Главная Коллекция "Otherreferats" Медицина Полиморфный анализ генов, ассоциированных с шизофренией

Полиморфный анализ генов, ассоциированных с шизофренией

Полиморфизм: сущность, виды, значение. Изучение влияния генетических полиморфизмов определённых генов на склонность к развитию шизофрении. Теории развития заболевания. Основные классы вариабельных участков ДНК. Выделение нуклеиновых кислот из крови.

Рубрика Медицина
Вид дипломная работа
Язык русский
Дата добавления 01.02.2018
Размер файла 437,7 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Страница:

PGC-1б является универсальным белком-коактиватором. Он связывается с транскрипционными факторами и вызывает изменения структуры хроматина, инициирует транскрипцию и элонгацию, а также регулирует сплайсинг, тем самым усиливая экспрессию генов (Handschin, 2009). С момента своего открытия в 1998 году в качестве коактиватора ядерного рецептора PPAR-гамма PGC-1б, как было выявлено, коактивирует более двадцати транскрипционных факторов (Puigserver et al. 1998). Учитывая большой перечень важных для регуляции обмена веществ факторов транскрипции коактивированных PGC-1б, можно было бы ожидать, что PGC-1б участвует в регуляции транскрипции множество различных программ функционирования генов. Выявленные мишени гена PGC-1б участвует в контроле энергетического гомеостаза клетки. PGC-1б, в силу разнообразных регуляторных функций, получил название «главный регулятор обмена веществ". PGC-1б сильно экспрессируется в бурой жировой ткани (BAT), печени, сердце, скелетных мышцах, почках и головном мозге (Puigserver et al. 1998) - все эти ткани обладают повышенными энергетическими потребностями. PGC-1б сильно активируется в физиологических условиях при воздействии холодом в BAT, при голодания в печени, и при физической активности в скелетных мышцах (Finck and Kelly 2006). PGC-1б инициирует транскрипцию генов, стимулирующих глюконеогенез, биогенез митохондрий, окисление жирных кислот и генов антиоксидантной защиты, причем все эти процессы существенны для метаболизма. Несколько видов посттрансляционных модификации белка PGC-1б служат для предотвращения неконтролируемой и преждевременной активации. Фосфорилирование белка PGC- 1б домене с репрессирующими функциями р38 митоген-активируемой протеинкиназой (МАРК - сигнальный путь, индуцируемый клеточным стрессом) ингибирует связывание корепрессора и увеличивает способности PGC-1б к взаимодействию с факторами транскрипции (Fan et al., 2004). Метилирование PGC-1б гистонмодифицирующим ферментом PRMT1 (Аргинин-N-метилтрансфераза 1) повышает его функциональную активность (Teyssier et al. 2005) Эти посттрансляционные модификации, в сочетании с альтернативными вариантами сплайсинга (Zhang et al. 2009), придают PGC-1б регуляторный потенциал, необходимый для обеспечения его функций по поддержанию гомеостатического контроля в изменяющихся условиях окружающей среды.

Сигнальные пути и ркгуляторные функции PGC-1б, как сказано выше, весьма многообразны. Далее рассмотрим роль этого белка в работе центральной нервной системы. В ранних публикациях Лин и др. (2004) предположил, что PGC- 1б -/- животные, могут быть потенциальной моделью для изучения болезни Гентингтона (БГ). Эта гипотеза оказалось заслуживающей внимания, т. к. PGC-1б, на самом деле, играет определенную роль в патологии этого заболевания. БГ является гиперкинетическим двигательным расстройством, вызванном распространением в гене Гентингтина и его продукте полиглутаминовых повторов. Эта болезнь характеризуется прогрессирующей потерей проекционных нейронов стриатума и, подобно PGC-1б -/- мышам, больные на самых ранних стадиях БГ, как правило, гиперактивны и более худощавы, чем здоровые люди (Walker 2007). Снижение экспрессии PGC-1б наблюдалось в стриатуме и мышцах пациентов с БГ (Kim et al., 2010) возможно, из-за патогенного воздействия мутантного гентингтина на PGC-1б промотор. Полиморфизм в гене PGC-1б как было показано, влияет на возраст начала БГ (Che et al., 2011). С момента открытия участия PGC-1б в БГ, роль PGC-1б была исследована в целом спектре других нейродегенеративных расстройств, в том числе болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера. Полиморфизм в гене PGC-1б, как было показано, влияет на возраст начала болезни Паркинсона (БП) (Clark,et al., 2011). Аномалии в экспрессии генов PGC-1-alp PGC- 1б лись в ткани у пациентов с болезнью Альцгеймера (Qin et al., 2009). С учетом количества доказательств, подтверждающих причастность PGC-1б к неврологическим расстройствам, этот ген и его продукт являются потенциальными терапевтическими мишенями при нейродегенеративных расстройствах в целом (Handschin 2009). Кроме того было показано, что суперэкспрессия PGC-1б имела нейропротекторное действие в химически индуцированных животных моделях нейродегенерации (St-Pierre et al., 2006).

На данный момент в наших знаниях о роли PGC-1б в работе головного мозга существует ощутимый недостаток. Практически все существующие данные о PGC-1б были почерпнуты из исследований периферических тканей, которые состоят из небольшого числа популяций клеток, отвечающих сходным образом на стимулы, получаемые из окружающей среды. В отличие от периферических тканей, мозг обладает очень сложной структурой, состоит из различных популяций клеток, которые реагируют по-разному на одни и те же стимулы извне. Также как и в периферических тканях, в ЦНС PGC-1б поддерживает энергетический гомеостаз (Wareski, P., et al., 2009).

Первые ключи к разгадке возможных специфических для мозга функций PGC-1б пришли из исследований по пространственно-временному распределению продукта гена. В 2003 году Tritos и др. провели анализ методом in situ гибридизации пространственного распределения экспрессии транскриптов PGC-1б в переднем мозге. Интересно, что не было выявлено равномерного распределения мРНК PGC-1б во всех областях мозга, но выявлены различные картины мечения в определенных корковых слоях, ретикулярном ядре, таламусе и черной субстанции (Tritos, et al., 2003). С помощью иммунофлюоресцентного мечения и конфокальной микроскопии наблюдали, что экспрессию белка PGC-1б была сконцентрирована преимущественно в ядрах нейронов, которые экспрессируют высокий уровень фермента декарбоксилазы глутаминовой кислоты 67 кДа (GAD67) во всех областях головного мозга (Cowell et al., 2007). GAD67 представляет собой фермент, ответственный за преобразование глутамата, возбуждающего нейромедиатора, в гамма аминомасляную кислоту (ГАМК), являющейся тормозным нейромедиатором. Эти исследования не согласуются с мнением, что PGC-1б действует как общий регулятор обмена веществ в головном мозге и подводят нас к ключевой гипотезе, что этот транскрипционный коактиватор в первую очередь обладает функциями регуляции генных программ специфически в пределах ГАМКергических нейронов.

Правильное функционирование нервной системы достигается за счет тонкого баланса между возбуждающими и тормозящими сигналами. Медиаторы, обеспечивающие этот баланс варьируются в зависимости от области мозга, но основными возбуждающими и подавляющими нейротрансмиттерами являются глутамат и ГАМК. В коре и гиппокампе, проекционные нейроны высвобождают глутамат, в стриатуме и коре мозжечка проекционные нейроны высвобождают ГАМК. В последние годы, парвальбумин-содержащий подкласс интернейронов (PVI), как было установлено, играет очень важную роль в синхронизации выходного сигнала всей популяции основных клеток. PV является одним из трех Са-связывающим белков, которые, вместе с кальбиндином и калретинином, экспрессируются в значительной степени в неперекрывающихся популяциях ГАМКергических нейронов.

Несколько уникальных особенностей PV-содержащих интернейронов делают их функционально отличными от других типов интернейронов. Конструктивно, PV-содержащие интернейроны образуют аксо-соматические контакты с пирамидальными клетками (Melchitzky et al., 1999), соединены друг с другом с помощью щелевых контактов (Fukuda et al., 2006) и экспрессируют специализированн К+ и Са2+ каналы, которые облегчают быструю ответную реакцию на внешние сигналы (Zaitsev et al., 2007)/ Вместе эти функции позволяют PV-содержащим интернейронам синхронизовать формирование потенциала действия всей цепи основных нейронов в виде характерных форм активности, известных как гамма-осцилляции (Cardin et al., 2009).

Гамма-осцилляции, как полагают, играют жизненно важную роль в формировании рабочей памяти (Buzsaki. and Draguhn 2004) и являются аномальными при шизофрении, одним из нарушений, которые наблюдаются при этом заболевании, как раз является дефицит рабочей памяти и когнитивных функций (Gonzalez-Burgos and Lewis 2008). Соответственно, снижение экспрессии PV является характерной отличительной чертой в невропатологии шизофрении (Torrey, E.F., et al.2005).

Из-за физиологического фенотипа, включающего быстроразряжающиеся сигналы, предполагают, что PV-содержащие интернейроны имеют повышенную метаболическую потребность в энергии, по сравнению с другими типами клеток в головном мозге. В соответствии с этой идеей, PV-интернейроны гиппокампа имеют повышенное количество митохондрий и более высокие концентрации цитохром с- оксидазы (фермент, участвующий в клеточном дыхании), чем соседние нейроны (Gulyas et al., 2006). Кроме того, инсулин-чувствительный переносчик глюкозы GLUT4 преимущественно экспрессируется в этой нейрональной популяции (Apelt et al., 1999), предполагая, что PV-содержащие интернейроны имеют более высокий спрос на глюкозу в качестве субстрата энергии по сравнению с другими нервными клетками. С учетом роли PGC-1б в биогенезе митохондрий, а также тот факт, что GLUT4 является прямой транскрипционной мишенью коактиватора PGC-1б (Michael, L.F., et al.,2001), предполагается, что экспрессия PGC-1б и ее полиморфизм имеют особенно важную роль в поддержании энергетического гомеостаза в PV-содержащей популяции ГАМКергических интернейронов. Тем не менее, совершенно ясно, что PGC-1б участвует в поддержании более, чем просто энергетического гомеостаза в этой нейрональной популяции. Формирование, поддержка и реорганизация синапсов имеют решающее значение для развития мозга а для ответа нейронных цепей на экологические проблемы.

Из анализа литературы можно заключить, что PGC-1б играет роль важного регулятора биогенеза митохондрий и участвует в формировании и поддержании дендритных шипиков в нейронах гиппокампа. В культуре клеток нейронов гиппокампа, суперэкспрессия PGC-1б увеличивает число шипиков и усиливает процесс молекулярной дифференциации синапсов, в то время как нокдаун PGC-1б ингибирует биогенез шипиков и синаптогенез. Нокдаун PGC-1б также уменьшает плотность дендритных шипиков в гранулярных нейронах гиппокампа в естественных условиях. Из данных литературы следует, что PGC-1б и биоенез митохондрий играют важную роль в формировании и поддержании дендритных шипиков и синапсов гиппокампа.

Итак, можно сделать вывод о значительной неизученности, как роли белка коактиватора PGC-1б в поддержании гомеостаза нервной системы, и в обеспечении ее энергией и в функционировании, так и роли различных полиморфных форм гена в обеспечении указанных функций. Следовательно, полиморфный анализ с последующим изучением экспрессии гена и его эпигенетической модификации критически важен для понимания функционирования различных видов нейронов и вспомогательных клеток, а также в нарушениях, приводящих к развитию шизофрении.

Тем не менее, нервные расстройства, такие как - болезни Гентингтона и Паркинсона, болезнь Альцгеймера, шизофрения и биполярное расстройство, к сожалению, не столь предсказуемы, отчасти в силу очень малого количества данных о первичных функциях PGC-1alpha в центральной нервной системе. Таким образом, остается в значительной степени малоизученной роль полиморфизма этого гена и изменений в его экспрессии в развитии этих заболеваний.

2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы

Исследование проводилось на базе Психоневрологической клиники нервных расстройств "Роса" и лаборатории Социогеномики МГУ. Материалом для данного исследования служила геномная ДНК, полученная из образцов венозной крови участников эксперимента. Взятие материала осуществлялось в процедурном кабинете клиники «Роса». Для исследования брали кровь из вены в пробирку с консервантом EDTA. После чего осуществляли транспортировку в Лабораторию социогеномики МГУ при температуре +4єС. В опытную группу вошли 25 человек (17 женщин и 8 мужчин), страдающих шизофренией в остром психотическом периоде с преобладанием галлюцинаторно-параноидного синдрома. Возраст 19-35 лет. Диагноз ставился врачами-психиатрами отделения острых психозов по Международной классификации МКБ-10 категория F20.0. Общая сумма баллов выраженности психопатологических симптомов определялась по шкале PANSS (шкала оценки позитивной и негативной симптоматики), у пациентов составляла 97.1±3.1. Контрольная группа -- 15 здоровых добровольцев (11 женщин и четверо мужчин) 19-28 лет. Статистически значимых различий по полу, возрасту и уровню образования между исследованными группами обнаружено не было (р>0.1).

При выделении ДНК использовали наборы фирмы «Силекс» (Россия), следуя рекомендациям производителя. Нуклеиновые кислоты выделяли с помощью входящих в наборы магнитных частиц типа «RNA-Grade», покрытых SiO2.

Для ПЦР использовали Taq ДНК-полимеразу, dNTP, и минеральное масло компании «Силекс». Последовательности праймеров были взяты из научных публикаций либо разработаны в Лаборатории социогеномики МГУ. Полимеразную цепную реакцию проводили в термоциклерах «ТЕРЦИК» или «ДТ- 322» компании «ДНК-Технологии».

Для горизонтального электрофореза использовали однократный буфер TBE, 3% агарозу, маркер молекулярного веса (100-1000 п.н. с шагом 100 п.н.), флюоресцентный краситель для ДНК SYBR Green I, плашки и гребенки для заливки геля, горизонтальный аппарат для электрофореза.

2.2 Методы

Для исследований полиморфизма генов и анализа их экспрессии использовали следующий набор методов:

Выделение ДНК/РНК из крови на парамагнитных наночастицах с покрытием из SiO2.

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией по конечной точке (Endpoint PCR).

2. Постановка электрофореза.

3. ПЦР с детекцией в реальном времени (Realtime PCR).

2.2.1 Выделение нуклеиновых кислот из крови

Поскольку нуклеиновые кислоты (НК) являются одним из основных объектов биологических исследований в течение уже нескольких десятилетий, к настоящему моменту существует огромное разнообразие методов их выделения и очистки. Процедура пробоподготовки позволяет извлечь нуклеиновую кислоту из любого биологического материала, а очистка позволяет добиться требуемой её чистоты, позволяющей проводить дальнейшие молекулярные процедуры. Независимо от того, какой конкретно методикой выделяется НК, существуют общие этапы пробоподготовки.

1. Лизис. Образец необходимо разрушить для высвобождения НК. Клетки и ткани разрушаются, связанные с НК белки частично или полностью денатурируются.

2. Иммобилизация. Перед тем, как начать очистку НК от примесей, её необходимо иммобилизовать. Существует два основных подхода, позволяющих достигнуть этого. Исторически первым методом была преципитация. Преципитация нуклеиновой кислоты из водного раствора обычно вызывается с помощью добавления какого-либо спирта и/или соли. Это вызывает разрушение водородных связей, поддерживающих молекулы НК в растворе, и выпадение её в осадок (преципитацию). Преципитированная НК затем центрифугируется (иногда с соосадителем), что приводит к образованию плотного осадка. После этого её можно отмывать от примесей.

Связывание с твёрдой фазой является более современным подходом в выделении НК. В связи с гораздо большей технологичностью, эта группа методов эволюционировала существенно дальше. НК может связываться с различными сорбентами (микро- и нанодисперсными суспензиями, нанотрубками), с мембранами, со сплошными активированными твёрдыми поверхностями (стенки капилляра, поверхность микрофлюидного чипа) и т. д.

Наиболее зрелые и широко используемые методы из этой группы основаны на использовании спин-колонок и парамагнитных наночастиц. Спин-колонки являются особым видом мини колонок, заполненных специальным сорбентом (обычно на основе силики) и/или содержащих мембраны. НК связывается с наполнителем колонки, а затем отмывается несколько раз для удаления примесей. Проток жидкости осуществляется за счёт центробежной силы при центрифугировании (отсюда и название спин-колонки). Парамагнитные наночастицы в определённых буферных растворах связывают НК на поверхности своей оболочки, состоящей из SiO2. Благодаря огромной суммарной площади поверхности наночастицы обеспечивают очень высокую эффективность связывания -- данный метод позволяет связать очень большое количество НК (в большинстве случаев около 100% содержащихся в образце). При этом в отсутствии внешнего магнитного поля частицы образуют суспензию, а при приближении магнита собираются в виде осадка на стенке пробирки рядом с магнитом. Управляя таким образом состоянием частиц, можно удалить (отмыть) с них примеси, сохранив при этом связанные НК.

3. Очистка. Как правило представляет собой серию отмывок иммобилизованной НК специальными реагентами. Связанные или осаждённые НК прочно удерживаются, в то время как различные примеси легко удаляются отмывочными реагентами. Преципитированную НК промывают непосредственно в пробирках. Спин-колонки -- протоком жидкости сквозь наполнитель колонки. Наночастицы отмывают в состоянии суспензии, ресуспендируют, предварительно удалив внешнее магнитное поле. Это обеспечивает свободный доступ отмывочных реагентов к поверхности частиц и позволяет получить очень высокую чистоту препарата НК. После этого снова помещают частицы в магнитное поле. Суспензия быстро распадается и частицы оседают на стенку пробирки около источника магнитного поля. Таким образом устраняется необходимость процедуры центрифугирования, которая нужна при работе с немагнитными сорбентами. Затем отмывочный раствор со смытыми с частиц примесями удаляют из пробирки, а НК остаётся связанной с осаждёнными частицами. После нескольких таких процедур отмывки частицы сушат в термостате для удаления летучих органических веществ.

4. Элюция. После проведения очистки нуклеиновую кислоту снова растворяют (элюируют). Для этого используют буферные растворы с низкой ионной силой или воду высокой степени очистки.

Из всего этого разнообразия были выбраны несколько наиболее эффективных подходов. Были опробованы методы выделения, основанные на преципитации НК, реализованные в виде оптимизированного коммерческого набора Yellow Solve компании Клоноген и система пробоподготовки на основе магнитных частиц компании Силекс. От использования спин-колонок было решено отказаться по причине ранее имевшегося негативного опыта их применения (сложность в использовании, высокий риск кросс-контаминации образцов). При этом выделение НК набором Yellow Solve оказалось низкоэффективным в силу больших затрат времени и сложности процедуры. Поэтому все дальнейшие работы проводились с использованием магнитных наночастиц.

Выделение нуклеиновых кислот из крови на магнитных частицах с оболочкой из SiO2

Для пробоподготовки НК использовался комплекс, производимый компанией Силекс. Комплекс состоит из магнитного штатива, ручного минимиксера, наборов на основе магнитных частиц.

Магнитный штатив необходим для быстрого и удобного отделения магнитных частиц от раствора. Использованный штатив MagRack40 рассчитан на работу с 40 образцами.

Минимиксер позволяет эффективно перемешивать образец и ресуспендировать магнитные частицы, обеспечивая их качественную отмывку. Использованный миксер LabMix201 позволяет полностью ресуспендировать и отмыть образец за 3-5 секунд.

Наборы на основе магнитных наночастиц оптимизированы под различные типы биологического материала. Для данного исследования использовались наборы для выделения НК из крови на магнитных частицах универсального типа.

Состав набора:

Буфер START 12 мл, буфер Lysis&Binding 24 мл, магнитные частицы SiO2 1 мл, буфер Wash1 30 мл, буфер Wash2 30 мл, буфер Wash3 30 мл, буфер Final Wash 30 мл, буфер Elution 10 мл.

Прочее использованное оборудование и расходные материалы:

Медицинские перчатки, штатив для вакуумных пробирок, стерильные пробирки, микроцентрифужные пробирки 1,5 мл типа Эппендорф, микроцентрифуга-вортекс, автоматические дозаторы переменного объема, одноразовые наконечники для дозаторов, термостат для микроцентрифужных пробирок, одноразовые зонды для минимиксера.

Описание:

Набор предназначен для эффективного и быстрого (30 мин.) выделения НК из свежих и замороженных образцов крови. Набор оптимизирован для работы с человеческой кровью. Из 100 мкл человеческой крови можно выделить 2-6 мкг НК. Выделенная НК может использоваться как в ПЦР, так и в других молекулярно-биологических целях (мечение, клонирование, секвенирование). Внабор входят все необходимые реактивы и буфера.

Принцип работы набора основан на лизировании образца крови с использованием хаотропных агентов, последующем связывании высвободившейся НК на поверхности наночастиц и серии отмывок.

Протокол:

Выделение НК из 100 мкл крови.

Перед началом работы убедились, что в буфере не образовался осадок или компоненты буфера не расслоились. Расслоение или выпадение осадка не влияет на качество буфера. Если образовывался осадок, прогревали буфер при 50 градусах до его полного растворения.

Буфера START, Lisys&Binding, Wash1, Wash2 перед началом работы тщательно перемешали.

Лизис:

1. Внесли 100 мкл крови в чистую 1.5 мл пробирку

2. Внесли 120 мкл буфера START, тщательно перемешали на вортексе. Инкубировали пробирку при комнатной температуре в течение 5 минут, периодически встряхивая на вортексе.

3. Смешали в отдельной пробирке 240 мкл хорошо перемешанного буфера Lysis&Binding и 10 мкл предварительно размешанных магнитных частиц SiO2. Пробирки поместили в магнитный штатив (магниты убраны). Тщательно размешали частицы в буфере при помощи миксера.

Сорбция:

4. Перенесли смесь образца и буфера START в суспензию наночастиц. Инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут, периодически перемешивая смесь миксером.

5. Поместили магниты под пробирки, дали частицам собраться (около 1 минуты). Удалили супернатант.

Отмывка:

6. Внесли в пробирку 300 мкл хорошо перемешанного буфера Wash1, тщательно перемешали миксером.

7. Поместили магниты под пробирки, дали частицам время полностью собраться и удалили супернатант.

8. Повторили таким же образом отмывку с буферами Wash2 и Wash3.

9. Внесли в пробирку 300 мкл буфера FinalWash, тщательно перемешали миксером. На этой стадии НК консервировали, т. к. накапливали образцы для дальнейшего исследования и последующие процедуры проводились в другой день. Пробирки с образцами помещались в холодильник на -20єС.

10. В день постановки эксперимента поместили пробирки в магнитный штатив, дали частицам время полностью собраться и удалили супернатант.

11. Поместили пробирку в термостат и инкубировали при 60 градусах в течение 10 минут, до полного высыхания и испарения буфера.

12. Внесли в пробирку 100 мкл буфера Elution. Тщательно ресуспендировали частицы на вортексе.

13. Поместили пробирку в термостат для элюции и инкубировали при 60° в течение 10-15 минут.

14. Поместили пробирку в магнитный штатив, дали частицам время полностью собраться и перенесли супернатант, содержащий выделенную НК, в новую стерильную пробирку.

2.2.2 Полимеразная цепная реакция

В основе метода лежит природный процесс репликации ДНК, перенесенный в пробирку. В лабораторных условиях можно многократно скопировать не всю цепь молекулы, а лишь интересующий нас фрагмент. Для этого важно правильно подобрать праймеры и условия реакции. Один цикл ПЦР включает в себя 3 основные стадии, всего таких циклов за реакцию происходит 32-40:

1. Денатурация молекулы ДНК («расплетание» и расхождение двух нитей) (93-95°С)

2. Отжиг - присоединение праймеров к ДНК-матрице (50-65°С) 3. Достраивание комплиментарной цепи (70-72°С)

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР потребовались следующие компоненты:

- ДНК-матрица, полученная из образцов крови участников исследования;

- праймеры: для трех исследуемых генов плюс зонды, меченые флуоресцирующими метками (каналы оценки Fam и Hex) для PGC-1б, DRD2;

- двухкратный буфер для реакционной смеси;

- деионизированная вода;

- dNTP (смесь трифосфатов с ионами магния);

- Taq-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза;

- минеральное масло, для предотвращения испарения реакционной смеси.

Оборудование и приборы:

- штатив для микропробирок;

- автоматические дозаторы переменного объема;

- наконечники для дозаторов;

- пробирки 0,5мл для ПЦР;

- термостат;

- термоциклер «ТЕРЦИК».

Постановка ПЦР (генотипирование ДНК крови на ген АСЕ с детекцией при помощи электрофореза) :

1. В пронумерованные пробирки внесли по 28 мкл ПЦР-смеси, приготовленной в следующем соотношении:.

Таблица 1

Компонент ПЦР-смеси

На 1 пробу

На 10 проб

Десятикратный буфер

3 мкл

30 мкл

dNTP (10 мМ)

2 мкл

20 мкл

ddH2O

22 мкл

220 мкл

Праймер F1-прямой

1 мкл

10 мкл

Праймер F2-обратный

1 мкл

10 мкл

Фермент

0,5 мкл

5 мкл

3. Все пробирки для предварительной денатурации перенесли в термостат с температурой 80° на 5 минут.

4. В каждую пробирку добавили по 1 мкл пробы в соответствии с нумерацией.

5. Осадили содержимое пробирок кратковременным центрифугированием.

6. Для предотвращения испарения поверх реакционной смеси нанесли минеральное масло.

8. Пробирки поместили в термоциклер «ТЕРЦИК».

9. После окончания ПЦР перенесли пробирки в термостат на 72° 7 минут (финальная стадия элонгации).

2.2.3 Электрофорез

Материалы

- 1 г агарозы;

- 0,5 кратный буфер для агарозного геля;

- 100 мл дистиллированной воды;

- однократный ТАЕ-буфер для электрофореза.

Подготовка реагентов

1.Приготовление 3% агарозы:

· в колбу объемом 1л поместили 1г агарозы, добавили 100 мл дистиллированной воды и 2 мл 50-кратного ТАЕ-буфера.

· агарозу нагревали в микроволновой печи до полного расплавления. 2.Приготовление однократного ТАЕ-буфера:

· 20 мл 50-кратного ТАЕ-буфера разбавили 1 л дистиллированной

воды. Получили однократный ТАЕ-буфер для электрофореза.

Оборудование

- прибор горизонтального электрофореза;

- трансиллюминатор;

- фотоаппарат с фильтрами для съемки в УФ;

- автоматические дозаторы переменного объема;

- наконечники для дозаторов;

- перчатки

- плашка для окраски проб

- ванночка для геля и гребёнка.

Подготовка проб с ПЦР с электрофорезу:

1. В каждую лунку плашки внесли по 3 мкл краски;

2. Добавили 2 мкл маркера в первую и вторую лунки плашки;

3. В остальные лунки внесли по 6 мкл амплифицированных образцов ДНК;

4. Из каждой лунки плашки взяли по 9 мкл и внесли в ячейки агарозного геля. В первую и 13 ячейки - внесли маркер, со 2 по 11 ячейки внесли образцы ДНК, в 12 ячейку - контроль ПЦР.

Постановка электрофореза

1. В ёмкость прибора горизонтального электрофореза добавили однократный ТАЕ-буфер на 1-1,5 сантиметра от дна;

2. Ванночку и гребенку для геля промыли под проточной водой, ополоснули дистиллированной водой;

3. Гребенку положили на ванночку ровно;

4. В агарозный гель добавили реагент бромистый этидий. Бромистый этидий встраивается в состав ДНК и светится;

5. В специальную ванночку с гребенкой внесли расплавленный агарозный гель комнатной температуры и дали остыть в течение получаса;

6. После застывания агарозы гребенку аккуратно достали, стараясь не повредить образовавшиеся ячейки;

7. Внесли 13 подготовленных проб в ячейки;

8. Гель поместили в ванночку для электрофореза;

9. Закрыли крышку прибора для электрофореза и подключили к источнику тока на 30 минут -110 вольт, ток - 74 миллиампера.

10. Результат оценивали, поместив гель в трансиллюминатор, сфотографировали. Для примера приведу одну из полученных фотографий.

Рисунок 1: Электорофореграмма в 3% агарозном геле гена ACE. 1 и 13 -- маркеры молекулярного веса («Силекс»); 2, 3 -- гомозиготы; 4 -- гетерозигота (I/D); 5-8 -- гомозиготы; 9 -- гетерозигота; 10, 11 -- гетерозигота; 12 -- контроль.

2.2.4 ПЦР в режиме реального времени

Методика генотипирования ДНК крови на гены PGC1б, DRD2 при помощи ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) позволяет видеть процесс накопления продукта амплификации непосредственно во время проведения реакции. Каждая новая полученная копия ДНК начинает испускать флуоресцентное свечение, таким образом чем больше продукта амплификации находится в пробирке, тем сильнее его свечение, которое детектируется прибором. Это позволяет проводить не только качественный, но и количественный анализ ДНК-копий в образце, повышается чувствительность метода, потому что улавливается даже легкое свечение. Серьезным преимуществом РТ-ПЦР является экономя времени, т. к. исключается долгая и трудоемкая стадия электрофореза. Снижается риск перекрестной контаминации ампликонами. Вместо субъективной визуальной оценки электрофореграмм применяется объективная цифровая оценка.

Принцип работы РТ-ПЦР можно описать следующим образом: пара праймеров ограничивает амплифицируемый участок ДНК, содержащий исследуемый полиморфизм. Флуоресцентные зонды связываются только с одним из вариантов полиморфизма. В нашем случае, зонд связывающийся с SNP 482Gly (ген PGC-1б ) и, зонд, связывающийся с TaqIA-1 (ген DRD2) светятся в диапазоне детекции канала FAM. Зонды, работающие в диапазоне канала HEX связываются с SNP 482Ser (PGC-1б) или TaqIA-2 (ген DRD2).

Методика для PGC-1б: Образцы ДНК получали как указано выше.

Gly482Ser(GGT>AGT) полиморфизм PGC-1б анализировали с использованием метода аллельной дискриминации.

Прибор для РТ ПЦР ДТ-322 фирмы «ДНК-технологии». Праймеры: 5?- CACTTCGGTCATCCCA-3? (прямой) и 5?-TTATCACTTTCATCTT-3? (обратный), и зонд TaqMan: Fam-5?-AGACAAGACCGGTGAA-3? и Vic-5?- CAGACAAGACCAGTGA-3?.

Для DRD2( Т/C полиморфизм): реакционная смесь в 40 мкл содержала-20 нг геномной ДНК, 20 мкл - 2хTaqMan универсальную смесь, 900 нмоль праймеров (прямой: 5'-GTGTGCAGCTCACTCC-3', обратный: 5'- GCAACACAGCCATCCT-3'), и 200 nM TaqMan-MGB зондов (T-зонд = FAM5'

-TGCCTTGACCAGCAC-3', C-зонд -- VIC 5'-TGCCTCGACCAGCA-3'). Пациенты имели следующие аллельные формы A1 (A1/A1 или A1/A2) или A2 (A2/A2). Условия ПЦР:

95° С - 5 мин (активация фермента)

· 40 циклов 94о С - 30 сек (денатурация);

60 °С - 30 сек (отжиг).

10 °С - конечное сохранение.

Таким образом, протокол ПЦР в реальном времени является отражением светимости в разных диапазонах, которую регистрирует прибор после каждого цикла денатурации-отжига-элонгации.

Интерпретация результатов ПЦР напрямую связана с принципом работы, который описан выше. Яркость свечения прямо пропорциональна количеству амплифицированной ДНК. Таким образом, по превышению некоторого порогового значения светимости можно говорить о наличии соответствующего аллеля в исследуемом материале. Если образец светится по двум каналам, это свидетельствует о том что у хозяина образца ДНК есть и один и другой исследуемый аллель, т.е. Организм гетерозиготен по данному признаку.

Для примера приведу один из протоколов, т.к. не имеет смысла рассматривать их все.

3. Результаты

В ходе работы было получено 40 образцов геномной ДНК. В исследовании приняли участие 25 человек с диагнозом шизофрения и 15 здоровых добровольцев. Для анализа нуклеиновые кислоты выделялись при помощи магнитных частиц из цельной венозной крови участников. С помощью ПЦР и РТ-ПЦР в полученных образцах определяли полиморфизмы генов PGC-1б, DRD2 и ACE.

Учет результатов анализа гена ACE проводили визуально, при помощи трансиллюминатора. Полиморфизмы PGC-1б и DRD2 анализировались методом количественной ПЦР в реальном времени. Данные по трем генам приведены в сводной таблице ниже.

Таблица 2 результаты исследования.

Пол

Возраст

Состояние

PGC-1б Gly482Ser, rs8192678

DRD2 TaqIA, rs18000497

ACE, инсерция/ делеция

М

24

ШЗ

gly/gly

CC

D/D

Ж

26

ШЗ

gly/ser

CT

D/D

Ж

22

ШЗ

ser/ser

CC

D/D

Ж

23

ШЗ

gly/gly

CT

D/D

Ж

25

ШЗ

gly/gly

CC

-

Ж

26

ШЗ

gly/gly

CC

I/I

М

20

ШЗ

gly/gly

CC

I/I

Ж

19

Норма

gly/gly

CC

D/D

Ж

22

Норма

gly/ser

CC

D/D

М

26

Норма

gly/ser

CC

I/I

Ж

24

Норма

gly/gly

CТ

D/D

?

27

Норма

gly/gly

CC

D/D

Ж

23

Норма

gly/ser

CC

D/D

Ж

22

ШЗ

gly/ser

CC

D/D

М

24

ШЗ

gly/gly

CC

D/D

М

32

ШЗ

gly/ser

CC

D/D

Ж

33

ШЗ

gly/gly

CT

D/D

Ж

26

Норма

gly/ser

CC

D/D

Ж

28

Норма

gly/ser

CC

D/D

Ж

27

ШЗ

gly/gly

CC

D/D

Ж

21

ШЗ

gly/gly

CC

D/D

М

30

ШЗ

gly/ser

CC

D/D

М

24

ШЗ

ser/ser

TT

I/D

Ж

21

ШЗ

gly/gly

CC

I/D

Ж

29

ШЗ

gly/ser

TT

D/D

Ж

27

Норма

gly/ser

CC

D/D

М

26

Норма

gly/ser

TТ

D/D

Ж

24

Норма

gly/gly

CC

D/D

Ж

27

Норма

gly/ser

CC

D/D

М

28

Норма

gly/ser

CC

I/D

Ж

25

Норма

ser/ser

CC

D/D

Ж

27

Норма

gly/gly

CC

I/I

Ж

24

ШЗ

ser/ser

CT

I/I

М

26

ШЗ

gly/ser

CC

I/D

Ж

27

ШЗ

gly/gly

CC

I/D

М

19

ШЗ

gly/ser.

CC

I/D

Ж

20

ШЗ

ser/ser.

CC

D/D

Ж

33

ШЗ

gly/ser

CC

I/I

Ж

25

ШЗ

gly/gly

CC

I/I

Ж

35

ШЗ

gly/gly

CC

I/D

Для статистического анализа полученных данных применили критерий ч Пирсона. Это непараметрический метод, позволяющий оценить значимость различий между количеством исходов (заболеваний ШЗ) и качественными характеристиками выборки (тот или иной аллель того или иного гена). То есть при помощи этого критерия можно оценить частоту встречаемости того или иного аллеля и его корреляцию с развитием заболевания. Получили следующие результаты.

Число степеней свободы равно 2

Значение критерия ч2 составляет 2.979

Критическое значение ч при уровне значимости p2<0.05 составляет 5.991

Связь между факторным и результативным признаками отсутствует, уровень значимости р>0.05

Таблица 3 ассоциация полиморфизма гена ACE с заболеваемостью шизофренией

Вариант аллелягена ACE

Результативный признак

Сумма

Норма

ШЗ

I/I

2

5

7

I/D

1

6

7

D/D

12

13

25

Всего

15

24

39

Диаграмма 1: Частота аллелей гена АСЕ в норме и при шизофрении

Диаграмма 2: Частота аллелей гена DRD2 в норме и при шизофрении

Число степеней свободы равно 2

Значение критерия ч2 составляет 7.380

Критическое значение ч2 при уровне значимости p<0.05 составляет 5.991

Связь между факторным и результативным признаками статистически значима при уровне значимости р<0.05

Таблица 4 ассоциация полиморфизма гена PGC-1б с заболеваемостью шизофренией

Gly482Ser, rs8192678

Результативный признак

Сумма

Норма

ШЗ

ser/ser

1

12

13

gly/ser

9

9

18

gly/gly

5

4

9

Всего

15

25

40

Диаграмма 3: Частота аллелей гена PGC-1б в норме и при шизофрении

Выводы

Для выполнения работы был собран генетический материал от лиц, страдающих шизофренией и здоровых добровольцев, принявших участие в качестве здоровой контрольной группы. Нуклеиновые кислоты были своевременно выделены и заархивированы для последующих геномных исследований.

Проведен полиморфный анализ генов, ассоциированных с шизофренией, результаты оценивались при помощи критерия ч2 Пирсона. Оценка инсерции/делеции гена АСЕ осуществлялась при помощи качественной ПЦР с детекцией в агарозном геле. Связи между вариантами аллелей гена АСЕ и развитием шизофрении не выявили. SNP анализ генов DRD2 и PGC-1б осуществляли при помощи ПЦР в реальном времени. Для гена DRD2 значимой разницы между аллелями и возникновение заболевания не обнаружено. Для гена PGC-1б связь между факторным и результативным признаками статистически значима. Уровень значимости составляет р<0.05. Данные, полученные в результате проведенного исследования не подтверждают связи полиморфизмами гена АСЕ и DRD2 с развитием шизофрении. Для аллеля gly/gly гена PGC-1б наметилась тенденция. Следует отметить, что для полиморфного анализа выборка из сорока участников является недостаточной, поэтому необходимо продолжить данное исследование и дополнить статистику данными по большему количеству участников.

Литература

1. Барякин Д.Н., Семенов Д.В., Савельева А.В., Коваль О.А., Рабинов И.В., Кулигина Е.В., Рихтер В.А. Аналоги aluи 7SL РНК подавляют жизнеспособность клеток MCF-7, модулируя транскрипцию генов ответа на стресс эндоплазматического ретикулума. - "Acta Naturae (русскоязычная версия)", № 4 (19) / том 5 / 2013

2. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. ISBN 5- 9231-0254-4

3. Преображенская И.С. Антагонисты NMDA-рецепторов в лечении пациентов с сосудистыми когнитивными нарушениями. Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика -- Выпуск № S2 /2014

4. Рядовая Людмила Александровна, Гуткевич Елена Владимировна, Иванова Светлана Александровна, Семке Валентин Яковлевич, Епанчинцева Елена Макаровна Полиморфизм генов серотонинового обмена при невротических психических расстройствах у русских западно-сибирсого региона. Вестник Томского государственного университета Выпуск № 319 /2009

5. Тимофеев-Ресовский Н.В., Свирежев Ю.М., О генетическом полиморфизме в популяциях, «Генетика», 1967, № 10.

6. Хлесткина Е.Р. «Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и в селекции» Вавиловский журнал генетики и селекции, 2013, Том 17, № 4/2

7. Agid O, Mamo D, Ginovart N, Vitcu I, Wilson AA, Zipursky RB, Kapur S. Striatal vs extrastriatal dopamine D2 receptors in antipsychotic response--a double-blind PET study in schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 2007 Jun;32(6):1209-15. Epub 2006 Nov 1.

8. Apelt, J., G. Mehlhorn, and R. Schliebs, Insulin-sensitive GLUT4 glucose transporters are colocalized with GLUT3-expressing cells and demonstrate a chemically distinct neuron-specific localization in rat brain. J Neurosci Res, 1999. 57(5): p. 693-705.

9. Buzsaki, G. and A. Draguhn, Neuronal oscillations in cortical networks. Science, 2004. 304(5679): p. 1926-9.

10. Cadenhead, K.S. Modulation of the startle response and startle laterality in relatives of schizophrenic patients and in subjects with schizotypal personality disorder: evidence of inhibitory deficits / K.S. Cadenhead [et al.] // Am. J. Psychiatry. - 2000. - Vol. 157. - P. 1904.

11. Cardin, J.A., et al., Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature, 2009. 459(7247): p. 663-7.

12. Caverie, J.M., Gene number. What if there are only 30,000 human genes? Science, 2001. 291(5507): p. 1255-7.

13. Che, H.V., et al., Localization of sequence variations in PGC-1alpha influence their modifying effect in Huntington disease. Mol Neurodegener, 2011. 6(1): p. 1.

14. Clark, J., et al., Association of PGC-1alpha polymorphisms with age of onset and risk of Parkinson's disease. BMC Med Genet, 2011. 12: p. 69.

15. Clinton SM, Meador-Woodruff JH. Abnormalities of the NMDA Receptor and Associated Intracellular Molecules in the Thalamus in Schizophrenia and Bipolar Disorder. Neuropsychopharmacology. 2004 Jul;29(7):1353-62.

16. Cowell, R.M., K.R. Blake, and J.W. Russell, Localization of the transcriptional coactivator PGC-1alpha to GABAergic neurons during maturation of the rat brain. J Comp Neurol, 2007. 502(1): p. 1-18.

17. Cunningham MO, Hunt J, Middleton S, LeBeau FE, Gillies MJ, Gillies MG, Davies CH, Maycox PR, Whittington MA, Racca C. Region-specific reduction in entorhinal gamma oscillations and parvalbumin-immunoreactive neurons in animal models of psychiatric illness. J Neurosci . 2006 Mar 8 ; 26(10):2767-76.

18. Finck, B.N. and D.P. Kelly, PGC-1 coactivators: inducible regulators of energy metabolism in health and disease. J Clin Invest, 2006. 116(3): p. 615-22. Fan, M., et al., Suppression of mitochondrial respiration through recruitment of p160 myb binding protein to PGC-1alpha: modulation by p38 MAPK. Genes Dev, 2004. 18(3): p. 278-89.

19. Fukuda, T., et al., Gap junctions among dendrites of cortical GABAergic neurons establish a dense and widespread intercolumnar network. J Neurosci, 2006. 26(13): p. 3434-43.

20. Gadelha A1, Yonamine CM2, Ota VK3, Oliveira V4, Sato JR5, Belangero SI6, Bressan RA1, Hayashi MA7. ACE I/D genotype-related increase in ACE plasma activity is a better predictor for schizophrenia diagnosis than the genotype alone. Schizophr Res. 2015 May;164(1-3):109-14. doi: 10.1016/j.schres.2015.01.044. Epub 2015 Feb 17.

21. Ge D; Fellay J; Thompson AJ; Simon JS; et al. (September 2009). "Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance". Nature 461 (7262): 399-401. doi:10.1038/nature08309. PMID 19684573.

22. Glenthoj BY, Mackeprang T, Svarer C, Rasmussen H, Pinborg LH, Friberg L, Baarй W, Hemmingsen R, Videbaek C. Frontal dopamine D(2/3) receptor binding in drug-naive first-episode schizophrenic patients correlates with positive psychotic symptoms and gender. Biol Psychiatry. 2006 Sep 15;60(6):621-9. Epub 2006 Apr 3.

23. Goldberg TE1, Weinberger DR. Genes and the parsing of cognitive processes. Trends Cogn Sci. 2004 Jul;8(7):325-35.

24. Goldman-Rakic PS, Muly EC 3rd, Williams GV. D(1) receptors in prefrontal cells and circuits. Brain Res Brain Res Rev. 2000 Mar;31(2-3):295-301.

25. Gonzalez-Burgos, G. and D.A. Lewis, GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull, 2008. 34(5): p. 944-61.

26. Gulyas, A.I., et al., Populations of hippocampal inhibitory neurons express different levels of cytochrome c. Eur J Neurosci, 2006. 23(10): p. 2581-94.

27. Handschin, C., The biology of PGC-1alpha and its therapeutic potential. Trends Pharmacol Sci, 2009. 30(6): p. 322-9.

28. Harris KD. Neural signatures of cell assembly organization. Nat Rev Neurosci . 2005 May 1 ; 6(5):399-407

29. Harrison PJ, Owen MJ. Genes for schizophrenia? Recent findings and their pathophysiological implications. Lancet . 2003 Feb 1 ; 361(9355):417-9.

30. Hashimoto T, Volk DW, Eggan SM, Mirnics K, Pierri JN, Sun Z, Sampson AR, Lewis DA. Gene expression deficits in a subclass of GABA neurons in the prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. J Neurosci . 2003 Jul 16 ; 23(15):6315-26.

31. Hensch TK. Critical period plasticity in local cortical circuits. Nat Rev Neurosci . 2005 Nov 1 ; 6(11):877-88

32. Kaneko T, Fujiyama F. Complementary distribution of vesicular glutamate transporters in the central nervous system. Neurosci Res . 2002 Apr 1 ; 42(4):243- 50.

33. Kim, J., et al., Mitochondrial loss, dysfunction and altered dynamics in Huntington's disease. Hum Mol Genet, 2010. 19(20): p. 3919-35.

34. Kinney JW, Davis CN, Tabarean I, Conti B, Bartfai T, Behrens MM. A specific role for NR2A-containing NMDA receptors in the maintenance of parvalbumin and GAD67 immunoreactivity in cultured interneurons. J Neurosci . 2006 Feb 1 ; 26(5):1604-15.

35. Knable MB Dopamine, the prefrontal cortex and schizophrenia / Knable MB, Weinberger DR // J Psychopharmacol. - 1997. - PMID:9208376

36. Kucukali CI, Aydin M, Ozkok E, Bilge E, Zengin A, Cakir U, Kara I. Angiotensin- converting enzyme polymorphism in schizophrenia, bipolar disorders, and their first-degree relatives. Psychiatr Genet. 2010 Feb;20(1):14-9. doi: 10.1097/YPG.0b013e3283351194.

37. Levey AI, S M Hersch, D B Rye, R K Sunahara, H B Niznik, C A Kitt, D L Price, R Maggio, M R Brann, B J Ciliax «Localization of D1 and D2 dopamine receptors in brain with subtype-specific antibodies.» Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Oct 1; 90(19): 8861-8865.

38. Li, B., M. Carey, and J.L. Workman, The role of chromatin during transcription. Cell, 2007. 128(4): p. 707-19.

39. Lieberman JA, Kane JM, Sarantakos S, Gadaleta D, Woerner M, Alvir J, Ramos- Lorenzi J. Prediction of relapse in schizophrenia. Arch Gen Psychiatry . 1987 Jul 1; 44(7):597-603.

40. Lonard, D.M. and B.W. O'Malley, The expanding cosmos of nuclear receptor coactivators. Cell, 2006. 125(3): p. 411-4

Puigserver, P., et al., A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis. Cell, 1998. 92(6): p. 829-39.

41. Lonard, D.M. and W. O'Malley B, Nuclear receptor coregulators: judges, juries, and executioners of cellular regulation. Mol Cell, 2007. 27(5): p. 691-700.

42. McKenna, N.J. and B.W. O'Malley, Combinatorial control of gene expression by nuclear receptors and coregulators. Cell, 2002. 108(4): p. 465-74.

43. Melchitzky, D.S., S.R. Sesack, and D.A. Lewis, Parvalbumin-immunoreactive axon terminals in macaque monkey and human prefrontal cortex: laminar, regional, and target specificity of type I and type II synapses. J Comp Neurol, 1999. 408(1): p. 11-22.

44. Meyer-Lindenberg A1, Miletich RS, Kohn PD, Esposito G, Carson RE, Quarantelli M, Weinberger DR, Berman KF. Reduced prefrontal activity predicts exaggerated striatal dopaminergic function in schizophrenia. Nat Neurosci. 2002 Mar;5(3):267-71.

45. Michael, L.F., et al., Restoration of insulin-sensitive glucose transporter (GLUT4) gene expression in muscle cells by the transcriptional coactivator PGC-1. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(7): p. 3820-5.

46. Moghaddam B, Jackson ME. Glutamatergic animal models of schizophrenia. Ann N Y Acad Sci. 2003 Nov;1003:131-7..

47. Moghaddam B, Javitt D. From revolution to evolution: the glutamate hypothesis of schizophrenia and its implication for treatment. Neuropsychopharmacology. 2012 Jan;37(1):4-15. doi: 10.1038/npp.2011.181. Epub 2011 Sep 28.

48. Murray JB Phencyclidine (PCP): a dangerous drug, but useful in schizophrenia research. J Psychol. 2002 May;136(3):319-27.

49. Narendran R, Frankle WG, Keefe R, Gil R, Martinez D, Slifstein M, Kegeles LS, Talbot PS, Huang Y, Hwang DR, Khenissi L, Cooper TB, Laruelle M, Abi- Dargham A. Altered prefrontal dopaminergic function in chronic recreational ketamine users. Am J Psychiatry. 2005 Dec;162(12):2352-9.

50. Pilowsky LS, Bressan RA, Stone JM, Erlandsson K, Mulligan RS, Krystal JH, Ell PJ. First in vivo evidence of an NMDA receptor deficit in medication-free schizophrenic patients. Mol Psychiatry . 2006 Feb 1 ; 11(2):118-9.

51. Qin, W., et al., PGC-1alpha expression decreases in the Alzheimer disease brain as a function of dementia. Arch Neurol, 2009. 66(3): p. 352-61.

52. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium

«Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci» Nature 511, 421-427, 2014

53. Seeman P, Chau-Wong M, Tedesco J, Wong K.(1975) Brain receptors for antipsychotic drugs and dopamine: direct binding assays. Proc Natl Acad Sci USA.72(11):4376-80. PMID 1060115

54. Sims R.J., 3rd, S.S. Mandal, and D. Reinberg, Recent highlights of RNApolymerase-II-mediated transcription. Curr Opin Cell Biol, 2004. 16(3): p.263-71.

55. St-Pierre J., et al., Suppression of reactive oxygen species and neurodegeneration by the PGC-1 transcriptional coactivators. Cell, 2006. 127(2): p. 397-408.

56. Suhara T, Okubo Y, Yasuno F, Sudo Y, Inoue M, Ichimiya T, Nakashima Y, Nakayama K, Tanada S, Suzuki K, Halldin C, Farde L. Decreased dopamine D2 receptor binding in the anterior cingulate cortex in schizophrenia. Arch Gen Psychiatry. 2002 Jan;59(1):25-30.

57. Teyssier, C., et al., Activation of nuclear receptor coactivator PGC-1alpha by arginine methylation. Genes Dev, 2005. 19(12): p. 1466-73.

58. Torrey, E.F., et al., Neurochemical markers for schizophrenia, bipolar disorder, and major depression in postmortem brains. Biol Psychiatry, 2005. 57(3): p. 252- 60.

59. Tritos, N.A., et al., Characterization of the peroxisome proliferator activated receptor coactivator 1 alpha (PGC 1alpha) expression in the murine brain. Brain Res, 2003. 961(2): p. 255-60.

60. Tsai G, Passani LA, Slusher BS, Carter R, Baer L, Kleinman JE, Coyle JT. Abnormal excitatory neurotransmitter metabolism in schizophrenic brains. Arch Gen Psychiatry. 1995 Oct;52(10):829-36.

61. Tzschentke T.M. Pharmacology and behavioral pharmacology of the mesocortical dopamine system / Tzschentke T.M. // Prog Neurobiol. - 2001 -- PMID:11115727

62. Usdin K - The biological effects of simple tandem repeats: Lessons from the repeat expansion diseases. doi: 10.1101/gr.070409.107 Genome Res. 2008. 18: 1011- 1019 Copyright 2008, Cold Spring Harbor Laboratory Press

63. Walker, F.O., Huntington's disease. Lancet, 2007. 369(9557): p. 218-28.

64. Wareski, P., et al., PGC-1{alpha} and PGC-1{beta} Regulate Mitochondrial Density in Neurons. J Biol Chem, 2009. 284(32): p. 21379-85.

65. Williams LE, Wernegreen JJ. Sequence context of indel mutations and their effect on protein evolution in a bacterial endosymbiont // Genome Biol Evol. - 2013. - Vol. 5. - P. 599-605

66. Woo TU, Pucak ML, Kye CH, Matus CV, Lewis DA. Peripubertal refinement of the intrinsic and associational circuitry in monkey prefrontal cortex. Neuroscience . 1997 Oct 1 ; 80(4):1149-58.

67. Woo TU, Walsh JP, Benes FM. Density of glutamic acid decarboxylase 67 messenger RNA-containing neurons that express the N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2A in the anterior cingulate cortex in schizophrenia and bipolar disorder. Arch Gen Psychiatry . 2004 Jul 1 ; 61(7):649-57.

68. Yang YK, Yu L, Yeh TL, Chiu NT, Chen PS, Lee IH. Associated alterations of striatal dopamine D2/D3 receptor and transporter binding in drug-naive patients with schizophrenia: a dual-isotope SPECT study. Am J Psychiatry. 2004 Aug;161(8):1496-8.

69. Zaitsev, A.V., et al., P/Q-type, but not N-type, calcium channels mediate GABA release from fast-spiking interneurons to pyramidal cells in rat prefrontal cortex. J Neurophysiol, 2007. 97(5): p. 3567-73.

70. Zhang, Y., et al., Alternative mRNA splicing produces a novel biologically active short isoform of PGC-1alpha. J Biol Chem, 2009. 284(47): p. 32813-26.

71. Nishioka et al. «DNA methylation in schizophrenia: progress and challenges of epigenetic studies» Genome Medicine 2012,

Размещено на Allbest.ru

Страница:


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.

© 2000 — 2023, ООО «Олбест» Все права защищены