Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Грипп является глобальной инфекцией, которая в период сезонных эпидемий поражает от 10 до 20% населения планеты, а также единственной, способной вызвать в современном мире пандемии. До настоящего времени было известно 3 подтипа вируса гриппа, вызвавшие пандемии: A(H1N1) - в 1918 г., A(H2N2) - в 1957 г., A(H3N2) - в 1968 г. Начиная с 1997 г., высокопатогенные (ВП) вирусы гриппа подтипа A(H5N1), циркулирующие среди дикой и домашней птицы в Юго-восточной Азии и других регионах мира, вызвали заболевание 390 человек с необычайно высокой смертностью, которая составила более 60%. Анализ вирусов гриппа А(H5N1), выделенных как от людей, так и от птиц, показал, что за последние 7-8 лет вирусы этого подтипа разделились на несколько линий, существенно отличающихся между собой, как антигенно, так и генетически. Клиническая картина при инфекции людей вирусами А(H5N1) характеризуется тяжестью клинических симптомов, связанных с проявлениями острой дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточности, признаками гепатита и тяжелой лимфопении. Дикие перелетные, особенно водоплавающие птицы являются одновременно природным резервуаром и переносчиком инфекции из стран Юго-Восточной Азии в другие регионы. Начиная с 2006 г., помимо Азии возбудитель распространился и внедрился в экологическую природную систему всей Европы, а также северной и центральной частей Африки. Не осталась незатронутой и территория России. Несмотря на то, что до сих пор не было получено убедительных данных об устойчивой передаче вируса А(H5N1) от человека к человеку (Katz et al., 1999, Ungchusak et al., 2005, Uyeki et al., 2008), что ознаменовало бы начало новой пандемии, продолжающееся заражение людей создает угрозу возникновения пандемической ситуации (Guan, 2004; Webster, 2005). В настоящее время ситуация по гриппу в мире оценивается согласно классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ, 2005) как «Период угрозы пандемии, фаза 3», для которого характерно выявление случаев заражения людей новыми подтипами вируса, но при этом отсутствует устойчивая передача вируса от человека к человеку.

В качестве потенциального источника нового пандемического штамма рассматриваются также вирусы птичьего гриппа других подтипов, способные передаваться людям: А(H9N2), А(H7N7). Опыт возникновения пандемий гриппа не исключает также возврата в циркуляцию вируса человека A(H2N2), который вызвал пандемию в 1957 году. В практике уже имеется пример возвращения ранее циркулирующих штаммов, как это было в 1977 г. с вирусом гриппа A(H1N1). Около 70% населения нашей страны не никогда встречались с вирусом А(H2N2) и не имеют иммунитета к нему. Однако вирусы этого подтипа продолжают циркулировать в популяциях животных (птиц, свиней), что увеличивает риск заболевания людей. В США в 2006 году от свиней с бронхопневмонией были выделены вирусы подтипа А(H2N3) (Ma et al., 2007). Молекулярный анализ НА и NA вирусов А(H2N3) показал, что они имеют птичье происхождение, но оба вируса уже приобрели признаки, характерные для вирусов млекопитающих. Это наблюдение подтверждает роль свиней как промежуточных хозяев при адаптации вирусов гриппа птиц перед передачей человеку.

В настоящий момент неизвестно, какой подтип вируса гриппа может вызвать следующую пандемию, но необходимость срочной разработки эффективных мер и средств защиты человека от пандемии признается специалистами всего мира, что отражено в рекомендациях Всемирной организации Здравоохранения и Комитета США по практике иммунизации, а также приказах Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Активная иммунизация общепризнанно считается наиболее эффективным медицинским средством профилактики вирусных инфекций. Опыт ликвидации наиболее опасных вирусных инфекций, таких как оспа, корь и полиомиелит позволяет заключить, что использование живых вакцин обеспечивает необходимую эффективность и результативность противоэпидемических мероприятий. На заседаниях ВОЗ 04.11.05 и 2.05-5.05.2006, посвященных разработке плана активных действий на пандемический период, живая гриппозная вакцина включена наряду с инактивированными вакцинами как средство профилактики пандемического гриппа.

Современные живые гриппозные вакцины (ЖГВ) включают аттенуированные штаммы вирусов гриппа, полученные методом генетической реассортации. Гены, кодирующие гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального штамма, а шесть генов, кодирующих негликозилированные белки - от холодоадаптированного (ХА) «донора аттенуации». В России в течение многих лет вакцинные штаммы вируса гриппа А, включаемые в состав ЖГВ для взрослых, подготавливают на основе ХА донорского штамма подтипа H2N2 - А / Ленинград/134/17/57 (Александрова, 1977), полученного путем последовательных пассажей в куриных эмбрионах при пониженной до 25-26?С температуре. Для создания рекомбинантных штаммов ЖГВ для детей 3-14 лет был подготовлен дополнительно аттенуированный 30-кратным пассированием при низкой температуре донор аттенуации А / Ленинград/134/47/57 (H2N2) (Гармашова с соавт., 1984). Изучение полной нуклеотидной последовательности генов, кодирующих негликозилированные белки доноров аттенуации А / Ленинград/134/17/57 и А / Ленинград/134/47/57, выявило ряд мутаций, ответственных за проявление этими штаммами признаков температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации (Klimov, Cox, 1995). В отличие от ЖГВ для взрослых, которая вводилась однократно, детский вариант ЖГВ применялся при двукратном введении с интервалом в 4 недели. Для подготовки реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В, включаемых в состав тривакцины, используется донор аттенуации В/СССР/60/69.

Многолетнее изучение реассортантной ЖГВ подтвердило ее безвредность и эффективность (Alexandrova et al, 1986, Rudenko et al., 1993, Khan et al., 1996). В ряде широкомасштабных клинических испытаний было показано, что применение ЖГВ вызывает выраженную стимуляцию всех систем иммунного ответа (гуморального, локального, клеточного), включая сывороточные антитела, секреторные IgA, цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты (Johnson et al. 1986, Найхин с соавт., 2000, 2002), обеспечивая формирование широкого спектра иммунитета против дрейфовых вариантов вирусов гриппа. Стимуляция неспецифических факторов иммунитета (интерферон, NK-клетки) обусловливает эффективность ЖГВ с первых дней применения (Rudenko et al., 2001). Создаваемый при применении ЖГВ уровень коллективного иммунитета, как показали исследования среди детей школьного возраста, играет значительную роль в ограничении распространения инфекции в обществе (Rudenko et al., 1993, Kendal et al., 1997, Monto et al., 1999).

Результаты целого ряда исследований свидетельствуют о генетической стабильности применяемых в настоящее время ХА донорских штаммов и реассортантов на их основе (Гендон с соавт., 1984, Klimov, Rudenko, 1996, Klimov et al., 2001). Клинические испытания американской реассортантной ЖГВ на основе донора аттенуации H2N2 А / Энн Арбор/6/60 показали, что при применении ЖГВ в условиях эпидемического подъема, вызванного вирусами А(H3N2), не происходило реассортации между вакцинными штаммами и дикими вирусами (Keitel et al., 1998). Более того, именно вакцинные штаммы выступали как доминирующие вирусы при опытах на хорьках и клиническом изучении у волонтеров, снижая уровень репродукции коинфицирующих диких вирусов (Whitaker-Dowling et al., 1991, Younger et al., 1994). Изучение полученных методами обратной генетики реассортантов американского донора аттенуации А / Энн Арбор/6/60 (H2N2) с циркулирующим эпидемическим вирусом А / Сидней/5/97 (H3N2) показало, что реассортанты с любым составом генома неизменно оказывались более аттенуированными по сравнению с эпидемическим вирусом, независимо от того, вводились ли гены ХА штамма в состав эпидемического вируса или наоборот, гены эпидемического вируса переходили к донору аттенуации (Parks et al., 2007).

Существенным практическим преимуществом использования ЖГВ является интраназальный (физиологический) путь введения в виде назального спрея. При этом стоимость живой вакцины, обусловленная особенностями технологического процесса, не требующего концентрации вирусного материала, в несколько раз меньше инактивированной. В случае возникновения пандемической ситуации повышение потребности в количестве доз инактивированной вакцины с учетом необходимости двукратной иммунизации, обусловленной отсутствием у людей предшествующего иммунитета к новому вирусу, может привести к недостатку производственных мощностей предприятий, производящих вакцину. В этом случае применение ЖГВ может значительно увеличить охват прививками.

К настоящему времени в России накоплен значительный опыт применения ХА реассортантной ЖГВ в практике здравоохранения, тем не менее, ряд теоретических и практических вопросов все еще оставался нерешенным.

Несмотря на то, что существующие в настоящее время доноры аттенуации, применяемые для подготовки реассортантов вирусов гриппа А, входящих в состав поливалентной ЖГВ - А / Ленинград/134/47/57 (H2N2) (Россия) и А / Энн Арбор/6/60 (США) - подробно охарактеризованы (определены основные мутации в их геноме, ответственные за проявление ts-фенотипа, изучена роль отдельных генов в аттенуации), не были определены мутации, ответственные за холодовую адаптацию вирусов гриппа, полученных в процессе пассирования при пониженной температуре. Не были проведены полное секвенирование и молекулярно-генетический анализ донора аттенуации вирусов гриппа В-В/СССР/60/69. Анализ реассортантов на основе В/СССР/60/69 проводился методами, требовавшими использования больших количеств концентрированного вирусного материала, что затрудняло проведение множественных исследований.

Не была разработана методика получения и оценки кандидатов в вакцинные штаммы ЖГВ для применения в случае пандемии, вызванной вирусом нового, не циркулирующего в настоящий момент подтипа.

До начала выполнения данной работы ЖГВ применялась для вакцинации лиц не старше 65 лет, а специфическая профилактика гриппа среди лиц пожилого в России не проводилась вообще.

До проведения настоящих исследований в России применялись два варианта ЖГВ - детский и взрослый, при этом использование для детского варианта ЖГВ специального донора аттенуации приводило к удорожанию производства вакцины. Необходимость двукратного введения детского варианта вакцины при вакцинации детей от 3-х лет затрудняло проведение вакцинопрофилактики в предэпидемический период, а также усложняло выполнение календаря плановых прививок против других инфекций.

Целью настоящей работы являлась разработка теоретических и научно-практических основ для создания, оценки и применения живой гриппозной вакцины против пандемически опасных вирусов гриппа.

Задачи исследования:

1. Молекулярно-генетический анализ и сравнительная оценка на чувствительных моделях гриппозной инфекции (куриные эмбрионы, культура клеток MDCK, мыши, хорьки) безвредных для человека ХА штаммов вирусов гриппа А и В, полученных последовательным пассированием при пониженной температуре.

2. Характеристика фенотипических и генотипических свойств ХА штамма А / Москва/21/17/65 (H2N2) для применения в качестве нового донора аттенуации или вакцинного штамма в случае возвращения в циркуляцию вирусов этого подтипа.

3. Секвенирование донора аттенуации В/СССР/60/69 и модификация метода рестрикционного анализа применительно к реассортантам на его основе для производства поливалентной ЖГВ.

4. Подготовка, характеристика и доклиническое исследование высокопродуктивных реассортантных штаммов на основе ХА донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) с потенциально пандемическими вирусами гриппа различных подтипов вирусов гриппа: Н5, Н7, Н9.

5. Оценка в ограниченных клинических испытаниях безвредности, генетической стабильности и иммуногенности ЖГВ, разработанной с использованием модельного апатогенного птичьего вируса подтипа А(Н5N2).

6. Разработка оптимальной стратегии и тактики вакцинации с использованием ЖГВ в интерпандемический период и при подготовке к пандемии.

Научная новизна. Автором впервые применен реассортантный метод к созданию вакцинных штаммов «шифтовых» вариантов вирусов гриппа на основе отечественного донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) с использованием апатогенных вирусов гриппа птиц, что отражено в заявке на изобретение 118284 A1 (WO, 2007). Впервые определены условия и закономерности получения и апробации холодоадаптированных штаммов вирусов гриппа потенциально пандемических подтипов - Н5, Н7 и Н9.

Автором впервые разработана экспериментальная модель для доклинического изучения прививочных свойств холодоадаптированных реассортантных штаммов потенциально пандемических подтипов. В доклиническом и клиническом изучении впервые исследована роль различных серологических тестов (РТГА, реакция микронейтрализации, иммуноферментный анализ) в оценке иммунологической эффективности ЖГВ подтипа Н5. На экспериментальной модели впервые теоретически обоснованы схемы иммунизации живой гриппозной вакциной из реассортантного штамма A(Н5N2).

Впервые проведенное определение нуклеотидной последовательности и молекулярно-генетический анализ штаммов А / Москва/21/17/65 (H2N2) и В/СССР/60/69 и позволили обосновать их применение в качестве доноров аттенуации для получения реассортантных вакцинных штаммов. Результаты секвенирования и рестриктазного картирования, выявившие целый ряд уникальных нуклеотидных замен в генах негликозилированных белков донора аттенуации В/СССР/60/69, указывают на единый генетический характер обеспечения холодовой адаптации вирусов гриппа А и В.

Теоретическая значимость проведенных исследований. Впервые разработана концепция создания реассортантной ЖГВ против вирусов гриппа, обладающих пандемическим потенциалом. Эта концепция основана на экспериментальных доказательствах безвредности, иммуногенности и протективной эффективности холодоадаптированных реассортантных штаммов, содержащих поверхностные антигены апатогенных птичьих вирусов, а также подтверждена данными о репродукции реассортантного штамма А(Н5N2) в носоглотке человека с формированием гуморальных и секреторных антител не только к вакцинному штамму, но и к высокопатогенным вирусам птичьего гриппа A(H5N1).

Получены новые фундаментальные данные о механизмах холодовой адаптации вирусов гриппа. Установлена связь изменений полимеразной субъединицы РВ2 с реализацией функции холодовой адаптации штамма А / Москва/21/17/65 (H2N2).

Практическая значимость работы. Работа имеет большое народно-хозяйственное значение. В результате ее выполнения автором создана уникальная коллекция холодоадаптированных реассортантов потенциально пандемических подтипов вирусов гриппа А(H5N2), А(H7N3) и А(H9N2), которые депонированы в Государственной коллекции вирусов института вирусологии имени Д.И. Ивановского. Эти штаммы могут быть использованы для быстрой наработки вирусного материала при производстве пандемической ЖГВ, что является одним из направлений международной стратегии подготовки к пандемии.

Данные доклинических испытаний реассортантного штамма A/17/утка / Потсдам/86/92 (H5N2) позволили разработать и утвердить программы 1 и 2 фазы клинических испытаний экспериментальной серии ЖГВ подтипа А(H5N2) «Орвакс», производства ФГУП НПО «Микроген» с целью создания модели для клинического изучения ЖГВ подтипа Н5. Суммарные данные доклинического и клинического изучения безвредности, иммуногенности и эффективности реассортантных штамма на основе апатогенного птичьего вируса гриппа А(H5N2) позволили разработать основы для апробации ЖГВ потенциально пандемического подтипа Н5.

На основании результатов клинических испытаний тривалентная ЖГВ, включающая реассортантные штаммы на основе донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2), рекомендована для профилактики гриппа среди детей с трех лет и пожилых людей, страдающих хроническими заболеваниями. Таким образом, были расширены контингенты для применения ЖГВ как единого препарата с включением наиболее уязвимых групп (детей дошкольного возраста и пожилых, хронически больных людей) что в случае пандемии позволяет обеспечить наибольший охват прививками всех групп и категорий населения.

Разработанные автором реассортантные вакцинные штаммы современных эпидемических вирусов В/60 / Йоханнесбург/99/50, А/17 / Калифорния/04/71 (H3N2), А/17 / Висконсин/05/84 (H3N2) использовались для производства ЖГВ, на их основе подготовлено 5 млн. доз вакцины.

Анализ нуклеотидной последовательности донора аттенуации В/СССР/60/69 и модификация ОТ-ПЦР рестрикционного анализа впервые позволили выполнять этим методом идентификацию внутренних и неструктурных белков реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В.

Положения, выносимые на защиту.

1. Холодовая адаптация штамма А / Москва/21/17/65 (H2N2) связана с появлением в процессе пассирования при пониженной температуре множественных нуклеотидных замен в гене РВ2, приводящих к изменениям в структуре соответствующей полимеразной субъединицы. Свойства холодовой адаптации, аттенуации и генетической стабильности, присущие штамму А / Москва/21/17/65 (H2N2), позволяют использовать его не только в качестве самостоятельного вакцинного штамма для иммунизации населения в случае возвращения в циркуляцию вируса гриппа А(H2N2), но и как потенциально новый донор аттенуации.

2. Методы классической генетической реассортации в куриных эмбрионах позволяют регулярно получать высокоурожайные реассортантные штаммы на основе ХА донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенных вирусов гриппа птиц потенциально пандемических подтипов.

3. Реассортантные штаммы апатогенных птичьих вирусов на основе донора А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) проявляют свойства температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации в различных чувствительных моделях. Высокая степень аттенуации ХА реассортантов птичьих вирусов для кур вплоть до полной неспособности к репродукции, свидетельствуют о безопасности для птичьих хозяйств производства и использования подобных штаммов.

4. Использование ЖГВ может быть эффективным против высокопатогенных вирусов гриппа даже в случае неполного антигенного соответствия между вакцинным вирусом и инфекционным штаммом (экспериментальная модель). Тем не менее, вакцинация штаммом нового подтипа до наступления пандемии является нецелесообразной, так как в настоящее неизвестен вирус, который вызовет пандемию.

5. Прототип ЖГВ «Орвакс» подтипа A(H5N2) является безвредным, генетически стабильным препаратом и способен к репродукции в носоглотке человека. При оценке иммуногенности ЖГВ подтипа H5 показано, что сочетанное применение реакции торможения гемагглютинации и теста микронейтрализации в наибольшей степени удовлетворяет критериям чувствительности и специфичности (клиническое изучение).

6. Реассортантная ЖГВ на основе доноров аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) и В/СССР/60/69 является безвредной и эффективной для всех групп населения, включая детей от 3-х лет и пожилых людей старше 65 лет, страдающих хроническими заболеваниями (клиническое изучение).

7. В случае появления нового пандемического штамма рекомендуется проведение двукратной прививки соответствующей моновакциной. Включение штамма нового антигенного подтипа в состав поливалентной живой гриппозной вакцины является нецелесообразным, так как его иммуногенность при этом снижается (экспериментальные данные).

Внедрение результатов работы. По теме работы получено 4 патента на изобретения. Подана 1 заявка на патент. Подготовлены методические рекомендации «Вакцинопрофилактика гриппа с помощью живой гриппозной вакцины среди лиц пожилого возраста». Внесены изменения в Фармакопейную Статью на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» ФСП 42-0504-4097-04.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 4-й Международной конференции по проблемам гриппа (Крит, Греция, 2000), 1-й и 2-й Европейских конференциях по проблемам гриппа (Мальта, 2002, 2005), 2-м Международном симпозиуме по проблемам респираторных инфекций (Ла Романа, Доминиканская Республика, 2002), 2-й Международной конференции по ортомиксовирусам (Нью-Джерси, США, 2003), 5-й Международной конференции по проблемам гриппа (Окинава, Япония, 2003), 1-й Международной конференции по вирусным вакцинам (Лиссабон, Португалия, 2004), Первой всероссийской конференции «Вакцинология 04» (Москва, 2004), VIII и IX Всероссийских научных Форумах с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2005), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2004), 4-й Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Лондон, 2006), 2-й Международной конференции по вирусным вакцинам (Вена, Австрия, 2006). 6-й Международной конференции по проблемам гриппа (Торонто, Канада, 2007), Заседании ВОЗ по вопросам подготовки к пандемии (Женева, Швейцария, 2007), 3-й Европейской конференции по проблемам гриппа (Виламоура, Португалия, 2008). Материалы работы также представлялись и обсуждались на заседаниях Отдела вирусологии НИИЭМ РАМН (2004 г., 2005 г.) и Центра по контролю заболеваемости США, Атланта, США (2001 г., 2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 77 печатных работ, в том числе 29 статей (20 - в журналах, рекомендованных ВАК), 4 патента, 1 научный обзор и 43 тезиса докладов общим объемом более 200 страниц.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 328 страницах текста, включая 61 таблицу и 20 рисунков; состоит из введения, трех глав обзора литературы, семи глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 485 источников, из них 98 отечественных и 387 - иностранных.

Личный вклад автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны автором на основании многолетних (1998-2007 гг.) исследований. Реассортантные штаммы апатогенных вирусов гриппа птиц A(Н5N2), А(H7N3) и A(Н9N2), а также реассортанты эпидемических вирусов гриппа А и В, подготовленные на основе ХА штаммов А / Москва/21/17/65 (Н2N2) и В/СССР/60/69, получены, проанализированы и апробированы в доклинических исследованиях на животных (мыши, хорьки) лично автором. Автор принимала личное участие в клинических исследованиях в домах престарелых и детских садах Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также на базе Военного госпиталя №1137. Во всех совместных исследованиях по теме диссертации, наряду с личным участием в их проведении, автору принадлежит участие в разработке программы исследований, а также анализ полученных данных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.

Содержание работы

вакционация реассортантный штамм грипп

Материалы и методы

Вирусы. В работе были использованы штаммы вирусов гриппа из коллекции отдела вирусологии: ХА доноры аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) и В/СССР/60/69; вакцинный штамм А / Москва/21/65 (H2N2) и его ХА вариант А / Москва/21/17/65 (H2N2), реассортантные штаммы современных эпидемических вирусов гриппа А и В. При разработке ЖГВ против пандемически опасных вирусов гриппа автором были подготовлены реассортантные штаммы на основе донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенных вирусов гриппа птиц подтипов H5, H7, H9, полученных из Центра по контролю и предупреждению заболеваний США. Для заражения иммунизированных животных применяли высокопатогенные (ВП) вирусы гриппа птиц подтипа А(H5N1), выделенные в во время вспышек в различных регионах. Все эксперименты с ВП вирусами гриппа птиц проводились в лабораториях с условиями повышенного уровня биологической защиты (BSL-3+).

Все вирусы культивировали в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). ХА донорские и реассортантные штаммы инкубировали при 34?С 48-76 часов. Апатогенные и высокопатогенные штаммы вирусов гриппа птиц инкубировали при 37?С в течение 18-24 часов. Инфекционную активность вирусов определяли в РКЭ при оптимальной, повышенной до 40є и пониженной до 25єС температуре, 50% эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД₅₀) рассчитывали по методу Reed-Muench (1938). К числу температурочувствительных (имеющих ts-) фенотип относили вирусы, которые репродуцировались при повышенной до 40^?С температуре на 5,0-6,0 lg ЭИД₅₀ ниже по сравнению с оптимальной (RCT₄₀). Если разница титров при оптимальной и пониженной до 25-26^?С температуре (RCT₂₅) не превышала 3,0-4,0 lg ЭИД _50, вирусы относили к ХА группе (са - фенотип).

Культура клеток. Использовали линию клеток MDCK (NBL-2), полученную из Центра по контролю и предупреждению заболеваний США (Атланта, Джорджия).

Получение реассортантов между вирусами «дикого» типа и ХА донорами аттенуации проводили в РКЭ по описанным методикам (Александрова, 1977).

Молекулярно-генетический анализ. Определение состава генома реассортантных вирусов выполняли с помощью ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа (Klimov, Cox, 1993) или частичным секвенированием отдельных генов. Для идентификации генов HA и NA применяли полное секвенирование. Специфические праймеры были разработаны с помощью компьютерной программы SeqLab. Обработку электрофореграмм нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета программ DNAstar (Madison, WI). Множественное выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов различных вирусов гриппа человека и птиц, а также определение идентичности проводили с помощью программы GeneDoc, версия 2.6.002 (Nicholas, 1997). Для филогенетического анализа использовали компьютерную программу Mega, версия 2.1 (Kumar, 2001) с применением алгоритма минимальной эволюции.

Лабораторные животные. Самки мышей линии BALB/c в возрасте 10 недель (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA, USA), самцы мышей линии СВА в возрасте 12-14 недель (питомник Рапполово, Ленинградская область), куры породы белый Леггорн в возрасте 4-х недель, хорьки обоего пола в возрасте 4-х месяцев.

Репродукция вирусов в дыхательных путях мышей. Мышам под легкой анестезией вводили интраназально (и/н) 50 мкл аллантоисной жидкости с содержанием вируса 10¹-10⁷ ЭИД_50. Эвтаназию проводили согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №266 МЗ РФ от 19.06.2003).Титры вирусов определяли в легких и носовых ходах на 3-и сутки по показателям титрования суспензии органов в развивающихся куриных эмбрионах, начиная с разведения 1:10 для легких и 1:2 для носовых ходов. 50% мышиную инфекционную дозу (МИД₅₀) и 50% летальную дозу (ЛД₅₀) определяли по методу Reed-Muench (1938).

Реинфекция. Иммунизированных мышей инфицировали ВП вирусами птичьего гриппа А(H5N1) в летальных дозах. Летальность и снижение веса регистрировали в течение 14 дней. Концентрацию вируса в дыхательных путях и лимфоидной ткани (тимус) определяли на 3-й день после заражения по результатам титрования суспензии органов на РКЭ. Концентрацию вируса в головном мозге мышей определяли на 6-е сутки после инфекции.

Клиническое изучение безвредности и эффективности реассортантной ЖГВ. В исследовании использовали ЖГВ, выпускаемую Иркутским ФГУП по производству иммунобиологических препаратов. Вакцина и плацебо в виде шифрованных препаратов вводились однократно интраназально помощью распылителя РДЖ-М4 или индивидуального распылителя по 0,25 мл в каждый носовой ход прививаемого с последующей оценкой реактогенности, безвредности, иммуногенности и эффективности. Интенсивность вакцинальных лихорадочных реакций оценивали в соответствии с классификацией, принятой Комитетом вакцин и сывороток Минздрава РФ: реакция отсутствует - при температуре 37,0?С; слабая реакция - с повышением температуры тела до 37,5?С; средняя реакция - с температурой 37,6-38,5?С; сильная реакция - с повышением температуры выше 38,6?С. Согласно Фармакопейной статье на ЖГВ допускается наличие реакций с повышением температуры тела выше 37,5?С не более чем у 2% привитых. Продолжительность температурной реакции не должна превышать 3 суток.

Получение и обработка клинических материалов (сыворотки крови, носовые смывы) производились согласно «Методическим указаниям по проведению контроля противогриппозных препаратов» от 16.11.84 или МУК 4.2.2136-06. Поствакцинальный иммунный ответ оценивали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции микронейтрализации (РН) и непрямом варианте иммуноферментного анализа (ИФА) по описанным методикам (Rowe et al., 1999).

Статистическая обработка данных. При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (M±у). Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы Statistica (версия 6,0) с использованием теста t-распределения Стьюдента для выборок с нормальным распределением, или непараметрических критериев Уилкоксона-Манна-Уитни. Влияние демографических факторов на иммунологическую эффективность вакцинации изучали с помощью дисперсионного анализа ANOVA. Сравнение долей (пропорций) в двух соотносящихся группах оценивали при помощи непараметрического критерия ч² Мак-Немара в модификации Лидделла, в других случаях использовали точный критерий Фишера. Различия считались достоверными при р<0,05.

Основные результаты исследований

Молекулярно-генетический анализ холодоадаптированных штаммов вирусов гриппа А и В

Все применяющиеся в настоящее время для получения реассортантных вакцинных штаммов ХА доноры аттенуации были получены эмпирическим путем после длительных пассажей при пониженной температуре. Поскольку в каждом конкретном случае в основе аттенуации могут лежать различные механизмы, при создании живых вакцин необходимо подробно изучить эти механизмы, для того чтобы понять, какой из них способен привести к получению наиболее эффективного препарата.

Молекулярно-генетический анализ и изучение биологических свойств ХА штамма А / Москва/21/17/65 (H2N2). Опыт появления пандемий не исключает возврата в циркуляцию вирусов человека A(H2N2), который является единственным подтипом, вызвавшим пандемию в 1957 году и исчезнувшим из циркуляции более 40 лет назад. Мы провели изучение штамма А / Москва/21/17/65 (H2N2) [Москва/21/17], который принадлежит к вирусам, завершающим эру циркуляции вирусов гриппа подтипа A(H2N2). ХА донор аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2), применяющийся в настоящее время для получения реассортантов, является документировано безвредным для людей и может использоваться как вакцинный штамм в случае возвращения в циркуляцию вирусов этого подтипа. Однако вирусы А(H2N2), выделенные в период с 1957 по 1968 год значительно отличаются между собой как антигенно, так и генетически. Наиболее существенные отклонения антигенных признаков от свойств пандемического возбудителя 1957 года произошло у штаммов 1965-1967 гг. выделения (Александрова, 1969). Предсказать антигенную структуру возможного возбудителя пандемии невозможно, так же как и его близость или отдаленность от имеющихся вакцинных штаммов соответствующего подтипа, поэтому является весьма важным наличие в коллекции вакцинных штаммов нескольких тщательно охарактеризованных вакцинных кандидатов.

По молекулярной структуре НА штамм Москва/21/17 является наиболее близким к эталонному штамму А / Англия/64. Вакцинный штамм Москва/21/17, входивший в состав ЖГВ для детей в 1967 году (Александрова с соавт., 1968), был получен после дополнительного 17-кратного пассирования при пониженной до 25-26⁰C температуре вакцинного штамма А / Москва/21/65 (H2N2) [Москва/21/65], применявшегося для вакцинации взрослых. Штамм Москва/21/17 характеризуется документированной безвредностью и высокой иммуногенностью для детей, что было неоднократно подтверждено за время его использования, как в виде моновакцины, так и в составе дивакцины в 1966-1967 годах (Сиротенко с соавт., 1967, Александрова с соавт., 1968, Беляева с соавт., 1969).

С целью изучения молекулярных изменений, приводящих к холодовой адаптации штамма Москва/21/17, было проведено секвенирование всех его генов, которое выполнялось в Центре по контролю и предупреждению заболеваний США (Атланта, Джорджия). Анализ отличий в генах и генных продуктах, появление которых могло бы повлиять на проявление таких фенотипических признаков, как холодовая адаптация и ограничение репродукции при повышенной до 38-39єС температуре штамма Москва/21/17, проводили в сравнении с вариантом Москва/21/65, полученным пассированием при оптимальной температуре. Было показано, что пассажный вариант Москва/21/65 отличался от ХА варианта сниженной репродукцией в РКЭ при 25єС и, наоборот, отсутствием существенного снижения инфекционной активности при 38-39єС (рис. 1 А). В культуре клеток MDCK было показано, что при заражении монослоя ХА вирусом Москва/21/17 при повышенной до 39єС температуре инкубации имела место значительная задержка репродукции по сравнению с оптимальными условиями. Такое угнетение репродукции было наиболее выраженным на ранних сроках инфекции (первые сутки после инокуляции) (рис. 1 В).

А В

Рис. 1. А - репродуктивная активность ХА штамма А / Москва/21/17 и пассажного варианта А / Москва/21/65 в РКЭ; В-динамика репродукции (24, 48 и 72 часа) в культуре клеток MDCK при заражающей дозе 0,02 MOI

Таким образом, в различных системах было показано, что вариант Москва/21/65, утративший способность размножаться при 40єС и аттенуированный для человека, достаточно сильно отличался от ХА варианта, по уровню репродукции при пониженной или повышенной до 38-39,5єС температуре.

Анализ нуклеотидных последовательностей генов негликозилированных белков штаммов Москва/21/17 и Москва/21/65 показал, что в процессе дополнительного пассирования при пониженной температуре штамм Москва/21/17 приобрел 8 нуклеотидных замен в генах внутренних и неструктурных белков по сравнению с промежуточным вариантом Москва/21/65. При этом 6 нуклеотидных замен являются значащими и приводят к аминокислотным замещениям в PB2 белке (три) и PB1, M1 и NS1 белках (по одному) (табл. 1). Было показано, что большинство мутаций, отличающих ХА вариант от исходного пассажного, локализовано в гене РВ2. Все значащие замены в гене РВ2 являются уникальными, одна незначащая замена в 1740 положении нуклеотидной цепи не является уникальной, поскольку встречается у более поздних вирусов подтипа H3N2 (А / Англия/41, А / Токио/38). Замена метионина на изолейцин в 202 положении белка PB2 располагается в участке 51-259 аминокислотной последовательности, который участвует во взаимодействии субъединиц РВ1 и РВ2 вирусной полимеразы в процессе транскрипции и репликации вируса (Toyoda et al., 1996, Ohtsu et al., 2002). Несмотря на то, что уникальные аминокислотные замены валина на изолейцин в 414 положении и глицина на серин в 416 положении белка PB2 не ведут к изменению полярности или заряда, анализ с помощью методики Чжоу-Фасмана (1974) показал возможность изменения в результате этих близко расположенных замен вторичной структуры белка в положении 415-416 в области б-спирали.

Таблица 1. Нуклеотидные замещения в генах ХА штамма A/Москва/21/17/65 (H2N2) по сравнению с пассажным вариантом A/Москва/21/65 (H2N2)

*А>G

Замена триптофана на аргинин в 723 положении белка PB1 Москва/21/17 встречается у большинства проанализированных эпидемических вирусов и, таким образом, не может привносить изменений в сторону холодовой адаптации. Отсутствие отличий в РА белке Москва/21/17 от пассажного варианта подтверждает данные о роли отдельных генов, полученные на модели одногенных реассортантов на основе ХА донора аттенуации А / Ленинград/134/57 (H2N2) (Киселева, 2001), когда было показано, что наследование только РА гена от ХА варианта не приводило к аттенуации, если остальные гены происходили от исходного штамма «дикого типа».

Нуклеотидная замена в гене NP является незначащей и прослеживается на электрофореграмме в виде двойного пика с преобладанием А над G у ХА варианта и G над А у его предшественника. Эта мутация не является уникальной, так как встречается также у эпидемического штамма А / Энн Арбор/67. Уникальная мутация в М-гене штамма Москва/21/17 (T-182-A), приводящая к замене в мембранном белке М1, сопровождается изменениями свойств гидрофобности. Ранее при изучении роли отдельных генов в аттенуации штамма А / Ленинград/134/57 (H2N2) было показано, что присутствие в геноме вирулентного штамма М-гена от ХА варианта не приводило к проявлению ts- и ca - фенотипа (Киселева, 2001).

Мутация в гене NS приводит к аминокислотной замене в белке NS1 (I-65-V), которая расположена в N-концевом участке б-спирали, состоящем из 73 аминокислот, который является эффекторным доменом взаимодействия с РНК (Qian et al., 1994), а также играет ключевую роль в модулировании таких факторов врожденного иммунитета, как интерферон б/в (Wang et al., 2000). Эта мутация является уникальной, однако, как будет продемонстрировано ниже, оказалось, что замещение NS-гена Москва/21/17 на NS-ген эпидемического вируса не приводило к изменению ts- и ca - фенотипа. Ранее в исследованиях in vitro было показано, что уровни индукции ранних цитокинов ХА реассортантными штаммами A(H1N1) и A(H3N2) на основе донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) в основном совпадали с аналогичными показателями для эпидемических вирусов соответствующего серотипа. Индукция интерферона I типа ХА реассортантами оказалась сниженной по сравнению с эпидемическими родителями. Изучение одногенных реассортантов, включающих мутантные гены донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2), показало, что включение генов РВ2 или РВ1 в состав реассортантов значительно снижало продукцию ранних цитокинов, включая и интерферон I типа, при инфицировании эпителиальных макрофагов человека. В то же время, в отношении реассортантов, включающих мутантный М или NS гены, такого снижения не наблюдалось (Rekstin et al., 2006).

Локализация мутации в гене НА, приводящей к аминокислотной замене в одном из петлеобразных участков глобулярной части тяжелой цепи НА1, свидетельствует, что она могла появиться в процессе адаптации при длительном пассировании в РКЭ (Каверин с соавт., 2000). В гене нейраминидазы различий не выявлено.

Был проведен сравнительный анализ известных последовательностей генов внутренних и неструктурных белков таких доноров аттенуации подтипа H2N2, как А / Ленинград/134/17/57 (Klimov, Cox, 1988), А / Энн Арбор/6/60 (Maassab, 1969) и ХА штамма, полученного пассированием на культуре клеток Vero: А / Сингапур/1/57 са (Romanova et al., 2004). Результаты представлены в таблице 2. Общим признаком для всех ХА штаммов является полигенный характер изменений, приводящих к проявлению са- и att - фенотипа при традиционном способе получения ХА штаммов, то есть методом последовательного пассирования при пониженной температуре, даже если это пассирование осуществляется в различных системах (куриные эмбрионы, первичные или перевиваемые культуры). Cопоставление данных о мутациях в различных генах и генных продуктах внутренних и неструктурных белков различных ХА штаммов подтипа A(H2N2) указывает на отсутствие каких-либо универсальных позиций в их геномах, мутации в которых должны приводить к аттенуации. Исключение составляет замена аланина в позиции 86 белка М2 на серин у штамма А / Энн Арбор/6/60 или треонин у штамма А / Ленинград/134/17/57, однако по данным Jin et al. (2003) эта мутация не связана с температурочувствительностью. Еще одним исключением является незначащая нуклеотидная замена в 813 положении гена NS вирусов А / Энн Арбор/6/60 (А>G) и ХА А / Сингапур/1/57 са.

Таблица 2. Мутации в генах негликозилированных белков ХА штаммов А(H2N2)

Данные сравнительного анализа подтвердили, что наибольшим изменениям подвергаются гены полимеразного комплекса холодоадаптированных штаммов. Большинство нуклеотидных замен в этом случае сопровождается аминокислотными замещениями в соответствующих полимеразных субъединицах. Во всех случаях наиболее консервативным является белок NP. Аминокислотные замещения в NP-белке ХА вариантов по сравнению с «дикими» штаммами или отсутствуют (А / Ленинград/134/17/57, А / Сингапур/1/57 ха), или существенно не влияют на структурную организацию белка. Во всех случаях множественный характер изменений в геноме ХА штаммов указывает на последовательную сопряженную эволюцию различных белковых субъединиц в процессе серийных пассажей при пониженной температуре. Эти сочетанные изменения в различных генах доноров аттенуации могут обеспечивать генетическую стабильность реассортантов на основе подобных штаммов.

Далее была поставлена задача оценить генетическую стабильность штамма А / Москва/21/17 и потенциальную возможность его применения как нового донора аттенуации. С этой целью были получены полигенные реассортанты с современным эпидемическим вирусом А / Новая Каледония/20/99 (H1N1). Один из реассортантов унаследовал от эпидемического вируса гены HA и NA (структура генома 6:2), а другой помимо этого еще NS-ген (структура генома 5:3) (табл. 3). Секвенирование показало сохранность всех мутаций в генах внутренних и неструктурных белков, приобретенных реассортантами от ХА родителя А / Москва/21/17.

Таблица 3. Структура реассортантов на основе штамма А / Москва/21/17/65 (H2N2)

Были изучены ростовые характеристики реассортантов и родительских штаммов при различных температурах инкубации в РКЭ, а также их репродуктивная активность в легких мышей линии СВА (рис. 2). Было показано, что наследование от ХА штамма шести или пяти генов внутренних и неструктурных белков (независимо от источника происхождения NS-гена) приводило к проявлению реассортантами ts и ca - фенотипа (рис. 2, А)

А В

Рис. 2. А - инфекционная активность в куриных эмбрионах при различных температурах инкубации, В-репродукция в дыхательных путях мышей

Репродукция 6:2 реассортанта в РКЭ при оптимальной температуре оказалась сниженной по сравнению с реассортантом 5:3 и родительским штаммом Москва/17, однако в дыхательных путях мышей такого снижения не наблюдалось (рис. 2, В).

Таким образом, было показано, что мутации, ответственные за холодовую адаптацию штамма А / Москва/21/17/65, локализованы в гене РВ2. Указанные замены расположены в активных доменах субъединицы РВ2 вирусной полимеразы: замена M-202-I локализуется в участке 51-259 аминокислотной последовательности, активном при взаимодействии субъединиц РВ1 и РВ2 вирусной полимеразы, а уникальные близкорасположенные замены V-414-I и G-416-S могут вызывать изменение вторичной структуры белка. Мутация V-65-I в белке NS1 не оказывает влияния на ca- и att-фенотип.

Генетическая стабильность штамма А / Москва/21/17 (H2N2), а также сохранение свойств холодовой адаптации и аттенуации реассортантами, полученными на его основе, позволяют его использование в качестве нового донора аттенуации для получения реассортантов, а также в качестве ХА вакцинного штамма в случае возвращения в циркуляцию вирусов А(H2N2).

Молекулярно-генетический анализ и рестриктазное картирование ХА штамма вируса гриппа В/СССР/60/69. Современная реассортантная ЖГВ применяется в виде поливалентного препарата, включающего штаммы всех трех циркулирующих в настоящее время разновидностей вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. Для подготовки реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа В применяется ХА донор аттенуации В/СССР/60/69. Было проведено определение нуклеотидной последовательности донора аттенуации В/СССР/60/69. На основании данных секвенирования была модифицирована схема ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа для изучения состава генома реассортантов на его основе. Ранее метод, основанный на идентификации уникальных нуклеотидных различий между генами ХА доноров аттенуации и эпидемических вирусов, был разработан для идентификации мутаций генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации А / Ленинград/143/17/57 (H2N2), который в течение многих лет используется для подготовки ХА реассортантных вакцинных штаммов с современными эпидемическими штаммами вирусов гриппа А подтипов Н1 и Н3 (Klimov, Cox, 1993).

Для получения ДНК-копий участков генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации В/СССР/60/69 применяли следующие праймеры, разработанные А.И. Климовым: PB2-1550 (5' TGG GGA AGT CAT AAT GG), PB1 - 518 (5' TTT GCC AAG ATA TCA TTG), PA-1061 (5' AAA TAC AAT AAG TAA TGA GG), NP-1123 (5' TGG GTA TGA AGC CAT GG), M-8 (5' GCA CGC ACT TTC TTA AAA TG), NS-6 (5' AAG CAG AGG ATT TAT TTA G). Комплементарными обратными праймерами были: PB2-r2389 (5' ACA CGA GCA TTT TTC ACT C), PB1-r1399 (5' CCA TAC ATG TCT CTT CAT C), PA-r2303 (5' GAA ACA CGT GCA TTT TT), NP - r1838 (5' GAA ACA ACA GCA TTT TTT AC), M-r1183 (5' ACA ACG CAC TTT TTC CAG), NS-r 576 (5' CCC TTT TTA TTG TCA AAC GG). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей показал, что гены PB2, PB1, PA, NP и NS ХА донора В/СССР/60/69 имеют нуклеотидные позиции, отсутствующие в геномах современных эпидемических штаммов вируса гриппа В и приводящие к возникновению сайтов рестрикции для Hind III, BspH I, Bcl II, Avr II, Mae I. Анализ нуклеотидной последовательности М гена выявил, что все современные изоляты имеют сайт рестрикции Bgl II, тогда как такой сайт отсутствует в М гене В/СССР/60/69 (табл. 4). Показано, что нуклеотидные замены, обнаруженные в PB1, PA, NP, M и NS генах донора аттенуации В/СССР/60/69, с большой долей вероятности можно считать уникальными, поскольку они не встречались у подавляющего большинства штаммов вируса гриппа В, выделенных в различных регионах мира и принадлежащих к различным генетическим линиям. Хотя нуклеотидная замена в PB2 гене не является уникальной, так как она встречалась у ряда вирусов линии В / Виктория, тем не менее, рестриктаза Hind III может применяться для определения происхождения гена PB2 у реассортантов, полученных на основе ХА донора В/СССР/60/69, поскольку у вирусов гриппа В линии В / Виктория, выделенных после 2002 года, сайт рестрикции для Hind III, характерный для гена PB2 донора В/СССР/60/69, отсутствует.

Таблица 4. Сайты рестрикции, уникальные для донора аттенуации В/СССР/60/69

Выявление целого ряда уникальных нуклеотидных замещений в генах внутренних и неструктурных белков донора аттенуации В/СССР/60/69, указывает на единый характер аттенуации вирусов гриппа А и В, полученных последовательным пассированием при пониженной температуре.

Подготовка и характеристика реассортантных ха вакцинных штаммов пандемически опасных вирусов гриппа

Характеристика вирусов птичьего гриппа, использованных в качестве источника поверхностных антигенов. В процессе отбора потенциальных кандидатов для подготовки вакцинных штаммов против возможных пандемий будущего были изучены характеристики репродукции в РКЭ при различных температурах следующих апатогенных вирусов гриппа птиц: А/утка / Потсдам/1406-86 (H5N2), А/утка / Вьетнам/342/01 (H5N1), А/дикая утка / Нидерланды/12/00 (H7N3), А / Гонконг/1073/99 (H9N2), А/перепел / Гонконг/6/97 (H9N2), А/курица / Гонконг/G9/97 (H9N2). Показана высокая степень температуроустойчивости всех вышеперечисленных вирусов: показатели роста при 40⁰С не отличались или были выше, чем при 34 и 37⁰С, только при повышении температуры до 41⁰С наблюдалось снижение репродукции на 3-4 lg ЭИД₅₀/мл. Для реассортации классическими методами в куриных эмбрионах были выбраны вирусы А/утка / Потсдам/1406-86 (H5N2) [H5N2-дт], А/дикая утка / Нидерланды/12/00 (H7N3) [H7N3-дт], А/перепел / Гонконг/6/97 (H9N2) антигенной линии G1 [H9N2-дт]. Молекулярно-генетический анализ НА родительских штаммов «дикого» типа показал, что все они содержат в сайте протеолитического расщепления гемагглютинина один остаток аргинина - признак, характерный для низкопатогенных вирусов. Анализ тяжелой цепи гемагглютинина НА1 вирусов подтипа Н5 показал наличие аминокислотных различий между родительским вирусом, использованным для подготовки реассортантного вакцинного штамма подтипа А(H5N2) - А/утка / Потсдам/1402-6/86 - и вирусами, выделенными в Гонконге в 1997 году (95-96% гомологии), а также вирусом A/Гонконг/213/03 (H5N1) (94% гомологии). Количество аминокислотных различий между А/утка / Потсдам/1402-6/86 (H5N2) и другими более поздними изолятами A(H5N1) находится в пределах 9-11%. Родительские «дикие» штаммы подтипа A(H9N2) и A(H7N3) были на 98% идентичными изолятам, выделенным от больных в Гонконге в 1999 г. и в Нидерландах в 2003 г.