Мониторинг онкологических заболеваний с помощью опухолевых маркеров

Размещено на http://www.allbest.ru/

мониторинг онкологических заболеваний с помощью опухолевых маркеров



Оглавление

Принятые сокращения и аббревиатуры

Введение

Глава I. Теоретическая часть. Обзор литературы

1.1 Историческая справка

1.2 Виды опухолевых маркеров

1.3 Использование опухолевых маркеров

Глава II. Материалы и методы

2.1 Иммуноферментный анализ

2.2 Радиоиммунный анализ

2.3 Методика определения простата-специфичного антигена

Глава III. Практическая часть

3.1 Мониторинг лечения рака предстательной железы с помощью простата-специфичного антигена

Заключение

Список литературы



Принятые сокращения и аббревиатуры

СЕА - карциноэмбриональный антиген. Онкомаркеры - опухолевые маркеры.

ЦНС - центральная нервная система.

HLA - человеческий лейкоцитарный антиген. ХГЧ - хорионический гонадотропин.

АФП - альфа-фетопротеин.

ПСА (PSA) - простатический специфический антиген. ИФА - иммуноферментный анализ.

РИА - радиоиммунный анализ.

РЭА - раковоэмбриональный антиген. ЖКТ -- желудочно-кишечный тракт. NSE - нейрон - специфическая енолаза. OPN - остепонтин.

ИК -- иммунный комплекс.

ДЛТ -- дистанционная лучевая терапия. СОД -- суммарная очаговая доза.

ТРУЗИ -- трансректальное ультразвуковое исследование. ELISA - enzyme linked immunosorbent assay.

ОП - оптическая плотность.

ГОСТ - государственный стандарт.



Введение

Современные знания и исследования в области биохимии не только помогли сформировать и повсеместно применять в клинической практике лабораторные методы исследования биоматериалов с целью диагностики

и предупреждения многих опасных, ранее смертельных, заболеваний, но и сделали лабораторные биохимические исследования универсальным и важным инструментом для врачей различной квалификации.

Биохимия -- фундаментальная дисциплина, основанная на анализе и изучении химических процессов в живом организме, несомненно является фундаментом современной медицины, составляя ее теоретическую основу. Далеко не каждый человек в условиях современного ритма жизни обращается к врачу-специалисту, чувствуя недомогание или болевые ощущения. Часто это списывается на усталость, тяжелые нагрузки, экологию. Современные биохимические технологии позволяют при помощи лабораторной диагностики проанализировать общее состояние здоровья человека и выявить его слабые стороны или скрытые заболевания. Сотни заболеваний могут иметь сходную симптоматику, но часто именно изменение определенных биохимических показателей позволяет установить диагноз или значительно упростить дифференциальную диагностику. Каждый врач обязан получить полные и объективные сведения о здоровье пациента, всесторонне охарактеризовать морфологическую основу патологического процесса, спрогнозировать развитие заболевания. Чтобы это вс? было возможно, нужно разбираться в реальных диагностических возможностях каждого лабораторного и инструментального исследований.

Лабораторные методы диагностики -- вспомогательные методы, позволяющие оценить состав и специфику биологического материала, сформировать и выявить критерии показателей, показывающих на патологический процесс и даже указать на возможную область его локализации. Это вс? значительно упрощает работу врача, позволяет контролировать процесс лечения и экономит время на поиски, позволяет контролировать эффективность выбранного препарата, или метода лечения.

В ряде случаев, когда симптомы неявные или вовсе отсутствуют, или же заболевание только начало развиваться, лабораторная диагностика оказывает решающее значение при постановке правильного диагноза.

В проведении биохимических исследований важны также и вопросы подготовки пациента, правила и техника сбора биоматеривала, правильная его маркировка, условия получения и транспортировки, соблюдение правил методик исследований и верная калибровка приборов.

Настоящая выпускная квалификационная работа посвящена очень важному сейчас методу лабораторной диагностики -- анализу крови на онкомаркеры. В современной практике клинических исследований данный метод получил широкое распространение как для выявления онкологических заболеваний, так и в качестве в качестве профилактических мер. Состояние экологии, наследственность, условия труда (вредное производство), общее истощение иммунитета, постоянные стрессы и облучения, вредные продукты, вс? это привело к увеличению числа онкологических больных. Онкология молодеет, вс? больше первично выявленных пациентов приходится на молодое население, и часто именно вовремя проведенная биохимическая диагностика указывает на заболевание или предрасположенность к нему. А это уже серьезный повод позаботиться о своем здоровье и совершить поход к специалисту-онкологу.

На 2014 год заболеваемость онкологическими заболеваниями стремиться к 3 млн. человек. ( Реброва, 2002). Наиболее подвержены новообразованиям такие структуры организма как:

Кожа -- 16%;

Молочная железа -- 14%; Трахея, бронхи и легкие -- 12%; Желудок -- 8,1%; Предстательная железа -- 6,1%;

Лимфатическая и кровеносная система -- 5,2%.

Анализ крови на онкомаркеры -- специфический метод исследования. Те или иные отклонения в результатах дают безоговорочный повод для более широкой диагностики даже на ранних стадиях заболевания, когда не появляется еще явной симптоматики, а вовремя предложенное лечение и его контроль дает возможность избежать тяжелых последствий и даже летального исхода у многих пациентов. Практические рекомендации, выработанные врачом на основании исследований могут улучшить качество жизни пациентов и влиять на развитие болезни.

Цель настоящей выпускной квалификационной работы заключается в выявлении специфических онкомаркеров при биохимическом исследовании крови пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями различной локализации и мониторинг течения заболевания с их помощью.

Задачи настоящей выпускной квалификационной работы включают в себя:

- изучение биохимии онкомаркеров ;

- изучение основных и некоторых специфичных показателей онкомаркеров в крови пациентов ;

- выявление особенностей онкомаркеров;

- исследование методики проведения лабораторной диагностики на онкомаркеры;

- анализ показателей и специфичности онкомаркеров у пациентов, страдающих онкологическим заболеванием с целью выявления отклонений и мониторинг течения заболевания.

Для анализы показателей и специфичности онкомаркеров, в ходе выполнения выпускной квалификационной работы, были взяты лабораторные отчеты пациентов выполненные на базе научно- исследовательского института, в оборудованной лаборатории, выполненные в ходе участия в клиническом исследовании.

Персональные данные всех пациентов в целях соблюдения конфиденциальности скрыты. Все методы клинико-лабораторной диагностики организованы в соответствии со всеми международными стандартами и требованиями.



Глава I. Теоретическая часть. Обзор литературы

1.1 Историческая справка

Опухолевые маркеры (онкомаркеры) -- важная составляющая для комплекса диагностики, проводимого в онкологии. Обнаружение онкомаркеров в биоматериале позволяет заподозрить наличие онкологического заболевания на ранней стадии его развития, проводить масштабные скрининговые исследования и пристально следить за динамикой болезни в процессе е? лечения. Метод исследования на опухолевые маркеры не является окончательным. При выявлении повышенного уровня одного из опухолевых маркеров, необходимо проводить и дополнительные исследования для постановки верного диагноза.

Впервые, данная методика успешно была применена доктором Джозефом Голдом (Joseph Gold) в 1965 году. Голд выявил в крови пациентов, с диагностированным раком толстой кишки вещество, которое было названо карциноэмбриональный антиген (CEA). Уже к концу 1970 года были разработаны специальные методики и тесты для выявления нескольких видов рака. Новым опухолевым маркерам присуждались нумерованные названия -- СА19-9 для рака прямой кишки и поджелудочной железы, СА15-3 -- для рака молочной железы, СА125 -- для рака яичников. (Назаренко, 2006).

С уверенность заговорили о том, что онкомаркеры -- это специфические белки, которые вырабатываются раковыми клетками в большом количестве.

Такое утверждение стало возможным, благодаря исследованиям, проведенным учеными Г. И. Абелевым и Л.А. Зильбером. Гарри Израилевич и Лев Александрович, обнаружив опухолевые маркеры стали склоняться к тому, что выявили антигенные белки вируса, который вызвал маниглизацию клеток печени. Однако, изучив структуру белка, Зильбер и Абелев были озадачены тем фактом, что маркером рака печени был альфафетопротеин -- белок, который содержится в крови в небольшом количестве (до 15 нг/мл). После их успешного исследования, в Европе начался настоящий ажиотаж по применению методики определения онкомаркеров в крови. Начался совершенно новый виток развития диагностики в онкологии. В современной медицинской практике используется около 20 онкомаркеров, не смотря на то, что определено их было значительно больше. Но наибольшую эффективность сохраняют за собой не более 20, обладающие достаточно высокой специфичностью, успешно превосходя остальные по статистике.

В 1988 году в Стокгольме, на 5-й Международной конференции по опухолевым маркерам человека было использовано следующее, дополненное, определение: «Биохимические опухолевые маркеры -- это вещества, образуемые опухолевыми клетками и секретируемые в биологические жидкости, в которых они могут быть количественно определены неинвазивными методами». ( Реброва, 2002).

К опухолевым маркерам относят достаточно большую группу факторов, концентрация которых в сыворотке крови изменяется в зависимости от развития злокачественного процесса. Онкомаркеры представляют собой макромолекулы, в основном белковой природы, с углеводным или липидным компонентом. От соединений, которые обычно продуцируются нормальными клетками, отличаются качественно (опухолеспецифичные) или количественно (могут быть ассоциированные с опухолью, но присутствовать и в нормальных клетках). Онкомаркеры могут формироваться внутри или на поверхности злокачественных измененных клеток, или же в результате индукции образоваться в нормальных клетках. Часть опухолевых маркеров секретируется в кровь, благодаря чему и можно определить их концентрацию методом иммуноферментного анализа.

1.2 Виды опухолевых маркеров

Существует такое понятие, как «идеальный маркер». Опухолевые маркеры, которые соответствовали бы «идеальному маркеру» должны отвечать следующим характеристикам:

1. Клиническая специфичность на уровне 100%. В этом случае онкомаркеры определяются только при злокачественности процесса, и отсутствуют при доброкачественности процесса или у здоровых людей.

2. Клиническая чувствительность на уровне 100%. В этом случае злокачественность процесса определяется уже на очень ранних стадиях.

3. Концентрация опухолевых маркеров в сыворотке крови коррелирует с размером опухоли, прогнозом и стадией заболевания.

4. Отражена гетерогенность опухоли.

5. Наличие короткого периода полужизни, для того, чтобы онкомаркер быстро отражал эффективность лечения.

6. Время опережения, предоставленное для ранней диагностики и раннего лечения.

При различных локализациях злокачественных опухолей существует огромное количество различных классов веществ, которые могут рассматриваться как опухолевые маркеры. ( Дарьялова, 1993).

К таким веществам относятся:

1. Ассоциированные с опухолью антигены или антитела к ним.

2. Гормоны.

3. Ферменты.

4. Продукты обмена -- креатин, гидроксипролин, полиамины.

5. Белки плазмы -- ферритин, церулоплазмин, в2-микроглобулин, цитокины, молекулы адгезии, металлопротеиназы.

6. Маркеры клеточного цикла, апоптоза.

7. Деградация клеточного матрикса.

В современной биохимии нет ни одного опухолевого маркера, который соответствовал бы идеальным параметрам. В клинической практике сейчас используются около двух десятков онкомаркеров, которые обладают достаточной диагностической значимостью, и являющихся рекомендованными к использованию экспертами. Но даже подобные рекомендации часто являются достаточно противоречивыми в частных случаях. В своей работе я рассмотрю и проанализирую наиболее диагностически значимые опухолевые маркеры. Чаще всего в лабораторной диагностике применяются:

в2-микроглобулин

в2-микроглобулин -- является идентичным легкой цепи белков HLA и обнаруживается на поверхности эпителиальных клеток, макрофагов, лимфоцитов. Как свободный, так и связанный в2-микроглобулин в норме в биологических жидкостях обнаруживается лишь в незначительных количествах. Именно по этой причине в2-микроглобулин следует использовать для подтверждения диагноза и мониторинга пациентов с такими заболеваниями, как множественная миелома или неходжкинские лимфомы. Увеличение его концентрации зависит от стадии заболевания, степени злокачественности опухолевого образования и типа клеток опухоли. У пациентов с прогрессирующим течением заболевания концентрация в2-микроглобулина значительно выше, чем у пациентов в период стабилизации процесса. Высокий уровень белка почти всегда коррелирует с плохим прогнозом. Кроме того, у пациентов, с диагностированной лейкемией повышение уровня в2-микроглобулина в спинномозговой жидкости может свидетельствовать о вовлечении в патологический процесс ЦНС. Уровень в2-микроглобулина возрастает и при различных аутоиммунных заболеваниях, а также при нарушениях клеточного иммунитета, после трансплантации органов, и в данном случае тест на опухолевые маркеры применим для наблюдения за состоянием таких пациентов.

Хорионический гонадотропин, свободная в-субъединица (ХГЧ)

ХГЧ -- гормон, который в своем составе имеет две субъединицы, из которых наиболее специфичной является именно в-субъединица. В норме ХГЧ образуется в синцитиотрофобласте плаценты, и обнаруживается при применении стандартной лабораторной диагностики в сыворотке крови беременных женщин через 6-10 дней после оплодотворения. Количество ХГЧ нарастает до конца первого триместра, а затем падает. У мужчин и небеременных женщин повышение уровня ХГЧ является достоверным показателем наличия злокачественного процесса.

Тест ХГЧ рекомендуется для диагностики и выявления, а также мониторинга эффективности терапии и раннего выявления рецидивов трофобластических опухолей, хориокарцином яичника и плаценты, хориоаденом, семином. Повышение уровня ХГЧ также типично для злокачественных процессах в ЖКТ, у небольшого процента больных раком легкого, и на поздних стадиях онкологии толстой и прямой кишки. Наиболее высокая концентрация наблюдается при наличии хорионэпителиоме. Следует также учитывать, что гемолиз или липемия могут значительно завышать результаты теста.

Альфа-фетопротеин

Альфа-фетопротеин -- это гликопротеин, состоящий из 591 аминокислоты и содержащий 4% углеводов, кодируется на хромосоме 4q11-q13. В норме альфа-фетопротеин продуцируется в период гестации в печени плода и желточном мешке. Обнаруживают гликопротеин в сыворотке плода, начиная с четвертой недели беременности, с пиком роста к 25 неделе.

Затем уровень альфа-фетопротеина снижается вплоть до рождения.

В лабораторной диагностике рекомендовано устанавливать референсные пределы для каждого используемого метода и локальной популяции, так как наблюдаются отклонения в результатах.

Определение альфа-фетопротеина необходимо проводить для выявления, мониторинга течения процесса и эффективности проводимой терапии при первичной гепатоцеллюлярной карциномы, гермином, выявления пороков развития плода и мониторинга беременности. Повышение концентрации альфа-фетопротеина в сыворотке крови может определяться непосредственно у больных с опухолями из зародышевого эпителия (тератомы яичка или яичника). Необходимо учитывать, что уровень белка повышается при гепатитах, что приводит к искажению картины теста.

Раково - эмбриональный антиген

Раково - эмбриональный антиген представляет собой гликопротеин с высоким содержанием углеводов, вырабатываемый в тканях пищеварительного тракта эмбриона и плода. Определяется в сыворотке крови плода, кроме крови беременных женщин. Его синтез подавляется после рождения и антиген практически не выявляется ни в крови, ни в других биологических жидкостях здоровых взрослых людей. При развитии опухолей, разных по своей локализации, уровень раково- эмбрионального антигена повышается и с достаточно высокой точностью отражает состояние злокачественного процесса. Повышение его наблюдается при карциномах пищеварительного тракта, при раке легких, раке молочной железы, раке головы и шеи, онкологии соединительнотканного происхождения. В лабораторной диагностике есть рекомендации совместно определять с различными органоспецифическими онкомаркерами. Для получения более конкретного диагностического ответа. (Vrkondi, 2001).

Раково-эмбриональный антиген является белком острой фазы, именно поэтому подниматься его уровень может у больных с аутоиммунными, инфекционными, острыми и хроническими воспалительными заболеваниями. А также при циррозе, хронических гепатитах, эмфиземе легких, туберкулезе, пневмонии, бронхитах и т. д. Незначительное повышении наблюдается у людей страдающих никотиновой зависимостью. Однако стоит заметить, что скорость роста показателей в этих случаях вс? же значительно уступает росту показателей при онкологии, что вс? же ставит метод как достаточно точный.

Антиген СА 125

Антиген СА 125 идентифицирован был в 1981 году группой ученых (Bast et al) при помощи мышиных антител в линии клеток пациентки с серозной карциномой яичников. Это муцин. Кодируется геном MUC16, и содержит несколько тандемных поворотов на N-концевом участке молекулы и сайтом фосфорилирования тирозина на C-конце. (Mernik, 2003).

У женщин различных рас, были замечены и зарегистрированы значительные колебания СА 125 (у африканок и азиаток концентрация СА 125 ниже).

Опухолевый маркер не обладает строгой специфичностью для рака яичников, его уровень может быть повышен и при процессах других локализаций, примерно в 28% случаев. Большинство случаев -- доброкачественные процессы (эндометриоз, острый или хронический сальпингит, миома матки, цирроз, хронические гепатиты, почечная недостаточность). Возможно повышение концентрации и в течении менструального цикла у женщина (1-2%) в фолликулярной фазе, и даже при травмах брюшной полости. Колебания концентрации были зарегистрированы и при беременности (первый триместр). (Реброва, 2002).

Определение концентрации СА 125 в сыворотке крови необходимо проводить перед процедурой ЭКО, для выявления группы риска по раку яичников и корректировки проведения ЭКО.

СА 15-3

В основном СА 15-3 используется для мониторинга и диагностики возможных рецидивов при онкологии молочной железы. Иногда регистрируются случаи повышения концентрации онкомаркера при циррозе, гепатите, аутоиммунных расстройствах и доброкачественных процессах молочной железы и яичников. При других процессах, как карцинома яичников, эндометрия, повышение концентрации опухолевого маркера СА 15-3 может наблюдаться уже на поздних стадиях заболевания.

СА 19-9

Опухолевый маркер СА 19-9 - это карбогидратный антиген групп крови Lewis (по фамилии исследователя. Который открыл антигены) и в норме присутствует всегда на мембране лейкоцитов. Молекула отвечает за адгезию лейкоцитов к эндотелию сосудов и соответственно выход клетки к очагам воспаления. Если происходит гиперэкспрессия СА 19-9 клетками, то это всегда приводит у увеличению их злокачественного потенциала, происходит это за счет большей способности к метастазированию. Не экспрессирует Lewis антигены около 5-10% населения. И в этом случае опухолевых клеток антигена не будет вообще на мембране. В лабораторной диагностике СА 19-9 применяют для обнаружения и мониторинга лечения опухолей поджелудочной железы, желудка, прямой и толстой кишки. (Реброва, 2002).

СА 19-9 из организма выводится только с желчью. Именно поэтому холестаз (даже незначительный) может привести к повышению концентрации онкомаркера в крови. Воспалительные процессы и доброкачественные образования ЖКТ и печени также могут влиять на концентрацию СА 19-9 и приводить к неточным показаниям теста.

Простата-специфичный антиген

Простата-специфичный антиген в клинической лабораторной диагностике определяется как общий и как свободный (ПСА, свободный ПСА). ПСА -- гликопротеин, который секретируется клетками эпителия канальцев предстательной железы. Относится он к группе калликреиновых сериновых протеаз и является химотрипсинподобной гликопротеазой. Действием андрогенов контролируется синтез белка. Контроль синтеза идет через рецепторы эпителиальных клеток протоков предстательной железы простаты. Считается, что андрогены регулируют непосредственно транскрипцию гена ПСА. В кровяное русло поступает непосредственно синтезируемый ПСА, и находится в кровяном русле в свободном и связанном состояниях. (Dey, 2004)

В лабораторной диагностике, онкомаркер применяется для обнаружения и мониторинга лечения рака простаты. Следует учитывать, что ПСА в норме изменяется с возрастом (увеличивается). Увеличение концентрации может повышаться после диагностических процедур (пальцевое ректальное исследование, цистоскопия, колоноскопия, лазерная терапия, тепловые процедуры, биопсия). В таких случаях забор крови на ПСА следует проводить через 5-6 дней после проведения сторонних диагностических манипуляций. Также следует выждать несколько недель после воспалительный процессов мочеполовых путей, инфекций и простатита.

Нейрон-специфическая енолаза (NSE)

NSE - гликолитический нейрон-специфический изофермент енолазы. Фермент присутствует в клетках нейроэктодермального происхождения, в периферической нервной ткани, и также в клетках головного мозга.

Название опухолевого маркера связано с тем, что именно в нейронах впервые была выявлена экспрессия NSE, позже экспрессия опухолевого маркера была зафиксирована в нейроэндокринных клеток или злокачественных опухолях, происходящих из этих клеток.

Енолаза катализирует взаимное превращение 2-фосфоглицерата и фосфоенолпирувата в гликолитическом пути и также участвует в становлении высокоэнергетической фосфатной связи. Известны димерные изоферменты, среди которых есть димеры бг и гг, которые как раз и известны как NSE.

В клинических исследованиях NSE применяется для диагностики и мониторинга лечения при нейробластомах. Увеличение концентрации опухолевого маркера в сыворотке крови наблюдается при развитии опухолей нейроэктодермального или нейроэндокринного происхождения, при лейкозах, после проведенной рентгенотерапии, рентгеновского обследования и лучевой терапии. При доброкачественных заболеваниях легких уровень NSE также повышен. При проведении исследования, следует помнить, что фермент содержится в тромбоцитах и эритроцитах, и значит, что гемолиз может значительно завышать результаты теста, и необходимо проводить центрифугирование не позднее, чем через час после взятия пробы.

По данным европейских исследователей, уровень NSE можно исследовать не только в крови, но и в спинномозговой жидкости. При повреждениях ЦНС или наличии специфических заболеваний, в ликворе (цереброспинальная жидкость, постоянно циркулирующая в ликворопроводящих путях и в желудочках головного мозга) сильно повышается уровень фермента. Например, при эпилепсии результат теста будет искажен.

Остеопонтин (OPN)

OPN - белок костной ткани, который является секреторным сиалопротеином, и имеет в своем составе RGD - последовательность, которая отвечает за взаимодействие с рецепторами интегринов, и участвует в связывании остеокластов на поверхности кости. Это кислый связывающий кальций гликофосфопротеин, который обнаруживается во всех биологических жидкостях, а также в межклеточном матриксе.

Первоначально опухолевый маркер был описан как белок, ассоциированный с клеточной трансформацией. Играет очень важную роль в процессах онкогенеза и метастазирования. Повышение уровня онкомаркера указывает на рак легких, рак молочной железы, рак простаты, рак яичников, рак пищевода, и некоторые другие виды онкологии. С связи с секреторностью белка возможно его определение методом ИФА в плазме.

НЕ4

НЕ4 -- является секреторным белком 4 эпидидимиса человека. Относится к группе ингибиторов протеиназ. Биологические функции НЕ4 не изучены. Предполагают, что он обладает антипротеазной активностью, но при этом протеаза-мишень неизвестна , и в нормальном эпидидимисе он вовлечен в созревание спермы. Существует также предположение, о антимикробной и противовоспалительной активности белка.

НЕ4 экспрессируется в нормальном эпителии репродуктивных органов, верхних дыхательных путей и поджелудочной железы. Повышение концентрации белка выявляется при эндометрии, опухолях яичников, в некоторых случаях при аденокарциноме легких. Уже на ранних стадиях опухоли яичников наблюдается повышение уровня белка. (Степанова, 2011).

Неоптерин

Повышение концентрации неоптерина выявлена при опухолях различной локализации: новообразования ЖКТ, рак легких, рак печени, опухоли системы крови (острые и хронические лейкозы, миелома, лимфогранулематоз, неходжкинская лимфома), онкология репродуктивных органов (рак тела шейки матки, мочевого пузыря, предстательной железы, яичников), рак молочной железы, опухоли головного мозга. (Богова, 2008).

Неодинакова диагностическая чувствительность теста на неоптерин, и при одних видах онкологии может достигать 100% (на поздних стадиях заболеваний крови), тогда как при раке молочной железы только 20%.

Применяется в лабораторной диагностике как дополнительный опухолевый маркер, наравне со специфичными онкомаркерами. Увеличение концентрации неоптерина обычно указывает не на наличие процесса, а на его прогрессирование, метастазирование или прогностическим показателем летального исхода (выявляется за полгода до смерти пациента).

Соматостатин

Соматостатин -- является пептидом, состоящим из 14 аминокислот. Был обнаружен в гипоталамусе, поджелудочной железе, кишечнике и слизистой желудка. Доказано, что служит мощным ингибитором гипофизарных, панкреатических и гастроинтестинальных гормонов, но тем не менее обладает и другими, не эндокринными функциями. Очень быстро распадается в крови (период полужизни 1-4 мин.) Некоторые онкологические заболевания сочетаются с высоким уровнем соматостатина в плазме. Уровень соматостатина повышен при соматостатиноме, раке щитовидной железы (медуллярном). (Степанова, 2011)

Известно и множество других опухолевых маркеров, но они не представляют собой интереса, из-за низкой специфичности и чувствительности и являются не основными, а уточняющими.

1.3 Использование опухолевых маркеров

В современных клинических исследованиях опухолевые маркеры это действенный и широко применяемый инструмент ранней диагностики онкологии. Но не стоит забывать, что на данный момент, ни один из известных онкомаркеров не обладает должной чувствительностью и специфичностью настолько, чтобы рекомендовать его для однозначного использования.

По этой причине на опухолевые маркеры неохотно применяют для проведения скрининга на наличие опухоли в общей популяции. Только в некоторых странах, существуют скрининговые программы для выявлении онкологии, относительно часто встречающейся для данного региона.

Примером может послужить скрининг нейробластомы в Японии, который проводится у детей младше года с помощью определения ванилилминдальной и гомованилиловой кислот. В Китае проводится скрининг гепатоклеточной карциномы онкомаркером альфа- фетопротеином.

Эффективное использование опухолевых маркеров отмечено в диагностике. Такое применение является выгодным экономически, и является грамотно подобранным дополнением к ряду других диагностических процедур. В дифференциальной диагностике онкологических заболеваний могут применяться и комбинации нескольких онкомаркеров, что позволяет выявить как локализацию опухоли, так и течение процесса метастазирования.

Большое значение онкомаркеры имеют при проведении мониторинга. Оценка эффективности лечения, правильности проводимой химиотерапии и прогнозирование необходимы для своевременной корректировки лечения и наиболее благоприятного результата. Именно мониторинг при помощи онкомаркеров помогает оценить результативность лечения ещ? задолго до появления критических ситуаций.



Глава II. Материалы и методы

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины. Индикация образующегося комплекса «антиген- антитело» может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико- химическим методом. Удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флюоресцентные, парамагнитные и другие метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз.

В настоящее время при определении опухолевых маркеров используют два метода проведения анализа -- иммуноферментный анализ и радиоиммунный анализ.

опухолевый маркер иммуноферментный рак

2.1 Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) - современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни. Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).

2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.

3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:

1) Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя. На чем основан метод ИФА.

Выделяют несколько разновидностей ИФА (прямой, непрямой, метод блокирования, конкурентный), однако на практике чаще всего используется гетерогенный твердофазный иммунный анализ или ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген- антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител. (Назаренко, 2006).

Суть метода ИФА

Простым языком этот процесс можно разделить на несколько этапов:

1) На поверхности лунок планшета доктора, проводящего обследование, находится очищенный антиген определенного возбудителя. При добавлении биологического материала (сыворотки крови) пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Это соединение будет выступать «особым антигеном» в следующем этапе.

2) На данном этапе идет образование ИК (иммунных комплексов) - реакция между «особым антигеном» и конъюгатом (это иммуноглобулин, меченый ферментом пероксидазой). Добавляется особый хромоген.

Результатом такой ферментативной реакции является образование окрашенного вещества в лунке планшета, интенсивность окраски которого зависит от количества содержащихся в материале пациента иммуноглобулинов (антител).

3) Далее происходит оценка результата: фотометрирование с помощью многоканального спектрофотометра, сравнение оптической плотности исследуемого материала с оптической плотностью контрольных проб, математическая обработка результатов. Количество антител у пациента напрямую зависит от высоты оптической плотности данной лунки.

Обычно на практике используют 96 луночные планшеты.

При измерении оптической плотности (ОП) исследуемой жидкости подсчитывается количество (или концентрация) антител в определенной единице объема. Затем результат сравнивается с контрольным образцом. (Корнеев, 1996).

Для каждой тест-системы разрабатываются индивидуальные показатели для учета результатов, показатели нормы и патологии (то есть «референтные значения»). Это нужно учитывать при оценке результатов каждого конкретного исследования. Некорректно интерпретировать результаты одной лаборатории по «референтным значениям» другой лаборатории. Также некорректно сравнивать результаты разных лабораторий между собой.

При постановке реакций ИФА имеет значение и такое понятие как авидность антител.

Авидность антител - это прочность связи антитела с антигеном и то количество антигена, находящегося во взаимосвязи с иммуноглобулинами (антителами). Авидность имеет большое значение при оценке предполагаемого срока инфицирования, что чрезвычайно важно при диагностике первичного инфицирования у беременных.

Основа теста на авидность антител состоит из обработки иммунного комплекса (антиген-антитело) раствором мочевины с целью разрушения белка. Высокоавидные связи остаются целыми, а низкоавидные разрушаются. Результат выдается в виде индекса авидности, выражаемого в процентах (%).

Материал для ИФА анализа и правила его забора

Наиболее распространенный материал для реакции ИФА - это сыворотка крови пациента, взятая натощак. Материалом также могут служить спинномозговая жидкость, околоплодные воды, содержимое стекловидного тела, слизь цервикального канала и уретры, мазки.

Подготовка пациентов к сдаче материала для ИФА

Кровь забирается натощак. Перед сдачей крови не нужно принимать никакие препараты. Специфическое лечение (антибактериальное, противовирусное, противопаразитарное и прочее) нужно прекратить не менее, чем за 2 недели до исследования.

2.2 Радиоиммунный анализ

Радиоиммунный анализ (РИА) -- метод количественного определения биологически активных веществ (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Для метки антител или антигенов чаще всего используют изотоп йода 1251, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность.

Для радиоиммунного анализа выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого- либо одного вещества.

Исследование проводят в несколько этапов:

1) смешивают биологический материал с реагентами,

2) инкубируют смесь в течение нескольких часов,

3) разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество,

4) осуществляют радиометрию проб,

5) рассчитывают результаты.

Радиоиммунный анализ обладает высокими чувствительностью и специфичностью.

Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

2.3 Методика определения ПСА

На данный момент наиболее ценным опухолевым маркером, исследование которого в сыворотке крови необходимо для диагностики и наблюдения за течением гиперплазии и рака предстательной железы является простата- специфический антиген. Начиная с 1987 г. ПСА широко используется в диагностике рака простаты, установлении стадии процесса, оценке эффективности лечения. Параметры, оцениваемые этим тестом, показывают чувствительность до 70% и положительную прогностическую ценность от 26 до 52%. Ценность этого метода заключается в его простоте, объективности, воспроизводимости, малой инвазивности и низкой стоимости по сравнению с ультразвуковым исследованием. Определение ПСА увеличило частоту выявления рака простаты на ранних стадиях, при которых возможно радикальное излечение.

Для лабораторных исследований биоматериала на опухолевые маркеры применяются определенные методики, регламентированные иностранными компаниями-производителями и одобренные министерством здравоохранения. Обязательна сертификация ГОСТ. В данной работе я рассмотрю методику лабораторной диагностики простата-специфического антигена. Выбор связан со спецификой дальнейшего исследования и с актуальностью проблемы рака предстательной железы. Среди всех известных онкомаркеров, ПСА занимает одно из первых мест по чувствительности, специфичности и частоты обращения пациентов.

При проведении лабораторного исследования, в специально оборудованной лаборатории, используется комплект тестов для проведения анализа «Элексис» total (free + complexed) PSA - Prostate- specific antigen (tPSA) (общий (свободный + комплексный) ПСА - Простата-специфический антиген (оПСА)) в заводской упаковке в количестве 100 шт. Диагностические тесты предназначены для работы на анализаторах: Elecsys 1010, Elecsys 2010, MODULAR ANALYTICS E170, cobas e 411, cobas e 601. Компания-производитель: Roche Diagnostics.

Диагностическая тест-система презназначена для количественного определения in vitro общего (свободный + комплексный) простата- специфического антигена (оПСА) в сыворотке и плазме крови человека. Тест-система вместе с мануальным ректальным исследованием предназначена для обнаружения рака простаты у мужчин в возрасте 50 лет и старше. Для диагностики рака простаты требуется биопсия простаты.

Анализ также используется для серийного измерения оПСА при мониторинге больных раком простаты.

Принцип метода:

Принцип сэндвича. Общая продолжительность анализа - 18 минут.

· 1-ая инкубация: 20 мкл образца, биотинилированное моноклональное ПСА-специфическое антитело и моноклональное ПСА-специфическое антитело, меченное комплексом рутения (комплекс трис(2,2`- бипиридил)рутения(II) (Ru(bpy)2+3)), взаимодействуют с образованием сэндвичевого комплекса.

· 2-я инкубация: после добавления покрытых стрептавидином микрочастиц комплекс связывается с твердой фазой путем взаимодействия биотина и стрептавидина.

· Реакционная смесь аспирируется в измерительную ячейку, где микрочастицы оседают на поверхность электрода вследствие магнитного взаимодействия. Затем удаляются несвязанные вещества с помощью ПроСелл. После этого приложенное к электроду напряжение вызывает хемилюминесцентную эмиссию, которая измеряется фотоумножителем.

· Результаты определяются с помощью калибровочной кривой, получаемой специальным для данного прибора способом калибровки по двум точкам, и референсной калибровочной кривой, получаемой со штрихового кода реактива.

Все реактивы имеют необходимые концентрации и содержание. Протоколы лабораторных исследований содержат таблицы с указанием этих концентраций, для проведения анализа.

Примеры приведены в таблице «Реактивы -- содержание и концентрации».

Реактивы - содержание и концентрации

M	Микрочастицы, покрытые стрептавидином (прозрачная крышка), 1 флакон, 6,5 мл: микрочастицы, покрытые стрептавидином, 0,72 мг/мл, консервант.
R1	Анти-ПСА Ab~биотин (серая крышка), 1 флакон, 10 мл: биотинилированное моноклональное анти-ПСА антитело (мыши) 1,5 мг/л; фосфатный буфер 100 ммоль/л, рН 6,0; консервант.
R2	Анти-ПСА Ab~Ru(bpy)2+3 (черная крышка), 1 флакон, 10 мл: моноклональные анти-ПСА антитело (мыши), меченное комплексом рутения, 1,0 мг/л, фосфатный буфер 100 ммоль/л, рН 6,0; консервант.



Меры предосторожности

Применять только для диагностики in vitro.

Соблюдать обычные правила предосторожности, необходимые при работе со всеми лабораторными реактивами.

Проводить удаление отработанных материалов в соответствии с установленными требованиями лаборатории.

Избегать образования пены со всеми типами реагентов и проб (образцы, калибраторы и контроли).

Хранение и стабильность

Хранить при 2 -- 8 °С.

Хранить набор реактивов «Элексиc общий ПСА» в вертикальном положении, чтобы обеспечить полную доступность микрочастиц во время автоматического смешивания реагента перед использованием.

Стабильность:

До вскрытия при 2 -- 8 °С:	до окончания указанного срока годности
После вскрытия при 2 -- 8 °С:	12 недель
на МОДУЛАР АНАЛИТИКС Е 170 или cobas e 601:	8 недель
На Элексис 2010 или cobas e411:	8 недель
На Элексис 1010:	4 недели (хранить поочередно в холодильнике и на анализаторе при температуре окружающей среды 20 -25 °С; до 20 часов суммарно в открытом виде)

Работа с реактивами

Реактивы в наборе собраны в готовом к употреблению виде и не должны разделяться.

Вся информация, необходимая для правильной работы, считывается автоматически со штрихового кода реактива.

Для оптимального проведения анализа важно следовать указаниям по работе с используемым анализатором и проверить, имеется ли в системе достаточный запас аналитических материалов и других расходных материалов.

Перемешивание микрочастиц перед использованием и считывание специфических для анализа параметров со штрихового кода реактива происходит автоматически. Нет необходимости в ручном вводе. Если в исключительных случаях невозможно считать штриховой код, ввести 15- цифровую последовательность чисел.

Для анализаторов MODULAR ANALYTICS E170 и cobas e 601 необходим PreClean М, - раствор для предварительной промывки.

Расчет результатов

Анализаторы автоматически рассчитывают концентрацию оПСА в каждом образце (в нг/мл или мкг/л).

Ограничения - интерференция

На анализ не влияют желтуха (билирубин < 1112 мкмоль/л или < 65 мг/дл), гемолиз (гемоглобин < 1,4 ммоль/л или < 2,2 г/дл), липемия (Интралипид < 1500 мг/дл) и биотин < 246 нмоль/л или < 60 нг/мл.

Критерий: открытие в пределах ± 10% начального значения.

У пациентов, получающих лечение высокими дозами биотина (а именно, > 5 мг/день), следует брать пробы не раньше, чем через 8 часов после последнего введения биотина.

Не обнаружено влияния ревматоидного фактора до 1500 МЕ/мл. Отсутствует эффект высокой дозы (hook effect) при концентрации оПСА до 17000 нг/мл.

Проведены тесты in vitro на 28 наиболее распространенных лекарственных препаратах. Влияния на результаты анализа при этом не обнаружено.

Диапазон измерения

Определены - 0,002 (Элексис 2010 или cobas e411), или 0,003 (МОДУЛАР АНАЛИТИКС Е 170 или cobas e601), или 0,00б (Элексис 1010) - 100 нг/мл (определено по значению чувствительности и максимальной точке референсной калибровочной кривой). Значения ниже чувствительности метода сообщаются как < 0,002 нг/мл, < 0,003 нг/мл или < 0,006 нг/мл.

Значения выше верхнего предела измерения сообщаются как > 100 нг/мл (более 5000 нг/мл для образцов, разведенных в 50 раз).

Разведение

Образцы с концентрацией оПСА, превышающей диапазон измерения, можно развести Элексис Универсальным Раствором для разведения проб. Рекомендуется разведение 1:50 (в автоматическом режиме на МОДУЛАР АНАЛИТИКС Е 170/Элексис 1010/ 2010 или cobas e или вручную). Концентрация ПСА в разведенном образце должна быть > 2 нг/мл. После ручного разведения необходимо умножить полученный результат на фактор разведения.

Ожидаемые значения

Ожидаемые значения для нормальных здоровых мужчин

а) В двух клинических центрах в Нидерландах и Германии с помощью набора «Элексис общий ПСА» проведен анализ сывороток от 244 здоровых мужчин различных возрастных групп. Полученные результаты приведены в таблице.

		оПСА (ng/mL - нг/мл)
Возраст (колич. лет)	N	Медиана	95% персентиль
< 40	45	0.57	1.4
40-50	42	0.59	2.0
50-60	107	0.75	3.1
60-70	41	1.65	4.1
> 70	9	1.73	4.4

б) Ниже представлено распределение результатов общего ПСА в группе из 395 нормальных здоровых мужчин в возрасте 50-94 лет (данные исследования в США).

Значения концентрации оПСА в таблице получены при использовании анализатора Элексис 2010.

		оПСА (ng/mL - нг/мл)
Возраст (колич. лет)	N	Медиана	95% персентиль
50-59	154	0.81	3.89
60-69	131	0.95	5.40
> 70	110	1.11	6.22

Точность метода зависит от компании-производителя диагностической системы, способа разведения реактивов, качества биоматериала сыворотки крови, состояния пациента (наличия или отсутствия воспалительных процессов и сопутствующих заболеваний).



Глава III. Практическая часть

3.1 Мониторинг лечения рака предстательной железы с помощью ПСА

Основной целью данной выпускной квалификационной работы является выявлении специфических онкомаркеров при биохимическом исследовании крови пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями различной локализации и мониторинг течения заболевания с их помощью.

Мониторинг течения онкологического заболевания был проведен мною среди тр?х случайно выбранных пациентов научно-исследовательского медицинского института, поступивших на лечение в разное время, различающихся по возрасту и стадии заболевания, но страдающих одним и тем же онкологическим заболеванием -- раком предстательной железы. Свойства простата-специфического антигена:

1) ПСА - гликопротеин клеток простаты, разжижающий эякулят

2) N < 4 нг/мл

3) Повышается при воспалительных процессах

4) Зависит от возраста

Границы показателей теста PSA:

Возраст	Среднее значение	Границы среднего	Рекомендуемый предел
40-49	0,7	0,5-1,1	2,5
50-59	1,0	0,6-1,4	3,5
60-69	1,4	0,9-3,0	4,5
70-79	2,0	0,9-3,2	6,5

Для проведения анализа на опухолевые маркеры, был произведен забор крови с дальнейшим проведением теста PSA free (ПСА общий) на анализаторе MODULAR ANALYTICS E170.

Для соблюдения врачебной тайны и конфиденциальности информации, личные данные пациентов не подлежат разглашению и в работе будут использованы только первые буквы инициалов фамилии, имени и отчества.

У всех рассматриваемых пациентов проводилась дистанционная лучевая терапия (ДЛТ), назначенная врачом-онкологом.

Дистанционная лучевая терапия - это разновидность лучевой терапии, когда источник облучения находится на определенном расстоянии от тела пациента. Пучок лучей входит в тело через определенный участок поверхности, который называют полем облучения.

Наиболее распространенный метод дистанционной лучевой терапии - гамма-терапия, которая проводится с помощью гамма-аппаратов.

Физической основой дистанционного облучение являются быстрые электроны и излучение высокой энергии. Лечение с помощью высокой энергии имеет свои преимущества - к опухоли можно подвести большую дозу облучения, при этом предохраняя от облучения здоровые ткани и уменьшая общую дозу облучения организма.

Для дистанционной лучевой терапии небольших опухолей, которые расположены в глубине организма (например, опухоли сетчатки, гипофиза) используют протоны и нейтроны. Благодаря нейтронам достигается большая плотность облучения. Этот эффект используется при лечении рецидивов злокачественных опухолей или при опухолях, которые малочувствительны к облучению.

Все методы дистанционной лучевой терапии могут быть статическими или подвижными. При статической лучевой терапии сам больной и источник облучения остаются неподвижными, облучение происходит через одно или несколько полей облучения. Этот метод сейчас применяют редко, так как он не позволяет подвести к опухоли нужную дозу облучения без повреждения кожных покровов.

Подвижная методика дистанционной лучевой терапии - это следствие развития технологий, передвижение источника облучения возможно по разным траекториям, которые обеспечивают наибольшую эффективность в каждом конкретном случае. Опухоль при этом поглощает максимальную дозу радиации, и одновременно наблюдается резкое падение дозы облучения окружающих тканей. Главный недостаток подвижных методик облучения - это облучение больших объемов тканей, чем при статическом.

Дистанционная лучевая терапия может применяться как самостоятельно, так и в комбинации с хирургическим лечением (до или после операции) или с химиотерапией. (Дарьялова, 1993).

Лучевая терапия проводится в условиях фиксированных суммарно очаговых доз (СОД).

Мониторинг лечения первого пациента К.Ю.А. в возрасте 53 лет, проводился на фоне лучевой терапии, с суммарно очаговой дозой 70Гр. При поступлении пациента в медицинский научно-исследовательский институт, и проведении лабораторного исследования сыворотки крови, было получено заметное повышение уровня PSA в биоматериале, что дало основание для проведения дополнительной диагностики. В рамках дополнительной диагностики были проведены: трансректальное ультразвуковое исследование (ТРУЗИ), первичная биопсия предстательной железы. Диагноз был подтвержден.

При получении лучевой терапии, состояние пациента наблюдалось как стабильное, ухудшения состояния не наблюдалось. Мониторинг ПСА проводился с целью подтверждения эффективности проводимого лечения и дал следующие результаты, приведенные в таблице 1, в соответствии с периодами получения терапии и контроля. После значительного превышения уровня ПСА, было зафиксировано резкое снижение показателя и его стабилизация.



Таблица 1.

Динамика изменений ПСА в крови больного К.Ю.А. после ДЛТ в СОД 70 Гр
Период лечения (мес)	Показатели ПСА в крови (нг/мл)
Исходный месяц	14,37
3	4,63
6	3,47
12	1,20
18	0,95
24	0,40
30	0,32
36	0,27

Устойчивое снижение показателя ПСА дало основание полагать, что лучевая терапия подействовала эффективно, лечение было проведено верно, пациент находится в состоянии ремиссии и может быть введен курс поддерживающей терапии.

Мониторинг лечения второго пациента Б.В.Е., в возрасте 69 лет, проводился на фоне проведения лучевой терапии, назначенной врачом- онкологом, в результате проведенного диагностического стандартного комплекса процедур. При поступлении пациента был проведен анализ, уровень ПСА при котором был значительно повышен. Проводилась лучевая терапия с суммарно очаговой дозой 70Гр. Данные по мониторингу лечения опухолевым маркером ПСА приведены в Таблице 2. При проведении лучевой терапии, уровень ПСА стал резко падать, что дало основание полагать, что лечение проходит эффективно. Однако, стойкой ремиссии не наблюдалось, и дальнейшие тесты указали на рост показателей ПСА. Коррекция лечения в виде изменения дозы лучевой терапии не помогла. Значительный рост показателей ПСА, который был зафиксирован, дал основание для неблагоприятного прогноза, а проведенные дополнительные исследования выявили ухудшение состояния пациента и прогрессирующий рост опухоли. Лечение было полностью изменено, откорректировано и в экстренном порядке введено в активный режим. На момент написания работы до следующей контрольной точки пациента остается два месяца (август 2016 года).

Введена химиотерапия тремя препаратами. Таблица 2.

Динамика изменений ПСА в крови больного Б.В.Е. после ДЛТ в СОД 70 Гр
Период лечения (мес)	Показатели ПСА в крови (нг/мл)
Исходный месяц	17,39
3	6,70
6	3,34
12	1,77
18	11,40
24	25,73
30	50,60

В данном случае мониторинг ситуации значительно упростил контроль за проводимым лечением и своевременно выявил его неэффективность.

Мониторинг третьего пациента, Р.Л.Н., в возрасте 72 лет, проводился на фоне курса комбинированной терапии, включающей в себя лучевую терапию, и лечение двумя химиопрепаратами. Основанием для начала лечения и выбранной схемы терапии были значительно повышенные показатели ПСА в сыворотке крови, и результаты ТРУЗИ. Диагностические мероприятия по взятию биопсии и гистологическое исследование подтвердили наличие опухоли предстательной железы.