Морфофункциональная характеристика миокарда при экспериментальной патологии и коррекции препаратами метаболического типа действия

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Морфофункциональная характеристика миокарда при экспериментальной патологии и коррекции препаратами метаболического типа действия

Автореферат

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие в связи с сохранением высоких показателей заболеваемости ишемической болезнью сердца во всем мире поддерживается интерес к изучению патогенеза повреждения миокарда (Драпкина О.М. и др., 2000; Арзамасцев А.П. и др., 2003; Сапрунова В.Б., 2003; Голиков П.П., 2004; Марков Х.М., 2005; Мартынов А.И. и др., 2005; Благонравов М.Л., 2007; Barton C.H., 2001; Bian K., Murad F., 2003). Учитывая, что последствия ишемии определяются не только гемодинамическими изменениями, но и тканевыми повреждениями, в современной клинической практике все большее значение придают миокардиальной цитопротекции (Голиков А.П., 2003; Лукьянова Л.Д, 2004; Смирнов Л.Д., 2005; Лапша В.И. и др., 2005).

Особое внимание в настоящее время уделяется изучению морфофункциональных изменений тканевых, клеточных и субклеточных компонентов миокарда, осуществляющих структурно-метаболические, адаптационные и регенераторные процессы в сердце, а также обеспечивающие эффективное функционирование сердечно-сосудистой системы (Непомнящих Л.М., 1991; Евсевьева М.Е., 2000; Павлович Е.Р., 2001). Одним из важных направлений исследования морфофункциональной организации сердца явилось открытие комплекса сигнальных молекул, обеспечивающих тригеррные функции органов и систем организма, одной из них является оксид азота (Bian K. et al., 2003). Эндогенный оксид азота проявляет свойства вазодилятатора (Ванин А.Ф., 1998). Именно нарушение продукции эндотелиальными клетками оксида азота рассматривается как один из факторов в патогенезе ишемических и стрессорных повреждений миокарда, приводящих к дисфункции сосудистого эндотелия (Марков Х.М., 2005).

Большое значение при изучении морфофункциональных изменений сердечно-сосудистой системы и компенсаторных реакций в условиях патологии имеют исследования влияния целого ряда лекарственных средств на восстановление структурно-метаболических параметров и поддержание эффективной деятельности сердца (Северина И.С., 2002; Голиков П.П., 2004; Сернов Л.Н и соавт., 2004; Ismailoglu U.B. et. al., 2001). В распоряжении клиницистов имеется большой арсенал лекарственных средств, позволяющий достаточно успешно бороться с последствиями стрессорного и ишемического повреждения миокарда. Однако механизм действия большинства препаратов основан на снижении потребности миокарда в кислороде, что, как правило, достигается угнетением его сократимости и может способствовать развитию сердечной недостаточности. Что касается современных стресспротекторов (седативные препараты, транквилизаторы, в-адреноблокаторы и др.), то по своей природе они являются средствами дезадаптационной природы: снижают остроту восприятия ситуации, угнетают психо-моторные функции организма, уменьшают реактивность сердечно-сосудистой и других систем организма. В связи с этим большой интерес представляет появившаяся в последнее время группа лекарственных средств, получившая название «препараты метаболического типа действия». К ним относят такие средства как димефосфон, мексидол, креатинфосфат, кудесан и другие. Они обладают широким спектром биологической активности, в том числе проявляют кардиотропные свойства (Меерсон Ф.З. и соавт., 1989; Ончинников В.Д., 1989; Сернов Л.Н., Гацура В.В., 1989; Сернов Л.Н., Смирнов Л.Д., 1996; Рябинин ВА. и соавт., 1996). Однако реализуются ли эти кардиотропные свойства на морфологическом уровне, а также имеются ли у них другие фармакодинамические аспекты на сегодняшний день остается достаточно серьезной неисследованной проблемой медицины. Учитывая актуальность проблемы и необходимость ее дальнейшего изучения, нами было предпринято данное исследование.

Цель работы: изучение морфофункциональных изменений миокарда при экспериментальной патологии (стрессорном и ишемическом повреждении миокарда) и анализ возможностей коррегирующего влияния препаратов метаболического типа действия на структурную организацию мышечных и сосудистых компонентов сердца

Задачи исследования

1. Изучить изменения морфологии миокарда и нарушения функции левого желудочка мышей при различной экспериментальной патологии (стрессорном и ишемическом повреждении миокарда)

2. Исследовать осо.

3. Изучить фармакотоксикологические свойства мексидола, неотона и димефосфона при длительном применении в условиях хронического стресса.

4. Изучить кардиопротекторное действие мексидола, неотона и димефосфона при экспериментальном ишемическом повреждении миокарда.

5. Оценить участие ферментов семейства NO-синтаз и их морфофункциональные проявления, а также медиаторов симпатоадреналовой системы в реализации стрессорного повреждения миокарда.

6. Оценить влияние препаратов метаболического типа действия на состояние NO-синтазной системы и на участие симпатоадреналовой системы в реализации их стресс-протекторного эффекта.

Научная новизна

В результате проведенных исследований впервые установлено, что при длительном применении препаратов метаболического типа действия в условиях хронического стресса наблюдаются компенсаторно-адаптационные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов, ведущие к поддержанию эффективности морфофункционального состояния миокарда. Установлено, что применение неотона, мексидола, димефосфона в условиях хронического стресса, умеренно коррегирует стрессорные изменения ультраструктуры миокарда, уменьшая зоны пересокращения миофибрилл, их деструкцию, участки внутриклеточного и интерстициального отека и количество измененных митохондрий с конденсированным матриксом, спазмированных сосудов.

Изучено кардиопротекторное действие мексидола, неотона и димефосфона при экспериментальном ишемическом и стрессорном повреждении миокарда. Выявлено, что выраженность противоишемического эффекта всех изучаемых препаратов примерно равнозначна. Установлено, что изучаемые препараты не оказывают влияния на смертность подопытных животных в условиях хронического экспериментального стресса и являются безопасными при длительном применении.

Препараты неотон, мексидол, димефосфон способны коррегировать стрессорные повреждения миокарда, влияя на экспрессию конститутивной эндотелиальной изоформы NO-синтазы в эндотелии кровеносных сосудов, что компенсирует эндотелиальную дисфункцию в условиях хронического стресса, и индуцибельной изоформы в кардиомиоцитах что, приводит к снижению токсического эффекта оксида азота. Выявлено, что неотон, мексидол и димефосфон коррегируют содержание оксида азота в миокарде мышей в условиях хронического иммобилизационного стресса.

Показано, что неотон, мексидол способны предотвращать стрессорные повреждения миокарда, влияя на концентрацию медиаторов симпатоадреналовой системы.

Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования

Полученные результаты подтверждают целесообразность использования данной модели стресса для изучения хронической токсичности кардиотропных средств при их доклинических испытаниях и изучения влияния препаратов метаболического типа на коррекцию стрессорных изменений в миокарде. Полученные данные о морфологических изменениях миокарда на фоне хронического иммобилизационного стресса и участии в этом процессе NO-синтазной системы должны учитываться в клинике ишемических и стрессорных поражений сердца, а также при изучении молекулярных основ компенсаторно-приспособительных процессов в эксперименте. Полученные результаты углубляют знания о механизмах кардиопротекторных эффектов препаратов метаболического типа действия (неотона, мексидола, димефосфона). По материалам диссертации получено удостоверение на рационализаторское предложение (2007 г.). Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии с курсом медицинской биологии Мордовского государственного университета, кафедры фармакологии и служат обоснованием для продолжения исследования кардиотропных эффектов препаратов метаболического типа действия в условиях стресса.

Положения, выносимые на защиту

1. Длительное применение препаратов метаболического типа действия в условиях хронического стресса не сопровождается негативными изменениями морфофункционального состояния миокарда. Изменения микроскопических и субмикроскопических структур миокарда можно рассматривать как компенсаторно-адаптационные, ведущие к поддержанию эффективности морфофункционального состояния миокарда.

2. Неотон, димефосфон и мексидол способны эффективно ограничивать альтеративные процессы в миокарде при моделировании экспериментального инфаркта. Выраженность противоишемического эффекта всех препаратов примерно равнозначна и соответствует эффекту пропранолола.

3. Препараты метаболического типа действия способны коррегировать стрессорные повреждения миокарда на уровне NO-синтазной и симпатоадреналовой систем.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на IV научной конференции молодых ученых МГУ им. Н.П. Огарева (Саранск, 1999); научной конференции МГУ им. Н.П. Огарева «Клинико-экспериментальные аспекты современной медицины» (Саранск, 1999); межрегиональной научной конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Пенза, 2000); на Всероссийской научно-практической конференции «Экология, здоровье и природопользование» (Саратов, 2000); на III международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2002); на I Всероссийского конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2002); на научной конференции МГУ им. Н.П. Огарева «ХХХI Огаревские чтения» (Саранск, 2003); на II Всероссийского конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2003); на VI Международном славянском конгрессе по электростимуляции и клинической электрофизиологии сердца (Санкт-Петербург, 2004); на научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов медицинского факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева «Медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте» (Саранск, 2005); 4-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2005); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти Я.В. Костина «Общество, здоровье, лекарство» (Саранск, 2005); IV национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005); на 2-ой Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека» (Ульяновск, 2005); на 11 научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов медицинского факультета Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева «Медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте» (Саранск, 2006); на Всероссийской научно-практической конференции «Неотложные состояния при сердечно-сосудистых заболеваниях» (Москва, 2006); на V Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2006); на научно-практической международной конференции «Актуальные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии» (Белгород, 2006); на VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2006); на XXXV научной конференции «Огаревские чтения» медицинского факультета Мордовского госуниверситета «медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте» (Саранск, 2006); на 6-й Всероссийской научной конференции, «Ретиноиды (Орел, 2007); на конференции, посвященной 70-летию Тверской государственной медицинской академии к 100-летию со дня рождения основателя кафедры анатомии человека, профессора И.С. Кудрина (Санкт-Петербург, 2006); на ХII международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2007); 5-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2007); ХII научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им Н.П. Огарева (Саранск, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, из них 10 статей, в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК и 1 монография, получено удостоверение на рационализаторское предложение (2007 г.).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы, включающего 297 источников (174 отечественных авторов; 123 - зарубежных авторов). Работа включает таблиц, иллюстрирована рисунками (49 микрофотографий и 15 таблиц).

Содержание работы

мексидол неотон димефосфон миокард

Материал и методы исследования

Характеристика подопытных животных

Эксперименты проводили на различных лабораторных половозрелых животных обоего пола, краткие сведения о которых представлены в табл. 1. Лабораторные животные находились в боксированных помещениях на стандартной диете с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской Конвенции по защите животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Все манипуляции, причиняющие животным боль, проводились под наркозом. Для анестезии использованы эфирный наркоз, тиопенталовый наркоз (35 мг/кг, внутрибрюшинно), уретан (800 мг/кг внутрибрюшинно).

Таблица 1. Характеристика экспериментальных животных и биологического материала

№	Раздел исследования	Вид животных	n	Масса, г
1.	Электронно-микроскопическое исследование миокарда	мыши	50	20-22
2.	Иммуногистогистохимическое исследование	мыши	75	20-22
3.	Определение содержания оксида азота в миокарде	мыши	50	20-22
4.	Изучение острой токсичности	мыши	373	18-20
5.	Изучение размеров зон ишемии и некроза	крысы	42	200-350
6.	Адреналиновые микронекрозы	мыши	67	20-22
7.	Острые окклюзионные аритмии	крысы	82	200-350
8.	Определение сократительной функции левого желудочка сердца	кошки	50	1800-4500
9.	Определение фармакотоксикологических свойств препаратов при длительном применении	мыши	225	20-22
10.	Определение концентрации катехоламинов в ткани сердца	мыши	50	20-22
Всего: Мыши 890 Крысы 124 Кошки 50

Метод моделирования хронического иммобилизационного стресса и изучения стресспротекторного действия

Для изучения стресс-протекторной активности метаболических средств нами была использована модель 25%-ного иммобилизационного стресса по И.А. Коломейцевой (1988), предложенная В.П. Балашовым и соавт. в 2002 году для оценки безопасности потенциальных противоаритмических средств как наиболее простой, дешевый и адекватный метод. Иммобилизационный стресс воспроизводили ежедневным помещением животных в тесные пеналы объемом 42 см³, ограничивающие подвижность животных. Длительность иммобилизации составляла 6 часов (25%) в течение 30 дней. Исследуемые соединения вводили ежедневно однократно внутрибрюшинно до стресса в объеме 0,2 мл на инъекцию в эффективных дозах.

Животные были разделены на пять групп: 1- интактные мыши (контроль); 2 - животные, подвергнутые хронической иммобилизации; 3 - животные, подвергнутые хронической иммобилизации и получающие мексидол (внутрибрюшинно, 20 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю), 4 - те же условия + неотон (внутрибрюшинно, 100 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю), 5 - те же условия + димефосфон (внутрибрюшинно, 100 мг/кг, 30 суток, 6 раз в неделю). О токсическом эффекте лекарственных препаратов судили по показателю смертности животных.

Электронно-микроскопическое исследование миокарда

Для электронно-микроскопического исследования миокарда левого желудочка проводили проводку и заливку материала по традиционному методу. Кусочки ткани фиксировали в 3% глутаровом альдегиде на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2) в течение 12 часов при 4⁰ С. После промывки 0,15 М фосфатным буфером (3 смены) проводили постфиксацию 2% растворе осмиевой кислоты в течение 2 часов при 4⁰ С, далее кусочки проводили через батарею спиртов возрастающей концентрации до абсолютного этанола (50⁰, 70⁰, 96⁰, -1 смена по 30 минут при 4⁰ С и 100⁰ - 3 смены по 30 минут при 18⁰ С) и окиси пропилена. Перед заливкой производили пропитку материала в смеси эпоксидных смол с окисью пропилена в отношении 1:1 в течение 3 часов, далее кусочки помещали в заливочную смесь эпоксидных смол на 30 минут при 60⁰С. Заливку осуществляли с использованием смеси эпоксидных смол эпон-аралдит (Mollenchauer., 1964) с последующей полимеризацией в течение 2 - суток при 60⁰С, ультратонкие срезы получали на микротоме, монтировали их на сетки и бленды, контрастировали уранилацетатом (5% раствор на метиловом спирте), цитратом свинца (Reynolds., 1963, Venable J.; Coggeshal R., 1965), препараты изучали на электронном микроскопе ЭМ-125 при ускоряющем напряжении 75 кВ.

Иммуногистохимическое исследование экспрессии eNOS и iNOS в миокарде

Проводили иммуногистохимическое исследование миокарда левого желудочка по традиционной методике (пероксидазный метод) с использованием первичных антител к индуцибельной и эндотелиальной изоформам NO-синтазы (eNOS, iNOS, Santa Cruz Вiotechnology, США, в концентрации 1: 400). В качестве контроля использовали инкубацию без первичных антител. Животных гильотинировали под легким эфирным наркозом. После извлечения сердце помещали в раствор фиксатора (4% раствор параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере, рН=7,4) на 6-8 часов при 4 ⁰С. После криопротекции (15% и 30% сахароза) и замораживания, на криостате готовили срезы (15-20 мкм). Далее срезы помещали в 0,3% раствор перекиси водорода на холодном 70% метаноле на 30 минут. Проводили промывку в 0,1 М фосфатном буфере в течение 15 минут. Далее проводили блокирование в 10% растворе сыворотки (goat blocking serum). Инкубацию срезов в растворе первичных антител проводили в течение ночи при 4 ⁰С. После отмывки первичных антител в фосфатном буфере в течение 15 минут препараты инкубированы с вторичными антителами, связанными с биотином (1:300) (Santa Cruz Вiotechnology, США) в течение 1 часа и затем с АВС комплексом (ABC Staining System) в течение 1 часа (в концентрации, рекомендуемой производителем (Santa Cruz Вiotechnology, США)). Как хроматоген был использован диаминобензидин - DAB (Santa Cruz Вiotechnology, США). Все инкубированные растворы готовили с использованием 0,2% Triton X - 100 и 2% сыворотки (goat blocking serum). Все полученные препараты просматривали в световой микроскоп Zeiss, снабженный цифровой фотокамерой. Полученные изображения обрабатывали с помощью Adobe Photoshop 6,0.

Методы исследования кардиофармакологических свойств испытуемых препаратов

Метод определения острой токсичности

Острую токсичность исследуемых соединений изучали на белых мышах при внутрибрюшинном ведении водных растворов изучаемых фармакологических препаратов. Показатель острой токсичности (ЛД₅₀) вычисляли графически по методу Миллера и Тейнтера (Беленький М.Л., 1963; Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000).

Дифференциальный индикаторный метод определения размеров зон ишемии и некроза у крыс

Метод предложен Серновым. Л.Н., Гацура В.В. (1989). После окклюзии коронарной артерии животных забивали путем декапитации под эфирным наркозом, извлекали сердце, канюлировали восходящую часть дуги аорты, промывали в течение 1-2 мин физиологическим раствором хлорида натрия при t=37 ⁰С под давлением 135 мм водн. ст., а затем перфузировали на протяжении 5-6 мин 0,025% раствором синьки Эванса на физиологическом растворе под прежним давлением. Перфузия продолжалась до темно-синего окрашивания интактных зон миокарда. Затем поврежденный и неповрежденный участки помещали в 2 отдельных бюкса, куда добавляли предварительно подогретый до 37 ⁰С фосфатный буфер, содержащий трифенил-тетразолия хлорид («Sigma», Германия) (1 мг/мл) в соотношении 1:9 (соответственно веса участков ткани и буфера). Бюксы инкубировали в термостате в течение часа при t 37 ⁰С. Через сутки после окрашивания участки поврежденного и неповрежденного отделов миокарда раздельно гомогенизировали в соответствующем инкубационном буфере. В гомогенатах определяли содержание красного формазана (индикатор зоны некроза) и синьки Эванса (индикатор зоны ишемии).

Модель адреналиновых аритмий

В качестве подопытных животных использованы белые мыши массой 20-22 г., которым при легком тиопенталовом наркозе (35 мг/кг, внутрибрюшинно) эндотрахеально вводили фторотан в объеме 0,02 мл, после чего в бедренную вену вводили раствор адреналина гидрохлорида в дозе 16,5 мг/кг. У животных регистрировали ЭКГ во II стандартном отведении, однако основным критерием противоишемической активности являлся показатель выживаемости мышей.

РАННИЕ ОККЛЮЗИОННЫЕ И РЕПЕРФУЗИОННЫЕ АРИТМИИ моделировали на беспородных кошках обоего пола массой 1800-4500 г. (Сторожук В.Г., 1985; Manning et al., 1986). Наркотизированных уретаном животных переводили на искусственную вентиляцию легких, производили торакотомию и, рассекая перикард, обнажали сердце. Под переднюю нисходящюю ветвь левой коронарной артерии подводили лигатуру, концы которой продевали в полость полиэтиленовой трубки с фиксатором. При подтягивании концов лигатуры (в течение 30 минут) достигалась окклюзия коронарной артерии, при ослаблении лигатуры восстановление коронарного кровотока - реперфузия. Об изменениях ритма сердечной деятельности судили по ЭКГ, которую регистрировали во II стандартном отведении. Состояние сократительной активности миокарда левого желудочка сердца в любой момент определяли соотношением «сила-скорость»; кривая этой зависимости соответствует максимальной скорости нарастания давления в левом желудочке (dP/dt_max).

Биохимическое определение катехоламинов в миокарде

Данный метод был предложенный У. Эшлер и Ф. Лимайко, в модификации Э.Ш. Матлиной в 1967 году (Карпищенко А.И., 2002). Извлеченное сердце омывали холодным 0,9% раствором хлорида натрия, отделяли левый желудочек, образец замораживали и взвешивали, затем тщательно гомогенизировали на холоде (0-4⁰С). Далее надосадосадочную жидкость (1,8 мл) добавляли в стеклянные пробирки с 25 мг ЭДТА с доведением pH до 8,2 - 8,5. Надосадочную жидкость с ЭДТА заливали в хроматографическую колонку, для оседания катехоламинов на окиси алюминия. Затем колонку промывали раствором аммиачной воды. Элюирование проводили 0,25 н уксусной кислотой (двумя порциями по 3,5 мл). Полученные специфически флюоресцирующие биогенные амины подвергали фотометрированию на анализаторе биожидкостей «Флюорат - 02 АБЛФ.

Определение содержания оксида азота в миокарде

Об уровне содержания оксида азота в миокарде судили по содержанию нитрит-иона, для определения которого использовали реактив Грисса, состоящий из N - нафтилэтилендиаминдигидрохлорида (12,5 мМ) и сульфаниловой кислоты (37,5мМ) в равных соотношениях (Guevara E. et al., 1998). Содержание нитрит-иона определяли спектрофотометрически.

Статистическая обработка результатов, морфометрия

Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента (t) и критерия ч² при 5% уровне значимости (Закс Л., 1976; Фисенко В.П., 2000). Данные обрабатывали в программе STAT - 2, на базе процессора Intel Pentium 333. Морфометрия проведена с помощью программы Scion Image for Windows (Release Alpha 4.0.3.2).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Исследование острой токсичности испытуемых соединений

Исследование острой токсичности неотона мы провели, используя субстанцию креатинфосфата (Реанал, Венгрия). Нам не удалось определить дозу, вызывающую у животных летальный исход даже при введении 1500 мг/кг. Острая токсичность мексидола составила 419+36 мг/кг (423-426). Согласно данным литературы (Арбузов Б.А., 1968) ЛД₅₀ димефосфона находится в диапазоне 2500 мг/кг. Анализ полученных результатов с учетом требований ГОСТа 12.1.007-76 (Березовская И.В., 2003) показал, что мексидол относятся к классу умеренно токсических соединений (ЛД₅₀, в диапазоне 40-1250 мг/кг), тогда как димефосфон и неотон - к классу малотоксичных веществ (ЛД₅₀, более 1250 мг/кг).

Исследование фармакотоксикологических свойств препаратов при длительном применении

Результаты исследования фармакотоксикологических свойств метаболических препаратов при длительном применении в условиях эксперементального хронического иммобилизационного стресса, моделированного по методу Коломейцевой представлены на рис. 1. Результаты исследования показали, что мексидол и неотон не влияют на стресс-опосредованную подопытных животных. При применении димефосфона наблюдается наиболее выраженная тенденция к снижению процента летальности мышей. Важным является тот факт, что смертность животных при длительной терапии препаратами метаболического типа действия не увеличивалась, что является свидетельством отсутствия у них летальногенных свойств и, следовательно, свидетельством их высокой безопасности.

Рис. 1. Динамика летальности животных при длительном введении метаболических препаратов

Морфологические изменения миокарда белых мышей при длительной экспериментальной терапии метаболическими средствами в условиях хронического стресса

В ответ на длительное стрессорное воздействие у животных развивались характерные морфологические изменения в миокарде. Изменения тонкой структуры мышечной оболочки встречались мозаично. Оболочки отдельных кардиомиоцитов выглядели размытыми, в них отмечалось неоднородность электронной плотности сарколеммы. Отмечался более электронноплотный матрикс органелл, в частности митохондрий и эндоплазматичсеской сети. Часто встречались кардиомиоциты с крупными, вытянутыми ядрами, в некоторых случаях ядерные оболочки образовывали складки, инвагинации, выпячивания (рис. 2а). Количество гетерохроматина существенно увеличивалось, и его скопления концентрировались по периферии ядра, что может косвенно свидетельствовать о полиплоидности ядер, типичной для кардиомиоцитов. Однако значительная часть нуклеоплазмы содержала эухроматин, что характерно для клеток с высокой синтетической активностью.

В кардиомиоцитах обнаруживался умеренный внутриклеточный отек, чаще наблюдающийся в периферических отделах клеток. Отмечалось и нарушение структуры вставочных дисков. В некоторых участках миокарда отмечается их дезорганизация с нарушением чередования специализированных контактов (Рис. 2в). Обнаруживались миофибриллярные структуры кардиомиоцитов с признаками значительного пересокращения (контрактуры I-III степени), чаще контрактуры II степени, а также обнаруживались участки разрыхления и разволокнения миофибрилл (Рис2б).

В кардиомиоцитах выявлялись два вида митохондрий: «светлые» - с хорошо выраженными кристами и «темные» - с конденсированным матриксом, причем количество последних преобладает (Рис. 2а), что возможно свидетельствует о нарушении энергетических процессов в клетках. В зоне деструкции крист обнаруживались точечные зоны просветления. Кроме того, наблюдался «феномен» скопления митохондрий под сарколеммой, что может свидетельствовать о адаптационно-компенсаторном ответе энергетических структур кардиомиоцитов на длительное стрессорное воздействие. Иногда встречались гиганские митохондрии с разрушенными кристами и просветленным матриксом.

Выявлялся значительный интерстициальный отек, наблюдалось увеличенное содержание коллагеновых волокон и соединительнотканных клеток, что может свидетельствовать о склерозе интерстициальной ткани миокарда, обусловленном, возможно, частичной гибелью кардиомиоцитов. Обнаруживалось большое количество спазмированных сосудов (Рис. 2в), что свидетельствует о нарушении метаболического обмена в миокарде.

аРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

бРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

вРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Фрагмент кардиомиоцита мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. а - Атипичное ядро с большим количеством инвагинаций, скопление митохондрии с уплотненным матриксом в саркоплазме. Обозначения: Мх - митохондрии, Я - ядро (х 24000); б - Участки пересокращения миофибрилл (контрактуры II степени). Разволокнение миофибрилл (стрелки). Обозначения: Мх - митохондрии (х 22000); в-Спазмированный сосуд в миокарде мыши на 30 сутки иммобилизационного стресса. Выраженный интерстициальный отек. Дезорганизация вставочного диска с преобладанием десмосомоподобных контактов. Обозначения: КС - кровеносный сосуд, ИО - интерстициальный отек, ВД - вставочный диск (стрелки) (х 26000)

В группах животных, находящихся в условиях длительного иммобилизационного стресса и получающих терапию метаболическими средствами (димефосфона, мексидола, неотона) обнаруживались подобные изменения ультраструктуры миокарда, что и в группе «стресс-контроль». Однако, выраженность и распространенность этих изменений в миокарде животных данных групп значительно снижалась. Форма клеточных ядер характеризовалась полиморфизмом. В основном наблюдались кардиомиоциты с неизмененными ядерными оболочками или ядерные оболочки образовывали незначительные инвагинации (Рис. 3а). Распределение гетеро и эухроматина в ядре свидетельствовало о том, что клетка являлась метаболически активной. В некоторых кардиомиоцитах сохранялся умеренный внутриклеточный отек, который занимал часть саркоплазмы.

аРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

б Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. а - Ядро с незначительными инвагинациями ядерной оболочки в кардиомиоците мышей, получавших димефосфон. Обозначения: Я - ядро х 24000; б - Ультраструктура вставочного диска с преобладанием десмосомоподобных контактов (стрелки) в миокарде мыши, получающей димефосфон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Вставочный диск (стрелки) х 28000

Протекция димефосфоном и мексидолом умеренно отражалась на структурной целостности сократительного аппарата кардиомиоцитов. Признаки пересокращения миофибрилл выявлялись с умеренной частотой в кардиомиоцитах (контрактуры I степени) (Рис. 4а) наряду с нормальными сократительными структурами с хорошо выраженными изотропными участками, Z-линиями. В меньшей степени сократительного аппарата клеток коснулась протекция неотоном. Чаще, чем при применении других препаратов обнаруживались признаки пересокращения миофибрилл (контрактуры I-II степени) (Рис. 4б).

аРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

бРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. а - Участки пересокращения миофибрилл (контрактуры I степени) в кардиомиоците мыши, получающей димефосфон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Мф - миофобриллы (х 20000); б - Участки пересокращения миофибрилл (контрактуры II степени) в миокарде левого желудочка мыши, получающей неотон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Область соединения двух кардиомиоцитов. Обозначения: Мф - миофибриллы, Вставочный диск (стрелки), Мх - митохондрии (х 16000)

В группе животных, получающих терапию метаболическими средствами, обнаруживалось преобладание «светлых» митохондрий с многочисленными, хорошо выраженными кристами (Рис. 5а), что может свидетельствовать о положительном влиянии препаратов на энергетические процессы в кардиомиоцитах и компенсации негативных последствий стресса. Однако в некоторых участках желудочкового миокарда обнаруживались скопления «темных» митохондрии с конденсированным матриксом (Рис. 5б), что возможно связано с локальными обратимыми изменениями ультраструктурных компонентов, как результат позитивного воздействия препаратов.

аРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

б Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 5. а - Преобладание «светлых» митохондрии, с хорошо выраженными кристами в кардиомиоците мыши, получающей димефосфон в условиях хронического иммобилизационного стресса. В кардиомиоците расположены интактные миофибриллы. Обозначения: Мф - миофобриллы, Мх - митохондрии (х 28000); б - Митохондрии 2-х видов: с уплотненным матриксом (Мх1), и с хорошо выраженными кристами (Мх2). Разволокнение и некоторая дезорганизация миофибрилл в кардиомиоците мыши, получающей мексидол в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Мф - миофобриллы, Я - ядро (х 21000)

Ультраструктура кровеносных сосудов не претерпевала значительных изменения. При применении метаболических средств в большинстве случаев отмечались незначительный интерстициальный отек. Эндотелиоциты капилляров имели нормальную ультраструктуру, в их цитоплазме обнаруживались пиноцитозные пузырьки, что свидетельствует об активном двустороннем транспорте веществ, как результат позитивного действия препарата при стрессорном воздействии. Сосуды микроциркуляторного русла значительной части желудочкового миокарда характеризовались полнокровием. Интерстициальный отек был выражен в меньшей степени, чем в миокарде животных группы «стресс-контроль».

аРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

б Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. а - Ультраструктура кровеносного сосуда миокарда мыши, получающей мексидол в условиях хронического иммобилизационного стресса. Эндотелий сосуда содержит большое количество пиноцитозных пузырьков (стрелки), хорошо выражены складки, миковорсинки. Обозначения: КС - кровеносный сосуд, Мв - микроворсинки (х 22000); б - Полнокровный капилляр в миокарде левого желудочка мыши, получающей неотон в условиях хронического иммобилизационного стресса. Обозначения: Мх - митохондрии, Кл - капилляр (х 18000)

Морфометрия проведена с помощью программы Scion Image for Windows (Release Alpha 4.0.3.2). Проводилось измерение оптической плотности митохондрий. Оптическая плотность представляла собой среднее значение интенсивности оттенка серого множества пикселей, образующих отображение структуры на микрофотографии. В качестве фона измерялась оптическая плотность цитоплазматических структур, расположенных в непосредственной близости к митохондриям, которая вычиталась из показателей оптической плотности митохондрий. В условиях длительного иммобилизационного стресса без применения метаболических средств отмечается достоверное увеличение оптической плотности митохондрий, которая составила 50,46±0,41 у. е. В условиях длительного иммобилизационного стресса и применения метаболических средств (мексидола, неотона, димефосфона) отмечается достоверное уменьшение оптической плотности митохондрий по сравнению с группой животных «стресс-контроль» - 43,54±3,34; 24,25±2,14 и 27,33±2,1 соответственно. Как показали результаты морфометрии, у животных группы «стресс-контроль» поврежденные митохондрии с конденсированным матриксом составляют 70% (при х 20000). В группе животных получающих мексидол, неотон и димефосфон в условиях длительного иммобилизационного стресса отмечается достоверное уменьшение количества митохондрий с конденсированным матриксом (40%, 15%, 15% при х 20000) соответственно по сравнению с группой животных «стресс-контроль».

Рис. 7. Показатели оптической плотности митохондрий при хроническом иммобилизационном стрессе и применении метаболических средств

Рис. 8. Количество измененных митохондрий при хроническом иммобилизационном стрессе и применении метаболических средств

Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что иммобилизационный стресс способствует развитию структурных нарушений миокарда. Все изученные препараты оказывают протекторное действие на комплекс морфологических повреждений миокарда при стрессе, а изученные изменения ультраструктуры можно рассматривать как компенсаторно-адаптационные проявления, способствующие эффективному восстановлению его морфофункционального состояния.

Исследование антиишемических свойств исследуемых соединений

Учитывая выраженный кардиоцитопротекторный эффект мексидола, неотона, димефосфона при хроническом стрессе, представляет интерес оценить протекторные свойства указанных препаратов при экспериментальной ишемии миокарда. С этой целью мы использовали различные методические приемы и в первую очередь дифференциальный индикаторный метод зоны некроза и ишемии в ранние сроки острого инфаркта миокарда у крыс. Результаты опытов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние исследуемых препаратов на размеры зоны ишемии и некроза у крыс через 4 часа после экспериментального инфаркта миокарда

Условия опыта	Доза, мг/кг	n	Зона ишемии/ масса миокарда (%)	Зона некроза/ масса миокарда (%)	Зона некроза/ зона ишемии (%)
Контроль	-	16	34,5±2,3	21,2±2,4	62,5±4,3
Пропранолол	1,0	6	29,7±3,0	12,1±1,4*	40,5±5,2*
Креатинфосфат	200,0	8	30,1±2,7	16,4±1,7*	51,2±3,4*
Димефосфон	200,0	6	31,0±4,0	15,0±1,8*	49,0±5,3*
Мексидол	20,0	6	35,1±3,4	9,8±2,6*	32,4±6,7*

Неселективный бета-адреноблокатор - пропранолол не изменял площадь зоны ишемии у подопытных крыс, однако весьма эффективно ограничивал зону некроза. Этот показатель через четыре часа после перевязки венечной артерии по отношении к общей массе миокарда составил 12,1±1,4%, в отношении к зоне ишемии - 40,5±5,2% (p<0,05). Противоишемический эффект всех трех испытуемых веществ был сопоставим с эффектом пропранолола. Креатинфосфат, димефосфон и мексидол не оказывали статистически достоверного влияния на размер зоны ишемии, которая в основном определяется местом перевязки коронарной артерии. Поскольку «высота» лигирования артерии во всех опытах была стандартной, понятно, почему величина зоны ишемии во всех опытах была примерно одинакова. Напротив, отношения зоны некроза к общей массе миокарда и к зоне ишемии, как и под влиянием препарата сравнения заметно снижались под действием всех трех испытуемых веществ.

Таким образом, креатинфосфат, димефосфон и мексидол способны эффективно ограничивать альтеративные процессы в миокарде при моделировании экспериментального инфаркта. Выраженность противоишемического эффекта всех препаратов примерно равнозначна и по своему качественному и количественному выражению соответствует эффекту бета-адреноблокатора - пропранолола.

Другим методическим приемом для оценки противоишемических свойств лекарственных средств, является тестирование эффективности препаратов при катехоламиновых микронекрозах сердца у мелких лабораторных грызунов. Результаты опытов представлены на рис. 9.

Рис. 9. Противоишемическая активность исследуемых препаратов при адреналиновой интоксикации белых мышей

Препарат сравнения пропранолол оказывал дозозависимое протекторное действие: снижение дозы пропранолола до 0,5 мг/кг сопровождалось развитием оптимального противоишемического и противоаритмического эффекта. Опыты показали, что мексидол, по сравнению со всеми другими препаратами, включенными в исследование, снижал смертность животных (8% в опыте, против 43% в контроле). Противоишемический эффект мексидола не сопровождался снижением вероятности развития эктопических желудочковых аритмий и блокад проведения. Димефосфон (200 мг/кг) не проявил достоверного противоаритмического действия в условиях данной экспериментальной патологии. Тем не менее, на наш взгляд представляется важным тот факт, что на фоне димефосфона, в отличие от других метаболических средств и традиционных антиаритмиков, в меньшей степени угнеталась деятельность СУ и реже возникали синоаурикулярные, атрио-вентрикулярные внутрижелудочковые блокады проведения. По выраженности этого эффекта димефосфон приравнивается к эффекту пропранолола в дозе 0,5 мг/кг. Креатинфосфат был исследован нами в одной серии экспериментов (150 мг/кг). Препарат не проявил статистически значимого противоишемического и противоаритмического действия в условиях данной экспериментальной патологии. В связи с этим, на модели адреналиновых аритмий у мышей отчетливо проявился противоишемический эффект лишь антагониста бета-адренергических рецепторов и мексидола, который в рамках рассматриваемой модели, вероятно, является наиболее мощным антиишемическим препаратом из трех, изучаемых нами.

В качестве косвенного показателя тяжести ишемического процесса определена интенсивность аритмий при окклюзии и реперфузии коронарной артерии у животных. Применялся метод комплексной сравнительной оценки противоаритмической активности ряда соединений, основанный на вычислении суммарного индекса терапевтической активности (СИТА), предложенный в работах Балашова В.П. и соавт. (2007). Результаты исследований представлены на рис. 10. В контрольной серии величина СИТА равна 6 условным единицам (по числу регистрируемых показателей). В опытных сериях величина СИТА обратно пропорциональна антиаритмической активности вещества. Из представленных расчетов видно, что в целом максимальную эффективность при данной экспериментальной патологии проявили препараты сравнения - пропранолол и верапамил, тогда как эффективность препаратов метаболического типа действия оказалась заметно ниже. Креатинфосфат был менее эффективен как кардиопротектор. Тогда как димефосфон и мексидол проявляли более выраженные противоишемические свойства.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 10 Величины суммарных терапевтических индексов исследуемых препаратов при острых окклюзионных аритмиях у крыс

Состояние сократительной активности миокарда левого желудочка сердца определяли соотношением «сила-скорость» в опытах на кошках. Кривая этой зависимости соответствует максимальной скорости нарастания давления в левом желудочке (dP/dt_max). С целью изучения гемодинамики в условиях острой ишемии, последнюю воспроизводили путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии после регистрации исходных значений. Результаты исследования dP/dt_max и среднего динамического артериального давления представлены на рис. 11. и рис 12.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Отличия от контроля достоверны при наличии маркировки

Рис. 11. изменение dp/dtmax в% по отношению к исходным значениям в контроле и после введения метаболических препаратов у кошек с экспериментальным инфарктом миокарда

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Отличия от исходных значений достоверны при наличии маркировки

Рис. 12. Влияние исследуемых препаратов на динамику артериального давления (в мм. рт. ст.) у кошек с экспериментальным инфарктом миокарда

Мексидол оказывал отчетливый протекторный эффект. На фоне его введения, начиная с 20 минуты наблюдения, значения dp/dt достоверно удерживались на более высоком уровне, чем в контрольных экспериментах. В течение 60 минут наблюдения мексидол не влиял на величину артериального давления. Однако следует отметить, что в контрольных опытах угнетение этого показателя достигало достоверного уровня лишь через 1 час наблюдения. В этот период времени препарат проявлял отчетливую тенденцию к поддержанию уровня среднего динамического артериального давления. Наиболее значимым эффектом димефосфона явилась его способность надежно препятствовать депрессии инотропной функции желудочкового миокарда подопытных животных. Так на фоне димефосфона, уже на пятой минуте эксперимента значения dp/dt были статистически достоверно выше, чем в контрольной серии опытов (соответственно 99±1,3% и 80±8,6%). В дальнейшем этот эффект сохранился на протяжении всего периода наблюдения и через час инотропная функция миокарда под влиянием димефосфона сохранялась на уровне 92±5,2% от исходного уровня, тогда как в контроле она в среднем составила 64±8,0% (p<0,05). В заключительной серии экспериментов мы оценили гемодинамические эффекты неотона у кошек, в той же экспериментальной постановке. Неотон вводили в двух дозах (50,0 и 100,0 мг/кг). При этом режимы введения препарата различались. В дозе 50,0 мг/кг креатинфосфат вводили одномоментно болюсно через 1 минуту после лигирования коронарной артерии. В дозе 100,0 мг/кг препарат вводили дробно в течение всего 1,5 часового периода наблюдения. При первом способе введения (50,0 мг/кг) Креатинфосфат не оказал статистически значимых эффектов на показатель сократимости миокарда левого желудочка кошек и величину артериального давления. При титровании большей дозы (100,0 мг/кг) Креатинфосфат не менее эффективно чем мексидол и димефосфон предупреждает негативное влияние острой коронароокклюзии на регистрируемые гемодинамические характеристики. Как свидетельствуют данные исследования препарат статистически достоверно уменьшает депрессию инотропной функции миокарда по тесту dp/dt начиная с пятой минуты наблюдения. Статистически значимого действия на уровень среднего динамического давления данный препарат не оказал и в этом режиме введения.

Исследование некоторых механизмов кардиотропного действия мексидола, димефосфона и неотона

Результаты исследования содержания биогенных аминов в миокарде при длительном применении метаболических препаратов в условиях экспериментального хронического иммобилизационного стресса представлены на рис. 13.

Рис. 13. Содержание катехоламинов в миокарде животных при длительном введении метаболических препаратов в условиях иммобилизации

В ответ на длительное стрессорное воздействие у животных отмечается статистически достоверное повышение концентрации адреналина в миокарде (11,06±2,51 нмоль/г) по сравнению с животными интактного контроля (4,97±0,62 нмоль/г).

При терапии мексидолом и неотоном у животных отмечается статистически достоверное снижение концентрации адреналина в миокарде до 4,02±0,39 нмоль/г и 5,51±0,72 нмоль/г, соответственно по сравнению с животными, подвергнутыми хронической иммобилизации без применения метаболических средств (11,06±2,51 нмоль/г). Димефосфон также проявлял выраженную тенденцию к снижению концентрации адреналина в миокарде (6,40±1,06 нмоль/г), однако она не носила статистически достоверного характера.

Результаты исследования концентрации медиатора симпатической нервной системы - норадреналина свидетельствуют (Рис. 13.), что при длительном стрессорном воздействии в миокарде животных не отмечается статистически достоверного изменения концентрации норадреналина (9,4±2,07 нмоль/г) по сравнению с животными интактного контроля (7,06±1,60 нмоль/г). У животных при длительном иммобилизационном стрессе и применении мексидола, неотона и димефосфона не отмечается статистически достоверного изменения концентрации норадреналина в миокарде (8,14±1,69 нмоль/г), (12,28±2,53 нмоль/г) и (11,25±1,88 нмоль/г) соответственно по сравнению с животными группы стресс-контроля.

Таким образом, комплекс полученных данных позволяет с уверенность утверждать, что мексидол и неотон способны влиять на механизмы стрессорного повреждения миокарда на уровне симпатоадреналовой системы, тогда как димефосфон не оказывает подобного эффекта.

Результаты проведенных исследований содержания оксида азота, представленные на Рис. 14. свидетельствует о заметном дисбалансе этого важного мессенеджера в условиях стрессорного повреждения. Препараты метаболического типа действия эффективно нормализуют количество NO в ткани сердца подопытных животных.

Рис. 14. Влияние стресса и препаратов метаболического типа на содержание оксида азота в миокарде мышей

Исследование экспрессии eNOS и iNOS в миокарде животных

У животных в ответ на длительное стрессорное воздействие выявляется значительная экспрессия индуцибельной изоформы в различных участках миокарда (Рис. 15а). В больших концентрациях, образующихся, как правило, индуцибельной изоформой NO-синтазы, оксид азота может оказывать на клетки токсический эффект, связанный как с прямым действием на железосодержащие ферменты, так и с образованием сильного окислителя, очень реакционного и токсичного свободнорадикального соединения пероксинитрита. Токсический эффект проявляется прежде всего в ингибировании митохондриальных ферментов, что приводит к снижению выработки АТФ и ухудшению метаболических процессов в миокарде.

аРазмещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

б Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 15. а - Значительная экспрессия iNOS в эндотелии кровеносных сосудов миокарда мышей при хроническом стрессе х 380; б - Слабая экспрессия iNOS в миокарде мышей при хроническом стрессе и применении неотона х 260. Пероксидазный метод

Выявление эндотелиальной изоформы в эндотелии кровеносных сосудов при хроническом стрессе по нашим данным, напротив понижается по сравнению с животными контрольной группы. Известно, что оксид азота является мощным сосудорасширяющий агентом. Расширение сосудов связано с диффузией NO из эндотелия к соседним гладкомышечным клеткам стенки сосуда, активацией в них гуанилатциклазы и образованием цГМФ.

У животных в условиях хронического иммобилизационного стресса и применения метаболических средств (неотона, димефосфона и мексидола) выявляется усиление экспрессии конститутивной эндотелиальной изоформы NO-синтазы в эндотелии кровеносных сосудов, по сравнению с животными, подвергнутыми иммобилизационному стрессу без применения данных препаратов.

Экспрессия индуцибельной изоформы в кардиомиоцитах при применении метаболических средств имеет тенденцию к снижению (Рис. 15б) по сравнению с животными, подвергнутыми хроническому иммобилизационному стрессу без применения препаратов метаболического типа действия. Это, очевидно, приводит к снижению токсического эффекта на клетки и проявляется повышением активности митохондриальных ферментов, повышению выработки АТФ и улучшению метаболических процессов в миокарде.