Генетический полиморфизм тромбоцитспецифических антигенов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Генетический полиморфизм тромбоцитспецифических антигенов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Значение генов и антигенов системы НРА (Human Platelet Antigens) в различных областях медицины, в том числе трансфузиологии и трансплантологии (в частности при алломиелотрансплантации), определяется их разнообразием и высокой иммуногенностью.

Накопленные и обобщенные к настоящему времени данные по частоте генов НРА свидетельствуют о наличии расовых и популяционных особенностей их распространенности. Иммуногенетические характеристики НРА хорошо изучены у населения большинства стран Западной и Восточной Европы [Reviron D. et al., 1992; Simsek S. et al., 1993; Holensteiner A. et al., 1995; Kekomaki S. et al., 1995; Legler T.J. et al., 1996; Steffensen R. et al., 1996; Merieux Y. et al., 1997; Drzewek K. et al., 1998; Rozman P. et al., 1999; Jones D.C. et al., 2003], Африки [Mojaat N. et al., 1999; Ferrer G. et al., 2002; Halle L. et al., 2004; Paola J.D. et al., 2005], Азии [Santoso S. et al., 1993; Kim H.O. et al., 1995; Urwijitaroon Y. et al., 1995; Tanaka S. et al., 1996; Chang Y.W. et al., 1998; Seo D.H. et al., 1998; Lyou J.Y. et al., 2002; Halle L. et al., 2004; Kulkarni B. et al., 2005; Al-Subaie A.M. et al., 2006; Feng M.L. et al., 2006], Северной и Южной Америки [Covas D.T. et al., 1997; Chiba A.K. et al., 2000; Cardone J.D.B. et al., 2004; Toralles-Pereirac C. et al., 2005], Австралии [Bennett J.A. et al., 2002]. У населения Российской Федерации сведения об иммуногенетических параметрах НРА отсутствуют.

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) широко применяется в лечении больных заболеваниями системы крови, прежде всего, гемобластозами. После пересадки ГСК необходимо проводить мониторинг за их приживлением. Для этих целей используют различия реципиентов и их доноров по многим маркерам, так называемым «меткам». Маркерами могут быть гипервариабельные участки ДНК - тандемные повторы с изменяющимся количеством копий и короткие тандемные повторы [Демидова И.А. и Савченко В.Г., 1995; Демидова И.А., 1997; Демидова И.А. с соавт., 1997], половые хромосомы (если донор и реципиент являются разнополыми) [Виноградова О.А., 2001], эритроцитарные антигены различных систем [Зотиков Е.А. с соавт., 1996; Порешина Л.П., 2004] и др. Различия по перечисленным маркерам удается найти только у 80% близкородственных пар донор-реципиент [Bryant E., Martin P.J., 2004], поэтому поиск новых «меток» представляется весьма актуальным. В настоящее время интенсивно разрабатываются методические приемы, позволяющие изучать замены единичных нуклеотидов в генах (SNP - single nucleotide polymorphism). Эти методы позволяют быстро и качественно использовать полученные результаты для оценки приживления трансплантированных ГСК [Hochberg E.P. et al., 2003]. Полиморфизм НРА-генов обусловлен, в основном, заменой одного нуклеотида в структуре аллель-специфических сайтов. Фенотипическая экспрессия антигенов системы НРА определяется несколькими генами, локализованными на длинном плече 5, 17 и 22 хромосом. Гены системы HLA расположены на 6 хромосоме. В соответствии с законом Моргана локализация генов на разных хромосомах предполагает их независимое наследование. Таким образом, HLA-идентичные сибсы могут различаться друг от друга по НРА-генам. Изучение распределения НРА-генов у HLA-идентичных сибсов, один из которых болен онкогематологическим заболеванием и является потенциальным реципиентом близкородственных ГСК, позволит использовать различия по НРА для проведения мониторинга за приживлением алломиелотрансплантата.

Внутривидовые различия людей по антигенам систем НРА и главного комплекса гистосовместимости - HLA (Human Leukocyte Antigens), их иммуногенность, являются причиной аллоиммунизации пациентов при проведении трансфузионной терапии компонентами крови, прежде всего тромбоцитами. В то же время, совершенствование программ цитостатической полихимиотерапии больных гемобластозами немыслимо без трансфузионного обеспечения. Переливания тромбоцитов являются эффективным методом лечения и профилактики геморрагических осложнений, обусловленных дисфункцией, снижением количества тромбоцитов периферической крови вследствие аплазии кроветворения или замещения нормального гемопоэза опухолевыми клетками. Аллоиммунизация пациентов, являясь основной причиной развития иммунологических реакций негемолитического типа, может привести к полному отсутствию клинического эффекта от переливания тромбоцитов. Иногда после трансфузий тромбоцитов доноров, несовместимых с реципиентом как по НРА, так и HLA, в организме больного происходят тяжелые нарушения в иммунной системе, проявляющиеся в срыве иммунологической толерантности и развитии аутоиммунного процесса (аутоиммунной тромбоцитопении), приводящие к тяжелым геморрагическим проявлениям.

Проведенные ранее исследования больных с множественными трансфузиями тромбоцитов были посвящены аллоиммунизации преимущественно к антигенам главного комплекса гистосовместимости [Компанеец М.А. с соавт., 1992; Зотиков Е.А. с соавт., 1996], в то время как за рубежом подход к проблеме был комплексным - вместе с анти-HLA антителообразованием изучали и аллоиммунизацию к антигенам системы НРА [Kickler T.S. et al., 1990; Chow M.P. et al., 1992; Wernet D. et al., 1993; Novotny V.M.J. et al., 1995; Zimmerman R. et al., 1999]. Изучение частоты аллоиммунизации антигенами системы НРА и HLA больных гематологическими заболеваниями с множественными трансфузиями компонентов крови необходимо для правильного выбора доноров тромбоцитов. Доноров обычно выбирают из регистра, в который внесены данные по гено(фено) типу форменных элементов крови - эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов. Для вычисления числа НРА-типированных доноров, достаточного для трансфузионного обеспечения пациентов с заболеваниями системы крови, необходимо знание иммуногенетических параметров НРА здорового населения в локальной популяции или конкретной местности, в нашем случае представителей восточно-европейской популяции Российской Федерации, самоидентифицирующих себя как русские.

Цель исследования:

Изучить генетический полиморфизм тромбоцитспецифических антигенов и его значение при алломиелотрансплантации и в клинической трансфузиологии (при переливании тромбоцитсодержащих сред) у больных с заболеваниями системы крови.

Задачи исследования:

Определить иммуногенетические характеристики НРА представителей восточно-европейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские: частоты генов, аллелей, генотипов, гаплотипов, величину гаметной ассоциации и генетической дистанции, выявить особенности распределения НРА. Изучить распределение НРА-генов у HLA-идентичных сибсов в семьях, где один из детей болен гемобластозом.

Оценить возможность проведения мониторинга приживления близкородственного алломиелотрансплантата по генам НРА.

Определить частоту аллоиммунизации к антигенам систем НРА и HLA у гематологических больных после терапии компонентами крови. Изучить частоту реагирования анти-НРА антител у аллоиммунизированных больных.

Оценить влияние подбора доноров тромбоцитов иммунологическими методами аллоиммунизированным больным на эффективность трансфузий.

Определить величину контингента НРА-типированных доноров, необходимого для трансфузионного обеспечения совместимыми по антигенной структуре тромбоцитами первичных больных с аплазией кроветворения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Применение молекулярных методов исследования позволяет изучить все иммуногенетические параметры НРА представителей восточно-европейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские, выявить особенности распределения НРА русских по сравнению с представителями иных популяций.

2) Независимое наследование HLA и HPA генов позволяет использовать имеющиеся различия по НРА между донором и реципиентом в качестве «метки» при оценке приживления близкородственного HLA-идентичного алломиелотрансплантата.

3) Частота аллоиммунизации к антигенам системы НРА у больных заболеваниями системы крови после множественных трансфузий тромбоцитов высока и превалирует над частотой аллоиммунизации к антигенам системы HLA.

Научная новизна исследования

Исследования по изучению полиморфизма НРА представителей восточно-европейского региона России, самоидентифицирующих себя как русские, проводились впервые. Рассчитаны все иммуногенетические характеристики НРА - частоты генов, аллелей, гено- и гаплотипов, величина неравновесного сцепления. Впервые по собственным данным частотных распределений аллелей НРА и литературным данным частоты НРА у представителей разных популяций вычислена величина генетической дистанции между русскими и иными народами. Впервые представлены данные по особенностям распределения НРА у русских при сравнении с результатами исследования зарубежных авторов. Впервые проведены исследования семей, доказано наследование генов GP2B и GP3A гаплотипами, выявлен кроссинговер между генами GP2B и GP3A материнской 17 хромосомы с формированием нового генотипа у одного из пяти детей.

Впервые показана частота и характер отличий по НРА HLA-идентичных сибсов.

Впервые в практике мировой трансплантологии доказана возможность проведения мониторинга приживления близкородственного алломиелотрансплантата по НРА-генам. Проведено сопоставление результатов мониторинга приживления стволовых гемопоэтических клеток по молекулярным и цитогенетическим маркерам, доказано, что критерии идентификации ремиссии и рецидива основного заболевания после алломиелотрансплантации совпадают.

Впервые в стране на большом материале представлена частота аллоиммунизации больных заболеванием системы крови после трансфузий тромбоцитов. Впервые проведен детальный анализ структуры аллоиммунизации у больных разными нозологическими формами заболеваний системы крови, определена частота реагирования анти-НРА антител.

Впервые подбор доноров тромбоцитов аллоиммунизированным больным выполнен двумя серологическими методами - методом иммуноферментного анализа и в лимфоцитотоксическом тесте. Предложен алгоритм и обоснована целесообразность проведения подбора донора тромбоцитов аллоиммунизированным больным по антигенам двух систем - НРА и HLA, который приводит к увеличению эффективности трансфузий тромбоцитов.

Практическая значимость

Полученные сведения по распространенности НРА-генов у русских использованы для вычисления величины контингента НРА-типированных лиц, необходимого для трансфузионного обеспечения больных с заболеваниями системы крови.

Собранные образцы ДНК доноров с установленным НРА - генотипом использованы как стандарты для создания отечественной системы генотипирования НРА.

Генетические различия гемопоэтических стволовых клеток реципиента и донора по НРА могут быть использованы для оценки приживления костного мозга.

Генотипирование по НРА можно применять в практической работе учреждений службы крови для трансфузионного обеспечения совместимыми по антигенной структуре тромбоцитами аллоиммунизированных больных.

Разработан алгоритм подбора доноров тромбоцитов больным, аллоиммунизированным к антигенам систем НРА и HLA.

Внедрение в практику

Результаты исследования внедрены в практику ГУ ГНЦ РАМН. Результаты работы используются при чтении лекций врачам, проходящих усовершенствование по специальностям «Иммуногематология», «Клиническая лабораторная диагностика», «Клиническая трансфузиология».

Работа выполнена в рамках следующих тем НИР: «Иммунологическая диагностика тромбоцитопений» (1997-1999) № гос. регистрации 01970000925 (Рук. академик Е.А. Зотиков), «Изучение иммуногенетических параметров тромбоцитспецифических антител (анти-НРА) у больных, сенсибилизированных в результате тромбоцито-, миело-, гемотрансфузий или иным путем» (2000-2002) № гос. регистрации 01200001737 (Рук. академик Е.А. Зотиков), «Изучение иммуногенетических параметров тромбоцитспецифических антигенов (НРА)» (2003-2005) № гос. регистрации 01200301548 (Рук. академик Е.А. Зотиков, канд. мед. наук Л.Л. Головкина).

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Новое в трансфузиологии» (Москва, 2000 г.), «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2000 г.), «Клиническая и производственная трансфузиология - единство целей» (Москва, 2001 г.), Пятой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001 г.» (г. Санкт-Петербург, 2001 г.), II Всероссийском съезде по трансплантологии и разработке искусственных органов (Москва, 2002 г.), V съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003 г.), VIII Европейском конгрессе международного общества трансфузиологов (Стамбул, Турция, 2003), на 8 Европейском симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и гранулоцитов (Руст, Австрия, 2004), научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004 г.), XIX Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Стамбул, Турция, 2005 г.), XXVIII конференции «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2005 г.), XX Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Осло, Норвегия, 2006), 9 симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и нейтрофилов (Тромсе, Норвегия, 2006), XXI Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Барселона, Испания, 2007 г.), Второй конференции иммуногенетиков «Восток-Запад» (Прага, Чехия, 2007), конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии» (Москва, 2007 г.), Ученом Совете ГУ ГНЦ РАМН (22 мая 2007 г.), 10 симпозиуме по иммунобиологии тромбоцитов и нейтрофилов (Тун, Швейцария, 2008). Апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии Гематологического научного центра РАМН «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» (16 июня, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 50 печатных работ, в том числе: монография «Тромбоциты и антитромбоцитарные антитела», глава в монографии «Основы трансфузионной иммунологии», 2 главы в монографии «Очерки по производственной и клинической трансфузиологии», статья в Российской энциклопедии, 8 статей (перевод одной статьи опубликован в США) и 12 тезисов в центральных российских журналах, рекомендованных ВАК; 2 статьи за рубежом и 10 тезисов в материалах Международных симпозиумов и конференций, в том числе 4 в иностранных журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 273 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 47 таблицами, 9 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список цитируемой литературы включает 50 отечественных и 308 зарубежных источников.

Данное исследование проведено в лаборатории иммуногематологии Гематологического научного центра РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор А.И. Воробьев), а также в институте трансплантации костного мозга и молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (директор - член-корр. РАМН, профессор В.Г. Савченко), в лаборатории молекулярной гематологии (зав. - к.б.н. А.Б. Судариков), в кариологической лаборатории совместно с к.м.н. О.А. Виноградовой (зав. - профессор, д.м.н. Е.В. Домрачева), в отделении экстракорпорального очищения крови (зав. - профессор, д.м.н. Н.Н. Калинин) и в научном содружестве с другими лабораториями и отделениями ГУ ГНЦ РАМН. Расчет величины НРА-типированных доноров выполнен совместно с заведующим лабораторией биостатистики к.т.н. С.М. Куликовым.

Содержание работы

кровь ген алломиелотрансплантат гематологический

Общая характеристика материала и методов исследования

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток выполнена в институте трансплантации костного мозга и молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (директор - член-корр. РАМН, профессор В.Г. Савченко) 50 больным с заболеваниями системы крови: хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в хронической фазе - 17, в фазе акселерации - 1; миелодиспластическим синдромом - 9, из них рефрактерной анемией с избытком бластов - 8, хроническим миеломонобластным лейкозом - 1; острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) - 7; острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ) - 3; острым миелобластным лейкозом - 6, острым миеломонобластным лейкозом - 3; острым недифференцированным лейкозом - 3; альвеолярной рабдомиосаркомой - 1. Возраст больных - от 15 до 64 лет (медиана 29,7 лет), из них 23 женщины и 27 мужчин. Трансплантация от донора противоположного пола осуществлена 28 пациентам: 13 женщинам и 15 мужчинам, от донора одного пола - 22 (10 женщинам и 12 мужчинам). Источником гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) у 46 больных были стволовые клетки костного мозга, у 4 - периферической крови. Кондиционирование перед трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток проводили в миелоаблативном режиме (35 больным) или режиме пониженной интенсивности (15 больным). Приживление пересаженных гемопоэтических стволовых клеток донора наблюдали в соответствии с протоколом: на +30^ые, +60^ые, +90^ые сутки, затем каждые 3 месяца в течение первого года, затем 1 раз в полгода. Самый длительный период наблюдения составил 4 года. Донорами ГСК были HLA-идентичные сибсы, лимфоциты которых были ареактивны в смешанной культуре с лимфоцитами больного. Возраст доноров колебался от 9 до 56 лет (медиана 28,4 лет). Тканевое типирование пар донор-реципиент серологическим методом выполняли совместно со старшим научным сотрудником лаборатории иммуногематологии к.б.н. Р.М. Кутьиной. Реакцию смешанной культуры лимфоцитов проводила ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии к.м.н. А.П. Шпакова (зав. лабораторией - профессор, д.м.н. Т.И. Булычева).

Исследованы 724 образца ДНК 576 человек. Типировано по НРА-генам: 17 сотрудников ГНЦ РАМН, 120 человек разных национальностей, 217 членов 80 семей, в которых один ребенок страдал заболеванием системы крови. После алломиелотрансплантации мониторинг приживления гемопоэтических стволовых клеток проводили на 173 образцах ДНК, полученных от 30 больных. Генотипирование выполняли с помощью коммерческой тест-системы фирмы «Protrans» (ФРГ). НРА-генотипирование отечественными праймерами выполнили 197 донорам ГНЦ РАМН совместно со старшим научным сотрудником лаборатории молекулярной гематологии к.м.н. Т.В. Макарик и заведующим лабораторией молекулярной гематологии, к.б.н. А.Б. Судариковым.

Для серологического HLA-типирования и определения анти-HLA антител в сыворотках больных применяли микролимфоцитотоксический тест. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови на градиенте плотности (смесь фиколла и верографина) с удельной плотностью 1,077 г./мл. Серологическое типирование локусов HLA-A, - B, - C проводили с помощью гистотипирующих сывороток фирмы «Гисанс» (г. Санкт-Петербург) и сывороток Республиканской станции переливания крови г. Минск (Республика Беларусь). Определяли 21 антиген локуса HLA-А, 43 антигена локуса HLA-В и 8 антигенов локуса HLA-С. Для идентификации специфичности анти-HLA антител в сыворотках больных использовали лимфоциты доноров, типированных по системе HLA.

Скрининг антитромбоцитарных антител у больных с разными формами тромбоцитопении был выполнен в 1950 образцах сывороток от 866 больных; из них было отобрано 950 образцов сывороток от 385 больных с повторными трансфузиями компонентов крови, находившихся на лечении в ГНЦ РАМН в периоды с 2000 г. по 2002 г. и с 2005 г. по 2007 г. Больные были разделены на группы в зависимости от диагноза: с апластической анемией (АА) - 100, острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) - 50, острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) - 77, миелодиспластическим синдромом (МДС) - 67, хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) - 39, хроническим миелолейкозом (ХМЛ) в бластном кризе - 28, анемиями различного генеза (кроме АА) - 8, после трансплантации костного мозга (ТКМ) - 16. Для скрининга антител в сыворотках больных использовали лимфоциты и тромбоциты 4000 доноров.

Для определения антитромбоцитарных антител в сыворотках больных проводили иммуноферментный анализ (ИФА) в 96-луночных планшетах с плоским дном с использованием нативных и модифицированных (с инактивированными HLA) тромбоцитов доноров. Все исследования выполняли в трех дублях. В качестве отрицательного контроля применяли пул сывороток от 10 доноров-мужчин АВ(IV) группы. Положительным контролем служили сыворотки с анти-HLA антителами и аутоиммунными или аллоиммуными антитромбоцитарными антителами. Положительный результат контрольных сывороток с антитромбоцитарными антителами свидетельствовал об активности конъюгатов. Количественную оценку окрашивания оценивали на ридер-мультискане при длине волны 492 нм. Показатель оптической плотности пула сывороток AB(IV) группы соответствовал значению 0,2. Активность исследуемых сывороток определяли путем сравнения с активностью пула сывороток AB(IV) группы: коэффициент активности вычисляли путем деления показания оптической плотности исследуемых сывороток на показание оптической плотности отрицательного контроля. Положительным результатом считали значение коэффициента равное или более 1,5 [Sintnicolaas K. et al., 1987].

Результаты исследования сыворотки пациента в ИФА трактовали после получения результатов выполняемого параллельно лимфоцитотоксического теста с лимфоцитами доноров, от которых были получены тромбоциты. Исследования проводили в динамике и заключение о наличии анти-НРА и / или анти-HLA антител делали после повторного исследования сывороток больных через 7-10 дней.

Для постановки полимеразной цепной реакции с праймерами фирмы «Protrans» использовали ДНК, которую выделяли из лейкоцитов цельной периферической крови и ядросодержащих клеток костного мозга после селективного лизиса эритроцитов по авторской методике и на специальных фильтрах фирмы «Protrans». Концентрацию и чистоту ДНК определяли на спектрофотометре: одна оптическая единица (OD) соответствовала 50 мкг/мл, чистоту определяли соотношением показателей при 260 нм и 280 нм (OD260/OD280): в реакции использовали только ДНК с показателями OD260/OD280 в диапазоне 1,65 - 1,8.

Полимеразную цепную реакцию с аллель-специфичными праймерами (ASP-PCR) фирмы «Protrans» выполняли по методике, предложенной производителем. Регистрацию результатов осуществляли в ультрафиолетовых лучах с длиной волны 312 нм после прокрашивания ДНК 1% бромистым этидием и проведения электрофореза в 2% агарозном горизонтальном геле. Продукты амплификации визуализировались в виде полос красно-оранжевого цвета. Постановку реакции считали корректной при получении двух полос - внутреннего коммерческого контроля и испытуемого образца ДНК. Длины амплифицированных участков ДНК были следующими: для НРА-1 - 190 пар нуклеотидов (п.н.), НРА-2 - 240 п.н., НРА-3 - 290 п.н., НРА-4 - 120 п.н., НРА-5 - 260 п.н., НРА-6w -260 п.н.

Для постановки ПЦР с модифицированными отечественными праймерами ДНК доноров выделяли из лейкоцитов по модифицированному «солевому» протоколу [Viller S. с соавт., 1988]. Для каждого НРА антигена использовали два аллель-специфичных праймера, различающихся одним нуклеотидом на 3` конце, последовательности которых соответствовали последовательности геномной ДНК, кодирующей искомые белки. С целью оптимизации условий и температурного режима амплификации праймеры для НРА-3, - 5 локусов были модифицированы (к.б.н. А.Б. Судариковым) таким образом, чтобы все праймеры работали при температуре отжига 68⁰С.

Каждую реакцию контролировали включением пары праймеров, которые амплифицировали фрагмент размером 434 п.н. гена фактора роста человека [Olerup O. et al., 1992]. Для каждого образца выполняли десять отдельных реакций. Каждая пробирка ПЦР реакции содержала аллель-специфичный праймер, общий праймер и пару праймеров положительного внутреннего контроля. Программа амплификации адаптирована для прибора Perkin Elmer: 95⁰С, 5 минут; 25 циклов: 95⁰С, 30 секунд; 68⁰С, 1 минута; 72⁰С, 45 секунд. Электрофорез проводили при 200 вольт в течение 15 мин в 2% агарозном геле и буфере TBE.

В методе флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) использовали зонды CEPXSG/CEPY() SO (к центромерным участкам X/Y хромосом) (Vysis, США) и LSI BCR-ABL DCDF (Vysis, США). Гибридизацию исследуемой ДНК с ДНК-зондом проводили по протоколу и совместно с научным сотрудником лаборатории кариологии к.м.н. О.А. Виноградовой (зав. - профессор, д.м.н. Домрачева Е.В.) [Виноградова О.А. с соавт., 2001]. Результаты анализировали на эпифлюоресцентном микроскопе Zeiss Axioplan с тройным фильтром (DAP/FITC/Texas Red).

Статистическая обработка данных

Экспериментально полученные частоты кодоминантно наследуемых диаллельных генов НРА считали непосредственно по результатам генотипирования обследуемых лиц (метод прямого подсчета генов по Фишеру).

Расчет частот НРА-генов проводили по формуле [Фогель Ф., Мотульски А., 1989]:

P₁= D + Dd/2 (1),

где P₁ - частота первого гена, D - частота гомозиготных особей по первому гену,

Dd - частота гетерозиготных особей.

P₂ = d +Dd/2 (2),

где P₂ - частота второго гена.

Коррекцию экспериментально полученных генных частот не проводили, поскольку использовали прямой подсчет результатов генотипирования.

На основе экспериментально полученных генных частот рассчитывали ожидаемые частоты генотипов по формуле:

p²AA+2pqAB+q²BB (3),

где p²AA - число лиц, гомозиготных по первому гену

q²BB - число лиц, гомозиготных по второму гену

2pqAB - число лиц, гетерозиготных по обоим генам диаллельной системы.

Частоту особей гомозиготных по первому гену вычисляли по формуле:

АА= p² x N (4),

гомозиготных по второму аллельному гену - по формуле: BB=q² x N (5), частоту гетерозиготных индивидумов - по формуле:

AB=2pq x N (6),

где N - число исследованных лиц, p - частота первого аллельного гена, q - частота второго аллельного гена.

Коррекцию ожидаемых генных частот проводили после определения значения D = 1 - (p₁ + p₂). Тогда скорректированная частота гена p₁ = р₁' (1+ D/2), p₂ = p₂' (1+ D/2), где р₁' и p₂' - ожидаемые некорректированные генные частоты [Фогель Ф., Мотульски А., 1989].

Степень достоверности существующего распределения генов в популяции устанавливали при сравнении экспериментально полученных и расчетных данных путем определения показателя ² по формуле:

² = (0 - Е)²/Е (7), где

- сумма разностей, 0 - экспериментально полученные значения, Е - расчетные данные.

Вероятность Р для отклонения от ожидаемого значения брали из таблицы значения ² (таблица Фишера) с соответствующей степенью свободы. Число степеней свободы равно числу классов минус 1. Для 5%-го уровня значимости при одной степени свободы ² = 3,84, при двух степенях свободы ² = 5,991 [Гланц С., 1999].

Для таблицы 2х2 или при степени свободы v=1 добавляли поправку Йетса:

² = (/0 - Е/ -0,5)²/Е (8).

Полученные значения генных частот применяли для определения частоты гаплотипов и величины гаметной ассоциации.

Экспериментальные частоты гаплотипов НРА-1, - 3 определяли непосредственно из результатов НРА-генотипирования. Ожидаемую частоту указанных гаплотипов рассчитывали по формуле:

H= p₁ x p₂ + (9),

где

p₁ и p₂ - ожидаемые частоты аллелей генов в популяции,

Н - частота гаплотипа при свободной рекомбинации,

- величина неравновесного сцепления или гаметная ассоциация.

Величину неравновесного сцепления вычисляли по формуле:

= d/ N - (b+d) (c+d)/N² (10), где

b, c - число индивидумов с одним из рассматриваемых генов, d - число индивидумов без обоих генов, a - число людей с обоими генами, N - сумма данных по таблице 2х2 или a+b+c+d.

Коэффициент корреляции вычисляли по формуле:

r = v²/N (11), где

N - сумма данных по таблице 2х2 или a+b+c+d.

² = (ad-bc) 2 x N: [(a+c) (c+d) (a+c) (b+d)]

Генетическую дистанцию между народами (популяциями) рассчитывали по формуле [Зарецкая Ю.М., Абрамов В.Ю., 1986]:

d _1,2 =v? (р₁ - р₂)² / n (12),

где d_1,2 - генетическая дистанция между популяциями 1 и 2, р₁ и р₂ - частота аллеля в популяциях, n - количество сравниваемых пар аллелей.

Проверка нулевой гипотезы о совпадении наблюдаемой (выборочной) и ожидаемой (популяционной) частот осуществляли по значению критерия z [Реброва О.Ю., 2002] с последующим вычислением значения р при помощи программы BIOSTAT.

Анализ количественных значений скорректированного посттрансфузионного прироста тромбоцитов проводили с помощью параметрического t-критерия Стъюдента [Гланц С., 1999].

Анализ качественных признаков проводили с помощью непараметрического критерия ² путем построения четырехпольной таблицы сопряженности 2х2. При ожидаемых значениях в любой из клеток таблицы меньше 5 использовали точный критерий Фишера. Сравнение двух количественных выборок (количество доз перелитых тромбоцитов, количество трансфузий тромбоцитов, длительность нейтропении и тромбоцитопении после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток) проводили при помощи непараметрического Т-критерия Манна-Уитни [Гланц С., 1999].

Для оценки величины необходимого донорского контингента были сделаны следующие допущения:

1. Доноры и реципиенты однородны в генетическом аспекте, то есть принадлежат одной локальной популяции.

2. Совместимость реципиента и донора определялась по локусам HPA 1, 2, 3, 5 по следующему правилу: а) гомозиготный по гену конкретного локуса реципиент совместим только с гомозиготным по тому же аллельному гену донором; б) гетерозиготный по аллельным генам конкретного локуса реципиент совместим (по этому локусу) с донором, имеющим гены в гомо- или гетерозиготном состоянии; в) донор и реципиент должны быть совместимы по всем клинически значимым генам локусов HPA (НРА - 1,2,3,5).

3. Создание контингента НРА-типированных доноров считали практически целесообразным, если удавалось подобрать необходимую для курса терапии группу доноров для одного реципиента с 90% вероятностью.

4. Для обеспечения курса трансфузионной терапии одному больному апластической анемией необходимо в среднем не менее 100 потенциальных доноров, количество которых было взято с учетом вероятного отказа донора от изъятия у него тромбоцитов или его временной недосягаемости.

Для обозначения генотипа донора / реципиента использовали следующую форму:

G = g₁, g₂, g₃, g₅ (13),

где g_i - генотип по i-локусу, т.е. g_i = {aa, ab, bb}, i={1,2,3,5}.

Весь список возможных комбинаций генотипа по 4 локусам выглядел следующим образом: G₁=aa aa aa aa, G₂=ab aa aa aa, G₃=bb aa aa aa, G₄=aa ab aa aa …G₈₁=bb bb bb bb.

Пусть P={p₁, p₂, …, p₈₁} - распределение вероятности генотипа в исследуемой популяции. Вероятность HPA совместимости реципиента с генотипом G_k и случайного донора вычисляли по формуле:

(14), где

p_i - вероятность генотипа G_i, d_ki - индикатор совместимости генотипа реципиента G_k и генотипа донора G_i (то есть: d_ki =1, если генотипы совместимы, d_ki = 0 - в противном случае).

Считали, что доноров отбирают из популяции случайно, т.е. без плановой селекции по генотипам. В этом случае распределение генотипов в группах доноров и реципиентов будет популяционным.

Вероятность того, что в банке доноров объема N число совместимых с генотипом G_k меньше чем m, вычисляли в соответствии с биноминальным распределением:

(15), где

S_k - условная вероятность совместимости с генотипом реципиента G_k вычисляемая по формуле (14).

Если реципиентов выбирают из той же популяции, что и доноров, то общая вероятность неудачи подбора необходимого числа m доноров из пула объема N будет складываться из вероятностей частных неудач для конкретных генотипов (G_k):

(16)

Зависимость вероятности неудачи подбора HPA доноров рассчитывали для различных объемов банка доноров с помощью формул (13-16), в которые, вместо теоретического распределения {p_k.k=1,…, 81}, подставляли полученные нами значения частот генотипов у доноров (использовали программу на MS EXCELL).

Основные результаты исследования

Генотипирование по системе НРА выполнено у 297 индивидумов, идентифицирующих себя как русские. Установлено, что все доноры были гомозиготны по аллельному гену «а» локусов НРА-4 и НРА-6w (таблица 1). Аллельные гены «a» и «b» локуса НРА-1 обнаружены у 95,62% и 27,61% доноров, соответственно; генотипы НРА-1а/1а встречались у 72,39%, НРА-1а/b - у 23,23%, НРА-1b/b - у 4,38%. Аллельный ген НРА-2а был обнаружен у 97,98%, НРА-2b - у 23,57%, генотип НРА-2а/а - у 76,43%, НРА-2а/b - у 21,55%, ген НРА-2b в гомозиготном состоянии (НРА-2b/b) был выявлен у 2,02% обследованных лиц. Частота генов локуса НРА-3 составила: аллеля НРА-3а - 80,81%, аллеля НРА-3b - 69,70%. Генотип НРА-3а/а обнаружен у 30,64% людей, НРА-3а/b - у 50,17%, НРА-3b/b - у 19,19%. Частота генотипа НРА-5а/а составила 83,165%, НРА-5а/b - 15,49%, НРА-5b/b - 1,346%. В целом наши сведения о частоте аллелей и генотипов НРА у русских оказались сопоставимы с частотами генов у представителей некоторых европейских популяций (словенами, македонцами, поляками, нидерландцами, финнами, австрийцами, британцами). Выявлены достоверные различия в частоте генов НРА-1 локуса между русскими и жителями Марокко, Туниса, Юго-Восточной Азии (Кореи, Китая, Японии), в частоте генов НРА-2 локуса - с немцами, нидерландцами, корейцами, в частоте НРА-3 локуса - с марокканцами и японцами, в частоте НРА-5 локуса - со всеми представителями Юго-Восточной Азии.

Таблица 1. Частота аллельных генов и генотипов НРА у обследованных лиц

Локусы НРА	Частота аллелей (%)	Частота генотипов (%)
	а	b	aa	ab	bb
НРА-1	95,62	27,61	72,39	23,23	4,38
НРА-2	97.98	23,57	76,43	21,55	2,02
НРА-3	80,81	69,70	30,64	50,17	19,19
НРА-4	100	0	100	0	0
НРА-5	98,65	17,85	83,165	15,49	1,346
НРА-6	100	0	100	0	0

Генные частоты «а» и «b» аллелей НРА определены как 0,84 и 0,16 для локуса НРА-1; 0,87 и 0,13 для НРА-2; 0,557 и 0,443 для НРА-3; 0,91 и 0,09 для НРА-5. Частота генов НРА-4а и НРА-6а составила 1,0, то есть доноры с редким аллельным геном «b» указанных локусов в исследованной выборке не встретились (таблица 2).

Таблица 2. Частота аллельных генов и генотипов НРА у обследованных лиц (в долях единицы)

Локусы НРА	Генная частота аллелей	Частота генотипов
	a	b	a/a	a/b	b/b
НРА-1	0,84	0,16	0,7239	0,2323	0,0438
НРА-2	0, 87	0, 13	0,7643	0,2155	0,0202
НРА-3	0, 557	0,443	0,3064	0,5017	0,1919
НРА-4	1,0	0	1,0	0	0
НРА-5	0,91	0,09	0,83165	0,1549	0,01347
НРА-6	1,0	0	1,0	0	0

Полученные данные по частоте генов и генотипов хорошо согласовывались с частотой, предсказанной на основе закона Харди-Вейнберга, что свидетельствовало об адекватности и корректности проведенных исследований.

Продемонстрировано, что гены локусов НРА-1 и НРА-3, локализованные на одной хромосоме в одном сегменте, наследуются сцепленно гаплотипами. На основании экспериментально полученных данных из популяционных и семейных исследований по количеству индивидуумов с разными сочетаниями аллельных генов локусов НРА-1 и НРА-3 вычисляли частоту гаплотипов аллельных генов НРА-1/3. Частота гаплотипа НРА-1а/3а составила 45,76%; НРА-1а/3b -36,23%; HPA-1b3a - 11,23%, HPA-1b/3b - 6,78%. Вычисленные ожидаемые частоты гаплотипов полностью соответствовали экспериментально полученным данным.

Неравновесное сцепление генов означает, что некоторые аллели, расположенные рядом в гене, могут появляться вместе в одном и том же гаплотипе более часто, чем это можно было ожидать при случайном их появлении. На гены НРА этот феномен может также распространяться, ибо является установленным факт, что гены, кодируюшие синтез аллоантигенов локусов НРА-1 и НРА-3, локализованы в одном сегменте длинного плеча 17^ой хромосомы - 17q21-32. Известно, что ген GP2B, с локализованным внутри него геном, кодирующим синтез аллоантигенов локуса НРА-1, находится со стороны 3' - конца гена GP3A, внутри которого находится ген, кодирующий синтез аллоантигенов локуса НРА-3, причем физически эти два гена картированы внутри 260-килобазного Sfi I фрагмента [Bray P.F. et al., 1988]. Вычисление величины неравновесного сцепления генов с учетом частоты аллеля в популяции показало наличие незначительной гаметной ассоциации между генами НРА-1a и НРА-3b, HPA-1b и НРА-3a (таблица 3).

Таблица 3. Величина гаметной ассоциации между аллельными генами локусов НРА-1 и НРА-3

Гаплотипы	Величина гаметной ассоциации
НРА-1а/3а	-0,018
НРА-1а/3b	0,01474
НРА-1b/3a	0,0081
НРА-1b/3b	-0, 0071

В литературе недостаточно полно освещены вопросы, касающиеся наследования НРА-1/3, локализованных на гликопротеидах IIb и IIIa. На основании проведенных нами семейных исследований продемонстрировано, что гены, кодирующие синтез НРА-1 и НРА-3, наследуются сцепленно гаплотипами, аналогично генам системы HLA и Резус.

Для установления закономерностей наследственного формирования иммуногенетической характеристики представляло интерес исследовать частоты аллельных генов и генотипов НРА локусов 1-5 у HLA-идентичных сибсов. В исследование были включены 142 HLA-идентичных сибсов - здоровых (74 человека) и больных (68 человек) с разными формами лейкозов. HLA-идентичные братья и сестры составили между собой 71 пару: из 136 человек было сформировано 68 пар больной ребенок - здоровый ребенок, 6 здоровых детей составили 3 пары.

Анализ распределения НРА-генов показал полную их идентичность у 17 пар сибсов (23,94%) (таблица 4). Тридцать две пары сибсов (45,07%) имели отличия по одному аллельному гену, четырнадцать пар (19,72%) - по двум и семь пар (9,86%) - по трем аллельным генам разных локусов НРА. Всего было выявлено 79 различий по НРА. По аллельным генам первого локуса имели отличия 17 пар сибсов (21,52%), по генам второго локуса - четырнадцать пар (17,72%), третьего локуса (НРА-3) - тридцать две пары (40,51%), пятого локуса (НРА-5) - шестнадцать пар (20,25%).

Изучение симметрии процесса распределения аллельных генов по гаметам отцов и матерей показало отсутствие преобладающего наследования детьми какого-либо аллельного гена или генотипа НРА, что доказывает сохранение равновесия генных концентраций у представителей исследуемой популяции. Ни в одном случае мы не получили статистически достоверных различий между частотой аллельных генов и генотипов у родителей и их детей, что указывает на случайный выбор генотипов и генов из общего пула, то есть отсутствие избирательной селекции каких-либо гамет.

Таблица 4. Различия НРА-генов у сибсов, идентичных по антигенам системы HLA

	Число пар сибсов (n=71)
	идентичных по НРА	Отличающихся по локусам НРА	Отличающихся по аллельным генам локусов (абсолютное количество различий равно 79)
		одному	двум	трем	четы-рем	НРА-1	НРА-2	НРА-3	НРА-5
абс. число	17	32	14	7	1	17	14	32	16
%	23,94	45,07	19,72	9,86	1,41	21,52	17,72	40,51	20,25

Изучение генетической дистанции между народами по НРА показало близость русских к таким славянским народам как македонцы (d=2,36х10^-2), поляки (d=2,786х10^-2), словены (d=3,54х10^-2). Нидерландцы оказались в генетическом аспекте ближе к русским (d=3,87х10^-2), чем финны (d=4,842х10^-2), хотя известно, что в этногенезе великорусского народа принимали участие финно-угорские племена, проживавшие на Восточно-европейской равнине [Гумилев Л.Н., 2004]. Наибольшая величина генетической дистанции определена при сравнении генных частот НРА русских и представителей монголоидной расы - корейцев, китайцев и японцев (таблица 5).

Таблица 5. Генетическая дистанция между русскими и представителями иных популяций

Популяции	Генетическая дистанция, рассчитанная по генам системы НРА
	Абсолютная (х 10-2)	Относительная
Русские - словены	3,546	1
Русские - македонцы	2,36	0,67
Русские - поляки	2,786	0,79
Русские - нидерландцы	3,8725	1,09
Русские - финны	4,842	1,365
Русские - австрийцы	4,91	1,385
Русские - британцы	5,145	1,45
Русские - немцы	8,636	2,44
Русские - берберы	8,775	2,475
Русские - корейцы	10,08	2,82
Русские - китайцы	11,21	3,16
Русские - японцы	14,65	4,13

Полиморфизм генов, основанный на замене единичных нуклеотидов, является основным источником разнообразия человеческого генома [Hochberg E P. et al., 2003]. Существование аллельных вариантов НРА-генов основано, как правило, на замене одного нуклеотида в аллель-специфических сайтах. Вследствие различной хромосомной локализации генов HLA и НРА передача их детям от родителей будет происходить независимо. Следовательно, HLA-идентичные сибсы могут иметь отличия по НРА-генам, что и было показано нашими исследованиями: 76,06% HLA-идентичных сибсов различались по НРА. При близкородственной HLA-идентичной трансплантации гемопоэтических клеток эти различия могут служить информативными маркерами, которые позволят следить за судьбой трансплантированных клеток в организме реципиента.

Информативными считали те аллели НРА, которые не совпадали у реципиента и донора костного мозга. Среди них таковыми оказались аллельные гены локусов НРА-1, НРА-3, НРА-5 и НРА-2, поскольку чаще отличия между сибсами касались аллельных вариантов именно этих генов. Поскольку при приживлении гемопоэтических клеток происходит смена кроветворения реципиента на гемопоэз донора, то исчезновение маркеров реципиента и появления «метки» донора, свидетельствовало о репопуляции пересаженных стволовых клеток. Появление маркеров реципиента после их отсутствия свидетельствовало, как правило, о рецидиве заболевания.

Различия по НРА-генам нам удалось обнаружить у 37 из 50 (74%) пар сибсов, взятых на трансплантацию ГСК. Тринадцать пар HLA-идентичных сибсов были идентичны и по НРА. Информативность НРА-маркеров могла быть двунаправленной (то есть донор и реципиент имели различия по двум или более гетерозиготным аллелям НРА) или однонаправленной. Однонаправленные маркеры могли быть двух типов: 1) реципиент имел отличающийся аллель в гетерозиготном, а донор ГСК - в гомозиготном состоянии; 2) реципиент имел отличающийся аллель в гомозиготном, а донор ГСК - в гетерозиготном состоянии. Выборочные данные представлены в таблице 6. Двунаправленные НРА-маркеры были выявлены у 12 из 37 (32,4%) пар сибсов (например, №1-5). Однонаправленный НРА-маркер первого типа был выявлен у 13 (32,5%) пар сибсов (например, №6-8). По исчезновению клеток с собственным маркером НРА можно было судить о типе химеризма. То есть, у 27 пар донор-реципиент (в 67,5% случаев) мы могли достоверно идентифицировать донорский тип кроветворения - по исчезновению собственных маркеров реципиента и / или появлению «метки» донора. Однонаправленный НРА-маркер второго типа был выявлен у 12 (32,4%) пар сибсов. При репопуляции пересаженных стволовых клеток мог проявляться только маркер гетерозиготного донора (например, №9-12). Положительным моментом таких сочетаний аллелей являлась возможность идентифицировать отторжение трансплантата по исчезновению продукта амплификации аллельного гена НРА донора.

Таблица 6. НРА-метка при оценке приживления близкородственного алломиелотрансплантата (выборочные данные)

№	HLA-идентичные сибсы	Генотип НРА	Метка по генам НРА у реципиента после ТКМ
1	Аб-ва (больная)	1a/a, -2a/a, -3a/b, 5-a/a	Появление 1b+, 2b+ и исчезновение 3b+ клеток
	Аб-в (брат)	1a/b, -2a/b, -3a/a, -5a/a
2	Т-в (больной)	1a/a, -2a/a, -3a/a, -5a/b	Появление 3b+ клеток и исчезновение 5b+
	Т-в (брат)	1a/a, -2a/a, -3a/b, -5a/a
3	Кур-на (больная)	1a/b, -2a/a, -3a/a, -5a/a	Появление 3b+ клеток и исчезновение 1b+
	Кур-на (сестра)	1a/a, -2a/a, -3b/b, -5a/a
4	Шт.-ва (больная)	1a/a, -2a/a, -3a/b, -5a/a	Появление 1b+ клеток и исчезновение 1а+, 3b+
	Шт.-в (брат)	1b/b, -2a/a, -3a/a, -5a/a
5	Ш-ков (больной)	1a/b, -2a/b, -3a/a, -5a/a	Появление 3b+ клеток и исчезновение 2b+и
	Ш-кова (сестра)	1a/b, -2a/a, -3a/b, -5a/a
6	Ш-на (больная)	1a/a, -2a/a, -3a/b, -5a/b	Исчезновение 3b+ и 5b+ клеток
	Ж-кин (брат)	1a/a, -2a/a, -3a/a, -5a/a
7	Аб-на больная)	1a/a, -2a/a, -3a/b, -5a/b	Исчезновение 5b+ клеток
	Гул-в (брат)	1a/a, -2a/a, -3a/b, -5a/a
8	Кел-н (больной)	1a/a, -2a/b, -3a/b, -5a/a	Исчезновение 2b+ клеток
	Куд-ва (сестра)	1a/a, -2a/a, -3a/b, -5a/a
9	З-цев (больной)	1b/b, -2a/b, -3a/b, -5a/a	Появление 1а+ клеток
	М-на (сестра)	1a/b, -2a/b, -3a/b, -5a/a
10	Ов-ва (больная)	1a/a, -2a/a, -3b/b, -5a/b	Появление 3а+ клеток
	Ов-в (брат)	1a/a, -2a/a, -3a/b, -5a/b
11	Зин-ва (больная)	1a/a, -2a/a, -3b/b, -5a/a	Появление 3a+5b+ клеток
	Зин-ва (сестра)	1a/a, -2a/a, -3a/b, -5a/b
12	Шт.-рев (больной)	1a/a, -2a/b, -3a/a, -5a/a	Появление 5b+ клеток
	Шт.-рев (брат)	1a/a, -2a/b, -3a/a, -5a/b

Мониторинг приживления ГСК по изменению НРА-генотипа ядросодержащих клеток провели 30 больным, которым была выполнена алломиелотрансплантация: 24 после миелоаблативного режима кондиционирования и 6 после режимов кондиционирования пониженной интенсивности. Применение молекулярного метода позволило следить за приживлением алломиелотрансплантата, определять тип кроветворения в конкретные сроки после трансплантации ГСК. Полный донорский химеризм на +30 и +60 дни достоверно чаще выявляли у больных после применения миелоаблативных режимов кондиционирования по сравнению с больными после проведения режимов кондиционирования пониженной интенсивности. Сопоставление результатов мониторинга приживления ГСК по молекулярным и цитогенетическим маркерам у больных позволило диагностировать молекулярную и цитогенетическую ремиссию в 38 случаях, предполагать рецидив в 6, выявить персистенцию клеток с маркерами реципиента в 10 случаях. В целом результаты молекулярного исследования по НРА совпали с критериями идентификации ремиссии или рецидива по цитогенетическим маркерам.

Изучение факторов, влияющих на восстановление показателей периферической крови, особенно количество нейтрофилов и тромбоцитов, у больных после трансплантации ГСК, имеет большое значение. Восстановление показателей периферической крови напрямую зависит от приживления трансплантированных ГСК, что, в первую очередь, определяется степенью совместимости донора и реципиента по антигенам главного комплекса гистосовместимости [Debili N. e.a., 2001; Emambokus N.R., Frampton J., 2003]. При выборе донора гемопоэтических стволовых клеток, как правило, не учитывают соответствие антигенной структуры эритроцитов и тромбоцитов донора и реципиента.

Влияние несовместимости по НРА-генам донора и реципиента на восстановление показателей нейтрофилов и тромбоцитов периферической крови не изучено. Под несовместимостью понимают привнесение с трансплантированными клетками тромбоцитарных антигенов, отсутствующих у реципиента. Можно предположить, что различия реципиента и донора по НРА тромбоцитарных гликопротеидов, являющихся адгезивными молекулами и экспрессированными на CD34+ и более зрелых клетках миелогемопоэза [Debili N. et al., 1992, 2001; Gomez-Espuch J. et al., 1999; Lepage A. et al., 2000; Kanaji T. et al., 2004; Taichman R.S., 2005], могут оказывать влияние на плотность контакта стволовых клеток и некоммитированных клеток-предшественниц гемопоэза с клетками микроокружения и внеклеточным матриксом костного мозга. От плотности этого контакта будет зависеть пролиферативный потенциал стволовых клеток и некоммитированных клеток-предшественниц гемопоэза, а, следовательно, и сроки восстановления количества нейтрофилов и тромбоцитов периферической крови у больных после алломиелотрансплантации.

Больные были разделены на группы - НРА-идентичные (1-ая группа, 11 человек), НРА-совместимые (2-ая группа, 12 человек) и НРА-несовместимые (3-я группа, 17 человек). Совместимыми с реципиентом считали доноров ГСК с точки зрения непривнесения нового антигена системы НРА c трансплантированными клетками, то есть имеющих различающиеся аллельные НРА-гены в гомозиготном состоянии, в то время как реципиенты имели гетерозиготные варианты аллелей НРА. В группу больных, НРА-несовместимых с донором, вошли гомозиготные реципиенты с трансплантированными ГСК от гетерозиготных доноров и реципиенты, отличающиеся от доноров по аллелям целого локуса. О начале восстановления нейтрофилов после трансплантации ГСК судили по достижению ими значения более или равного 0,5х10⁹ кл/л. Началом восстановления количества тромбоцитов в периферической крови считали достижение значение 50х10⁹ кл/л после прекращения трансфузий тромбоцитсодержащих сред. Из подсчета были исключены больные (10 человек) с ранним рецидивом после трансплантации ГСК, с фиброзом стромы костного мозга, с несостоятельностью трансплантата, со смешанным химеризмом на +30 день, а также больные, получавшие противовирусные препараты в лечебных дозах из-за их миелотоксического эффекта. Различий в клинической характеристике между больными выделенных групп не было.