Идентификация штамма Echinococcus granulosus и генетические факторы риска гидатидозного эхинококкоза на Южном Урале

Рис. 7. Диаграмма распределения (в %) генотипов CYP1А1 у больных сочетанным эхинококкозом дошкольного и школьного возраста: 1 - носители генотипа *АG, 2 - носители генотипа *АА.

Таким образом, среди больных с сочетанным эхинококкозом дошкольного возраста генотип *АG гена CYP1А1 встречается в 12 раз чаще, чем у лиц школьного возраста. Эти данные свидетельствуют о том, что наличие мутантной аллели гена CYP1А1 провоцирует раннюю манифестацию заболевания.

Проведен анализ полиморфизма гена GSTM1, кодирующего ферментативный антиоксидант семейства глютатион S-трансфераз, класса mu, с целью выявления возможных ассоциаций с повышенным риском возникновения и тяжести течения гидатидозного эхинококкоза у детей. Полиморфизм GSTM1 представлен двумя аллелями: нормальным (N) и мутантным (делеционным, del), приводящим к потере функции фермента [Autrup H. et al., 2000]. Исследование проводилось методом ПЦР анализа у 88 больных эхинококкозом и 102 здоровых лиц контрольной группы. Нормальный генотип GSTM1 (N) у пациента устанавливали при наличии на электрофореграмме амплифицированных фрагментов ДНК длиною 271 пн, отсутствие подобного фрагмента указывало на делеционный генотип (del) (рис. 8).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Рис. 8. Идентификация генотипов GSTM1 методом ПЦР-анализа. Номера дорожек соответствуют следующим генотипам: 1, 2, 4, 6, 8, 10 - GSTM1(del); 3, 5, 7, 9 - GSTM1(N).

Установлено, что у больных эхинококкозом детей частота встречаемости делеции генотипа GSTM1 (del) составляет 46,6%. В контрольной группе этот показатель был незначительно (р=0,31) меньше и равнялся - 37,9%.

Проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов GSTM1 у больных эхинококкозом в зависимости от количества паразитирующих в организме кист. Среди пациентов вошедших в выборку 31 (35,2%) составляли больные солитарным эхинококкозом печени, 27 (30,7%) пациентов - солитарным эхинококкозом легких, 30 (34,1%) пациентов - сочетанным эхинококкозом.

Установлено, что среди пациентов с генотипом GSTM1 (N) частота лиц с 2 и более кистами составляет 48,8%, а частота лиц с солитарным эхинококкозом составляет 80,9%. Среди пациентов с делеционным генотипом GSTM1 частота лиц с 2 и более кистами составляет 51,2 %, а частота лиц с солитарным эхинококкозом составляет 19,1% (рис. 9).

Рис. 9. Диаграмма распределения генотипов (норма и делеция) GSTM1 у больных гидатидозным эхинококкозом: 1- c солитарным эхинококкозом; 2 - с сочетанным эхинококкозом.

Таким образом, среди носителей делеции гена GSTM1, больные с сочетанным эхинококкозом встречались достоверно чаще, чем пациенты с солитарным поражением (чІ=8,65; р=0,004; OR=4,43; RR=2,03). Значит, носители делеции гена GSTM1 более предрасположены к сочетанному эхинококкозу, чем лица с нормальным генотипом.

При сравнительном анализе распределения частот генотипов GSTM1 у больных эхинококкозом в зависимости от особенностей локализации кист выявлено, что среди пациентов с поражением печени носителей делеции гена GSTM1 в 2 раза больше (чІ=5,25; р=0,02) чем лиц с нормальной активностью фермента.

Сочетанный эхинококкоз у детей встречается нередко, и разнообразие клинических проявлений этой патологии является причиной поздней диагностики. Часто при сочетанном эхинококкозе одна киста растет значительно быстрее остальных, поэтому мелкие кисты остаются не выявленными. При множественном и сочетанном поражении эхинококкозом хирургическое вмешательство становится более травматичным, чаще приводит к серьезным осложнениям [Каримов Ш.И., 1994]. За последние годы отмечена значительная тенденция увеличения роста у детей сочетанных форм поражения легких и печени, занимающих третье место после изолированных поражений печени и легких [Алиев М.М. и соавт., 2000]. Своевременное выяснение клинической формы заболевания (сочетанный, солитарный) имеет большое практическое значение, поскольку при сочетанном поражении оптимальный срок между операциями должен быть не более 2-3 месяцев.

Генетические маркеры повышенного риска и прогнозирование гидатидозного эхинококкоза

В последнее время накапливается все больше данных свидетельствующих о том, что возникновение заболеваний или характер их протекания ассоциирован с определенными полиморфизмами генов-кандидатов. Появилось новое направление, которое получило название предиктивная (предсказательная) медицина, основанная на тестировании генов «предрасположенности» и позволяющая выявлять наиболее ранний этап развития патологии [Баранов B.C., 2004]. Выявление генетических маркеров приобретает особую актуальность, знание их роли в патогенезе многих заболеваний дает возможность прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее протекания, подобрать специфическую терапию для конкретного пациента [Nebert D.W., 1997].

Проведенные исследования установили ассоциации полиморфизма специфичностей главного комплекса гистосовместимости и генов ферментов детоксикации ксенобиотиков с развитием гидатидозного эхинококкоза. На основании полученных результатов были определены генетические маркеры повышенного риска.

Маркерами подверженности к заболеванию у инвазированных E. granulosus детей в Башкортостане являются следующие полиморфизмы:

• Генотип *AG (A2455G) 7 экзона гена CYP1А1;

• Специфичности HLA *07 локуса DRB1 и *02 гена DQB1;

• Фенотип HLA-А24 и В51.

К маркерам устойчивости к заболеванию эхинококкозом относятся:

• Генотип *AА (A2455G) 7 экзона гена CYP1А1;

• Специфичности HLA *05 гена DQB1;

• Фенотип HLA-В14 и В27;

Распространенность аллелей и генотипов главного комплекса гистосовместимости и генов ферментов детоксикации ксенобиотиков в разных популяциях человека может значительно отличаться. Подверженность к эхинококкозу в других этнических группах населения может быть ассоциирована с другими маркерами. В то же время наличие маркера не обязательно должно указывать на определенное развитие эхинококкоза. Инвазионный процесс в организме человека зависит от множества факторов: возраста больного, сопутствующих заболеваний, неблагоприятного влияния факторов внешней среды, патологических состояний специфического и неспецифического иммунитета, гормонального статуса. Поэтому на основании обнаружения генетических маркеров можно лишь прогнозировать повышенный риск заболевания и характер ее течения.

Результаты проведенных исследований явились основанием для разработки алгоритма прогнозирования повышенного риска гидатидозного эхинококкоза у детей проживающих в эндемичных районах Башкортостана.

Алгоритм прогнозирования риска заболевания гидатидозным эхинококкозом

Предлагаемый алгоритм может быть использован для определения группы повышенного риска заболевания эхинококкозом среди детского населения Башкортостана.

Известен способ выявления эхинококкоза по результатам серологических реакций (РЛА, РНГА, ELISA и др.), с применением инструментальных методов (УЗИ, КТ, МРТ). Однако чувствительность, специфичность и разрешающая способность этих исследований часто недостаточна для выявления ранних стадий развития ларвоцист (Ахмедов И.Г., Османов А.О., 2002).

Разработанные в настоящее время клинические, иммунологические, инструментальные методы не позволяют достоверно прогнозировать развитие эхинококковых кист, поскольку имеют следующие недостатки:

• отсутствие диагностических маркеров болезни на ранних этапах развития патологии, из-за разнообразия клинических проявлений;

• недостаточно эффективные инструментальные методы при выявлении мелких кист;

• недостаточно чувствительные и специфичные серологические реакции.

Генетическое тестирование полиморфизма гена CYP1A1, у инвазированных лиц, позволяет с большой вероятностью прогнозировать возможность клинической манифестации эхинококкоза до появления первых симптомов болезни.

Алгоритм прогнозирования состоит из трех этапов (рис. 10). На первом этапе у лиц, проживающих в эндемичных по эхинококкозу районах Башкортостана, проводится обследование с использованием ультразвуковой диагностики и серологических методов. При обнаружении кисты проводится стандартная предоперационная подготовка. Если у лиц, имеющих неблагоприятный эпидемиологический анамнез (контакт с собаками, положительная серологическая реакция и др.), киста не выявляется, то на втором этапе рекомендуется молекулярно-генетическое исследование полиморфизма Ile462Val (A2455G) 7 экзона гена CYP1A1. При обнаружении генотипа *AG прогнозируют повышенный риск заболевания эхинококкозом. На третьем этапе проводится диспансерное наблюдение не менее 3 раз в год под ультразвуковым и серологическим контролем.

Рис. 10. Алгоритм прогнозирования повышенного риска гидатидозного эхинококкоза у детей

Алгоритм прогнозирования сочетанного эхинококкоза у детей в Башкортостане

В настоящее время достоверно установить природу (рецидивный, резидуальный, реинвазивный) развившихся и выявленных после операции кист достаточно трудно, пути профилактики каждого из этих форм различны [Ахмедов И.Г., Османов А.О. 2002]. По серологическим реакциям диагностировать полное выздоровление после хирургического лечения не всегда представляется возможным, ошибочные результаты отмечаются в 5 - 12% случаев [Тимошин А.Д. и др., 2000]. Снижение титров серологических реакций можно регистрировать не ранее чем через 1,5 года (до 5-7 лет) после операции [Ахмедов И.Г., 1998; Galitza Z. et al., 2005], а при сочетанном поражении оптимальный срок между операциями должен быть не более 2-3 месяцев. Возможно выявление ранних стадий развития ларвоцист иммунологическими и инструментальными методами, однако чувствительность, специфичность, разрешающая способность этих исследований недостаточна [Ахмедов И.Г., Османов А.О., 2002; Константинова, Т.Н., Авдюхина Т.И., 2004].

Генетическое тестирование полиморфизма гена GSTM1, у больных, позволяет с большой вероятностью (OR=4,43) прогнозировать повышенный риск развития сочетанного эхинококкоза.

Алгоритм прогнозирования состоит из двух этапов (рис. 11). На первом этапе у пациента после оперативного удаления эхинококковой кисты проводится молекулярно-генетическое исследование полиморфизма гена GSTM1. При обнаружении делеции гена GSTM1 у обследуемого прогнозируют повышенный риск сочетанного эхинококкоза. У лиц, предрасположенных к сочетанному эхинококкозу, соответственно повышен риск развития резидуальных кист после операции. На втором этапе рекомендуется диспансерное наблюдение не менее 3 раз в год с проведением ультразвукового и серологического контроля.

Рис. 11. Алгоритм прогнозирования сочетанного эхинококкоза у детей

Алгоритм прогнозирования нагноения эхинококковой кисты

При эхинококкозе до сих пор остаются не до конца изученными вопросы возникновения осложнений и рецидивов. Наиболее частой причиной смертности являются осложнения, связанные с нагноением и последующим прорывом кисты. Клиническая диагностика осложненного нагноением эхинококкоза у детей представляет значительные трудности, поскольку картина заболевания чаще всего отличается полиморфизмом и не имеет четких дифференциально-диагностических признаков [Гандуров С.Г. и др., 1997; Шамсиев A.M. и др., 1999]. Общепринятые лабораторные анализы в большинстве случаев малоспецифичны, диагноз осложненного нагноением эхинококкоза устанавливается инструментальными методами исследования (УЗИ, КТ, рентген) часто в запущенных случаях. Своевременная диагностика осложнений имеет также значение при определении характера и методики оперативного вмешательства [Абдуллаев А.Г. и др., 2005].

Генетическое тестирование полиморфизма генов HLA и обнаружение специфичностей DRB1*03 и DQB1*02 у больных гидатидозным эхинококкозом детей в Башкортостане, позволит с большой вероятностью (OR=2,20-2,74) прогнозировать повышенный риск осложненного течения заболевания.

Алгоритм прогнозирования состоит из двух этапов (рис. 12). На первом этапе у больного эхинококкозом начальной стадии проводится молекулярно-генетическое исследование полиморфизма HLA локусов DRB1 и DQB1. При обнаружении специфичностей DRB1*03 и/или DQB1*02 у обследуемого прогнозируют повышенный риск нагноения кисты. На втором этапе рекомендуется профилактика осложнений.

Рис. 12. Алгоритм прогнозирования нагноения эхинококковой кисты у детей

Выводы

1. Возбудитель гидатидозного эхинококкоза у детского населения Республики Башкортостан относится к штамму Echinococcus granulosus «общий, домашних овец» с генотипом G1.

2. Филогенетический анализ на основе сравнения нуклеотидной последовательности таксономически значимого фрагмента митохондриального гена СО1 показал генетическое сходство исследуемых южно-уральских изолятов E. granulosus с зарегистрированными в “GenBank” полиморфными вариантами Acc. No DQ109036 и Acc. No U50464.

3. Обнаружено, что у детского населения Башкортостана предрасположенность к гидатидозному эхинококкозу ассоциирована с наличием в фенотипе антигенов HLA-А24, В51. Резистентность к заболеванию выявлена у носителей антигенов В14 и В27.

4. Установлена ассоциация HLA специфичностей *07 гена DRB1, *02 гена DQB1 (более выраженная у лиц со A(II) группой крови системы AB0) и *09 гена DQB1 с повышенным риском гидатидозного эхинококкоза у детей. Выявлен протективный эффект специфичности *05 гена DQB1.

5. Обнаружена ассоциация HLA специфичности *03 гена DRB1 и *02 гена DQB1 с повышенным риском осложнений, связанных с нагноением эхинококковой кисты у детей.

6. Установлена ассоциация полиморфного аллеля G (A2455G) и генотипа *АG экзона 7 гена CYP1A1 с предрасположенностью к заболеванию гидатидозным эхинококкозом детей (более выраженной у детей дошкольного возраста).

7. Выявлена ассоциация делеции гена GSTM1 с повышенным риском сочетанного эхинококкоза у детей.

8. Генетическое тестирование полиморфизма генов комплекса гистосовместимости DRB1, DQB1 и генов ферментов детоксикации ксенобиотиков CYP1А1, GSTM1 с целью выявления маркеров повышенного риска и маркеров устойчивости позволяет прогнозировать развитие гидатидозного эхинококкоза.

Практические рекомендации

1. Для идентификации штаммовой принадлежности изолятов E. granulosus на территории Республики Башкортостан рекомендовано использовать модификацированный метод ПЦР-ПДРФ анализа.

2. При организации и проведении санитарно-эпидемиологического надзора за эхинококкозами в Башкортостане рекомендовано учитывать принадлежность возбудителя к штамму G1 E. granulosus «общий, домашних овец».

3. Для оценки повышенного риска гидатидозного эхинококкоза у детей в Башкортостане рекомендовано использовать молекулярно-генетическое тестирование маркеров предрасположенности и маркеров устойчивости среди генов ферментов детоксикации ксенобиотиков (CYP1А1, GSTM1) и генов комплекса гистосовместимости HLA (DRB1, DQB1).

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Лукманова Г.И., Иксанова Р.Ф. Особенности распределения антигенов групп крови АВ0 среди населения // Ж-л «Здравоохранение Башкортостана». -2000. - С.95-96.

2. Гумеров А.А., Мамлеев И.П., Лукманова Г.И. [и др.] Торакоскопическое лечение эхинококкоза легких у детей // Национальный конгресс по болезням органов дыхания. - СПб., 2003 - С. 12.

3. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Шангареева Р.Х. Строение ларвоцисты эхинококка // Труды IV Междунар. научной конф. «Современные проблемы общей, медиц. и ветеринарной паразитол.». Витебск.- 2004. - С. 178-180.

4. Лукманова Г.И., Еличева З.М., Шангареева Р.Х., Зулькарнаев Т.Р., Гумеров А.А. Распределение аллелей HLA у больных эхинококкозом // Труды IV Междунар. научной конф. «Современные проблемы общей, медиц. и ветеринарной паразитол.». Витебск.- 2004. - С.180.

5. Хидиятова И.М., Ишмухаметова А.Т., Лукманова Г.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ полиморфизма гена HLA-DRB1 в популяциях Волго-Уральского региона // Генетика. - 2004. - №2. - С.267-271.

6. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Хидиятова И.М., Викторова Т.В. Проблема эхинококкоза в Республике Башкортостан // Мед. помощь. - 2005. - №2. - С. 44-46.

7. Викторова Т.В., Лукманова Г.И., Белалова Г.В., Мусыргалина Ф.Ф. и др. Лекции по биологии. Ч.2. Изд. ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава», 2005. - 252 с.

8. Лукманова Г.И. Распределение антигенов HLA и групп крови системы АВ0 и резус-фактор у больных эхинококкозом // Мат. докладов научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - Москва. - 2005. - Вып. 6. - С. 216-218.

9. Лукманова Г.И., Бадретдинов М.А., Викторова Т.В. О колебаниях уровня заболеваемости населения гельминтозами // Мат. VII Междунар. конф. «Циклы». - 2005. - Т.3. - С.154-156.

10. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Еличева З.М., Шангареева Р.Х., Викторова Т.В. Анализ полиморфизма генов главного комплекса гистосовместимости у больных эхинококкозом // Мат. IV Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - Москва. - 2005. - С.268-269.

11. Lukmanova G.I. Badretdinov M., Viktorova T. To a question on the social importance of an epidemiological situation in inter-regional integration // Мат. докладов Всеросс. научно-практ. конф. «Интеграция России в Евросоюз». 2005. - С. 61-62.

12. Ефимов Г.Е., Плечев В.В., Хазиев Г.З., Зулькарнаев Т.Р., Кайданек Т.В., Белалова Г.В., Лукманова Г.И. Система эпидемиолого-эпизоотологического надзора за эхинококкозами: Методические рекомендации для медицинских работников и работников ветеринарной медицины. Уфа. Изд. «Здравоохранение Башкортостана». 2005. 48 с.

13. Лукманова Г.И., Викторова Т.В., Белалова Г.В., Бадретдинов М.А. и др. Проблема гельминтозов в Башкортостане. «Актуальные вопросы современной медицины и здравоохранения» // Мат. Республ. научно-практич. юбилейной конференции. Уфа, 2006. - С. 60-61.

14. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Мушарапов Д.Р., Викторова Т.В. Эхинококкоз на Южном Урале // Эпидемиол. и инфекционные болезни. - 2006. - №5. - С.7-11.

15. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Туйгунов М.М., Викторова Т.В. Геномное типирование изолятов Echinococcus granulosus из районов Южного Урала // Паразитология. - 2006. - Т.40. - №5. - С.479-483.

16. Лукманова Г.И., Комиссарова М.А., Гумеров А.А., Викторова Т.В. Полиморфизм генов глутатион-трансфераз М1 и Т1 и риск заболевания детей эхинококкозом // Мед.паразитол. - 2006. - №3. - С.15-17.

17. Гумеров А.А., Ишимов Ш.С., Гумеров М.И., Шангареева Р.Х., Комиссарова М.А., Лукманова Г.И. Особенности клиники осложненного эхинококкоза легких у детей // Казанский мед. журн. - 2006. - Т.87. - С. 25-6.

18. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Комиссарова М.А., Викторова Т.В. Полиморфизм гена Cyp1A1 у больных эхинококкозом // Сб. докладов Всеросс. Научной конф. «Теоретические и практические вопросы паразитологии». Кемерово, 2006. - С.139-141.

19. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Комиссарова М.А., Викторова Т.В. Пути искоренения эхинококкоза. «Актуальные вопросы современной медицины и здравоохранения» // Мат. Республ. научно-практич. юбилейной конф. Уфа. - 2006. - С. 60-61.

20. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Мухаметханов Н.Х., Билалов Ф.С., Туйгунов М.М. Геномное типирование изолята E. granulosus из Южного Урала // Труды V Республиканской научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития современной паразитологии». - 2006. - Витебск. - С125-127.

21. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Мухаметханов Н.Х., Билалов Ф.С., Туйгунов М.М. ПЦР анализ изолятов E. granulosus из Южного Урала // Мат. Х Международной научной конференции «Здоровье семьи ХХ1 век». 27 апр.-9 мая. Таиланд, 2006. - С. 225.

22. Нартайлаков М.А., Плечев В.В., Мушарапов Д.Р., Лукманова Г.И. Эхинококкоз печени. Уфа. 2006. 104 с.

23. Лукманова Г.И., Викторова Т.В. Актуальные проблемы тканевых цестодозов в Башкортостане // Мат. Респ. конференции «Медицинская наука 2007», посвященной Году Единства Башкортостана с Россией, 75-летию БГМУ, Дню медицинского работника. - Уфа. - 2007. - С.131-2.

24. Лукманова Г.И., Гумеров А.А. Случай сочетанного поражения печени у ребенка цистным эхинококкозом и личинкой (нимфой) Artropoda // Мед.паразитол. - 2007. - №1. - С.54-55.

25. Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Нартайлаков М.А., Билалов Ф.С., Баймиев А.С. Идентификация возбудителя цистного эхинококкоза у населения Южного Урала // Мед.паразитол. - 2007. - №4. - С.29-32.

26. Лукманова Г.И., Туйгунов М.М., Нартайлаков М.А., Билалов Ф.С., Гумеров А.А. Типирование изолятов Echinococcus spp. на Южном Урале. Мед.паразитол. - 2008. - №1. - С.26-27.

27. Лукманова Г.И. Генетические факторы риска эхинококкоза. Уфа, 2008. - 115 с.

Размещено на Allbest.ru