Идентификация штамма Echinococcus granulosus и генетические факторы риска гидатидозного эхинококкоза на Южном Урале

Возбудитель эхинококкоза у детского населения Башкортостана. Структурные элементы генетической компоненты индивидуальной подверженности к эхинококкозу детей, инвазированных штаммом G1 E. granulosus. Определение полиморфизма аллелей генов-кандидатов.

Рубрика Медицина
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 22.01.2018
Размер файла 1,4 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

идентификация штамма Echinococcus granulosus И Генетические факторы риска гидатидозного эхинококкоза на Южном Урале

03.00.19 - паразитология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Лукманова Гульнур Ишмурзовна

Москва - 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Викторова Татьяна Викторовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Чебышев Николай Васильевич

доктор медицинских наук, профессор

Токмалаев Анатолий Карпович

доктор медицинских наук, профессор

Довгалев Анатолий Семенович

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский

институт микробиологии и паразитологии

Роспотребнадзора (г. Ростов-на-Дону)

Защита состоится « 23 » октября 2008 г. в «1400» часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.12 при ГОУ ВПО «Московская медицинская академия имени И. М. Сеченова Росздрава». Адрес: 119992, Москва, ул. М. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский просп., д. 49).

Автореферат разослан «____» сентября 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Фролова Александра Александровна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Высокий уровень заболеваемости эхинококкозом является серьезной экологической и медико-социальной проблемой для многих стран с разными природно-климатическими и социально экономическими условиями [Daneshbod Y., 2004; Oudni M. et al., 2004; Hashemitabar G.R. et al., 2005; Sapkas G.S. et al., 2006; Varcasia A. et al., 2007], в том числе и для ряда регионов Российской Федерации, к которым относится и Южный Урал [Бессонов А.С., 2001]. За последние пять лет показатель заболеваемости эхинококкозом в России увеличился в 3 раза, при этом в структуре заболевших 14,4% составляли дети, что свидетельствует об интенсивности передачи инвазии и неэффективности проводимых мероприятий [Онищенко Г.Г., 2006]. В Республике Башкортостан за последние десять лет количество детей и подростков, больных эхинококкозом, возросло в 5 раз [Гумеров А.А. и др., 2006; Шангареева Р.Х. и др., 2006]. Эти факты диктуют необходимость разработки новых подходов в профилактике эхинококкозов.

Важнейшим звеном в решении проблемы является типирование таксономической принадлежности возбудителя заболевания. Немаловажное значение в эпидемиологии и эпизоотологии эхинококкозов имеют биологические отличия изолятов Echinococcus из разных паразитарных систем [Коваленко Ф.П., 1998; Thompson R.C., McManus D.P., 2002]. Использование методов молекулярной биологии позволило дифференцировать десять внутривидовых вариантов (штаммов, генотипов, биоваров) E. granulosus: G1 - «общий, домашних овец»; G2 - «тасманийских овец»; G3 - «буйволов»; G4 - «лошадей»; G5 - «крупного рогатого скота»; G6 - «верблюдов»; G7 - «свиней»; G8 - «северных оленей»; G9 - «человека»; G10 - «Fennoscandian cervid» [Bowles J. et al., 1992; 1995; Bowles J., McManus D.P. 1993; Scott J.C. et al. 1997; McManus D.P., 2002; Kamenetzky L. et al., 2002; Lavikainen A. et al. 2003]. Важная биолого-эпидемиологическая особенность штаммов E. granulosus - их неодинаковая инвазивность для человека [Ястреб В.Б., Скворцова Ф.К., 1990; McManus D.P. et al., 1994; Bart J. et al., 2006]. Большинство исследователей считают человека наиболее восприимчивым к овечьему штамму с генотипом G1 [McManus D.P. et al., 1994; Thompson R.C., McManus D.P., 2002; Dinkel A. et al., 2004; Bart J. et al., 2006]. Хотя описаны случаи инвазии и другими штаммами, например, в Аргентине у 42% больных гидатидозным эхинококкозом людей были идентифицированы штаммы G2, G5 и G6 [Naidich A. et al., 2006]. В литературе не описано ни одного случая инвазии человека E. equinus (штамм G4). Биологическая сущность этих явлений пока только начинает изучаться.

Определение у E. granulosus внутривидового полиморфизма имеет огромное практическое значение для совершенствования мероприятий по снижению уровня заболеваемости эхинококкозом [McManus D.P., Thompson R.C., 2003]. В настоящее время во многих странах ученые ведут поиск эффективных диагностических тестов и профилактических вакцин против ларвальных цестодозов, в том числе эхинококковых гидатидозов, для разработки которых необходимо типирование штаммовой принадлежности и определение популяционной индивидуальности возбудителя [Озерецковская Н.Н., 2001; Одоевская И.М., 2007; Arend A.C. et al., 2004; Carmena D. et al., 2006; Muzulin P.M. et al., 2007]. В Республике Башкортостан подобные исследования ранее не проводились. Очевидно, что для характеристики эпидемиологической ситуации в Южно-Уральском регионе необходимо располагать данными о структуре популяций E. granulosus.

Определенные трудности в профилактике гидатидозного эхинококкоза создает недостаточность сведений об индивидуальной восприимчивости человека к штаммам E. granulosus. Считается, что клиническая реализация эхинококковой инвазии происходит менее чем у 1% людей [Тумольская Н.И., 1992]. Известны случаи бессимптомного течения эхинококковой болезни или со слабо выраженными симптомами, которые заканчивались полным выздоровлением [Журавец А.К., 2004].

К числу наиболее актуальных аспектов проблемы эхинококкозов относятся вопросы выявления факторов, влияющих на развитие заболевания, причин возникновения осложнений и рецидивов [Тумольская Н.И., 1992]. Мало изучены механизмы, обусловливающие локализацию эхинококковой кисты в организме человека [Zahawi H.M. et al., 1999].

В последнее время сформулирована концепция, согласно которой характер течения и исход паразитарных заболеваний зависит от предрасполагающих факторов, многие из которых генетически детерминированы [Cooper P.J. et al., 2003; Quinnell R.J., 2003]. В некоторых случаях описывают врожденную, генетически обусловленную, резистентность человека к инвазии гельминтами [Антонов М.М. и др., 2004]. Одним из методов анализа роли генетических факторов в возникновении и развитии заболеваний является исследование ассоциаций с генетическими маркерами, что позволяет определять группы риска, обосновывать индивидуальную профилактику и превентивную терапию [Баранов В.С. и др., 2000]. В этой связи поиск генов-кандидатов индивидуальной восприимчивости человека к эхинококкозу представляется актуальной задачей, которая позволит глубже проникнуть в фундаментальные механизмы патогенеза этой болезни, и будет способствовать совершенствованию профилактических мероприятий.

Цель исследований

Идентифицировать таксономическую принадлежность возбудителя эхинококкоза и разработать алгоритм прогнозирования повышенного риска заболевания у детского населения Республики Башкортостан на основании выявления молекулярно-генетических маркеров индивидуальной предрасположенности.

Задачи исследований

1. Осуществить типирование штаммовой принадлежности возбудителя эхинококкоза у детского населения Республики Башкортостан по морфологическим признакам и генотипической характеристике.

2. Изучить нуклеотидный полиморфизм маркерного фрагмента митохондриального гена CO1 у изолятов E. granulosus из Южного Урала.

3. Изучить распределение антигенов HLA-A, B класса I у больных гидатидозным эхинококкозом детей в Башкортостане.

4. Установить распределение частот специфичностей HLA генов DRB1 и DQB1 у больных эхинококкозом.

5. Изучить полиморфизм Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1 и полиморфизм N/del гена GSTM1 у больных эхинококкозом.

6. Провести анализ ассоциаций полиморфных аллелей и генотипов с вариантами течения эхинококкоза (солитарным, сочетанным, осложненным).

7. Разработать алгоритм прогнозирования повышенного риска гидатидозного эхинококкоза у детского населения Башкортостана на основе анализа молекулярно-генетических маркеров индивидуальной предрасположенности.

Научная новизна работы

Впервые проведен комплексный анализ таксономической принадлежности возбудителя и восприимчивости к заболеванию населения в очаге гидатидозного эхинококкоза на Южном Урале.

Проведены исследования генотипа и проанализирован нуклеотидный полиморфизм таксономически значимого маркерного фрагмента митохондриального гена CO1 у изолятов E. granulosus. На основании полученных результатов установлено, что на территории Южного Урала возбудитель гидатидозного эхинококкоза у населения принадлежит штамму G1 «общий, домашних овец».

Определены условия для амплификации и последующего рестрикционного анализа маркерных фрагментов ДНК гена CO1 для идентификации генотипа G1 у изолятов E. granulosus.

Изучен полиморфизм генов комплекса гистосовместимости (HLA DRB1*, DQB1*) у больных эхинококкозом детей в Башкортостане. Установлена ассоциация специфичностей *03 гена DRB1 и *02 гена DQB1 с высокой степенью риска развития осложнений.

Выявлены маркеры повышенного риска эхинококкоза у детского населения Республики Башкортостан среди полиморфных вариантов генов ферментов детоксикации ксенобиотиков и антиоксидантной защиты. Установлена ассоциация полиморфной аллели G и генотипа *AG гена CYP1А1 с предрасположенностью к заболеванию. Определена ассоциация делеции гена GSTM1 с развитием сочетанного эхинококкоза.

Впервые показано, что генетическое тестирование лиц из эндемичных очагов эхинококкоза позволит выделять группы риска, прогнозировать течение заболевания.

Теоретическая и практическая значимость работы

Научно обоснован и предложен комплексный подход к характеристике синантропного очага эхинококкоза, основанный на определении генетической структуры популяции E. granulosus и скрининге полиморфизма генов-кандидатов восприимчивости к заболеванию у человека.

Разработаны и предложены методические основы оценки индивидуальной предрасположенности к гидатидозному эхинококкозу, которые базируются на результатах молекулярно-генетического тестирования маркеров риска.

Предложен и апробирован способ получения маркерных фрагментов ДНК митохондриального гена CO1 и модифицирован метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации генотипа G1 E. granulosus.

Материалы диссертации использованы при подготовке

1. Методических рекомендаций для медицинских работников и работников ветеринарной медицины.// «Система эпидемиолого-эпизоотологического надзора за эхинококкозами». - Уфа. - 2005. - 48 с.

2. Изобретений:

2.1. Способ прогнозирования сочетанного поражения органов цистным эхинококкозом у детей / Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Комиссарова М.А., Викторова Т.В. (Патент РФ №2307349);

2.2. Способ прогнозирования рецидивов эхинококкоза / Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Лукманова Л.И., Мурзабаев Х.Х., Викторова Т.В. (Патент РФ №2313275);

2.3. Способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза у детей / Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Викторова Т.В., Нартайлаков М.А., Комиссарова М.А., Лукманова Л.И. (Патент РФ №2324940);

2.4. Способ идентификации возбудителя цистного эхинококкоза в биологическом образце (Положительное решение о выдаче патента на изобретение №2006144980).

3. Учебного пособия: «Лекции по биологии» / Т.В. Викторова, Г.И. Лукманова, Г.В. Белалова, Ф.Ф. Мусыргалина и др.: в 2-х кн. - Уфа: БГМУ, 2005. - Ч. 2. - 252 с.

4. Монографии: «Эхинококкоз печени» / М.А. Нартайлаков, В.В. Плечев, Д.Р. Мушарапов, Г.И. Лукманова. - Уфа, 2006. - 104 с.

5. Монографии: «Генетические факторы риска эхинококкоза» / Г.И. Лукманова. - Уфа, 2008. - 115 с.

Материалы исследований внедрены в учебный процесс на кафедрах биологии; инфекционных болезней ИПО; детской хирургии, ортопедии и анестезиологии Башкирского государственного медицинского университета; в работу Самаркандского научного центра детской хирургии; клинической больницы №1, г. Стерлитамака.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Возбудитель эхинококкоза у детского населения Башкортостана принадлежит штамму G1 - «общий, домашних овец» E. granulosus и по структуре маркерного фрагмента митохондриального гена CO1 гомологичен зарегистрированным в “GenBank” полиморфным вариантам Acc. No DQ109036, Acc. No U50464.

2. Полиморфизмы генов комплекса гистосовместимости HLA локусов DRB1, DQB1 и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1А1, GSTM1 являются структурными элементами генетической компоненты индивидуальной подверженности к эхинококкозу детей, инвазированных штаммом G1 E. granulosus.

3. В популяциях человека имеет место полиморфизм аллелей генов-кандидатов (HLA-DRB1, HLA-DQB1, CYP1А1, GSTM1), что вносит вклад в различия клинических проявлений гидатидозного эхинококкоза.

4. Данные о вкладе аллельных вариантов генов в развитие эхинококкоза у человека, могут быть использованы при прогнозировании характера течения заболевания и формировании групп повышенного риска.

Апробация работы

эхинококкоз возбудитель генетический штамм

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Национальном конгрессе «Болезни органов дыхания» (С.-Петербург, 2003); IV Международной конференции «Современные проблемы общей, медицинской и ветеринарной паразитологии» (Витебск, 2004); VII Международной конференции «Циклы» (Ставрополь, 2005); IV Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Интеграция России в Евросоюз» (Уфа, 2005); конференции ВИГИС «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2005); Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины и здравоохранения» (Уфа, 2006); II региональной научно-практической конференции Приволжского Федерального округа «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском Федеральном округе» (Казань, 2006); Всероссийской научной конференции «Теоретические и практические вопросы паразитологии» (Кемерово, 2006); Республиканской научно-практической юбилейной конференции (Уфа, 2006); V Республиканской научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития современной паразитологии» (Витебск, 2006); Х Международной научной конференции «Здоровье семьи ХХ1 век» (Бангкок, 2006); конференции ВИГИС «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2007); на заседаниях кафедры биологии БГМУ, 2002- 2008.

Публикации

Результаты диссертационной работы опубликованы в 27 научных изданиях, в том числе 2 монографии и 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций. Получено 3 патента РФ на изобретение.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста, иллюстрирована 48 рисунками и 20 таблицами. Состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (176 отечественных и 173 зарубежных публикаций) и приложения.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ, д.м.н., профессору А.А. Гумерову, сотрудникам клиники кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии БГМУ за помощь в сборе материала. Автор выражает глубокую признательность заместителю директора по науке, д.м.н., профессору М.М. Туйгунову, сотрудникам лаборатории ФГУП НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат» МЗ СР РФ, за помощь оказанную при постановке молекулярно-генетических методов. Автор выражает благодарность заведующей лаборатории молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН д.б.н., профессору Э.К. Хуснутдиновой, в.н.с. И.М. Хидиятовой за помощь в работе.

Содержание работы

Материал и методы исследований

Материал для морфологических и молекулярно-генетических исследований изолятов Echinococcus получали от материнских эхинококковых пузырей (ларвоцист), выделенных во время оперативного вмешательства у пациентов, поступавших в клинику кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» на базе детской республиканской клинической больницы в 2000-2006 гг., и один экземпляр был получен из Абзелиловского района (Зауралье) от естественно инвазированного убойного крупного рогатого скота (трехгодовалой коровы). Для проведения работы была собрана коллекция из 65 ларвоцист эхинококка. Среди них: 37 - полученные от пациентов, оперированных по поводу эхинококкоза печени и один образец - из печени коровы; 25 - полученные от пациентов с эхинококкозом легких; по одному образцу получено от детей с эхинококкозом селезенки, головного мозга, щитовидной железы. Морфология ларвоцист была изучена согласно рекомендациям В.Б. Ястреб (1986), В.Б. Ястреб, Ф.К. Скворцовой (1990); Н.И. Перчун (2002).

Материалом для молекулярно-генетических исследований служили образцы ДНК, выделенные из клеток герминативной оболочки и протосколексов. Депротеинизацию и осаждение ДНК осуществляли стандартным фенол-хлороформным методом [Sambrook J. et al., 1987]. В качестве маркерного гена для идентификации биоваров эхинококка использовали митохондриальный ген CO1, кодирующий субъединицу 1 цитохром-с-оксидазы (CO1). Для получения таксономически значимых фрагментов гена CO1 E. granulosus применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК по J. Bowles et al., 1992. ПЦР проводили на четырехканальном термоциклере «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», Россия). Присутствие продуктов амплификации анализировали электрофоретическим разделением смеси в 10% ПААГ, после окрашивания гелей бромистым этидием, с последующей визуализацией в УФ-свете на трансиллюминаторе (“Vilber Lourmat” TCP-20M). В качестве маркера молекулярных масс использовали фрагменты ДНК плазмиды pUC 19/MSpI («СибЭнзим», Россия). Секвенирование ДНК ферментативным дидезокси-методом Сэнгера [Senger F. et al., 1977] проведили на автоматическом секвенаторе ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems (USA) согласно условий рекомендованных производителем.

Анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы “DNASTAR, Inc.” (США). Нуклеотидные последовательности для сравнительного анализа были взяты из опубликованных статей, получены из банка нуклеотидных последовательностей NCBI, посредством Интернета в обновляемых версиях “GenBank”. Для сравнительного анализа полиморфизма гена CO1 E. granulosus использовали известные последовательности нуклеотидов: G1 - Acc. No U50464; G1A - AF458871, G1B - AF458872, G1C - AF458873, G1D - AF458874, G1E - AF458875, G2 - M84662; G3 - M84663; G4 - M84664; G5 - М84665; G6 - М84666; G7 - М84667, G8 - М84668, G9 М84669, G10 - AF525457. Консенсусная последовательность была построена с помощью программы SeqMan «DNASTAR» (США). Выравнивание сиквенсов проводили методом ClustalW (Slow/Accurate, IUB) с помощью программы MegAlign «DNASTAR» (США). Для сравнительного анализа полученных при секвенировании нуклеотидных последовательностей с последовательностями, зарегистрированными в “GenBank”, использовали поисковую систему ґBasic Local Alignment Search Toolґ (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

ПЦР-ПДРФ анализ (Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) проводили с учетом рекомендаций описанных в лабораторном регламенте «Способ выявления внутривидового ДНК-полиморфизма E. granulosus с помощью рестрикционного анализа продуктов ПЦР» [Никулина Н.А., и соавт., 2003].

Материал для молекулярно-генетического исследования полиморфизма генов больных гидатидозным эхинококкозом собран в 2000-2007 годах от детей, поступивших на оперативное лечение по поводу эхинококкоза в клинику кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава». В качестве контроля аналогичные исследования проведены в группе здоровых и серонегативных в отношении эхинококкоза лиц. Группы обследованных пациентов и контроля были сопоставимы по возрасту, полу, этнической принадлежности и месту жительства.

Объектом молекулярно-генетических исследований служили образцы ДНК, полученные из периферической венозной крови. Опытная группа состояла из 112 пациентов. Среди них 102 (91,1%) ребенка проживают в сельской местности, 10 (8,9%) являются жителями городов Республики Башкортостан. Возраст пациентов варьировал от 3 до 16 лет. Мальчиков было 55 (49,1%), девочек - 57 (51,9%). Контрольная группа состояла из 108 детей в возрасте от 5 до 16 лет. Мальчиков было 51 (47,2%), девочек - 57 (52,8%).

Образцы ДНК получали с использованием набора PROTRANS (фирмы «PROTRANS», Германия), а также ДНК выделяли методом фенольно-хлороформной экстракции по C.C. Mathew, (1984). В дальнейшем полученную ДНК использовали в качестве матрицы полимеразной цепной реакции для амплификации нужного фрагмента.

Типирование специфичностей HLA локусов DRB1*, DQB1* осуществляли при помощи ПЦР-анализа, с применением стандартного набора реагентов HLA DRB1*, DQB1* и полного комплекта оборудования фирмы «PROTRANS» (Германия), а также набора реагентов ООО «Био-Рад лаборатория» (Россия). Идентифицированные специфичности HLA генов DRB1, DQB1 классифицировали согласно общепринятой в мире номенклатуре [Bodmer J.G. et al., 1995]. Антигены HLA- А и В, класса 1 определяли путем типирования в стандартном микролимфоцитотоксическом тесте с использованием гистотипирующей панели антисывороток HLA (ЗАО Межрегиональный центр «Гиссанс», Россия) методом Terasaki [Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., 2000]. Групповую принадлежность крови систем AB0 Rh-фактор изучали, используя стандартные сыворотки («Гематолог», Россия) в простой реакции [Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., 2000].

Полиморфизм Ile462Val (A2455G) 7 экзона гена CYP1A1 исследовался методом ПЦР-ПДРФ анализа [El-Zein R. et al., 1997]. Полиморфизм N/del гена GSTM1 был изучен методом ПЦР-анализа [Ivaschenko T.E. et al., 2002]. ПЦР проводили на четырехканальном термоциклере «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», Россия). Присутствие продуктов амплификации и рестрикции анализировали электрофоретическим разделением смеси в 10% ПААГ, после окрашивания гелей бромистым этидием, с последующей визуализацией в УФ-свете на трансиллюминаторе (“Vilber Lourmat” TCP-20M).

Статистический анализ

Математическую обработку результатов исследования проводили на ПЭВМ IBM PENTIUM с использованием пакетов статистических программ: STATISTICA v. 6.0; “Rows and Collumns” (RxC - статистика) [Roff P., Bentzen P., 1989], Microsoft Excel v.2000.

Разницу в распределении частот генотипов и аллелей генов между группами рассчитывали с использованием критерия чІ с поправкой Йетса на непрерывность. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Для количественной оценки относительного риска заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли показатель отношения шансов (odds ratio - OR). Для этого использовали формулу, предложенную Бландом [Bland J.M., Altman D.G., 2000]. OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом («фактор риска»), OR<1 - как отрицательную ассоциацию («фактор устойчивости»), OR=1 считали отсутствием ассоциации.

результаты исследования

Идентификация штаммовой принадлежности изолятов E. granulosus из Южного Урала

Использование совокупности морфологических и молекулярно-генетических методов для дифференциации внутривидовых вариантов E. granulosus является в настоящее время наиболее эффективным [McManus D.P., Bowles J., 1996; Eckert J., Thompson R.C., 1997; Gordo P.F., Badera C.C., 1997]. В исследованной нами выборке ларвоцисты имели размеры от 25 до 155 мм в диаметре. Из них 8(12,3%) эхинококковых кист имели малые размеры, до 50 мм в диаметре; 45(69,2%) - имели средние размеры, от 50 до 100 мм в диаметре; 12 (18,5%) кист в диаметре были более 100 мм. Большинство средних 27(41,5%) и больших 7(10,8%) кист были выделены из печени, 17(26,1%) средних и 5(7,7%) больших кист были обнаружены в легком, по 1 кисте выявлены в селезенке, головном мозге, щитовидной железе.

При исследовании стенки кисты во всех образцах определялась характерная для эхинококковых пузырей слоистая хитиновая оболочка, изнутри прилежащий герминативный слой. В полости большинства изученных нами кист (92%) находились выводковые капсулы и протосколексы. Длина ввернутых протосколексов доходила до 135 мкм. Крючья протосколексов располагались в передней части. Количество крючьев протосколексов у исследованных нами изолятов эхинококка варьировало в пределах 29-37 штук. Измерение параметров крючьев показало, что средние размеры общей длины большого крючка (ОДБК) соответствуют 22,73±0,11 мкм; общей длины малого крючка (ОДМК) - 16,03±0,08 мкм; длины лезвия большого крючка (ДЛБК) - 13,14±0,09; длины лезвия малого крючка (ДЛМК) - 7,58±0,07. Соотношение между длиной лезвия и общей длиной большого крючка составляло 57,61±0,19%, соотношение между длиной лезвия и общей длиной малого крючка - 47,37±0,21%. Полученные показатели морфологических исследований сравнили с литературными данными [Ястреб В.Б., 1986, Скворцова Ф.К., 1994; Перчун Н.И., 2002; Журавец А.К., 2004; Gordo P., Badera C.C., 1997; Ahmadi N., Dalimi A., 2006]. Анализ результатов показал, что 64 (98,5%) ларвоцист относятся к виду E. granulosus. По параметрам протосколексов изоляты E. granulosus показывали сходство с овечьим штаммом. Значимых морфологических отличий, демонстрирующих особенности у изолятов эхинококка из Южного Урала не выявлено.

Один образец эхинококковой кисты от больной 14 лет, поступившей в клинику с диагнозом «Эхинококковая киста печени» значительно отличался по морфологическим показателям от остальных. Макроскопическое исследование кисты показало, что это однокамерное полостное образование неправильной формы, размерами 55х43 мм. Ревизия полости кисты показала наличие внутри множества плотных шаровидных образований молочно-белого цвета, диаметром около 5-8 мм, которые были плотно прикреплены к стенке кисты. Фрагмент стенки материнского пузыря взят на микроскопическое исследование. Анализ показал, что оболочка кисты имела характерную для кутикулярного слоя ларвоцисты эхинококка слоистость. Шаровидные образования имели стенку, также представленную снаружи кутикулярным слоем. Внутри них находились ввернутые протосколексы. Длина протосколексов варьировала от 115 до 130 мкм (меньше чем у остальных изученных нами изолятов E. granulosus). Малые и большие крючья имели длину от 17 до 20 мкм. Сравнение морфологических данных этого изолята эхинококка с литературными данными [Xiao et al., 2005] позволило предположить его принадлежность Echinococcus shiquicus.

На следующем этапе работы проведены исследования генотипа изолятов E. granulosus. Используя способ получения маркерных фрагментов митохондриального гена CO1 E. granulosus в полимеразной цепной реакции синтеза ДНК [Bowles J. et al., 1992] был проведен анализ 65 образцов ДНК, выделенных из клеток герминативной оболочки и протосколексов ларвоцист. В результате ПЦР от 48 (73,8%) образцов ДНК были амплифицированы фрагменты ДНК гена CO1. От 17 (26,2%) образцов ДНК продукты ПЦР не получили. Поэтому, используя компьютерные программы «DNASTAR» (США), были подобраны новые условия ПЦР и праймеры для CO1 следующей структуры: "форвард" 5ґ TGTGTTGATTTTGCCTGG 3ґ; "реверс" 5ґ GCCACCACAAACCAAGTATC 3ґ, которые синтезировали в НПФ «Литех» (Россия). Использование этой модификации ПЦР позволило получить фрагменты гена CO1 E. granulosus для проведения генотипирования.

Девять ПЦР-продуктов маркерного фрагмента CO1 E. granulosus подвергли секвенационному анализу. Среди изученных образцов ДНК: 2 - получены от пациентов с солитарным эхинококкозом легкого (№1, №5); 2 - получены от пациента с сочетанным эхинококкозом обоих легких (по 1 образцу из каждой кисты: №2, №4); 2 - от больных с рецидивным эхинококкозом печени (№6, №9); 1 - от пациента с солитарным эхинококкозом печени (№3); и 2 образца, полученные от разных участков солитарной кисты в печени (№7, №8).

Определение нуклеотидных последовательностей секвенированного фрагмента ДНК показало на 444 выровненные позиции. Идентифицировали полученные фрагменты ДНК путем сравнения с известными последовательностями нуклеотидов гена CO1 митохондриальной ДНК представителей рода Echinococcus spp. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, показал значительное сходство изученных образцов ДНК с генотипом G1 E. granulosus.

Для определения уровня родства генотипов исследуемых нами образцов ДНК с генотипами E. granulosus из “GenBank” проведено сравнение нуклеотидных последовательностей путем построения дендрограммы сходства. Для этого был выбран наиболее короткий, информативный и часто используемый в подобных исследованиях [Никулина Н.А., 2003] фрагмент ДНК длиною 366 нуклеотидных пар от 5' - концевого участка гена CO1 E. granulosus с координатами 9896 - 10262. В качестве аут-группы была использована аналогичная последовательность фрагмента гена CO1 Taenia solium, Acc. No AB086256. Филогенетическое древо было построено с использованием пакета программ «DNASTAR» (США) (рис. 1).

Рис.1. Филогенетическое древо. №1-№9 - нуклеотидные последовательности изолятов из Южного Урала; G1A, G1B, G1C, G1D, G1E, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8 -зарегистрированные в “GenBank”, Taenia solium - аут-группа.

Из дендрограммы сходства, изображенной на рис. 1 видно, что нуклеотидные последовательности от изолятов эхинококка из Южного Урала, группируются с генетическими вариантами G1, G1A, G1B, G1C, G1D, G1E E. granulosus (“GenBank”). В структуре филогенетического древа можно выделить четыре основные ветви. Нижнюю ветвь (IV) дендрограммы формирует Taenia solium. Следующая ветвь (III) формируется генотипом G4. Ветвь II формируется генотипами G5, G6, G7, G8. Следующая ветвь (I) образуется кластером генотипов G1, G1A - G1E , G2, G3 и нуклеотидными последовательностями от изолятов из Южного Урала. Внутри этого кластера формируются 4 ответвления филогенетического древа. Нижнее ответвление образует генотип G2, выше - генотип G3. Следующее ответвление формируют нуклеотидные последовательности G1 и от исследуемых изолятов E. granulosus №1, 2, 4. Верхнее ответвление формируют генотипы - G1A, G1B, G1C, G1D, G1E, и нуклеотидные последовательности от изолятов №3, 5, 6, 7, 8, 9.

Проведено попарное сравнение нуклеотидных последовательностей участка гена CO1 с помощью программы MegAlign («DNASTAR»). Установлен генетический полиморфизм анализируемого фрагмента ДНК, обусловленный заменами нуклеотидов. Вариабельность составляла 1-4 замены. Расхождения нуклеотидных последовательностей между образцами ДНК от изолятов E. granulosus из Южного Урала наблюдались в пределах 0,3% - 2,6%. При попарном сравнении процент дивергенции анализируемых нами образцов ДНК с нуклеотидными последовательностями G1, G2 и G3 находился в пределах 0,0% - 2,6%. Расхождения нуклеотидных последовательностей анализируемых нами образцов ДНК с G4, G5, G6, G7, G8 наблюдались в пределах 8,0% - 12,4%.

По результатам проведенного сравнительного анализа изучаемые нами образцы ДНК от изолятов из Южного Урала были разделены на 2 группы. Первая группа включала сиквенсы трех анализируемых нами образцов ДНК (№1 - полученные от пациента с солитарным эхинококкозом легкого; №2 и №4 - от ребенка с сочетанным эхинококкозом обоих легких, по 1 образцу из каждой кисты). Для этих сиквенсов была построена с помощью программы SeqMan («DNASTAR») отдельная консенсусная последовательность. Сравнительный анализ консенсусной последовательности нуклеотидов с зарегистрированными нуклеотидными последовательностями гена CO1 из “GenBank”, показал на значительное сходство с генотипом G1, «общий, овечий штамм» E. granulosus, Acc. No DQ109036. Вторая группа включала нуклеотидные последовательности от 6 изолятов: полученные от двух пациентов с рецидивным эхинококкозом печени (№ 6, 9), больного с солитарным эхинококкозом печени (№ 3), больного с эхинококкозом легких (№ 5) и два образца, полученные от разных участков солитарной кисты печени у больного (№7, №8). Для этих нуклеотидных последовательностей была построена отдельная (вторая) консенсусная последовательность. В результате сравнительного анализа построенной консенсусной последовательности с зарегистрированными в “GenBank” нуклеотидными последовательностями гена СО1, мы получили значительную гомологию с генотипом G1 E. granulosus, Acc. No U50464.

Проведено попарное сравнение нуклеотидных последовательностей участка гена CO1 изолятов E. granulosus из Южного Урала между собой и с нуклеотидными последовательностями Acc. No DQ109036 и Acc. No U50464.

Из рис. 2 видно, что расхождения нуклеотидных последовательностей фрагмента CO1 между анализируемыми нами образцами ДНК № 1-9 наблюдались в пределах 0,3% - 2,6%. Расхождения нуклеотидных последовательностей анализируемых образцов ДНК № 1-9 с Acc. No U50464 и DQ109036 составляли 0,3% - 2,3%. Учитывая высокую эволюционную консервативность гена CO1, наличие полиморфизмов по данному локусу рассматривают как внутривидовую вариабельность, способную существенно изменять свойства E. granulosus [Bowles J. et all., 1995].

1 2 3 4 5 6 7 8 9 А В

Percent Similarity in upper triangle

1 *** 98.1 98.1 97.5 97.8 98.1 97.5 97.5 97.5 97.8 98.7

2 1.9 *** 98.7 98.7 98.4 98.7 98.1 98.1 98.1 98.4 99.4

3 1.9 1.3 *** 98.1 99.1 99.4 98.7 99.4 98.7 99.1 99.4

4 2.6 1.3 1.9 *** 97.8 98.1 97.5 97.5 97.8 97.8 98.7

5 2.3 1.6 1.0 2.3 *** 99.7 99.1 99.7 99.7 100.0 99.1

6 1.9 1.3 0.6 1.9 0.3 *** 99.4 99.4 99.4 99.7 99.4

7 2.6 1.9 1.3 2.6 1.0 0.6 *** 98.7 98.7 99.1 98.7

8 2.6 1.9 0.6 2.6 0.3 0.6 1.3 *** 99.4 99.7 98.7

9 2.6 1.9 1.3 2.3 0.3 0.6 1.3 0.6 *** 99.7 98.7

А 2.3 1.6 1.0 2.3 0.0 0.3 1.0 0.3 0.3 *** 99.1

В 1.3 0.6 0.6 1.3 1.0 0.6 1.3 1.3 1.3 1.0 ***

Percent Divergence in lower triangle

1 2 3 4 5 6 7 8 9 А В

Примечание:

• В верхнем треугольнике рисунка показан процент гомологии (Percent Similarity in upper triangle), в нижнем треугольнике - процент дивергенции (Percent Divergence in lower triangle).

Рис. 2. Результаты попарного сравнения (%) сходства и различий нуклеотидных последовательностей фрагмента гена CO1 E. granulosus: №1 - 9 от изолятов из Южного Урала, А - Acc. No U50464, В - Acc. No DQ109036 (Pair Distances of meg ClustalW «DNASTAR»).

Нуклеотидные последовательности образцов ДНК от изолятов №1, 2, 4 сравнили с Acc. No DQ109036. Расхождения нуклеотидных последовательностей при попарном сравнении наблюдались в пределах 0,6% - 1,3%. Нуклеотидные последовательности образцов ДНК изолятов №3, 5, 6, 7, 8, 9 сравнили с Acc. No U50464. Расхождения при попарном сравнении наблюдались в пределах от 0,0 до 1,0%.

Для сравнительного анализа локализации вариабельных позиций в нуклеотидных последовательностях гена CO1 митохондриальной ДНК E. granulosus от изолятов из Южного Урала был выбран участок длиною 180 пн с координатами 9896 - 10076. Этот фрагмент часто используется при анализе генетического полиморфизма, поскольку является достаточно информативным и содержит большинство вариабельных позиций генотипов E. granulosus [Никулина Н.А., 2003]. В качестве прототипной нуклеотидной последовательности фрагмента гена CO1 взят аналогичный участок Acc. No U50464 E. granulosus.

Анализ показал, что нуклеотидные последовательности изолятов E. granulosus из Южного Урала отличаются между собой по 1-3 различным полиморфным позициям. Только полиморфизм, обусловленный заменой нуклеотида в положении Т108А маркерного фрагмента CO1 E. granulosus, встречается в трех образцах (№2, 4, 6). Большинство замен приходилось на третий нуклеотид в кодоне и не изменяли аминокислотный состав цитохромоксидазы. Обращает на себя внимание выявленная вариабельность гена CO1 в образцах ДНК, полученных от разных участков одной солитарной кисты печени, они имели 98,7% сходство. Если считать, что все протосколексы - это партеногенетическое потомство одной особи, то полученные данные согласуются с предположением, что причиной возникновения штаммов E. granulosus являются генетические перестройки на стадии ларвоцисты [McManus D.P., 2006].

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые были получены данные по нуклеотидным последовательностям маркерных фрагментов митохондриального гена CO1 от изолятов E. granulosus из Южного Урала. Эти исследования позволили модифицировать ранее известный [Никулина Н.А., 2003] способ идентификации штаммовой принадлежности методом ПЦР-ПДРФ анализа.

На основании изучения последовательности нуклеотидов были определены локализации сайтов рестрикции для эндонуклеаз R.Fok l, R.Sfa N1, R.Mael и рассчитана длина рестрикционных фрагментов. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов позволил идентифицировать штаммовую принадлежность у изолятов E. granulosus из Южного Урала.

В результате проведенной ПЦР-ПДРФ с параллельным использованием эндонуклеаз R.Sfa NI, R.Mae l и R.FokI на электрофореграмме были обнаружены фрагменты ДНК длиной 18, 60, 118, 248 пн (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма параллельной рестрикции R.FokI, R.Mae l и R.Sfa N1 фрагмента гена CO1 E. granulosus. Дорожки 1, 9 - маркер молекулярных масс; 8 - амплификат ПЦР фрагмента гена CO1; 2, 3, 4, 6, 7 - рестрикционные фрагменты, полученные от образцов ДНК изолятов Южного Урала.

Сравнительный анализ сайтов рестриктаз аналогичного участка гена CO1 штаммов G1 - G10 E. granulosus (“GenBank”) показал, что рестрикционные фрагменты такой длины (18, 60, 118, 248 пн) характерны для генотипа G1.

Таким образом, в синантропном очаге гидатидозного эхинококкоза на территории Республики Башкортостан, возбудитель заболевания у детского населения относится к штамму G1 E. granulosus «общий, домашних овец».

Изучение территориальной приуроченности генотипа G1 исследованных изолятов E. granulosus по районам Республики Башкортостан (рис. 4) показало на Абзелиловский, Баймакский, Хайбулинский, Зианчуринский районы (лесостепная и степная зоны Южного Зауралья) и Давлекановский, Бижбулякский, Аургазинский, Федоровский, Миякинский районы (лесостепная и степная зоны Нижнего Предуралья).

Рис. 4. Территориальная приуроченность генотипа G1, E. granulosus по районам Республики Башкортостан.

Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов с развитием гидатидозного эхинококкоза у детей в Башкортостане

Учитывая возможную роль генетических факторов в развитии гидатидозного эхинококкоза, проведено изучение полиморфизма генов прямо или опосредовано участвующих в патогенезе заболевания. Поскольку наиболее вероятна заинтересованность систем, обеспечивающих биологическую индивидуальность особи, участвующих в узнавании «чужого» и обезвреживании чужеродных токсинов (в том числе и продуктов метаболизма гельминтов), были исследованы ассоциации генов главного комплекса гистосовместимости и генов ферментов детоксикации ксенобиотиков с развитием эхинококкоза.

Распределение частот специфичностей HLA у больных

гидатидозным эхинококкозом

Проведен молекулярно-генетический анализ полиморфизма специфичностей HLA локуса DRB1* (табл. 1).

Таблица 1

Распределение частот специфичностей HLA локуса DRB1* у больных эхинококкозом и в контрольной группе

специфичность

DRB1

Больные эхинококкозом

абс(%)

Контрольная группа

абс(%)

Р

*01

*02 (15)

*02 (16)

*03

*04

*05 (11)

*05 (12)

*06 (13)

*06 (14)

*07

*08

*09

11(9,6%)

9(7,9%)

5(4,4%)

8(7,0%)

14(12,3%)

10(8,8%)

2(1,7%)

10(8,8%)

3(2,6%)

28(24,7%)

8(7,0%)

6(5,3%)

18(10,3%)

28(16,1%)

7(4,0%)

14(8,0%)

25(14,4%)

15(8,6%)

3(1,7%)

21(12,1%)

6(3,4%)

25(14,4%)

10(5,7%)

2(1,1%)

1,01

0,06

1,00

0,92

0,22

1,00

1,1

0,49

0,96

0,04

0,85

0,08

2N

114(100%)

174(100%)

-

Примечание:

• N - объем выборки

• Окрашиванием выделены группы больных имеющие достоверные различия с контролем p<0,05

Анализ результатов исследований показал, что наиболее частотными в наблюдаемой нами группе больных эхинококкозом являются специфичности *07 (24,7%), *04 (12,3%), *01 (9,6%). В контрольной группе более часто встречаются специфичности гена DRB1 *15 (16,1%), *04 (14,4%), *07 (14,4%) и *13 (12,1%). Статистически достоверные отличия по частоте встречаемости полиморфных вариантов HLA-DRB1 выявлено для *07 (24,7% против 14,4% в контроле, ч2=4,16; р=0,04; OR=1,94; RR=1,44).

Проведено исследование полиморфизма гена HLA-DQB1 у больных эхинококкозом и у лиц контрольной группы. В результате типирования было выявлено 7 специфичностей (табл. 2).

Таблица 2

Распределение частот специфичностей HLA локуса DQB1 у больных эхинококкозом и в контрольной группе

специфичность

DQB1

больные эхинококкозом

абс (%)

Контрольная

группа

абс (%)

р

*02

*04

*05

*06

*07

*08

*09

31 (29,8%)

10 (9,6%)

16 (15,4%)

18 (17,3%)

13 (12,5%)

9 (8,7%)

7 (6,7%)

34 (18,5%)

12 (6,5%)

51 (27,7%)

44 (23,9%)

34 (18,5%)

8 (4,3%)

1 (0,5%)

0,04

0,47

0,02

0,24

0,24

0,21

0,00

2N

104

184

-

Как видно из таблицы 2, наиболее частотными в наблюдаемой нами группе больных эхинококкозом являются специфичности *02 (29,8%) и *06 (17,3%) гена DQB1. В контрольной группе чаще наблюдаются специфичности *05 (27,7%) и *06 (23,9%). Статистически значимые отличия по частоте встречаемости полиморфизмов гена HLA-DQB1 у больных эхинококкозом детей от группы контроля выявлены по специфичностям *09 (6,7% против 0,5% в контроле, ч2=7,26; р=0,007; OR=13,2), *02 (29,8% против 18,5% в контроле, ч2=4,25; р=0,04; OR=1,87). Менее частотной в группе больных эхинококкозом чем в контроле была специфичность *05 (15,4% против в 27,7% контроле, ч2=4,99; р=0,02; OR=0,47).

Таким образом, установлено, что носители DRB1*07, DQB1*09 и DQB1*02 достоверно чаще встречаются среди больных гидатидозным эхинококкозом, чем среди здоровых в отношении этого заболевания детей в Башкортостане. Специфичность DQB1*05 наоборот является значительно менее частотной в группе пациентов, чем в контроле. На основании полученных результатов можно считать, что наличие в генотипе DRB1*07, DQB1*09 и DQB1*02 является фактором предрасположенности, а присутствие специфичности DQB1*05 - фактором устойчивости к заболеванию.

Проведено исследование распределения частот специфичностей DRB1 и DQB1 в зависимости от групповой принадлежности крови по системе AB0. Исследование антигенов системы AB0 и Rh-фактор у 106 больных эхинококкозом и 102 лиц контрольной группы показало, что наиболее часто встречается у жителей Башкортостана первая 0(I), резус-положительная группа крови, в том числе у больных эхинококкозом и здоровых в отношении этого заболевания детей. Статистически значимых отличий между частотами антигенов эритроцитов систем AB0 и Rh-фактор в контрольной группе и группе больных эхинококкозом не выявлено (p>0,05).

При сравнительном анализе полиморфизма гена DRB1 в зависимости от групповой принадлежности крови системы AB0 было установлено, что среди больных эхинококкозом детей более часто, чем в контрольной группе встречаются носители DRB1*09 с AB (IV) группой крови (25,0% против 1,1% в контроле, ч2=17,47; р<0,00).

При анализе полиморфизма гена HLA-DQB1 в зависимости от групповой принадлежности крови по системе AB0 было установлено, что среди больных эхинококкозом детей более часто, чем в контроле встречаются носители DQB1*02 со A (II) группой крови (36,7% против 18,5% в контроле, ч2=4,10; р=0,04).

Проведено исследование распределения частот специфичностей HLA гена DRB1 у 57 больных эхинококкозом детей с осложненным нагноением кисты и неосложненным течением заболевания (табл. 3).

Исследования показали, что при осложненном эхинококкозе чаще, чем при не осложненном течении заболевания, встречается специфичность DRB1*03 (15,4% против 5,4% при неосложненным течении, ч2=4,14; р=0,04; RR=2,74).

Таблица 3

Распределение частот специфичностей гена HLA-DRB1 (%) у больных осложненным и неосложненным эхинококкозом

специфичность

DRB1

неосложненное

течение

абс (%)

осложненное

течение

абс (%)

p

*01

*03

*04

*07

*08

*09

*11

*12

*13

*14

*15

*16

8(9,4)

5(5,4)

11(13,5)

17(20,3)

7(8,1)

3(4,1)

9(10,8)

2(2,7)

7(8,1)

1(1,3)

9(10,8)

5(5,4)

5(15,4)

5(15,4)

4(11,5)

8(26,9)

2(7,7)

1(3,8)

1(3,8)

-

2(7,7)

1(3,8)

-

1(3,8)

0,64

0,04

1,00

0,98

1,00

1,00

0,50

0,47

1,00

1,00

0,18

1,00

2N

84

30

-

Проведено исследование распределения частот специфичностей HLA-DQB1 у 52 больных эхинококкозом детей с осложненным и неосложненным течением заболевания (табл. 4). Анализ полученных результатов показал, что при осложненном эхинококкозе чаще встречается специфичность DQB1*02 (46,1% против 21,6% при неосложненным течении, ч2=4,59; р=0,03; RR=2,20).

Таблица 4

Распределение частот специфичностей HLA-DQB1 (%) у больных осложненным и не осложненным эхинококкозом

специфичность

DQB1

неосложненное

течение

абс (%)

осложненное

течение

абс (%)

p

*02

*04

*05

*06

*07

*08

*09

17(21,6)

7(9,4)

12(14,9)

17(21,6)

15(18,9)

5(6,7)

5(6,7)

12(46,1)

2(7,7)

5(19,2)

2(7,7)

1(3,8)

3(11,5)

1(3,8)

0,03

1,00

0,83

0,19

0,12

1,00

0,95

2N

78

26

-

Учитывая, что основной причиной летальных исходов и инвалидности при эхинококкозе являются различные осложнения [Акматов Б.А., 1989], полученные результаты будут иметь практическое значение в профилактике неблагоприятных исходов заболевания.

У больных гидатидозным эхинококкозом и в контрольной группе было проведено серологическое типирование антигенов HLA-А и -В, класса 1. Сравнительный анализ полученных результатов показал, что наиболее частотными среди больных эхинококкозом были антигены: HLA-А1; А2; А24; В13; В51. Статистически значимые отличия между группой пациентов и контролем по частоте встречаемости HLA - антигенов 1 класса выявлены для А24 (29% против 0% в контроле, ч2 =7,1; р<0,01; RR =24,4) и В51 (17% против 0% в контроле, ч2 =4,27; р<0,05; RR=16,1). Установлена несколько повышенная частота встречаемости гаплотипа А2, В13 у больных гидатидозным эхинококкозом (25,0% против 7,8% в контроле, р>0,05; RR=5,51). Наименее частотными в наблюдаемой нами группе больных эхинококкозом являются антигены В5 (4% против 14% в контроле, ч2 =0,58; р>0,05), В18 (4% против 11% в контроле, р>0,05) и В12 (4,2% против 18% в контроле, р>0,05). Среди больных однокамерным эхинококкозом, носители антигенов В27 и В14 не выявлены. Сравнительный анализ результатов показал, что в группе контроля частота антигенов, относящихся к «широким» специфичностям (Original Broad Specificities): HLA-А9; А10; В5; В12 значительно выше, чем у больных эхинококкозом, у которых чаще встречаются (58%, против 0% в контроле) антигены «узких» специфичностей (Splits): А24(9); А26(10); В51(5); В44(12).

Таким образом, установлено, к гидатидозному эхинококкозу более предрасположены в Башкортостане дети, имеющие в генотипе специфичности HLA *07 локуса DRB1 и *02 локуса DQB1, а в фенотипе специфичности HLA- А24 и В51. Среди пациентов носителей специфичности DQB1*02 более часто встречались лица со A (II) группой крови.

Менее подвержены заболеванию носители антигенов HLA- В14, В27 и специфичности *05 гена DQB1.

Полиморфизм генов ферментов детоксикации ксенобиотиков у больных эхинококкозом

Для выявления участия ферментов фазы 1 детоксикации ксенобиотиков в патогенезе гидатидозного эхинококкоза у детей проведен молекулярно-генетический анализ полиморфизма 7 экзона гена CYP1A1, обусловленного однонуклеотидной транзицией (аденина на гуанин, 2455A>G), приводящей к замене аминокислоты изолейцин на валин (Ile462Val) в 462 положении молекулы цитохрома Р-450 CYP1A1. Исследование проводили методом ПЦР-ПДРФ анализа у 78 больных эхинококкозом детей и 101 лица контрольной группы. Гомозиготный генотип *AA (Ile/Ile) устанавливали при обнаружении на электрофореграмме фрагментов ДНК размерами 139 и 48 пн; гетерозиготный генотип *AG (Ile/Val) устанавливали при обнаружении фрагментов длиной 139, 120, 48 и 19 пн и гомозиготный генотип *GG (Val/Val) устанавливали при обнаружении фрагментов ДНК длиной 120, 48 и 19 пн (рис. 5).

Рис. 5. Электрофореграмма рестрикционного анализа гена CYP1A1. Номера дорожек соответствуют следующим генотипам: 1, 3, 5, 7 - *АG (Ile/Val); 2, 4, 8, 9, 11, 12 - *АА (Ilе /Ilе); 6, 10 - *GG (Val/Val).

При изучении результатов рестрикционного анализа выявлено, что распределение частот генотипов CYP1A1 у больных гидатидозным эхинококкозом существенно отличается от контрольной группы. Частота встречаемости гомозигот *АА (Ile/Ile) у больных гидатидозным эхинококкозом составляет 75,6% (в контроле 95,0%; р =0,001; ч 2 =12,65; OR=0,16; RR=0,48), гетерозигот *АG (Ile/Val) составляет - 20,5% (в контроле 4,0%; р=0,002; ч 2=10,54; OR=6,25; RR=2,05), гомозигот *GG (Val/Val) составляет - 3,8% (в контроле 1,0%; р =0,44; ч2 =0,59; OR=4,00; RR=1,75) (табл. 7).

Таблица 7

Распределение частот генотипов CYP1A1 у больных эхинококкозом детей и в контрольной группе

Генотип

Больные эхинококкозом

абс.(%)

Контрольная группа

абс.(%)

р

ч2

OR

*АА

*АG

*GG

59(75,6%)

16(20,5%)

3(3,8%)

96(95,0%)

4(4,0%)

1(1,0%)

0,001

0,002

0,44

12,65

10,54

0,59

0,16

6,25

4,00

N

78(100%)

101(100%)

-

-

-

Таким образом, в обеих группах наиболее частотным был генотип *АА, тем не менее доля лиц с данным генотипом в контроле оказалась значительно выше (р=0,00), чем среди больных эхинококкозом. Результаты исследований показывают, что у больных гидатидозным эхинококкозом частота гетерозиготного генотипа *AG в 5 раз превышала подобный показатель контрольной группы. Относительный риск развития эхинококкоза для лиц с генотипом *АG оказался равным RR =2,05, что рассматривается как положительная ассоциация с заболеванием, то есть «фактор повышенного риска».

Проведен анализ распределения аллелей гена CYP1А1 у больных гидатидозным эхинококкозом и в контрольной группе. Установлено, что частота аллеля G (Val) среди больных эхинококкозом составляет 14,1% (против 3,0% в контроле; ч2 = 6,10; р = 0,01; OR= 5,36), то есть в 4,6 раз больше чем в контрольной группе (рис. 6). Показатель относительного риска эхинококкоза для носителей аллеля G(Val) также оказался высоким (ОR=1,94). Значит, наличие полиморфной аллели G (Val) гена CYP1А1 является фактором предрасположенности к гидатидозному эхинококкозу детей в Башкортостане.

Рис. 6. Диаграмма распределения (в %) полиморфных аллелей гена CYP1А1 у больных эхинококкозом и в контрольной группе: 1 - носители аллели G(Val), 2 - носители аллели A(Ile).

Таким образом, генетическое тестирование полиморфизма Ile462Val (A2455G) 7 экзона гена CYP1A1 у лиц, проживающих в эндемичных по эхинококкозу районах Республики Башкортостан, показало, что к заболеванию более подвержены лица с генотипом *AG. Высокий показатель отношения шансов (OR=5,36) позволяет рассматривать генотип *AG и полиморфную аллель G (Val) в качестве генетического маркера, ассоциированного с повышенным риском гидатидозного эхинококкоза у детей.

Изучено распределение частот генотипов CYP1А1 у больных эхинококкозом в зависимости от возраста детей. Среди вошедших в выборку пациентов, лица дошкольного возраста составляют 19,4% и школьного возраста соответственно 80,6%. Установлено, что среди больных эхинококкозом дошкольников частота встречаемости гомозиготного генотипа *АА составляет 50,1%. Значительно выше этот показатель у пациентов школьного возраста - 81,1% (р =0,04; ч 2 =4,25; OR=0,23). Среди пациентов дошкольного возраста частота встречаемости гетерозигот *АG составляет 42,8%; среди больных эхинококкозом школьного возраста соответственно - 15,5% (р=0,04; ч2 =4,25; OR=4,27). Гомозиготы *GG среди больных эхинококкозом дошкольного возраста составляют 7,1%; среди детей школьного возраста - 3,4%. Выявлено, что среди пациентов дошкольного возраста с сочетанным поражением органов, частота встречаемости гетерозиготного генотипа *АG составляет 21,4%; соответственно среди больных школьного возраста - 1,7% (р=0,02; ч2 =5,01; OR=15,5) (рис. 7).


Подобные документы

  • Роль наследственных факторов в возникновении и развитии туберкулеза. Молекулярные механизмы патогенеза туберкулеза у человека. Физиологические функции белковых продуктов генов-кандидатов. Молекулярно–генетические методы анализа полиморфизма генов.

    дипломная работа [851,1 K], добавлен 11.08.2010

  • Основной источник инвазии. Основные стадии эхинококкоза. Быстрота нарастания симптомов и клинические проявления. Классификация эхинококкоза в зависимости от стадии развития ленточного глиста. Осложнения эхинококкоза, виды оперативного вмешательства.

    презентация [457,0 K], добавлен 18.12.2013

  • Возбудитель личиночной формы эхинококкоза; промежуточные и дефинитивные хозяева для эхинококкуса. Разработка и внедрение эффективных методов борьбы и профилактики антропозоонозов; обеспечение безопасности продуктов убоя сельскохозяйственных животных.

    презентация [6,7 M], добавлен 07.08.2012

  • Понятие и общая характеристика эхинококкоза, периоды и особенности его протекания. Описание возбудителя и его биологические хозяева, наиболее распространенные пути заражения человека данным гельминтом. Этапы протекания Эхинококкоза, альвеококкоза легких.

    реферат [27,5 K], добавлен 04.01.2011

  • Биогельминты, возбудитель эхинококкоза и альвеококкоза, их распространение, морфологические особенности и жизненный цикл. Заражение человека эхинококкозом от собак при несоблюдении правил личной гигиены. Лентец широкий и спарганоз, их основные хозяева.

    реферат [186,9 K], добавлен 06.09.2009

  • Пневмония как острое инфекционное поражение нижних отделов дыхательных путей. Развитие пневмонии у людей старческого возраста, ее проявления. Возбудитель заболевания, факторы риска. Классические клинические симптомы пневмонии у грудных детей, лечение.

    презентация [1,9 M], добавлен 17.09.2015

  • Ферментативная система биотрансформации ксенобиотиков. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и патология. Анализ роли полиморфных вариантов генов ферментов метаболизма ксенобиотиков в детерминации бронхиальной астмы и туберкулеза.

    диссертация [245,8 K], добавлен 15.01.2009

  • Изучение понятия и видов гельминтов. Рассмотрение цикла развития, симптомов и методов лечения аскаридоза, энтеробиоза, трихоцефалеза, тениаринхоза, тениоза и эхинококкоза. Правила оказания первой помощи при термических, химических и электрических ожогах.

    контрольная работа [32,7 K], добавлен 09.08.2010

  • Группы крови и эволюция; исследование полиморфизма украинских популяций по локусам групп крови: фенотипическая, генотипическая структура; частота аллелей групп крови по системе АВ0 и Rh; инфекционные заболевания. Анализ распределения фенотипов в Украине.

    курсовая работа [1,5 M], добавлен 04.04.2011

  • Анализ ассоциаций генотипов и аллелей исследованных полиморфизмов с гестозом в популяциях русских и якутов. Оценка ассоциации tagSNPs генов LEP и ACVR2A с развитием клинических форм гесоза в русской и якутской популяциях. Анализ частот гаплотипов.

    дипломная работа [2,4 M], добавлен 11.02.2017

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.