Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени как метод выявления вируса свиного гриппа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени как метод выявления вируса свиного гриппа



Содержание

Сокращенные обозначения

Введение

Глава 1. ПЦР: история открытия, принцип действия, разновидности. Ортомиксовирусы

1.1 Открытие ПЦР

1.2 Метод ПЦР 11

1.2.1 Принцип метода ПЦР

1.2.2 Основные компоненты ПЦР

1.2.3 Разновидности ПЦР

1.2.4 Преимущества и недостатки ПЦР перед другими методами

1.3 Ортомиксовирусы

1.3.1 Антигенная изменчивость

1.3.2 Особенности вируса свиного гриппа H1N1

1.4 Противовирусный иммунитет

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Устройство ПЦР лаборатории

2.2 Регионы взятия образцов для анализов

2.3 Материал для исследования и проведение ПЦР-диагностики

Глава 3. Результаты исследований

3.1 Результаты ПЦР диагностики вируса свиного гриппа

3.2 Сравнение методов, применяемых при диагностики вируса свиного гриппа

3.3 Рекомендации по предотвращению заболевания гриппом

Заключение

Список литературы

Приложение

Размещено на http://www.allbest.ru/



Сокращенные обозначения

ВКО - внутренний контрольный образец

В- - отрицательный контроль РНК В+ - положительный контроль РНК кДНК - комплементарная ДНК ОКО - отрицательный контрольный образец

ОТ - обратная транскрипция ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПКО - положительный контрольный образец

ПЦР - полимеразная цепная реакция FEP - флуоресцентная детекция по «конечной точке»

FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора - Федеральное государственное учреждение науки «Центральный научно- исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека КОА - коагглютинация.

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

РАГА - реакция аггрегатгемагглютинации. РНаг - реакция нейтрализации антигена.

РНат - реакция нейтрализации антител.

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК-рибонуклеиновая кислота РП - реакция преципитации.

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации.

РИФ - реакция иммунофлюоресценции.

ИФА - иммуноферментный анализ. IgA - иммуноглобулин A.

IgM - иммуноглобулин M. IgG - иммуноглобулин G.

PCR или ПЦР - полимеразная цепная реакция.



Введение

Последние десятилетия отличаются неудержимым развитием в самых разных направлениях молекулярной биологии, медицинской генетики, биохимии, биофизики, и нанотехнологий, которые всё шире используются в современной науки.

Методы молекулярной биологии всё шире используется в клинической лабораторной диагностике. В ряду современных молекулярно-генетических технологий особое место занимают методы генодиагностики, среди которых выделяются нерадиоизотопный гибридизационный анализ (НГА) нуклеиновых кислот (НК), секвенирование НК и амплификационные методы, в частности, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), имеющий различные модификации: мультиплексный ПЦР, ПЦР в реальном времени (качественный или количественный анализ) и др. Следует отметить что, широкому распространению ПЦР сопутствовало развитие некоторых технологий, в частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментативная система выдерживает высокие температуры и сохраняет свою биологическую активность после нагревания до 100 градусов цельсия. Фундаментальный принцип молекулярной биологии, существование комплементарных взаимодействий между молекулами НК создаёт основу для разработки гибридизационных и ПЦР- технологий. Метод приобрёл такую популярность, что сегодня трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. Важное преимущество молекулярно-генетических диагностических методов - это возможность одновременной и независимой детекции нескольких различных нерадиоизотопных гибридизационных меток, проведение мПЦР или Рв-ПЦР с несколькими парами олигонуклеотидных праймеров и зондов, что позволяет обнаруживать в одном образце различные возбудители инфекционных заболеваний: микроорганизмы, грибы, вирусы.

Вирус гриппа является возбудителем острых респираторных заболеваний у человека и животных. Он принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Различают три группы вирусов, так называемые серовары (А, В и С). Принадлежность к каждой группе определяется типом нуклеопротеида. Поверхностные же антигены в каждой группе разнообразны, причем их структура часто меняется, особенно в группе А. А всего специалисты насчитывают более 2 тыс. вариантов сочетаний разных антигенов.

По антигенным вариантам поверхностных гликопротеидов гемагглютинина (Н) и нейраминидазы (N) выделяют разные штаммы вируса гриппа A. На сегодня известно 16 вариантов гемагглютинина и 9 вариантов нейраминидазы. Вирусы, вызывающие грипп у человека, обычно относятся к трем подтипам по гемагглютинину (Н1, Н2 и НЗ) и к двум подтипам по нейраминидазе (N1 и N2). Грипп типа A поражает широкий круг хозяев: птиц, людей, свиней, лошадей, морских млекопитающих.

Полное название вируса -- А/California/04/2009 (A/H1N1). После выделения вируса специалисты провели поиск наиболее близких его родственников в базе GenBank нуклеотидных последовательностей. Оказалось, что наибольшее сходство (95 %) по гену гемагглютинина он показал со штаммом вируса гриппа А/swine/Indiana/P12439/00(H1N2) -- типичным представителем североамериканской линии свиного гриппа, циркулирующей в США с 1999 года. Грипп свиней распространен в большинстве стран мира с развитым свиноводством. В большинстве случаев при заражении новым штаммом А/H1N1 заболевание протекает в легкой степени. В виду появления нового штамма вируса, иммунная система не способна быстро и оперативно справиться с защитой организма. Эпидемии гриппа привела к высокой смертности, которая варьировала среди разных возрастных групп и достигала максимума у детей до 5 лет, пожилых людей и лиц с хроническими заболеваниями органов дыхания и сердечно-сосудистой системы. Однако во время пандемии гриппа в 2009 г., вызванной так называемым «свиным гриппом» А/H1N1pdm2009 (или A/H1N1sw2009), наибольший уровень летальности отмечался среди лиц от 30 до 64 лет. К группе риска относились лица, страдающие ожирением, заболеваниями сердечно-сосудистой системы и беременные женщины.

В этих условиях разработка методов быстрой и высокоспецифичной диагностики гриппа свиней и появляющихся новых штаммов является крайне актуальной задачей.

Предлагаемый метод обнаружения вируса гриппа свиней основан на полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ). ПЦР-РВ сочетает в себе достоинства классической ПЦР (высокую чувствительность, специфичность, быстроту получения результатов) и одновременно обладает рядом преимуществ. Регистрация результатов реакции в режиме реального времени позволяет отказаться от электрофореза продуктов ПЦР, что сокращает продолжительность анализа и уменьшает вероятность ложноположительных результатов из-за контаминации исследуемых проб продуктами амплификации.

Методика основана на амплификации высококонсервативного фрагмента гена, кодирующего матриксный протеин M1 вируса гриппа свиней, и позволяет выявлять вирус гриппа A всех подтипов.

Целью дипломного исследования является обоснование использования метода ПЦР-РВ как предпочтительного метода для выявления вируса свиного гриппа.

Для достижения поставленной цели будет проделана работа по решению следующих задач:

Изучить историю открытия ПЦР и определить её значения в современных молекулярно-генетических диагностических технологиях;

Подробное изучить этапы проведения полимеразной-цепной реакции;

Выявить преимущества и недостатки метода ПЦР относительно других методов диагностики свиного гриппа;

Проанализировать результаты исследований и сделать выводы о распространённости вируса свиного гриппа среди разных возрастных групп населения Российской Федерации;

На основании результатов выявить возможность определения сезонной вспышки гриппа как эпидемии.

полимеразный вирус свиной грипп



Глава 1. ПЦР: история открытия, принцип действия, разновидности. Ортомиксовирусы

1.1 Открытие ПЦР

Появление полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало возможно с рядом научных открытий, связанных с открытием дезоксирибонуклеиновой кислотой и впоследствии дало толчок для бурного развития молекулярной биологии и разработки и усовершенствования методов. В процессе опытов с гнойными выделениями, Иоганном Фридрих Мишер исследовался химический состав выделенных из ядер лейкоцитов нуклеин. Он предполагал, что нахождение нуклеина возможно только в ядрах, и до конца его роль не была этим ученым установлена.

На сегодняшний день мы понимаем, что нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК)

представляют собой высокомолекулярные органические соединения (линейные биополимеры), образованные с помощью фосфорнодиэфирных связей между 5?- фосфатом одного нуклеотида и 3?- гидроксильной группой сахара соседнего нуклеотида, присутствующие во всех клетках всех живых организмов и выполняющие важнейшие функции по хранению, передаче и реализации наследственной информации. Вернувшись во времени назад, двое ученых Крик и Уотсон, основываясь на ранних исследованиях Чаргаффа, Уилкинса и Франклин, решили попытаться определить химическую структуру ДНК. Согласно модели Уотсона, сплетённые одна на другую цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин - с цитозином. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой (растущей) цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. Хотя ранее Лайнус Полинг, придумал спиралевидную модель строения ДНК, но она обладала недостатком: учёный неправильно связал фосфатные группы с основаниями ДНК.

По прошествии времени А. Корнбергом был открыт и выделен фермент ДНК- полимеразы и четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов. ДНК-полимеразы обеспечивают репарацию и репликацию ДНК.

Эти ферменты способны удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3'-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был гибридизован, т.е. связан с комплементарной цепью ДНК, которая называется матрицей. Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (они используются в качестве строительных блоков). Нуклеотид, который присоединяет ДНК-полимераза, комплементарен основанию в соответствующем положении матричной цепи. Многократно повторяя эту реакцию, полимераза способна удлинять 3'-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5'-конца матрицы. В ходе репарации и репликации двойной спирали ДНК каждая цепь служит матрицей для синтеза другой цепи.

Основные принципы ПЦР и состав реакционной смеси для получения копий ДНК впервые были описаны Хьеллем Клеппе с соавторами. Однако исследователями не была продемонстрирована главная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК.

Так же были произведены специальные ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, которые расщепляют ДНК в специфических точках. Исследователи получили возможность "разрезать" ДНК на более короткие и более стабильные фрагменты, которые просто идентифицировать. При этом стало проще выделять и изучать фрагменты ДНК с находящимися в них генами. А уже вначале восьмидесятых годов проблема с синтезом праймеров была разрешена благодаря разработке автоматических синтезаторов ДНК. В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы живущие там, где, как ранее считалась, жизни быть не должно. Это были бактерии Thermus aquaticus (Taq), содержащий термостабильную Taq-ДНК-полимеразу.

В 1983-1984 гг. К. Мюллис, предложив метод и проведя ряд экспериментов по разработке ПЦР, первый начал использовать Taq-ДНК-полимеразу вместо ранее использовавшейся неустойчивой к высоким температуры ДНК-полимеразы. Это позволило ускорить работы по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллис совместно с Ф. Фалуном разработал алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.

Сегодня метод ПЦР является жизненно важным инструментом во многих областях естественных наук, медицины и практической деятельности человека, в частности в клинико-лабораторной микробиологии. ПЦР - это метод амплификации ДНК, который произвел настоящую революцию в молекулярной биологии и имеет многочисленные и разнообразные применения. Методы ПЦР, используемых сегодня, являются почти исключительно на основе ПЦР в реальном времени, или технологии количественной ПЦР (кПЦР).

1.2 Метод ПЦР

1.2.1 Принцип метода ПЦР

В основе бесклеточного молекулярного клонирования лежит многоступенчатый циклический процесс репликации ДНК, включающий ряд последовательных этапов (стадий), составляющих трёхступенчатый цикл амплификации ДНК: денатурацию (расплетение двойной спирали и расхождение ДНК), отжиг праймеров и полимеризацию (элонгацию) цепей ДНК, протекающих при различных температурных режимах. Переход от одной стадии к другой достигается изменением температуры в инкубируемой смеси. Данный метод обеспечивает многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Taq-ДНК-полимеразой в условиях in vitro. Данный процесс происходит в пробирке в циклическом режиме контролируемого молекулярного копирования участков нуклеиновых кислот. Каждый цикл амплификации состоит из трёх этапов, протекающих при различных температурных и временных режимах. В начале при нагревании амплификационной смеси до 93-95 єС происходит термическая денатурация ДНК, в результате которой двухнитевые сегменты ДНК разделяются на отдельные цепи. Следующий этап - комплементарное присоединение (отжиг, гибридизация) праймеров к комплементарным последовательностям на противоположных цепях ДНК, на границах специфического участка (мишени). Отжиг протекает в соответствии с правилом комплементарности Чаргоффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина - цитозин. Если данное условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значение которой располагается в интервале 37-65 єС. Третий этап (элонгация) - комплементарное достраивание цепей ДНК, которое происходит от 5?-конца к 3?-концу цепи в противоположных направлениях, начинается с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит добавляемые в раствор дезоксидизоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом ДНК-полимеразой и происходит при температуре 70-72 С. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служит материалами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК-ампликон, размер которого ограничен праймерами. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. «Таким образом, в результате постановке бесклеточного молекулярного клонирования происходит экспоненциальное (в геометрической прогрессии) накопление специфических ампликонов в растворе по формуле



A=M•(2?-n-1)2 ,

где А - количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации; М - начальное количество ДНК-мишеней, а n - число циклов амплификации. Теоретически, в результате 20 циклов образуется миллион копий, в результате 30 циклов миллиард копий. Следует отметить, что во время первого цикла удлинение новой цепочке от праймера заканчивается произвольно».

Однако со второго цикла в смеси начинают накапливаются специфические продукты амплификации - ампликоны, которые ограничены двумя праймерами. На самом деле эффективность каждого цикла может быть менее 100 % (до 78-97). Если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30?40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона.1

1.2.2 Основные компоненты ПЦР

Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК- мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:

Быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, то высока вероятность, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить процессы неспецифического связывания, и синтеза фрагментов различной длины, отличных от искомых. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

Не должны образовывать димеры и петли, то есть не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига (комплементарного присоединения) праймеров самих на себя или друг с другом.

Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону, отжиг праймеров не происходит, и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат.

Taq-полимераза - термостабильный фермент, участвует в репликации второй цепи ДНК. Существует большое разнообразие полимераз и их использование зависит от целей, поставленных перед исследователем.

Смесь дезоксинуклеотдтрифосфатов (дНДФ) - дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Буфер - смесь катионов и анионов, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

Внутренние контроли - гетерологичный специфическому фрагменту ДНК, фланкированный специфическими праймерами. Является альтернативной матрицей ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации.

ДНК-зонды используются для детекции продуктов реакции.

Минеральное масло - вносится для предотвращения испарения ПЦР смеси.

1.2.3 Разновидности ПЦР

Конвенциональная ПЦР

В данном варианте постановки ПЦР идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

Данный вариант постановки ПЦР при использовании в качестве способа диагностики является качественным методом. Положительная реакция свидетельствует о наличии хотя бы следовых количеств искомых молекул ДНК в образце. Отрицательная реакция свидетельствует об их отсутствии.

Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

Основным методом выявления наличия продукта является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Продукты ПЦР разделяются в геле под действием электрического поля в соответствии с их молекулярной массой. В гель добавляется интеркалирующий краситель (флуоресцирующий в связанном с двухцепочечной ДНК состоянии - чаще всего бромистый этидий). Таким образом, при облучении ультрафиолетом можно будет увидеть наличие или отсутствие полоски, соответствующей ДНК необходимой молекулярной массы. При проведении ПЦР в диагностических целях всегда ставятся положительный и отрицательный контроли реакции, с которыми сравниваются образцы.

Цифровая количественная ПЦР

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце. В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК- содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

Мультиплексная ПЦР

Полимеразная цепная реакция, при которой в одной реакции участвуют более одного набора праймеров. В результате с одной матрицы может быть одновременно получено несколько продуктов ПЦР. Температура отжига для каждого из набора праймеров должна быть оптимизирована, а длина ампликонов с каждой пары праймеров должна достаточно различаться, чтобы сформировать отдельные полосы при визуализации путем электрофореза. Мультиплексная ПЦР применяется во многих приложениях анализа ДНК, включая анализ делеций, мутаций и полиморфизмов, а также ПЦР с обратной транскрипцией. Часто применяется в процедурах генотипирования, при которых требуется одновременный анализ многих маркеров, при детектировании патогенов или в анализе микросателлитов. Однако, так как используется несколько пар праймеров, необходима оптимизация для получения достоверных и воспроизводимых результатов.

Вложенная ПЦР (гнездовая, «вложенная», англ. nested PCR)

В данной модификации метода ПЦР в ходе второго раунда полимеразной цепной реакции используют две пары праймеров и проводят два раунда реакции, в ходе которого праймеры расположены внутри по отношению к использованным в первом раунде, а первый продукт ПЦР используется как новая матрица. ПЦР представляет собой мощный инструмент для амплификации небольших количество ДНК из сложных смесей. Однако, если нужная матрица имеет малую концентрацию в смеси ДНК-фрагментов, требуется проводить много циклов амплификации и использовать праймеры, которые могут связаться с другими локусами. Это зачастую приводит к амплификации посторонних или неверных последовательностей. Использование второго набора праймеров (вложенные праймеры), отжигающихся внутри первого продукта ПЦР, позволяет проводить дальнейшую амплификацию с образованием более короткого продукта, с более высокой чувствительностью и без потерь специфичности. Таким образом, любые нежелательные последовательности ДНК, амплифицированные в ходе первого раунда ПЦР, имеют меньше шансов амплифицироваться во втором раунде.

Случайная полимеразная ПЦР

Модификация ПЦР, которая позволяет осуществить амплификацию случайных последовательностей (с неопределенной структурой) с матрицы, сложных смесей ДНК или целых клеток. Существует несколько вариантов проведения случайной ПЦР: с единственным случайным праймером (происходит линейное накопление продукта) или ПЦР при нормальных условиях (экспоненциально).

Обычный вариант случайной ПЦР - амплификация с праймером, часть которого имеет определенную последовательность, а другая часть - вырожденную. Включение вырожденных районов в последовательность праймера делает возможным его отжиг на множестве сайтов связывания в целевой матрице (или матрицах). Вырожденные праймеры образуют продукты ПЦР с различной длиной и последовательностью, покрывающей значительную часть целевой ДНК. Часто используется для амплификации, преобладающей ДНК или вставочных последовательностей, последовательность и длина которых неизвестна. Менее распространенный вариант случайной ПЦР, когда реакцию проводят при низких температурах (например, 30°С). При этом праймеры отжигаются на матрице неверно, приводя к амплификации продуктов случайной ПЦР.

ПЦР с «горячим» стартом (англ. hot-start PCR)

Модификация ПЦР, суть которой состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Для этого полимеразная активность фермента в момент постановки ПЦР блокируется антителами или имитирующими антитела небольшими молекулами типа Affibody до наступления первой денатурации (проводится при 95 °C в течение 10 минут). Кроме того, для предотвращения преждевременного взаимодействия фермента с компонентами реакционной смеси и, как следствие, образования неспецифических продуктов реакции до момента полного прогрева, используется легкоплавкий парафин или специальные масла, отделяющие полимеразу от реакционной смеси. В зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления, при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает температуру плавления, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, то есть температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двуцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции. Даже если не специфический отжиг произошел до начала температурного циклирования, в отсутствии фермента элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому не специфические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.

Таким образом, ПЦР с «горячим» стартом позволяет минимизировать вероятность образования не специфических продуктов ПЦР и возможность получения ложно положительных результатов анализа.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР или РНК-ПЦР)

Инструмент, который позволяет осуществить амплификацию небольшого количества матрицы РНК. ОТ-ПЦР представляет собой двустадийный процесс. На первой стадии происходит копирование РНК обратной транскриптазой с образованием комплементарной ДНК. Существуют термостабильные обратные транскриптазы (например, обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц), которые могут быть использованы в ПЦР. На второй стадии одноцепочечная комплементарная ДНК экспоненциально амплифицируется термостабильной ДНК-полимеразой в ходе полимеразной цепной реакции с образованием большого количества ДНК для дальнейшего анализа. Возможно также модифицировать протокол, включив использование заякоренных праймеров с олиго(dT)- модифицированным праймером. Это позволяет осуществить транскрипцию и амплификацию с 3?-конца поли(А)-«хвоста». Так как синтезирующийся пул ДНК образуется на основе исходной последовательности РНК, есть возможность секвенировать ДНК после клонирования, тем самым определяя последовательность исходной РНК. ОТ-ПЦР находит широкое применение в молекулярной биологии и клинических исследованиях, где ее можно применять для детектирования инфекциоонных агентов, генетических маркеров, а также опосредованно для выявления белков в малом количестве.

ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (англ. End-point PCR). Это модификация метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирки. Таким образом, решается одна из основных проблем ПЦР - проблема контаминации ампликонами. Одним из таких вариантов является метод «FLASH» (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization - специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами). Ключевым элементом метода «FLASH» является использование гибридизационных олигонуклеотидных зондов, меченных молекулами флуорофора и «темнового» гасителя. Зонды добавляют в реакционную смесь наряду с праймерами и остальными компонентами реакции. Поскольку в структуре зонда флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости друг от друга, то перед началом реакции флуоресценция отсутствует. Во время реакции зонды гибридизуются с ДНК-мишенью, на стадии элонгации Taq- полимераза разрушает зонд благодаря 5'-экзонуклеазной активности и флуорофор оказывается свободным от гасителя. Таким образом, количество разрушенных зондов и, соответственно, уровень флуоресценции оказываются пропорциональными количеству образовавшихся ампликонов. Следует отметить, что регистрация флуоресценции происходит с помощью детектора флуоресценции после окончания реакции, поэтому метод не является количественным.

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ, англ. Real-Time PCR, RT-PCR).

Этот метод был разработан в связи с тем, что ОТ-ПЦР является только полуколичественной методикой. Полимеразная цепная реакция представляет собой наиболее чувствительный метод детектирования РНК и может быть использована для различения сходных мРНК. ПЦР в реальном времени основана на измерении уровня флуоресценции в ходе реакции, что отражает продукцию ампликона в каждом цикле ПЦР в реальном времени вместо оценки количества продукта по окончании реакции, как это происходит в других модификациях ПЦР. Однако, ПЦР-РВ не определяет размер ампликона. ПЦР-РВ основана на детектировании и количественно определении флуоресцентного репортера; интенсивность флуоресцентного сигнала возрастает с увеличением содержания продукта ПЦР в реакционной системе. Количественно определяя эмиссию флуоресценции в каждом цикле, можно следить за ходом ПЦР в фазе экспоненциального роста, когда первое достоверное увеличение содержания продукта коррелирует с начальным количеством матрицы. Чем выше начальное количество матрицы, тем быстрее начнется возрастание интенсивности флуоресценции.

Существует два основных подхода к детекции результатов ПЦР в реальном времени: с помощью интеркалирующих красителей и на основе флуоресцентно- меченых олигонуклеотидных зондов. Низкоспецифичная детекция результатов ПЦР-РВ с помощью интеркалирующих красителей возможна за счет увеличения флуоресценции интеркалирующего красителя при образовании комплекса с двуцепочечной ДНК. Самый популярный краситель на сегодняшний день - SYBR Green I. Это чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК. Максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм). Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером. Квантовый выход флуоресценции - около 0.8 (что в 5 раз превышает квантовый выход комплекса этидий-ДНК). Более высокой специфичности детекции результатов ПЦР в режиме реального времени можно достигнуть за счет наличия в реакционной смеси дополнительного олигонуклеотида - гибридизационного зонда. Такой зонд "отжигается" (комплементарно соединяется с ДНК) на участке ампликона между прямым и обратным праймером. На разных концах зонда расположены флуорофор и гаситель флуоресценции этого красителя (по аналогии с «FLASH» методом). Когда флуорофор и гаситель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5?-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с гасителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

Таким образом, в случае если используемые праймеры "отожгутся" на неспецифических участках с образованием в ходе ПЦР-РВ "нецелевого" продукта, то его последовательность не будет иметь участок, комплементарный гибридизационному зонду и, соответственно, "нецелевые" ампликоны не будут регистрироваться как целевые. При этом для такого варианта ПЦР-РВ можно одновременно использовать несколько видов флуорофоров и гасителей их флуоресценции (с неперекрывающими спектрами излучения). Это позволяет осуществлять мультиплексную ПЦР в реальном времени. В ПЦР-РВ используются различные типы флуоресцентных зондов или праймеров, включая TaqMan-зонд, молекулярные маяки и Scorpion-зонд. Каждый из них основан на использовании олигонуклеотида. Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом, момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового - так называемый пороговый цикл - зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.

Главным преимуществом детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени» является возможность проведения количественного анализа. При количественном исследовании образцов каждая серия экспериментов сопровождается постановкой амплификации с контрольными образцами, в которых заведомо известно количество копий ДНК (калибровочные образцы). Сравнение кинетики накопления продуктов амплификации в экспериментальных и контрольных образцах позволяет оценить концентрацию ДНК в диапазоне разведений контрольных препаратов ДНК. Следует отметить, что для выполнения количественного ПЦР-анализа рекомендуется использование препаратов ДНК с высокой степенью очистки, так как присутствие нежелательных примесей (ингибиторов) снижает эффективность амплификации исследуемой и контрольной ДНК. Для контроля точности количественного анализа используют калиброванные внутренние контроли. Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР для измерения малых количеств мРНК, что позволяет получать количественную информацию о содержании искомой мРНК в клетке и судить об уровне экспрессии гена в отдельной клетке или ткани.

ПЦР «инвертированная»

Используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для этого проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов.

Асимметричная ПЦР

Проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. Сама ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

Метод молекулярных колоний.

Данная модификация основана на использовании акриламидного геля, который до начала ПЦР полимеризуют со всеми ее компонентами на поверхности. В процессе реакции в точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) - вариант ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Для реализации данного подхода используют смесь двух полимераз, одна из которых - Taq-полимераза с высокой процессивностью (способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая - ДНК-полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью (Pfu-полимераза). Она необходима для корректирования ошибок, внесённых Taq-полимеразой, при этом некомплементарные нуклеотиды удаляются с помощью Pfu-полимеразы.

Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) - ПЦР с использованием консервативных праймеров к последовательностям ДНК для родственных групп внутри одного или между разными видами. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов.

Ступенчатая ПЦР (англ. touchdown PCR) -- с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев первые десять ПЦР-циклов можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например, до 60-65°С.

1.2.4 Преимущества и недостатки ПЦР перед другими методами

К преимуществам полимеразной цепной реакции можно отнести следующее:

Прямое выявление возбудителя с возможностью количественной оценкой.

Высокая специфичность выявление возбудителя.

Материалом могут служить любые биологические жидкости, соскобы со слизистых оболочек, вода, почва, воздух, смывы.

Исследуемый материала может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следовательно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

Метод прост в исполнении, возможна его полная автоматизация.

Достаточно быстрое и точно получения и интерпретация результатов.

Ограничения метода ПЦР

Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма.

Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. Интервал повторного анализа составляет 4-8 недель.

Возможность перекрестной реакции. Подбор праймеров происходит на основе существующих знаний о геноме данного и сходных микроорганизмов. Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции.

Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа.

Изменчивость микроорганизмов. Хотя при конструировании тест-системы фрагмент генома, используемый для амплификации, выбирается из высоко консервативной области, изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом участке генома, и, таким образом, становиться неуловимыми данной тест-системой. Последние два пункта важны для разработчиков ПЦР-диагностикумов. В настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний (включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя), которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок.

1.3 Ортомиксовирусы

Грипп - наиболее часто встречающееся заболевание человека. Вирусы гриппа могут быть разделены на три типа: А, В и С (Таблица 1).

Таблица 1 - Классификация вирусов гриппа

Порядок	Семейство	Род	Вид
Mononegavirales	Orthomyxoviridae	Influenzavirus A	Influenza A virus
		Influenzavirus B	Influenza B virus
		Influenzavirus C	Influenza C virus
		Isavirus	Infectious salmon anemia virus
		Thogotovirus	Thogoto virus Dhori virus

Все штаммы одного типа имеют в своем составе дающие перекрестные серологические реакции белки М и NP, которые являются главными компонентами вируса. Из трех типов вирусы гриппа типа А -- наиболее актуальные возбудители заболеваний у людей, так как с ними связаны пандемии гриппа.

На протяжении истории человечества среди людей не раз возникали заболевания в результате мутаций в гемагглютинине вирусов гриппа А. Клинические и эпидемиологические черты прошлых и современных эпидемий очень похожи. Это наводит на мысль, что минувшие эпидемии были вызваны антигенно отличающимися вирусами, подобно современным штаммам, изучаемым в настоящее время. Такое предположение подкрепляется серологическими и недавно полученными молекулярно-генетическими доказательствами возвращения, или рециркуляции, вариантов вируса, которые существовали в прошлом. Таким образом, современное изучение генетики вирусов гриппа имеет не только ретроспективное, но и прогностическое значение для оценки этого рециркулирующего вируса.

В то время как варианты других человеческих вирусов в результате эволюции трансформировались в многочисленные разновидности, варианты вирусов гриппа А, известные своей изменчивостью, с трудом сосуществовали в человеческой популяции. Вследствие этого лишь один или два основных варианта вызывали заболевания в отдельные годы, причем такие «подтипы» выживали на протяжении одного-трех десятилетий. Подобная ускоренная эволюция вируса, обреченного на быстрое исчезновение по мере нарастания иммунитета у населения, объясняет исключительность гриппозной инфекции и трудности ее предупреждения.

В отличие от других заболеваний, генетика вируса гриппа позволяет понять патогенез и эпидемиологию данной инфекции.

1.3.1 Антигенная изменчивость

Ортомиксовирусы делятся на рода (или типы А, В и С), что связано с антигенными свойствами главных белков нуклеокапсида (нуклеокапсидный белок фосфопротеин NP) и матрикса вирусной оболочки (белок М). Функции гемагглютинина распознает клеточный рецептор - мукопептид;

отвечает за проникновение вириона в клетку, обеспечивая слияние мембран вириона и клетки;

его антигены обладают наибольшими протективными свойствами. Изменения антигенных свойств (антигенные дрейф и шифт) способствуют развитию эпидемий, вызванных новыми Аг вариантами вируса (против которых не сформировался в достаточной мере коллективный иммунитет).

Нейраминидаза отвечает за диссеминацию вирионов, совместно с гемагглютинином определяет эпидемические свойства вируса.

Нуклеокапсид состоит из 8 сегментов вРНК и капсидных белков(таблица 2), образующих спиралевидный тяж.

Кроме отличий по NP и M белкам, ортомиксовирусы отличаются высочайшей антигенной изменчивостью, обусловленной вариабельностью поверхностных белков HA и NA. Выделяют два базовых типа изменений - антигенный дрейф и антигенный шифт. Антигенный дрейф обусловлен точечными мутациями, изменяющими структуру этих белков. Основным регулятором эпидемического процесса при гриппе является популяционный (коллективный) иммунитет. В результате его формирования происходит отбор штаммов с измененной антигенной структурой (прежде всего гемагглютинина), против которых антитела менее эффективны. Антигенный дрейф поддерживает непрерывность эпидемического процесса.

При этом у вирусов гриппа А обнаружена и другая форма антигенной изменчивости - антигенный шифт (сдвиг), связанный со сменой одного типа гемагглютинина (или нейраминидазы) на другой,

?.е. на появлении нового антигенного варианта вируса. Это наблюдается редко и связано с развитием пандемий.



Таблица 2 - Функции некоторых клеточных белков в репродукции вируса гриппа

Белок	Функции и факторы патогенности
HA	Адсорбция, проникновение в клетку и раздевание вируса. Изменения в сайте расщепления обуславливают изменение тропизма вируса и скорости инфекционной активации.
NA	Инвазия в слизистые оболочки дыхательных путей и отделение почкующихся вирионов от клеточных рецепторов с последующей диссеминацией. Активирует расщепления HA. Изменения в структуре NA способствуют выработке резистентности к ингибиторам нейраминидазы
M1	Импорт ядерного РНП, участвует в сборке вирусных частиц.
M2	Его тетрамеры образуют ионные каналы. Изменения в структуре этого белка приводят к изменениям активности ионного канала, резистентности к амантадину. Действует на клеточные ионные каналы, что приводит к развитию отека тканей легких.
NP	Является частью транскрипционного комплекса; обеспечивает ядерный/цитоплазматический транспорт вРНК. Ответственен за видовую температурную адаптацию вирусов.
PA	Эндонуклеаза расщепляет клеточные мРНК, кэпированные фрагменты которых затем используются в качестве затравок в синтезе вирусных мРНК. Участвует в протеолизе вирусных и клеточных белков.
PB1	РНК-зависимая РНК-полимераза участвует в синтез вирусных РНК.
PB2	Участвует в синтез полимеразы при высокой температуре.	вирусных	РНК.	Усиливает	активности
NS1	Образует димер, который ингибирует экспорт поли-A-содержащих мРНК из ядра, контролируя тем самым экспрессию клеточных генов. Способствует усилению супрессии иммунной системы и противовирусной защиты, за счет антиинтерфероновой активности. Кроме того, NS1, возможно, способен подавлять интерфероновый ответ в вирусинфицированных клетках.
NS2 (NEP)	Nuclear Export Protein (NEP), структурный белок вируса гриппа. Ранее назывался NS2-белком и считался неструктурным. Опосредует экспорт из ядра клетки вирусных рибонуклеопротеидов (vRNPs).
PB1-F2	Субъединица вирусной РНК-полимеразы, проапоптотическую активность, фактор апоптоза макрофагов.	усиливает

За всю известную историю гриппа выделено только несколько антигенных фенотипов, вызывающих эпидемии гриппа у людей? HoN1, H1N1, H2N2, H3N2,?.е. только три типа гемагглютинина (HA1-3) и два - нейраминидазы (NA 1 и 2). Вирусы гриппа типа В и С вызывают заболевания только у человека, вирусы гриппа А - у человека, млекопитающих и птиц. Наибольшую эпидемическую роль имеют наиболее изменчивые вирусы гриппа А. У вирусов гриппа С отсутствует нейраминидаза, эти вирусы обычно вызывают более легкую клиническую картину.

Существует гипотеза, что антигенный шифт - результат генетического обмена (рекомбинации) между вирусами гриппа человека и животных. До сих пор окончательно не установлено, где в межэпидемический период - вне человеческой популяции (у птиц или млекопитающих) или в человеческой популяции (благодаря длительной персистенции, локальной циркуляции) сохраняются вирусы, на время исчерпавшие свои эпидемические возможности. Птиц считают первичными и основными хозяевами вирусов гриппа А, у которых в отличие от человека распространены вирусы со всеми 17 типами HA и 10 типами NA. Дикие утки - естественные хозяева вирусов гриппа А, у которых возбудитель находится в желудочно - кишечном тракте и не приносит хозяевам заметного ущерба. Вирусы проявляют свои патогенные свойства при переходе на других птиц и на млекопитающих. Среди млекопитающих наибольшее значение придают свиньям, которых считают промежуточным хозяином и сравнивают со “смешивающим сосудом”. Характеристика пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 Филогенетический анализ позволил установить происхождение тройного реассортанта вируса A(H1N1)pdm09 из вирусов H1N1, H1N2, H3N2 птиц, свиней и человека (таблица 3).

Таблица 3 - Происхождение тройного реассортантного вируса A(H1N1)pdm09 из вирусов H1N1, H1N2, H3N2 птиц, свиней и человека

Ген	Субтип	Родительскаяя линия	Вид-хозяин
HA	H1N2	Североамериканская свиная	Свинья
NA	H1N1	Евразийская свиная	Свинья
M	H3N2	Евразийская свиная	Свинья
PB2	H3N2	Североамериканская птичья	Птицы
PB1	H1N1	Человеческая	Человек
PA	H1N2	Североамериканская свиная	Птицы
NP	H3N2	Североамериканская свиная	Свинья
NS	H3N2	Североамериканская свиная	Свинья

Современные вирусы гриппа человека слабо переходят на животных. Все пандемии гриппа А с 1930 ?. начинались в Китае, основными воротами распространения является Сибирь (массовые миграции птиц).

Н1N1 -- 1930 ?. Выявлен у человека, свиньи, китов (1972 ?.), домашних и диких птиц. С ним связана знаменитая пандемия “испанки” (испанского гриппа). Этот тип вновь получил распространение с 1977 ?.

H2N2 выявляется с 1957 ?. у человека и птиц. Эпидемии, связанные с этими вирусами, приходили периодически. Сейчас оба типа выявляют параллельно.

H3N2 выявлен в 1963 ?. (Гонконг).

Вирус А/ Сингапур/1 /57 (H2N2) имеет три гена от вирусов гриппа птиц Евразии, вирус А/ Гонконг /1 /68 (H3N2) содержит 6 генов от вируса “Сингапур” и два - от птиц. Эти данные подтверждают, что новые эпидемические типы вирусов гриппа А человечество получает от птиц - первичного хозяина. Ближайший прогноз - возможность появления новых эпидемических вариантов вируса гриппа А, имеющих гемагглютинин HA5 или 7 (достаточно замены одной - двух аминокислот в их структуре). Главную роль имеют вируснейтрализующие (противгемагглютинина и нейраминидазы) антитела - сывороточные IgG и секреторные IgAs, клеточные иммунные реакции.

1.3.2 Особенности вируса свиного гриппа H1N1

Человеческий организм слишком хорошо организованная структура, чтобы пасовать перед вновь возникшей инфекцией. Пару циклов циркуляции бактерии или вируса в социуме, увеличение числа переболевших, но выживших, нарабатывается коллективный иммунитет, который защищает общество в целом и индивидуума в частности от новой напасти, что в итоге и произошло со свиным гриппом, перешедшим к данному моменту в категорию традиционных вирусов гриппа человека.

Наследственная информация о структуре всех без исключения белков, входящих в состав клетки, записана в двойной спирали молекулы ДНК, которая хранится в клеточном ядре. В нормальных условиях жизнь любой клетки человека регулируется деятельностью ее собственных нуклеиновых кислот, в которых записана программа синтеза клеточных белков и других химических соединений.

Но вот в клетку проник вирус, содержащий свою нуклеиновую кислоту с его программой. Эта программа переключает весь основной обмен клетки, все процессы синтеза под свой контроль, и, используя энергию клетки, ее «оборудование», «сырьевые ресурсы», ферменты, заставляет «оккупированную» клетку человека переключиться на производство новых вирусов. Вирусное потомство стремится выйти наружу через поры клеточной мембраны или повредив клеточную оболочку. При повреждении мембраны клетки она гибнет, а огромные «полчища» убийц устремляются к здоровым клеткам, чтобы заразить их. Через 24 часа число вирусов, предшественник которых проник в клетку, может достигать нескольких сотен миллионов.

Вирус гриппа способен за счет гемагглютинина прикрепляться к клеткам эпителия сосудов, повреждая их. Кроме того, одним из основных механизмов влияния вируса гриппа на сосудистую систему является повышенное образование активных форм кислорода (свободных радикалов), которые взаимодействуют с фосфолипидами клеточных мембран, вызывают нарушение барьерных функций клетки и ее гибель. Внутриклеточные лизосомальные ферменты клеток после ее гибели дополнительно повреждают эпителий капилляров, что способствует попаданию вирусов в кровоток, после чего они распространяться по всему телу, способствует распространению гриппозной инфекции.

Повреждение вирусом эпителия сосудов повышает проницаемость сосудов, ломкость их стенок и если в таких капиллярах появится сгусток эритроцитов, капилляр может разорваться. Это является причиной того, что при гриппе часто возникают геморрагические проявления (кровоизлияния) -- от носовых кровотечений до геморрагического отека легких и кровоизлияний в вещество головного мозга.

Коварство свиного гриппа H1N1 объясняется повышенной способностью его поверхностного белка гемагглютинина присоединяться к клеткам легких и вызывать пневмонию еще до того, как успеет сформироваться полноценный иммунный ответ. Подобные осложненные формы течения заболевания характеризуются рядом неотложных состояний, как правило, являющихся результатом крайне тяжелого, гипертоксического течения инфекции, а также рядом вторичных заболеваний. Повреждение вирусом эпителия сосудов повышает проницаемость сосудов, ломкость их стенок, и если в таких капиллярах появится сгусток эритроцитов, капилляр может разорваться. Это является причиной того, что при гриппе часто возникают геморрагические проявления (кровоизлияния) -- от носовых кровотечений до геморрагического отека легких и кровоизлияний в вещество головного мозга. Приведенные осложнения становятся чаще всего причиной летальных случаев (таблица 4).