Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени как метод выявления вируса свиного гриппа

Такие первичные пневмонии носят молниеносный характер и вызывают значительные поражения легких. Возможен острый геморрагический отек легких и последующая гипоксемическая кома, зачастую ведущая к смерти больного.



Таблица 4 - Осложнения свиного гриппа

Вирусное поражение легких. Состояние обусловлено распространенным воспалительным процессом в нижних отделах дыхательных путей. Клинически проявляется (на фоне течения гриппозной инфекции) дыхательной недостаточностью и возможным развитием острого респираторного дистресс- синдрома (ОРДС)
Токсический геморрагический отек легких. Клинически проявляется (на фоне выраженной интоксикации) одышкой, цианозом, расстройством дыхания, появлением примеси крови в мокроте, развитием острой дыхательной недостаточности.
Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС). Состояние обусловлено повреждением капилляров альвеолярных перепонок, воспалительными изменениями, развитием интерстициального и альвеолярного отека, последующим развитием интерстициального фиброза. Клинически проявляется развитием токсического геморрагического отека легких, острой прогрессирующей дыхательной недостаточности.
Ложный круп. Состояние обусловлено отеком голосовых связок, рефлекторным спазмом мышц гортани. Клинически проявляется внезапным появлением приступа удушья, сопровождаемым тревогой, тахикардией с последующим развитием острой дыхательной недостаточности.
Вторичные осложнения гриппа
Вторичная пневмония. Состояние обусловлено присоединением бактериальной или грибковой флоры
Септический шок. Состояние обусловлено присоединением бактериальной или грибковой флоры.

Часто при гриппе возникают пневмонии вторичные пневмонии, вызванные нарушением циркуляции крови и последующим распространением в ослабленных легких бактериальных инфекций. Многие патогенные бактерии, грибы в норме присутствуют в организме в небольшом количестве (бактероиды, анаэробные кокки, золотистый стафилококк, стрептококки, синегнойная палочка, энтеробактерии, грибы и др.). Вторичные пневмонии при гриппе протекают со склонностью к образованию инфильтратов и последующим гнойным или гнилостным распадом легочной ткани.

После перенесенных пневмоний часто сохраняются остаточные явления в виде бронхоэктазов. Бронхоэктаз -- это необратимое увеличение участка бронха в результате повреждения бронхиальной стенки, которое вызывает частые сезонные обострения с выделением большого количества гнойной мокроты. В период ремиссии остаётся кашель с мокротой, отмечается умеренная одышка, снижается трудоспособность.

Грипп может способствовать развитию отита, а также осложняться синуситами, гайморитами, фронтитами. Со стороны других органов и систем могут отмечаться нефриты, циститы, воспаление сердечной сумки. Осложнения со стороны сердца при гриппе считается причиной повышения в период эпидемии частоты инфарктов миокарда, развития острой сердечно-сосудистой недостаточности.

У беременных женщин грипп протекает тяжело, может случиться самопроизвольное прерывание беременности или внутриутробная смерть плода.

Особенно ярко явления интоксикации при гриппе возникают у людей с сердечнососудистыми заболеваниями, хроническими болезнями легких, анемиями, со сниженным иммунитетом, заболеваниями печени.

1.4 Противовирусный иммунитет

Вирусы в течение эволюции адаптировались к использованию биосинтетического аппарата клетки хозяина и являются облигатными внутриклеточными паразитами. Все это определяет особенности противовирусного иммунитета.

К механизмам врожденного противовирусного иммунитета относятся NK-клетки и интерфероны. NK-клетки представляют собой крупные лимфоциты. Основной их функцией является цитолитическая, которая обеспечивается содержанием в гранулах этих клеток белка перфорина и сериновых эстераз. Нормальные киллеры являются продуцентами ряда цитокинов, а также интерферона г. NK-клеткинесут на поверхности особые рецепторы, способные связываться с белками МНС I класса собственных клеток организма. Эти рецепторы не активируют, а ингибируют киллерную функцию. Если при контакте с какой-либо клеткой эти рецепторы «не находят» достаточного количества белков МНС I класса, то ингибирующий сигнал также оказывается недостаточным, и NK развивает в отношении этой клетки цитотоксическую атаку и убивает ее.

Интерфероны - основные факторы врожденной защиты от вирусов. Считается, что основным их источником являются лимфоидные дендритные клетки. Индуктором синтеза интерферонов служат молекулы двуспиральной РНК. Это может быть геномная РНК вирусов или промежуточный продукт транскрипции у ДНК-содержащих вирусов. Интерфероны индуцируют в клетке биосинтез необычных ферментов, нарушающих репликативный цикл вируса, а также приводят к активации NK-клеток.

Механизмы приобретенного противовирусного иммунитета

Для успешного уничтожения и запоминания вирусных антигенов необходимо их представление эффекторным и регуляторным Т- лимфоцитам. Основную роль в презентации вирусных антигенов играют дендритные клетки. Этот тип АПК обильно представлен в лимфоидной ткани и обладает выраженной и постоянной экспрессией молекул МНС I и II классов. Они не обладают способностью к фагоцитозу, но захватывают вирусные частицы посредством пиноцитоза. У них отсутствует выборочность при столкновении с вирусами, они поглощают самые разнообразные вирусные частицы. В результате происходит быстрое формирование иммуногенных комплексов вирусных пептидов с соответствующими белками МНС, создаются условия для включения в иммунный ответ Т - киллеров и Т-хелперов.

При вирусной инфекции основными эффекторными клетками являются цитотоксические Т-лимфоциты (Т-киллеры, ЦТЛ). Этапы цитолитического действия ЦТЛ включают: распознавание антигена предшественниками, их пролиферацию и дифференцировку до зрелых эффекторов, собственно процесс лизиса. Подготовка вирусных белков к взаимодействию с молекулами MHC I видно на рисунке 1:

Рисунок 1. Схема подготовки вирусных антигенов к взаимодействию с молекулами МНС I: I - разрушение вирусных белков; II - транспортировка в эндоплазматическую сеть; III - взаимодействие с молекулами МНС; IV - транспортировка комплекса к мембране клетки.

Известны две формы гибели клеток: некроз и апоптоз. Первая из них связана с нарушениями в мембране или цитоплазме клеток и не затрагивает клеточного ядра. Некротическая гибель клеток-мишеней под влиянием ЦТЛ проходит в несколько этапов. Первый этап - специфическое связывание ЦТЛ с поверхностным чужеродным антигеном. Второй этап носит название «летального удара» и представляет собой основное событие, предопределяющее гибель клетки. Для него характерно повышение проницаемости клеточной мембраны, нарушение баланса натрий-калиевого.



Глава 2. Материал и методика исследования

Практическая работа проводилась на базе OOO «KDL-Домодедово-тест». Это коммерческая организация, которая специализируется на выполнении медицинской лабораторной диагностики, отвечающей современным международным стандартам качества. Работы в ПЦР-лаборатории проводятся согласно «Правилам устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях».

Проведение ПЦР-диагностики инфекций связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК- ампликонов; ДНК-стандарта, используемого в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложноположительных результатов.

2.1 Устройство ПЦР лаборатории

Пре-ПЦР-помещение, где производится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР, то есть в этих помещениях проводится предварительная работа с биоматериалом.

Пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации.

В этом помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций. Комната детекции продуктов амплификации должна быть расположена максимально дальше от пре-ПЦР-помещений.

Рабочие помещения оснащены ультрафиолетовыми лампами. Кварцевание производится за 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы2. Работа проводится в лабораторной одежде: в одноразовых халатах, масках перчатках, так как анализируемые биопробы являются потенциально инфицированным опасным материалом. На входе в каждый отдел надевается новый одноразовый халат.

Используются отдельные наборы дозаторов, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, предназначенных для различных стадий анализа. Они не переносятся из одного помещения в другое. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.

Все этапы работы проводятся только с использованием одноразовых расходуемых материалов: наконечников для автоматических пипеток, пробирок, перчаток и т.д. Обязательно нужно менять наконечники с фильтром аэрозольным для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники сбрасываются в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующий раствор МерадезБазик 1 %. Клинические образцы следует хранить отдельно от реагентов. Для обработки и уборки рабочего в каждом отделе используются салфетки, пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы.

Оснащение ПЦР-диагностической лаборатории

Помещение для пробоподготовки.

Отдельный стол или настольный бокс с бактерицидной лампой.

Холодильник на 2-8°С с морозильной камерой.

Твердотельный термостат для пробирок типа “Эппендорф” 1,5 мл на 25-100єС.

Микроцентрифуга для пробирок типа “Эппендорф” до 16 тыс. g.

Встряхиватель для пробирок типа “Эппендорф” вортекс

Вакуумный насос с колбой-ловушкой для отсасывания надосадочной жидкости.

Амплификатор.

Отдельные наборы автоматических пипеток переменного объема для выделения ДНК и для приготовления реакционной смеси.

Штативы для микропробирок, автоматических пипеток и наконечников к автоматическим пипеткам.

Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером).

Одноразовые полипропиленовые плотно закрывающиеся микропробирки типа “Эппендорф” на 1,5 мл.

Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,2 или 0,5 мл в зависимости от модели амплификатора.

Одноразовые резиновые перчатки.

Отдельный халат.

Оснащение пост-ПЦР-помещения

Оснащено вычислительной техникой для интерпретации и валидации результатов. Также имеются ёмкости с дезинфицирующими растворами, спирты, декантаминирующие растворы для дезинфекционных мероприятий.

2.2 Регионы взятия образцов для анализов

География компании очень обширна и в неё входят (рис. 2): Центральный федеральный округ (Тверская область, Москва и Московская область, Рязанская область, Ярославская область), Южный Федеральный округ, Северо-Кавказский округ, Приволжский федеральный округ, (Пермский край, Самарская область, Уральский федеральный округ, Сибирский федеральный округ. На рисунке 2 выделены регионы жёлтыми линиями.



Рисунок 2. Регионы РФ, охваченные компанией КДЛ-ДОМОДЕДОВО ТЕСТ.

2.3 Материал для исследования и проведение ПЦР-диагностики

Все заболевшие обследованы с помощью молекулярно-генетических методов исследования, включая секвенирование генома вируса и выделение изолята возбудителя. Первичная диагностика осуществлялась набором реагентов для идентификации вируса гриппа А/H1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией "АмплиСенс®Influenza virus A/H1-swine-Fl", разработанным ФГУН "ЦНИИЭ" Роспотребнадзора в первые дня объявления чрезвычайной ситуации, связанной с высокопатогенным вирусом гриппа, и введенным для внутриведомственного пользования временной инструкцией, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации. В настоящее время указанный набор реагентов для идентификации пандемического гриппа зарегистрирован в установленном законодательством Российской Федерации порядке.

Анализ организации лабораторной диагностики пандемического гриппа показал, что результаты исследований, проведенных в ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации и подтверждающих исследований в референс-центрах - совпадают и могут считаться репрезентативными.3

Материалом для исследования послужили мазки из полости носа и ротоглотки. Мазки из носа берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. Зонд с ватным тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Мазки из ротоглотки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки после предварительного полоскания полости рта водой. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой для хранения и транспортировки респираторных мазков. В транспортную среду входят фосфатно- солевой буферный раствор (0,1 моль/л) c добавлением бактериостатического препарата и криоконсерванта. Мокроту собирают в стерильные одноразовые контейнеры после предварительного полоскания полости рта водой.

Выявление вируса гриппа Influenza virus А/H1N1(sw2009) производили методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, который включает в себя следующие этапы: экстракцию (выделение) РНК из исследуемых образцов проводится комплектом реагентов для экстракции РНК/ДНК из клинического материала «АмплиПрайм РИБО-преп» в соответствии с инструкцией (см. приложение), амплификацию фрагмента кДНК и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится непосредственно в ходе ПЦР. Экстракция РНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-STIrec), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами РНК проводится реакция обратной транскрипции в соответствии с инструкцией (см. приложение), в ходе которой получают кДНК. Пробы кДНК используются для амплификации участка кДНК Influenza virus А/H1N1(sw2009) при помощи специфичных к этому участку ДНК праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала. Реакцию проводили на CFX96 Touch - это многофункциональный высокоскоростной Real Time амплификатор (рис. 3).

Рисунок 3. Амплификатор CFX-96 "REAL TIME" (Bio-Rad США).

Интерпретацию результатов производили с помощью лабораторного программного обеспечения FRT-Manager. За период с февраля по апрель 2016 года на базе лаборатории были проведены исследования материала 567 человек.



Глава 3. Результаты исследований

3.1 Результаты ПЦР диагностики вируса свиного гриппа

Положительными результаты оказались в 94 случаях из 567, что составляет 14 % от общего количества проб (рис. 4).

Рисунок 4. Отношение положительных результатов к общему количеству исследований.

Ссылаясь на данные полученные НИИ ГРИППА- «при обследовании 1004 больных гриппом и ОРВИ в 47 городах страны грипп был подтвержден в 113 (11.3%) случаях. Вирус гриппа A(H1N1)pdm09 был выявлен в 22 (19.5%) случаях от числа положительных случаев, вирус гриппа В - в 80 (70.8%) случаях, вирус гриппа А(H3N2) - в 7 (6.2%) случаях»4

Основная возрастная категория пациентов, чьи результаты оказались положительными - это дети до 12 лет, а также зрелые люди 30-40 лет (рис. 5).

Рисунок 5. Соотношение заболевших по возрастным категориям.

Это позволяет сделать предположение о непосредственной зависимости случаев заболевания в возрасте до 12 лет от состояния иммунитета, который у вышеназванной категории лиц находится в развивающемся, дефицитном состоянии. Предполагаем, что вредные привычки, несбалансированное питание, нарушение режимов отдыха ставят под удар категорию зрелого возраста. Такое состояние иммунитета делает организм уязвимым, восприимчивым к вирусам и бактериям. Распределение по половым группам равномерное, что отражено в таблице 5.

Таблица 5 - Распределение количества инфицированных человек по половозрастному признаку

	Возрастные группы
пол	0-3	3-12	12-18	18-30	18-45	Свыше 45
мужской	4	24	2	2	14	3
женский	3	28	4	5	11	3



Учитывая небольшой процент заразившихся, можно предположить, что человеческий организм - слишком хорошо организованная структура, чтобы пасовать перед вновь возникшей инфекцией. Несколько циклов циркуляции вируса в социуме, увеличение числа переболевших и выживших, привели к наработке коллективного иммунитета. Этому также способствовало использование вакцины для сезона гриппа 2015-2016 гг. штаммов вирусов A(H1N1), A(H3N2) и B. Ввиду непродолжительности эпидемии вакцинные штаммы в достаточной мере совпали с вирусами сезонного гриппа: т.е. вирусы, вошедшие в вакцину, демонстрируют значительную степень родства с вирусами, циркулирующими среди людей. Следовательно, в настоящее время вакцина обеспечит достаточный уровень защиты.

Наибольшее количество положительных результатов было выявлено в Москве и Московской области (табл. 6), но эти данные не могу стать свидетельством эпидемии именно в этом регионе. Такое количество инфицированных людей обусловлено, тем что Москва является столицей с огромный числом проживающих людей, плюс транзитно-пересадочным узлом как внутри страны, так и за её пределами. В Краснодаре и Ростове на Дону примерно схожая картина по положительным результатам. Повышение инфицированных в этих городах можно объяснить тем, что входными воротами для свиного гриппа (по данным, полученные из средств массовой информации) в 2016 году стал юг и запад России. Усиленный санитарный контроль вводят на приграничных территориях - на Украине, хоть министр здравоохранения и уверяет, что эпидемии нет5. Остальные случаи инфицирования - это уже процесс распространения вируса по другим регионам страны.

Таблица 6 - Распространённость инфицированных по городам

МОСКВА	42
КРАСНОДАР	10
РОСТОВ НА ДОНУ	9
ТВЕРЬ	4
ОМСК	4
ПЕРМЬ	5
УФА	4
НОВОКУЗНЕЦК	3
ВОЛГОГРАД	3
КАЗАНЬ	3
САРАТОВ	2
НОВОСИБИРСК	2
УЛА-УДЕ	1
АСТРАХАНЬ	1
ВЛАДИКАВКАЗ	1

3.2 Сравнение методов, применяемых при диагностики вируса свиного гриппа

Культуральное исследование основано на изоляции вирусов в живых культурах клеток млекопитающих или на развивающихся куриных эмбрионах с последующим определением активности гемагглютинации (агглютинации вирусами эритроцитов) и идентификацией субтипов гемагглютинина в реакции торможения гемагглютинации с типоспецифическими сыворотками. Методы отличаются трудоемкостью и длительностью, во многом зависят от качества не стандартизованных реагентов, в связи с чем для рутинной диагностики практически не используется, но применяется в эпидемиологических исследованиях.

Для обнаружения АГ вирусов гриппа применяют методы (табл. 4), ИФА, РИФ. Метод РИФ обладает низкой чувствительностью, недостаточной специфичностью и отличается субъективностью при интерпретации результатов анализа. При использовании ИХА велика вероятность ложноположительных

результатов вне эпидемического подъема гриппа и ложноотрицательных - во время эпидемического подъема. Кроме того, быстрые тесты на основе РИФ и ИХА характеризуются низкой чувствительностью к пандемическому, так называемому «свиному» гриппу (40-60%). В связи с этим CDC6 для быстрой диагностики нового варианта гриппа А/H1N1pdm2009 рекомендовано использовать выявление РНК вируса методом ПЦР.

При выявлении специфических АТ оценивают нарастание их титра в образцах крови, полученных с интервалом в 2 недели (парные сыворотки) с использованием методов РТГА, РСК. Результаты в значительной степени зависят от состояния иммунной системы пациента.

Использование в качестве мишени специфичных консервативных участков генома вирусов гриппа обуславливает высокие показатели диагностической чувствительности и специфичности ПЦР, приближающихся к 100% по сравнению с культуральной диагностикой. Преимуществами такого способа диагностики являются короткие сроки выполнения анализа, а также возможность типирования вирусов гриппа А и В и идентификации субтипа вирусов гриппа А, в том числе - нового пандемического варианта «свиного» вируса гриппа. Максимальный уровень специфичности и чувствительности имеют наборы реагентов с использованием ПЦР в режиме «реального времени». Материалом для исследования послужили: мазки из носоглотки, мокрота, плевральная жидкость, аспираты из зева, БАЛ - выявление РНК вирусов (поражение нижних дыхательных путей), мазки со слизистой носоглотки и ротоглотки - выявление РНК вирусов (поражение верхних дыхательных путей).

Таблица 7 - Методы лабораторной диагностики

Методы	Принцип метода	Специфичность	Чувствитель- ность
Микробиологический	Выделение чистой	100% “золотой стандарт”	1000-10 000 кл/ мл
	культуры возбудителя	лабораторной диагностики
Иммуноцитологический и серологический	Выявление антигенов после связывания с антителами РИФ, ИФА	70-90%	1000-100 000 кл/ мл
Молекулярно- биологический	Определение специфического участка ДНК/ РНК в геноме возбудителя	99-100% приравнивается к “золотому стандарту”	200 кл/мл (1 клетка в реакции)

3.3 Рекомендации по предотвращению заболевания гриппом

Истерия, вызванная средствами массовой информации, распустившими слухи о наступлении страшнейшей эпидемии гриппа, уничтожающего людей, привела общество к панике. Тем не менее, статистика показала, что страшные прогнозы СМИ не соответствуют действительности. Свиной грипп прошёл малозаметно. Циркуляция его среди населения оказалась небольшой, и своевременные меры, принятые для лечения и, в первую очередь, профилактики гриппа дали прекрасный результат. Исходя из этого, можно предположить, что нездоровый интерес к свиному гриппу подогревался искусственно фармацевтическими компаниями, которым озабоченность людей профилактикой и лечением, несомненно на руку, так как это хороший шанс для увеличения продаж противогриппозных и иммуностимулирующих препаратов.

Основными рекомендациями по борьбе с гриппом являются специфическая иммунопрофилактика (вакцинация) и повышение неспецифической резистентности организма. Прежде всего, это относится к группам лиц повышенного риска заболеваемости гриппом и ОРВИ и наиболее восприимчивым к этим заболеваниям.

Пик заболеваемости людей зрелого возраста приходится на период межсезонья, когда врождённый иммунитет ослаблен ввиду весеннего гиповитаминоза. Поддержание врожденного иммунитета в хорошем состоянии поможет организму сформировать своевременный и адекватный ответ при вторжении вирусов и других патогенных микроорганизмов.

Роль дефицита витаминов в иммунном ответе на вспышку вируса свиного гриппа

Синтезируемые иммунными клетками антимикробные пептиды -- это маленькие молекулы с выраженным противовирусным, антибактериальным и противогрибковым действием. Они представляют наиболее древнюю противоинфекционную систему, которая эффективно противодействует, преимущественно на поверхностях слизистых оболочек, широкому кругу патогенных бактерий, грибов и вирусов. Эффективность антибактериальных пептидов выше, чем у любого антибиотика. Наиболее эффективны такие пептиды, как дефензины и кателицидины, которые проникают сквозь микробные мембраны и разрушают их.

Способность организма синтезировать дефензины и кателицидины зависит от постоянной обеспеченности организма витамином D. При длительном дефиците этого витамина уменьшается количество рецепторов к витамину D (VDR), что влечет за собой нарушение процессов трансляции более чем 1000 генов нашего организма, в том числе тех, которые отвечают за быстрое «узнавание» вторгшихся патогенных микроорганизмов и формирование способности иммунных клеток (нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов) вырабатывать антимикробные пептиды.

Обеспечение организма витамином D - необходимое условие эффективной работы врожденного иммунитета и «запуск» работы адаптивного иммунитета.

Распространенность недостаточности витамина D во многих странах достигает эпидемического уровня, что связано как с недостаточностью пребывания на солнце в летнее время, а также с ограничением в рационе (из-за страха повышения уровня холестерина или увеличения массы тела) жиросодержащих продуктов (жирной рыбы, печени, желтка яиц, сливочного масла, рыбной икры и др.). К декабрю-январю у большинства жителей России уровень метаболита 25-ОН-витамин D находится на уровне 5-15 нг/мл, что свидетельствует о резком снижении иммунитета. По этой причине вспышки вирусных инфекций обычно начинаются в этот период. Экспериментальные данные свидетельствуют, что витамин D участвует в противовирусном ответе, особенно против оболочечных вирусов, каким является вирус свиного гриппа.

Не только дефицит витамина D может быть причиной подавления активности рецепторов к витамину D. Такие микроорганизмы, как микобактерии туберкулеза, хламидии, аспергиллы (плесневые грибы), вирусы гепатита С, Эпштейн-Барр и цитомегаловируса угнетают эти рецепторы. Недостаточная активность рецепторов витамина D, которые являются членами подсемейства тиреоидных гормонов (Т3), может быть связана также с гипотиреозом, дефицитом в организме микроэлементов (йод, железо, селен) необходимых для образования этого гормона.

Для поддержания иммунитета важно постоянно обеспечивать организм витаминами С, А, микроэлементами: цинк, железо, магний, селен и др.

Витамин С интенсивно накапливается в клетках иммунной системы и необходим для их функционирования, особенно фагоцитов и Т-лимфоцитов. Он усиливает подвижность иммунных клеток (нейтрофилов и макрофагов) и их активность, разрушение лизоцимом патогенных бактерий, способствует секреции противовоспалительных факторов, в том числе интерферона и антител, уничтожающих чужеродные микроорганизмы. Накопление витамина С в Т- лимфоцитах повышает длительность их жизни. Недостаток витамина С тормозит защитные реакции, однако слишком высокие дозы в силу избыточной антиоксидантной активности может снижать защиту клеток. Ставя эксперимент на себе в течении эпидемии гриппа 1 раз в сутки принимал аскорбиновую кислоту в дозировке 1000 мг. Эффект порадовал, так как весь сезон я оставался здорово, несмотря на то, что вся семья и коллеги переболели гриппом или ОРВИ.

Витамин А (ретинол) стимулирует образование Т-лимфоцитов и их активность, а также необходим для осуществления фагоцитоза (захвата и переваривания возбудителей инфекционных заболеваний и отмерших клеток). Следствие дефицита витамина А - клеточный иммунодефицит. Витамин А оказывает влияние на барьерную функцию слизистых оболочек, проницаемость клеточных мембран. Превращению витамина А в его активную форму способствует цинк, поэтому дефицит цинка приводит к нарушению усвоения витамина А и активации ферментов.

Цинк - незаменимый микроэлемент для иммунной системы. В организме образуется 1800 цинкзависимых белков, большинство из которых участвуют в ключевых функциях иммунной системы. Цинк способствует уменьшению общего воспаления, ответственен за созревание, обучение и активность Т-лимфоцитов. При дефиците цинка снижается секреция секреторного иммуноглобулина А (IgA), интерферонов, нарушается распознавание «свой-чужой». Все звенья иммунитета зависят от обеспеченности организма цинком.

Способность организма справляться с инфекцией зависит от обеспеченности всех клеток энергией, то есть питательными веществами и кислородом, иначе все клетки организма будут находиться в состоянии энергодефицита, при котором невозможна активная иммунная защита. Для переноса кислорода из легких к клеткам требуется железо, дефиците железа почти наполовину снижается количество Т-лимфоцитов, их функциональные способности, нарушается фагоцитарная деятельность нейтрофилов и синтез секреторного компонента иммуноглобулина А в слизи носоглотки, отчего страдает их барьерная функция. Железо необходимо не только для переноса кислорода, но также для нормального протекания процессов детоксикации (обезвреживания чужеродных для организма токсинов) в печени, что очень важно при гриппе.

Вакцинация

Вакцинация является одним из важнейших способов эффективного предотвращения распространения инфекций с воздушно-капельным механизмом передачи.

В настоящее время существуют эффективные вакцины только в отношении гриппа. Основной задачей вакцинации против гриппа является создание широкой иммунной прослойки (группы населения, устойчивые к заболеванию гриппом) среди населения. Вакцинация может предотвратить заболевание гриппом у 80- 90% детей и взрослых. Если болезнь все-таки развивается, то у привитых она протекает значительно легче и со значительно меньшим числом осложнений. Специфическая профилактика гриппа приводит к существенному сокращению заболеваемости и снижению смертности, сопровождающих эпидемии гриппа.

По современной классификации А. А. Воробьева иммунологические препараты включают: «препараты, получаемые из живых или убитых организмов (бактерий, вирусов, грибов). К ним относятся живые и убитые вакцины, анатоксины, фаги, иммуноглобулины и иммунные сыворотки от иммунизированных животных и человека;

иммуномодуляторы для иммунокоррекции, лечения, профилактики иммунодефицитов различной этиологии;

диагностические препараты для выявления антигенов и антител, для постановки кожных проб при аллергии и иммунопатологических состояниях.»7

Самыми распространенными на сегодняшний день считаются инактивированные вакцины, содержащие убитые вирусы или их части. Однако существует и ряд живых вакцин, содержащих живые аттенуированные (ослабленные) возбудители гриппа, которые используются преимущество для назального введения. Инактивированные (убитые) вакцины от гриппа могут быть цельновирионными, субъединичными и расщепленными (сплит). Каждая из них имеет свои особенности, достоинства и недостатки.

Цельновирионные вакцины. Такие препараты содержат целые клетки возбудителя, и считаются самыми реактогенными - то есть, могут вызвать достаточно сильные постпрививочные осложнения. Правда, именно этот вид вакцин способен наиболее эффективно сформировать иммунитет к заболеванию.

Сплит-вакцины. В состав сплит-вакцин входят внутренние и поверхностные белки, которые получают из разрушенного вируса гриппа. Этот тип профилактических препаратов считается сравнительно безопасным для организма, так как структура возбудителя заболевания в них полностью разрушена.

Субъединичные. Вакцины этого типа состоят исключительно из поверхностных, хорошо очищенных антигенов вируса заболевания, поэтому также отличаются низкой реактогенностью.

На данный момент на территории РФ зарегистрировано 11 вакцин разных производителей: две живых назальных и по три субъединичных, сплит и цельновирионных вакцины. Кроме того, каждый из препаратов изготавливается на основе разных штаммов гриппа, которые рекомендуются ВОЗ.

Субъединичные вакцины. «Гриппол». Производитель - «Иммунопрепарат», Россия. Вакцина последнего поколения, которая отличается низкой реактогенностью. Кроме того, она содержит сильный иммуномодулятор полиоксидоний, который усиливает действие вакцины. «Инфлювак». Производитель - Солвей Фармасьютикалз, Голландия. Препарат считается одним из самых популярных в странах СНГ и рекомендуется для иммунизации детей и лиц с хроническими заболеваниями. «Агриппал». Производитель - Кайрон СП, Италия. Вакцина не содержит ртутных консервантов, и отличается высокой степенью очистки, поэтому рекомендована к использованию более чем в 40 странах мира. Сплит-вакцины «Ваксигрипп». Производитель - Авентис-Пастер, Франция. Авентис-Пастер является старейшим производителем вакцин в Европе, поэтому Ваксигрипп был признан одним из наиболее безопасных профилактических препаратов в мире. Не содержит консервантов и подвергается многоступенчатой очистке и контролю. «Флюарикс». Производитель - компания SB Biologicals, Бельгия. Достоинством и в то же время недостатком вакцины достаточно высокое содержание (99 мкг/0,5 мл) белка вируса гриппа, то есть она отличается высокой эффективностью, но может вызвать некоторые побочные эффекты. «Бегривак». Производитель - компания Кайрон Беринг, Германия. Среди

всех существующих сплит-вакцин этот препарат показывает самую высокую эффективность - защитные антитела вырабатываются у 100% привитых пациентов. Побочные реакции отмечаются очень редко. Цельновирионные

«Грипповак». Производитель - Предприятие по производству бактерийных препаратов, СПб, Россия. Как и любая другая цельноклеточная вакцина, препарат может вызвать некоторые побочные реакции. Основные его достоинства - доступность и приемлемая стоимость. Производитель - «Иммунопрепарат», Россия. Обладает достоинствами и недостатками, которые аналогичны

«Грипповаку». Живые назальные «Ультравак». Производитель - Предприятие по производству МИБП, Россия. Препарат выпускается в двух формах: взрослой и детской. Основная особенность вакцины заключается в том, что ее вводят не посредством инъекции, а назально, то есть впрыскивают в носовые ходы специальным дозатором. Так как вакцина содержит ослабленный, но живой вирус гриппа, она не рекомендуется детям до двух лет.

Трехвалентные вакцины доступные в сезон 2015-2016 содержат биологический материал трех основных штаммов, циркулировавших в прошлый сезон: А(H3N2), А(H1N1) и одну разновидность гриппа B. После введения вакцины в организме включаются механизмы противовирусного иммунитета.



Заключение

Свиной грипп - высококонтагиозное заболевание животных и человека, вызываемое вирусом гриппа серотипа А(H1N1) и склонное к пандемическому распространению. Возбудитель свиного гриппа был открыт еще в 1930 г., однако последующие полвека циркулировал на ограниченной территории (в Северной Америке и Мексике) только среди домашних животных. Единичные случаи заражения людей свиным гриппом стали регистрироваться с начала 1990-х. В 2009 году мир потрясла пандемия свиного гриппа, известная как «Калифорния/2009», охватившая 74 страны. Тогда, по данным ВОЗ, свиным гриппом заболело свыше 500 тыс. человек. Наибольшую восприимчивость к вирусу демонстрировали лица в возрасте от 5 до 24 лет. Из-за склонности к пандемическому распространению, свиному гриппу был присвоен самый высокий 6 класс опасности.

В популяции свиней циркулируют несколько видов и серотипов вируса гриппа: вирусы сезонного гриппа человека, вирусы птичьего гриппа, H1N1, H1N2, H3N2, H3N1. Предполагается, что серотип А(H1N1), вызывающий свиной грипп у людей, явился результатом рекомбинации различных подтипов вируса гриппа. Именно гибридный вирус A(H1N1) приобрел способность преодолевать межвидовой барьер, вызывать заболевание среди людей и передаваться от человека к человеку. Как и другие вирусы гриппа человека, A(H1N1) содержит РНК; вирионы возбудителя имеют овальную форму. В оболочке вируса содержатся специфические протеины - гемагглютинин и нейраминидаза, облегчающие прикрепление вируса к клетке и его внутриклеточное проникновение. Вирус свиного гриппа малоустойчив во внешней среде: быстро инактивируется при нагревании, воздействии традиционных дезинфицирующих средств и ультрафиолета, однако может долго переносить пониженные температуры.

По своему течению свиной грипп напоминает обычный сезонный грипп (лихорадка, слабость, ломота в теле, першение в горле, ринорея), но отличается от него некоторыми особенностями (развитием диспепсического синдрома). Диагностика основывается на клинических признаках; для определения типа вируса проводится вирусологические, серологические исследования и ПЦР.

Многие традиционные методы лабораторной диагностики подразумевают выявление возбудителей заболевания по различным косвенным признакам. Например, ИФА-диагностика основана на обнаружении в крови пациента белков IgM и IgG, являющихся продуктами распада инфекционных возбудителей, на основании чего врач может поставить тот или иной диагноз. В пользу инфицирования вирусом свиного гриппа свидетельствует нарастание титра специфических антител более чем в 4 раза.

Метод ПЦР-анализа дает прямое указание на присутствие в забранном у пациента материале специфического участка ДНК возбудителя болезни. В процессе проведения анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный, т. е. присущий только конкретному возбудителю - только определенной бактерии или вирусу. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле.

Помимо этого, к преимуществам полимеразной цепной реакции можно отнести следующее:

Прямое выявление возбудителя с возможностью количественной оценкой.

Высокая специфичность выявления возбудителя.

Материалом могут служить любые биологические жидкости, соскобы со слизистых оболочек, вода, почва, воздух, смывы.

Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следовательно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

Достаточно быстрое и точное получение и интерпретация результатов.

Совокупность вышеуказанных преимуществ делает метод ПЦР приоритетным методом при диагностике вируса гриппа свиней.

Выводы

1. ПЦР диагностика является наиболее предпочтительным методов выявления вируса свиного гриппа. Чувствительность ПЦР-тест-систем составляет 10-1000 клеток в пробе, которая достигается точным подбором выскоспецифического праймера. Благодаря высокой чувствительности, тест- системы на основе ПЦР незаменимы в тех случаях, когда исследуемого материала (возбудителя заболевания) очень мало. Это также выгодно отличает метод ПЦР от других способов диагностики, например, иммунологических и микроскопических методов, чувствительность которых составляет - 1000-100000 клеток в пробе.

Выявлено 94 случая заражением вирусом свиного гриппа из 567 обследованных образцов биологического материала. Таким образом, сезонная вспышка свиного гриппа в 2016 году прошла мало заметно для населения. Количество заболевших фактически оказалось не столь велико, хотя средства массовой информации пестрили заголовками о повсеместном заражении смертоносным гриппом, не знающем пощады. Как показало наше исследование, эпидемический порог был несколько превышен, но превышение было связано с сезонными видами гриппа, а также с другими заболеваниями, относящимися к категории ОРВИ8.

Наибольшее количество положительных результатов было получено в Москве и Московской области, Краснодаре и Ростове на Дону. Причиной этого можно обозначить: в Москве - распространённость и общедоступность развитой лабораторной диагностики, социально более обеспеченное население, развитый маркетинг, в Краснодаре и Ростове на Дону - близостью к эпицентру распространения вируса свиного гриппа.

Установлено, что в подавляющем большинстве заражению были подвержены дети в возрасте от 3 до 12 лет. В меньшей степени вирус был определён у половозрелых людей от 18 до 45 лет.

Зависимость частоты инфицирования от половой принадлежности не выявлена. Во всех возрастных группах число инфицированных пациентов распределилось поровну. Очевидно, что половая принадлежность не играет значимой роли в подверженности заражению свиным гриппом.

Невысокий процент заболевших свиным гриппом в текущем сезоне связан с грамотной работой здравоохранения по профилактике заболеваемости. Эта работа включала в себя разработку актуальной вакцины и вакцинацию ею населения, санитарно-просветительскую работу по использованию средств индивидуальной защиты (масок) и общим правилам гигиены. Помимо этого, рекомендации по профилактике включают в себя использование противовирусных препаратов, употребление пищи, богатой витаминами, или привнесение в рацион готовых витаминных комплексов, соблюдение режима работы и отдыха.



Список литературы

Книги:

1. Альбицкий В.Ю., Абросимова М.Ю., Гурылева М.Э. Биомедицинская этика: Методические рекомендации к практическим занятиям. - Казань: КГМУ, 2002. -- 41 с.

2. Большаков А.М. Руководство к лабораторным занятиям по общей гигиене. 2-е изд., перераб. и доп. -- М.: Медицина, 2004. -- 272 с.

3. Большаков А.М., Новикова И.М. Общая гигиена. -- М.: Медицина, 2002. -- 384 с.

4. Воробьёв А.А. Медицинская и санитарная микробиология: Учеб. пособие для студ. высш. мед. учеб. заведений -- М.: Издательский центр «Академия», 2003. -- 464 с.

5. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология: Учебник. -- 2-е изд., перераб. и доп. -- М.: Медицина, 2003. -- 336 е.: ил. (Учеб. лит. для студ. фарм. вузов).

6. Гончарук Е.И., Бардов В.Г. и др. Коммунальная гигиена. 2006.

7. Государственные санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. Профилактика инфекционных заболеваний при эндоскопических манипуляциях Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.1275--03 Издание официальное Минздрав России. Москва, 2003.

8. Гусев М.В. Микробиология: Учебник -- М.: Издательский центр «Академия», 2003. -- 464 с.

9. Поздеев O.K. Медицинская микробиология. 2001.

10. .Прозоркина H.В., Рубашкина П.А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. 2011.

11. .Стожаров А.Н. Медицинская экология: учеб. пособие -- Минск: Выш. шк., 2007. -- 368 с. -- 2007.

12. .Червонская Г.П. Иммунопрофилактика. Вакцинация. 2012.

13. .Чешко В.Ф., Кулиниченко В.Л. Наука, этика, политика: социокультурные аспекты современной генетики. - К.: Центр практической философии. -- Изд. Парапан, 2003- 79 с.

14. .Ребриков Д.В [и др.]; ПЦР в реальном времени под ред. д.б.н Д.В. Ребрикова.? 6-е изд. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015.? 223 с.

15. .Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. -- Новосибирск: Сиб. унив. Изд- во, 2004. -- 496 с.; илл. -- ISBN 5-94087-098-8

16. .Меньшиков В.В. Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. Том 3. Молекулярные исследования в диагностики инфекционных заболеваний. -- М.: Лабора, 2009--714с

17. .Херсонская А.М. Сов?еменные методы клинической диагностики: ПЦР в ?ежиме ?еального в?емени // Справочник заведующего КДЛ 2007. №11 с.31 18.Чухловин.А.Б. Метод ПЦР в клинической лабораторной диагностике //Справочник заведующего КДЛ. 2008. №4 с.46-50

18. 19.Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) / А. Н. Екимов [и др.] // Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации. 2008.

19. 20.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М., 2002. 589 с.

Авторефераты:

20. Разработка мультиплексной ПЦР в реальном времени для детекции возбудителей ОРВИ человека : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.01.03, 03.01.06 / Сергеева Елена Игоревна; [Место защиты: Гос. науч. центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"] 9 13-4/1541.

21. Эффективность дифференциальной диагностики ОРВИ методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени : автореферат дис. ... кандидата биологических наук : 03.02.02 / Лободанов Сергей Александрович; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН] 9 13-2/863.

Диссертации:

22. Кузнецова Е.В. Изучение биологических параметров молекулярно- биологических свойств вирусов гриппа А и В при отборе и подготовке диагностических штаммов: дисертация. доктор мед. наук: 03.00.06 / МЗ НИИГ. 18.12.2000 г. С. 23.

23. Киреев Д.Е. Разработка тест систем на основе полимеразой цепной реакции для мониторинга вируса гриппа А:15.10.2007

24. Гаврилова, Елена Васильевна/Разработка метода видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.03 61 07-3/1059.

25. Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.01.03 / Щербаков Дмитрий Николаевич; [Место защиты: Гос. науч. центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"]

Электронные ресурсы:

26. ООО Научно-производственная фирма ЛИТЕХ: [Электронный ресурс]. 1992-2016. http://www.lytech.ru (Дата обращения: 17.05.2016)

27. НИИ ГРИППА- Лабораторная диагностика гриппа и ОРВИ: [Электронный ресурс] 2010-2016. http://www.influenza.spb.ru/ (Дата обращения: 19.05.2016)



Приложение

ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

Взять пробирки на 1,5 мл с завинчивающейся крышкой для обработки необходимого количества проб и контролей, промаркировать. В пробирки, предназначенные для клинических проб, внести отдельными наконечниками 100 мкл пробы затем 300 мкл лизирующего раствора, перемешать на вортексе до полного суспендирования клеток.

Приготовление положительного контроля (ПК). В отдельную пробирку, , добавить 300 мкл лизирующего раствора, 95 мкл ОКО и 5 мкл ПКОInfluenza virus А/H1N1.

Приготовление отрицательного контроля (ОК). В отдельную пробирку, предназначенную для отрицательного контроля, добавить 300 мкл лизирующего раствора и 5 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК.

Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 10 мин, перемешивая осадок каждые две минуты.

Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

6.Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Повторить пункт 7.

Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

.В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат 65 °С на 5 мин.

.Процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР. Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при температуре не выше минус 16 °С

Проведение обратной транскрипции

Отобрать необходимое количество микропробирок объемом 0,2 (0,5) мл.

Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку c RT-mix внести 5 мкл RT-G-mix-1 (RT-G-mix-2), тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием.

К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировать 5 раз, перемешать на вортексе. Осадить капли с крышки пробирки кратковременным центрифугированием.

Внести в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси.

Используя наконечники с аэрозольным барьером, добавить по 10 мкл РНК- пробы в пробирки с реакционной смесью. Осторожно перемешать пипетированием.

Поставить пробирки в амплификатор (термостат) c температурой 37 °С на 30 мин.

Полученную в реакции обратной транскрипции к ДНК для последующей постановки ПЦР развести в 2 раза ДНК-буфером (к 20 мкл к ДНК отдельным наконечником с аэрозольным барьером добавить 20 мкл ДНК-буфера, аккуратно перемешать пипетированием 10 раз)

Размещено на Allbest.ru