при шизофрении и биполярном расстройстве описано снижение плотности ГАМК-интернейронов, содержащих GAD67 и экспрессирующих NR2A (Woo et al., 2004). Еще одним свидетельством служит снижение экспрессии везикулярного глутаматного транспортера vGluT1 в префронтальной коре пациентов с шизофренией. Этот везикулярный транспортер является маркером глутаматергических окончаний (Kaneko and Fujiyama, 2002).

3. Существует мнение, что при шизофрении массового отмирания нейронов под действием эксайтотоксичности не происходт. Однако эксайтотоксическое действие может проявлятся не в гибели целого нейрона, а лишь в уменьшении синапсов на его поверхности. В случае с пирамидными нейронами, гибель их синапсов и дендритов приводит к еще большей десинхронизации и ухудшении функции.

Вторая ГАМК-ергическая гипотеза предполагает, что гамма- десинхронизация в подростковом возрасте нарушает процесс созревания нейросетей, при котором постепенно редуцируются лишние синаптические связи между нейронами, т. н. Прунинг. При прунинге сокращается количество контактов между клетками и количество дендритов, при этом качество оставшихся связей повышается. Нарушения этого процесса может запускать болезнь, приводить к уменьшению количества серого вещества. Считается, что ключевую роль в прунинге и финальном созревании коры играет тонкая подстройка ГАМКергических PV-содержащий нейронов (Hensch, 2005). Разные зоны коры «дозревают» в разное время. Префронтальная кора, как самая молодая в эволюционном плане, но самая сложная, в функциональном значении, заканчивает этот процесс последняя, в позднем пубертатном периоде -- начале взрослой жизни (Woo et al., 1997). Примечательно, что начало шизофрении часто совпадает с этим периодом. PV-содержащие интернейроны, по видимому, могут играть важную роль в управлении процессом синаптической подстройки в префронтальной коре. Процесс синаптической подстройки подчиняется принципу Хебба, согласно которому, если пре- и постсинаптические элементы синапса должны быть одновременно активны, в таком случае синапс усиливается, если же синапс не активен, то со временем он отмирает. Временное окно, в течение которого синапс должен быть активен для поддержания своей жизнеспособности и усиления, совпадает со частотой гамма-осцилляций (Buzsaki. and Draguhn 2004; Harris et al., 2005). Это значит, что гамма-осцилляции регулируют процесс синаптической подстройки, усиливая синхронно-взаимодействующие синапсы и «выбраковывая» синапсы, выбивающиеся из ритма. Нарушения работы PV-нейронов нарушают и гамма-осцилляции, приводя к излишнему прунингу. Помимо синапсов, в пубертатном периоде в префронтальной коре отмирает 40-60% аксональных бутонов глутаматергических окончаний (Woo et al., 1997). При шизофрении этот процесс, видимо, также нарушается, затрагивая аксоны, которые должны были бы воздействовать на NMDA-рецепторы ГАМКергических PV-нейронов, что опять же вызывает десинхронизацию гамма-осцилляций (Cunningham et al., 2006; Gonzalez- Burgos and Lewis 2008) и приводя к потере синапсов и дендритов.

Все нейромедиаторные системы и теории этиологии шизофрении тесно взаимосвязаны и дополняют друг друга. Изменение в одном звене приводит к сдвигу в другом. Накопленные на сегодняшний день эмпирические данные не позволяют выделить и назвать главной какую-либо одну теорию, все они должны рассматриваться в совокупности. Гипотезы помогают найти новое направление в разработке стратегий диагностики и лечения шизофрении.

Ген DRD2 : общие сведения.

DRD2 -- ген рецептора дофамина D2, который располагается в локусе 11q22-q23. Полиморфизмы этого гена активно исследуются в контексте развития шизофрении. Дофаминовый рецептор D2 известен с 1974 года, когда был открыт канадским нейрофармакологом Филипом Симаном, именно этот рецептор является основной мишенью антипсихотических препаратов, применяющихся в терапии шизофрении (Seeman et al , 1975).

D2-рецепторы локализуются в обонятельном бугорке, стриатуме и черной субстанции, а также в прилежащем ядре, гипоталамусе, амигдале и вентральной области покрышки и локализуется как на пре- так и на постсинаптических мембранах дофаминергических нейронов (Levey et al., 1993).

Лигандом для дофаминовых рецепторов является гормон дофамин (ДА). По своей химической природе он относится к группе катехоламинов и является предшественником норадреналина. В ЦНС ДА играет роль нейромедиатора. Дофамин задействован как в физиологических процессах, так и в высшей нервной деятельности. Стимулируя альфа- и бета-адренорецепторы, ДА повышает артериальное давление и частоту сердечных сокращений, усиливает почечную фильтрацию, тормозит перистальтику кишечника, участвует в акте рвоты. В стрессовых для организма ситуациях, при травмах и кровопотере ДА участвует в процессе адаптации. Однако из кровяного русла ДА не проникает через гематоэнцефалический барьер, поэтому повышение концентрации ДА в плазме практически не влияет на работу ЦНС.

В ЦНС дофамин принимает участие в процессах высшей нервной деятельности. Занимает центральное место в системе поощрения. Эта система иначе называется мезолимбический тракт, начинается в среднем мозге, откуда дофаминовые нейроны ведут свои проекции в область покрышки. Из покрышки аксоны достигают прилежащего ядра, выброс ДА в этой области вызывает чувство удовольствия. Проекции аксонов из прилежащего ядра формируют медиальный переднемозговой пучок, достигающий орбитофронтальной коры. В этой зоне коры чувство удовольствия интерпретируется как приятное переживание. Действия, вызывающие выброс дофамина, инициируют процесс обучения и закрепляются в памяти как полезный опыт.

Для гена DRD2 описано несколько полиморфных локусов. Нуклеотидные последовательности, кодирующие белок, также подвержены полиморфизму, из-за чего изменяется структура белка и нарушается его функция. Существует связь между неокторыми аллелями этого гена и шизофренией, а также аддиктивным поведением (алкоголизм, наркомания, игромания, курение).

Экспрессию DRD2 регулирует ANKK,

На регуляцию экспрессии гена DRD2 влияет ген ANKK, который находится рядом с ним. Полиморфизм гена ANKK (rs1800497), связанный с заменой цитозина (С) на тимин (Т) в позиции 2137 в 8-м экзоне, вызывает изменение активности гена DRD2. Аллель гена ANKK1 с азотистым основанием С в позиции 2137 обозначается как А2, а измененный минорный аллель Т - как А1. В результате аминокислота глутамин замещается на лизин (Glu713Lys) в позиции 713 аминокислотной последовательности белка ANKK1.

Наличие аллеля A1 гена DRD2/ANKKI связано с уменьшением плотности дофаминовых рецепторов (Thompson et al., 1997). Данные мета-анализов говорят о том, что носительство аллеля А1 гена DRD2/ANKK1 ассоциировано с дефицитом системы удовлетворения, что повышает частоту развития алкоголизма, наркоманий и других форм аддиктивного поведения (Blum et al., 1996; Blum et al., 2007).

У ученых, изучающих «синдром недостатка вознаграждения» (состояние, при котором «вознаграждающий центр мозга» активируется медленно), возникла интересная гипотеза о возможном значении низкой плотности рецепторов дофамина. Хорошо известно, что в нормальных условиях дофамин выделяется в синапс, связывается с рецепторами дофамина, вызывает эйфорию и снимает стресс. Синдром недостатка вознаграждения характеризуется снижением базального уровня дофамина из-за недостаточной мощности рецепторов, и это приводит к необходимости поиска человеком факторов, способных вызвать повышение уровня дофамина.

Ген ACE: общие сведения.

Ген АСЕ кодирует белок ангиотензин превращающий фермент (АПФ), который является частью ренин-ангиотензиновой системы (РАС, RAS). АПФ, циркулирующий во внеклеточном пространстве фермент (карбоксипептидаза), играющий важную роль в регуляции кровяного давления, ренальной гемодинамики, водного и электролитического гомеостаза. АПФ катализирует расщепление неактивного ангиотензина I до активного ангиотензина II. Неактивный ангиотензин I представляет собой декапептид - последовательность из 10 аминокислот Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu. В результате удаления 2 аминокислот -- His-Leu -- образуется активный октапептид ангиотензин II. Второй важной функцией АПФ является деактивация брадикинина (Uehara et al., 1994).

Работа ренин-ангиотензиновой системы связана с электролитами, нужными для поддержания гомеостаза, что необходимо для регуляции сердечной функции, баланса жидкости и многих других процессов. Гормон ангиотензин II является одним из компонентов ренин-ангиотензиновой системы. Он вызывает сужение сосудов, повышение АД и является основным регулятором синтеза альдостерона, образующегося в клубочковой зоне коры надпочечников человека.

АФП принимает участие во многих физиологических процессах. АФП экспрессируется в ренальных эпителиальных, васкулярных эндотелиальных клетках, а также в легких, кишечнике, семенниках, простате.

В норме у разных людей уровень АПФ в плазме крови может различаться до 5 раз. У конкретного же человека уровень АПФ достаточно стабилен. Такие колебания уровня АПФ между людьми вызваны полиморфизмом гена АСЕ. В 16-м интроне гена выявлен инсерционно-делеционный (I/D) полиморфизм, заключающийся во вставке (инсерции, I) или потере (делеции, D) Alu-повтора, размером в 289 пар нуклеотидов. Делеция Alu-повтора приводит к повышению экспрессии гена ACE и увеличению концентрации АПФ в крови, лимфе и тканях, что является фактором, повышающим риск развития сердечно-сосудистых заболеваний (инфаркта миокарда, гипертрофии левого желудочка, ишемической болезни сердца), болезни почек, атеросклероза, болезни Альцгеймера.

Анализ 145 независимых исследований (выборка составила 49 959 человек) позволил выявить, что наличие варианта DD гена АПФ ассоциируется с повышением риска развития ряда атеросклеротических и сосудистых заболеваний (Целуйко и др. 2004). Наличие гомозигот (генотип D/D) соответствует повышению риска развития ИБС (в 1,3 раза в среднем по 30 исследованиям), инфаркта миокарда (в 1,5 раза в среднем по 20 исследованиям), инсульта (в 2 раза, 5 исследований) и диабетической нефропатии (в 1,6 раза, 11 исследований). Исследование больных с диагнозом ИБС установило связи аллеля D и генотипа DD гена АПФ с предрасположенностью к ИМ и летальному исходу, а аллеля I и генотипов ID и II к более благоприятному течению болезни. При остром коронарном синдроме как у женщин, так и у мужчин с генотипом DD интервал между первым ангинозным приступом и развитием ИМ был значительно меньше, чем у носителей генотипов ID и II гена АПФ (Мелентьев и др., 2006).

При обследовании популяции (3145 человек) в рамках Фрамингемского исследования было показано, что присутствие аллеля D гена АПФ ассоциируется с более высоким уровнем артериального давления у мужчин, особенно выражена связь аллеля D с уровнем диастолического АД. У женщин такие закономерности не обнаружены (Минушкина и др., 2004).

Существенная и неоднозначная роль АПФ в организме была продемонстрирована достаточно убедительно в опытах на мышах, лишенных гена АПФ (Krege et al., 1995). У этих животных отмечалось низкое кровяное давление, различные сосудистые дисфункции, нарушения структуры и функции почек и бесплодие у самцов.

В ряде исследований была установлена достоверная корреляция полиморфизмов АПФ с предрасположенностью к возникновению психиатрических заболеваний. В частности, исследования, проведенные с семьями, близнецами и приемными детьми представили серьезные доказательства генетической обусловленности многочисленных психиатрических заболеваний, включая ШЗ и БПР. Поскольку существуют несколько общих генов, обуславливающих предрасположенность и к шизофрении и к биполярному расстройстыу, и поскольку, не страдающие этими заболеваниями близкие родственники пациентов имеют сходные варианты этих генов, были проведены исследования с целью установить роль генетических вариаций АСЕ у пациентов и их близких родственников.

В эксприменте участвовали 239 пациентов с ШЗ и 184 с БПР, а также 284 здоровых биологических родственников пациентов с ШЗ и 301 родственник - пациентов с БПР. Контрольная группа составляла 210 человек. В результате было показано, что полиморфизм АСЕ по типу инсерций/делеций ассоциирован с ШЗ и БПР. Встречаемость генотипа DD и распределение аллеля D у пациентов с БПР и их родственников были существенно выше, чем таковые у пациентов с ШЗ, их родственников и контроля. В противоположность этому, распространенность генотипа II и аллеля I были снижены у обеих групп пациентов и их родственников, в сравнении с контрольной группой.

В данном исследовании аллель D может быть ответственен за развитие психотичесой симптоматики, что приводит к проявлению психотических симптомов БПР. В это же время аллель I, очевидно, играет защитную роль, предотвращая развитие ШЗ и БПР (Kucukali 2010).

Несмотря на наличие некоторого количества противоречивых данных, большинство исследований показывает ассоциированность АСЕ с патофизиологией ШЗ. Однако причина этой неоднозначности данных, вероятно, кроется в самих подходах к их анализу. К примеру, если ввести дополнительные критерии сравнения, то корреляция сразу становится намного более отчётливой. В частности, было проведено сравнение активности АСЕ у 86 пациентов с ШЗ и 100 здоровых контрольных людей, сопоставив их по полу, возрасту, и уровню образования. Исследование проводилось с использованием метода флуоресцентной визуализации (FRET-метод) для оценки пептид-субстратного взаимодействия. Полиморфизмы АСЕ по типу инсерции/делеции были исследованы с помщью метода RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов). Существенно более высокая активность АСЕ наблюдалась у пациентов с ШЗ, по сравнению с контрольной группой. Усредненные уровни активности АСЕ были выше у носителей D-аллеля, но при этом не было обнаружено существенной разницы частоты встречаемости аллелей у пациентов с ШЗ и у здорового контроля. Был обнаружен интересный факт: различие между реально измеренной активностью АСЕ у пациентов с ШЗ и ожидаемым её средним значением, взятым для соответствующей группы здорового контроля, позволяла более точно предсказать ШЗ, чем изолированно взятые показатели значения активности АСЕ (высокая или низкая) или аллельные варианты АСЕ (I/D). Т.о. отдельно взятые показатели активности АСЕ менее информативны, чем показатели, сопоставленные с нормой для группы, совпадающей по гендерным и возрастным признакам, а также уровню образования. Полученные результаты позволяют предположить, что высокие уровни активности АСЕ ассоциированны с ШЗ гораздо сильнее, если принять во внимание общий генетический фон конкретного пациента. Этим может объясняться неоднозначность ранее полученных отдельными исследователями результатов исследований АСЕ (Gadelha 2015).

Ген PGC1-alpha: общие сведения.

Транскрипция, т.е. считывание генетической информации с ДНК в форме мРНК -- сложно регулируемый процесс, лежащий в основе экспрессии генов. Все клетки в организме имеют одинаковый генетический код, но именно экспрессия различных генов делает их отличными друг от друга и лежит в основе специализации клеток. Экспрессия генов определяется не только последовательностью генетического кода, считанного с ДНК. Во время транскрипции, на каждой её стадии, мРНК подвергается ряду преобразований, приводящих в результате к изменению функций белка, а в результате и целой клетки (Claverie 2001). Каждая из пяти последовательных стадий транскрипции у эукариот (перестройка хроматина, инициация, элонгация, сплайсинг и терминация) координируется множеством факторов.

В центре процесса находится взаимодействие фермента РНК-полимеразы II и вспомогательных факторов с регуляторный участком гена (Sims 2004). Это взаимодействие может быть модифицировано на нескольких уровнях:

· На уровне хроматина, т. к. в хроматине (нуклеопротеиновом комплексе) происходит реализация (считывание) генетической информации. Кроме того, в хроматине происходит репликация, репарация и рекомбинация ДНК. Регуляция на уровне хроматина по-другому называется эпигенетической регуляцией. Эпигенетические изменения могут как активировать, так и угнетать экспрессию генов, при этом никак не затрагивая сам генетический код клетки. Эти процессы работают в норме, но также могут приводить и к патологическим изменениям, вплоть до развития раковых заболеваний.

· Регуляция через экспрессию факторов транскрипции. Транскрипционные факторы связываются с промоторными областями на ДНК, активируя (коактиваторы) или ингибируя (корепрессоры), активность Pol II в специфических участках гена (Li, et al 2007). Корегуляторы включаются в процесс регуляции и изменяют трансактивационную активность факторов транскрипции (McKenna et al 2002).

В то время как факторы транскрипции, структурно консервативны, приблизительно 300 корегуляторов, как сообщается в литературе к настоящему времени структурно и функционально разнообразны (Lonard and O'Malley 2007). Хотя корегуляторы не связываются непосредственно с ДНК и не являются конструктивными членами комплекса Pol II, они могут обладать универсальным спектром ферментных функций, которые необходимы для выполнения не только инициации транскрипции, но и для других подэтапов транскрипции: модификации гистонов, удлинение мРНК (элонгация), альтернативный сплайсинг мРНК, прекращение транскрипции мРНК (терминация), транспорт из ядра, а также обеспечение посттрансляционных модификаций синтезируемого белка (Lonard and O'Malley 2006). Таким образом, корегуляторы играют решающую роль в создании транскрипционного разнообразия от исходного геномного кода.