Ростовые характеристики реассортантов птичьих вирусов при различных температурах инкубации в РКЭ. Для детального исследования были отобраны реассортанты, содержащие все значащие мутации в генах внутренних и неструктурных белков, описанные ранее для ХА донора аттенуации А / Ленинград/134/57 (H2N2) [Лен/17]. С помощью ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа и секвенирования генов НА и NA было показано, что реассортант А/17/утка / Потсдам/86/92 (H5N2) [Лен 17/Н5] унаследовал от «дикого» вируса только ген НА, а остальные 7 генов - от донора аттенуации Лен/17 (формула генома 7:1). Реассортанты подтипов Н7N3 и Н9N2 - А/17/дикая утка / Нидерланды/00/84 (H7N3) [Лен 17/Н7] и А/17/перепел / Гонконг/97/86 (H9N2) [Лен 17/Н9] - имели формулу генома 6:2, так как унаследовали гены НА и NA от «диких» родительских штаммов. Показано, что все реассортанты вирусов гриппа птиц на основе холодоадаптированного донора аттенуации Лен/17 обладают высокой продуктивностью в РКЭ (8,5-9,6 lg ЭИД ₅₀/мл) и устойчиво проявляют ts- и ca - фенотип, то есть свойства, характерные для ХА донора аттенуации (табл. 5).

Таблица 5. Репродукция в куриных эмбрионах реассортантов апатогенных вирусов гриппа птиц

Оценка безвредности для кур ХА реассортантов, содержащих гены вирусов птичьего гриппа. Данный раздел работы был выполнен совместно с ветеринарной лабораторией, г. Афины, США под руководством Д. Свэйна. Для оценки аттенуации при введении курам использовали реассортанты вирусов птичьего гриппа подтипов А(H5N2) и А(H7N3) на основе Лен/17, а также родительские птичьи вирусы и донор аттенуации Лен/17. Патогенность определяли при внутривенном (в/в) введении стандартного разведения (10^-1) вирусного материала (табл. 6). «Дикий» вирус подтипа А(H5N2), а также ХА реассортанты подтипов А(H5N2) и А(H7N3) были безвредными и не вызывали развития инфекции. Из всех исследованных вирусов только «дикий» вирус H7N3-дт проявлял токсичность при в/в введении, когда развитие инфекции и смертность на 7-8 сутки наступали в 5 случаях из 8. После интраназального введения птичий вирус H7N3-дт был выделен из ротоглоточных и клоакальных смывов на 3-й день после инфекции в средних титрах 1,1-0,9 lg ЭИД₅₀/мл. ХА реассортант данного подтипа не выделялся и не вызывал сероконверсий по данным радиальной иммунодиффузии в агарозном геле. Реассортант А(H5N2) и родительский вирус этого подтипа H5N2-дт, а также донор аттенуации Лен/17 также не были выделены после интраназального введения и не вызывали сероконверсий.

Таблица 6. Оценка безвредности и инфекционной активности реассортантов при внутривенном (в/в) и интраназальном введении курам

Таким образом, было установлено, что приобретение реассортантами «внутренних» генов донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) приводило к полной их аттенуации для кур. ХА реассортанты, являясь адаптированными к пониженной температуре репродукции и гиператтенуированными для кур, оказались неспособными ни инфицировать птиц, температура тела у которых значительно выше, чем у человека, ни выделяться от них в окружающую среду.

Безвредность кандидатов в вакцинные штаммы при интраназальном введении мышам. Изучение репродуктивной активности в дыхательных путях мышей показало, что все ХА реассортанты апатогенных птичьих вирусов были аттенуированными для мышей, репродуцируясь более эффективно в носовых ходах, чем в легочной ткани (табл. 7).

Таблица 7. Репродуктивная активность реассортантов апатогенных птичьих вирусов и родительских штаммов в дыхательных путях мышей при заражающей дозе 6 lg ЭИД₅₀

Полученные результаты свидетельствуют, что классическими методами в куриных эмбрионах подготовлены высокорепродуктивные реассортанты вирусов гриппа потенциально пандемических подтипов, проявляющие свойства температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации, необходимые для вакцинных штаммов ЖГВ.

Результаты доклинического изучения

Реассортантного штамма А/17/утка/потсдам/86/92 (H5N2).

Основные этапы данного раздела работы были выполнены в Центре по контролю и предупреждению заболеваний США (Атланта, Джорджия).

Антигенная специфичность. Проведенное сравнение полных нуклеотидных последовательностей вируса H5N2-дт «дикого» типа и 7:1 реассортанта соответствующего подтипа выявило отсутствие изменений в процессе реассортации и селективных пассажей. Тем не менее, известно, что вирусы гриппа могут антигенно отличаться даже в случае полной идентичности аминокислотного состава НА, в частности, вследствие различных путей гликозилирования при культивировании в различных системах (Katz et al., 1999, Romanova et al., 2003). В таблице 8 представлены данные изучения антигенных свойств реассортантного штамма Лен 17/Н5 в РТГА с набором иммунных сывороток хорьков.

Таблица 8. Данные РТГА с антисыворотками хорьков

Показано, что вакцинный кандидат Лен 17/Н5 являлся идентичным родительскому штамму А(H5N2), а также проявлял более выраженную степень антигенного родства с ВП вирусами А(H5N1), выделенными в Гонконге в 1997 году, по сравнению с вирусами А(H5N1) 2001-2003 годов выделения. При этом сыворотка, полученная к самому реассортанту Лен 17/Н5, реагировала в пределах всего 1:2 - 1:4 гомологичного титра как с вирусами 1997 года выделения, так и с более поздними изолятами.

Изучение генетической стабильности реассортантного ХА штамма Лен 17/Н5 после пассажа в носовых ходах хорька. В процессе получения иммунной антисыворотки реассортантный вирус вводили в носовые ходы хорька в дозе 6 lg ЭИД₅₀/мл с последующим выделением реизолятов на 3-й и 6-й день после инокуляции. Носовые смывы пассировали трехкратно в РКЭ. Вакцинный вирус, выделенный на 3-й день после инокуляции, сохранил все значащие мутации в генах внутренних и неструктурных белков, характерные для донора аттенуации Лен/17. На 6-й день после инокуляции вирус не был выделен (Desheva et al, 2005).

Иммуногенность реассортантного штамма Лен 17/Н5 при введении белым мышам. На мышах была изучена возможность использования штамма Лен 17/Н5 в качестве как ЖГВ, так и инактивированной вакцины (ИГВ). Было проведено сравнительное изучение иммуногенности ЖГВ в дозе 10⁷ ЭИД₅₀/мл, вводимой интраназально (и/н) и цельновирионной ИГВ, инактивированной формалином, в дозе 10 мкг/100 мл, вводимой внутримышечно (в/м). Результаты представлены в таблице 9. После однократной и/н иммунизации ЖГВ из штамма Лен 17/Н5 сероконверсии антигемагглютинирующих и нейтрализующих антител в сыворотках крови наблюдались только к гомологичному вирусу подтипа А(H5N2). В качестве ИГВ, парентеральное введение Лен 17/Н5 стимулировало образование сывороточных антител как к гомологичному вирусу A(Н5N2), так и вирусам A(H5N1), выделенным в 1997 г. в Гонконге (А / Гонконг/156/97 и А / Гонконг/483/97).

Таблица 9. Иммуногенность ЖГВ и ИГВ из реассортантного штамма Лен 17/Н5 через 6 недель после введения мышам

Применение ИФА позволило выявить в ответ на введение ЖГВ или ИГВ развитие сероконверсий вирус-специфических IgG и IgA в сыворотках крови к вирусам H5N1: к цельному вирусу A/Гонконг/213/03 и очищенному НА А / Гонконг/156/97 (рис. 3). В группе мышей, иммунизированных ЖГВ, были выявлены специфические IgG и IgA антитела к вирусам А(H5N1) в легких и верхних дыхательных путях (ВДП). Внутримышечное введение ИГВ не стимулировало выработку IgA в легких и ВДП, локальный иммунный ответ в этом случае был представлен в основном IgG и был выражен значительно слабее, чем при интраназальном введении ЖГВ (р<0,001) (рис. 3).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Системные и секреторные IgG и IgA антитела (ИФА) к вирусам гриппа A(H5N1) после введения мышам реассортантного штамма Лен 17/Н5

Таким образом, была подтверждена способность штамма Лен 17/Н5 индуцировать антитела не только к гомологичному варианту подтипа H5N2, но также и перекрестно - реагирующие антитела к вирусам А(H5N1) (Desheva et al., 2006).

Сравнительное изучение эффективности ЖГВ и ИГВ из штамма Лен 17/Н5 при реинфекции мышей вирусами A(H5N1). Для заражения животных через 1,5 месяца после однократной иммунизации ЖГВ и ИГВ на основе штамма Лен 17/Н5 использовали вирусы подтипа H5N1 А / Гонконг/483/97 в дозе 50 ЛД₅₀ и А / Гонконг/213 в дозе 100 МИД₅₀ (Desheva et al., 2006). Поскольку вирус А / Гонконг/213/03 не является высокопатогенным для мышей, оценку защитного действия вакцин проводили по показателям выделения этого вируса из легких на 3-й день после контрольного заражения. Результаты представлены в таблице 10.

Показано, что введение мышам ВП штамма А / Гонконг/483 в дозе 50 ЛД₅₀ приводило в контрольной группе к значительной потере веса, начиная с 3-го дня после инфекции и к 100% смертности к 8-му дню, при этом средние титры вируса в легких достигали 5,9 lg ЭИД₅₀/мл. Иммунизация ЖГВ на 100% защищала от летальности, при этом потеря в весе не превышала 5%, а средний титр инфекционного вируса в легких был в 10000 раз ниже, чем в контрольной группе (p<0,001). ИГВ защищала от летальности в 9 случаях из 10 (90%). Несмотря на то, что в группе ИГВ инфекционный вирус ни в одном случае не был выделен из легких, некоторое его количество было выделено из носовых ходов и из головного мозга.

Таблица 10. Эффективность против заражения вирусами А(H5N1), выделенными в 1997 и 2003 гг.

Заражение вирусом А / Гонконг/213, значительно отличающимся по антигенным свойствам, показало, что ЖГВ была на 90% эффективной, когда инфекционный вирус выделялся из легких в 1 случае из 10 в среднем титре 1,8 lg ЭИД₅₀/мл, то есть в 3000 раз меньшем, по сравнению с контролем (p<0,001).

В другом эксперименте была изучена эффективность против реинфекции антигенным вариантом вируса А(H5N1), выделенным во время вспышки во Вьетнаме в 2004 г. (в сотрудничестве с Lu et al.). В исследование были добавлены еще две группы мышей, которых иммунизировали в/м цельновирионной неадьювантной ИГВ из штамма Лен 17/Н5 двукратно с интервалом в 4 недели, либо ИГВ с добавлением гидроокиси алюминия - двукратно (табл. 11). Через 3 месяца после первичной иммунизации животные во всех вакцинных группах были полностью защищены от летальной инфекции 200 ЛД₅₀ вируса A/Вьетнам/1203/2004 (H5N1). В контрольной группе наблюдалось развитие тяжелой системной инфекции, сопровождающееся снижением среднего веса до 19%, выделением инфекционного вируса из тканей головного мозга в высоких титрах и 100% гибелью животных на 6-9 день инфекции. В группе ЖГВ снижение среднего веса было незначительным (7%), наблюдалось снижение титра заражающего вируса в легких в 10000 раз по сравнению с контролем, при этом инфекционный вирус не был выделен из головного мозга и верхних дыхательных путей.

Таблица 11. Эффективность против заражения антигенным вариантом вируса А(H5N1), выделенным во время вспышки во Вьетнаме в 2004 г.

Однократное введение ИГВ без адьюванта защищало мышей от летальности, однако заражающий вирус выделялся не только из легких, но также из носовых ходов и головного мозга. Для достижения полной защиты против системного распространения инфекционного вируса и его выделения из ВДП потребовалось две дозы ИГВ.

Таким образом, было показано, что однократная иммунизация ЖГВ из реассортантного штамма Лен 17/Н5 полностью защищала мышей против летальной инфекции высокопатогенными вирусами А(H5N1). При минимальном выделении вируса из легочной ткани зараженных животных, вирус не был выделен из носовых ходов или головного мозга, что коррелировало с наличием вирус-специфических IgA в секретах ВДП. Наблюдаемый защитный эффект реассортантного штамма Лен 17/H5 в отношении вирусов A(H5N1), принадлежащих к различным антигенным линиям в отсутствие достоверного уровня сероконверсий антигемагглютинирующих антител может объясняться как формированием специфических системных и локальных IgA и IgG, выявленных иммуноферментным методом, так и стимуляцией клеточного компонента иммунного ответа, что подтверждается выраженной индукцией интерферона-г спленоцитами мышей, иммунизированных ЖГВ, в ответ на стимуляцию цельным вирусом А / Гонконг/213/03 или рекомбинантным НА вируса А / Гонконг/156/97 (H5N1).

Перекрестная защита против ВП вируса A(H5N1), выделенного в 2005 г. на территории Российской Федерации. Данный раздел работы был выполнен на базе Вирусологического Центра НИИ микробиологии МО РФ (Москва) под руководством начальника отдела, к.б.н. С.А. Мельникова и начальника 1 НИУ, д.м.н., проф. Р.А. Хамитова, за что автор выражает им искреннюю благодарность. С целью изучения перекрестно-реактивной защиты, создаваемой ЖГВ из штамма Лен 17/Н5, было проведено заражение иммунизированных мышей вирусом H5N1 А/курица / Курган/2/05, выделенным специалистами Вирусологического центра в сентябре 2005 г. из легкого павшей курицы птицефабрики «Утятская». Культура штамма прошла один пассаж в легких белых мышей массой 14-16 г. В условиях закрытых лабораторий с повышенным уровнем безопасности на белых мышах линии BALB/с была изучена иммуногенность и эффективность ЖГВ из штамма Лен 17/Н5 по сравнению с субъединичной адьювантной ИГВ, приготовленной ФГУП «Микроген» из реассортантного штамма А(H5N1) NIBRG-14, полученного из Национального Института Биологических Исследований, Великобритания (WHO, 2006). Реассортант NIBRG-14 был подготовлен на основе штамма А/PR/8/34 и содержал модифицированные методами обратной генетики HA и NA от вируса A/Вьетнам/1203/2004 (H5N1). В качестве адьюванта использовали иммуномодулятор полиоксидоний (полимер-субъединичная вакцина) или гидроокись алюминия (адсорбированная вакцина). ЖГВ в дозе 10^6,4/0,05 мл вводили интраназально однократно или двукратно с интервалом в 10 дней, ИГВ в дозе 15 мкг НА по ОРИД - парентерально однократно. Для оценки иммунного ответа у вакцинированных животных были взяты сыворотки крови на 21 день после последней иммунизации. Результаты представлены в таблице 12.

Интраназальное введение ЖГВ как двукратное, так и однократное вызывало образование перекрестно-реагирующих антигемагглютинирующих антител в титрах на уровне протективных (1:80 и 1:40 соответственно). Наиболее высокие титры антител к вирусу А(H5N1) были выявлены при помощи ИФА. В случае применения полимер-субъединичной вакцины, содержащей полиоксидоний, по всем трем тестам были получены наиболее низкие показатели.

Таблица 12. Результаты оценки иммуногенных и протективных свойств вакцинных кандидатов против птичьего гриппа подтипа H5

Реинфекцию высокопатогенным вирусом А(H5N1) проводили на 21 день после первичной иммунизации в случае однократной вакцинации или на 21 день после последней иммунизации - в случае двукратного введения вакцины. После введения заражающего вируса в контрольной группе гибель животных наблюдалась, начиная с 6-го дня инфекции, и достигала 100% к 9-му дню. Иммунизация ЖГВ из штамма Лен 17/Н5 оказалась наиболее эффективной: двукратное введение защищало 87% иммунизированных животных против 27 ЛД₅₀ заражающего вируса (р<0,001), а однократная иммунизация ЖГВ была эффективной на 57% (р=0,006). У животных, выживших после введения летальной дозы вируса A(H5N1), были также собраны сыворотки крови на 21 день после заражения. Показано, что титры антигемагглютинирующих антител после инфекции ВП вирусом подтипа А(H5N1) были всего в 2 раза выше (1:160), чем после двукратной иммунизации ЖГВ подтипа A(H5N2) (1:80). Таким образом, была продемонстрирована корреляция более высокого уровня создаваемой защиты против ВП вируса А(H5N1) при двукратном применении ЖГВ Лен 17/Н5 с более высоким уровнем сывороточных перекрестно-реагирующих антител.

Безвредность и иммуногенность ЖГВ «Орвакс» подтипа а(H5N2) в ограниченном клиническом изучении

С целью разработки модели для клинической оценки вакцинных препаратов потенциально пандемического подтипа Н5 ФГУП НПО «Микроген» были подготовлены экспериментальные серии ЖГВ «Орвакс» из реассортантного штамма Лен 17/Н5. Клинические исследования проводили в сотрудничестве с зам. начальника ВЦ НИИМ МО РФ по научной работе к.м.н., ст. науч. сотр. В.И. Марковым и нач. отдела к.б.н., ст. науч. сотр. С.А. Мельниковым в соответствии с Протоколом исследования №ВГЖ-00/004/2006 «Оценка иммуногенных и протективных свойств вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой, лиофилизат для приготовления раствора для интраназального введения (Орвакс)», согласованным с директором ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Изучение препарата, проводимое на клинической базе Военного госпиталя №1137 Минобороны России, включало 2 этапа. Первый этап проводился на 20 добровольцах и согласно рекомендации «Комитета по этике при федеральном органе контроля качества лекарственных средств» в исследование не была включена группа плацебо. Во время второго этапа изучения в исследование была включена группа плацебо.

Безвредность. В ходе первого этапа испытаний показана безвредность и ареактогенность ЖГВ из реассортантного штамма Лен 17/Н5 для 20 вакцинируемых. ЖГВ вводили в дозе 6,9 lg ЭИД₅₀/0,5 мл. Регулярная термометрия в течение 42 суток после вакцинации не выявила повышения температуры тела ни у одного добровольца (табл. 13).

Таблица 13. Клинические реакции у волонтеров, привитых живой гриппозной вакциной «Орвакс» после первой и второй вакцинации

Катаральные явления, наблюдаемые только после первичной иммунизации, были очень слабо выражены, возникали на 3-4 день после вакцинации и проходили самопроизвольно к 6-му дню, их развитие не коррелировало с выделением вакцинного вируса из ВДП привитых (r=-0,29, р>0,05) и последующим приростом специфических антител в сыворотке крови добровольца.

Результаты клинического обследования добровольцев врачами-специалистами разного профиля и проведенные лабораторно-инструментальные исследования свидетельствовали об отсутствии отклонений в самочувствии и в результатах анализов после иммунизации вакциной «Орвакс» в сравнении с фоновыми значениями.

Генетическая стабильность. У вакцинированных волонтеров были получены мазки из носа на различные сроки после первичной иммунизации и ревакцинации. Всего было получено 33 реизолята, 16 - от 11 добровольцев после первичной вакцинации, и 17 - от 14 добровольцев после ревакцинации. Все реизоляты были выделены либо после 3-х пассажей в РКЭ, либо после 1-2 пассажей в культуре клеток MDCK в присутствии 2 мкг/мл трипсина TPCK c последующим пассажем в РКЭ. В отличие от выделения реизолятов реассортантов современных эпидемических вирусов на основе донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2), которые ранее не удавалось получить в сроки более 3 суток после иммунизации (Egorov et al., 1993, Klimov et al., 2000), средняя продолжительность выделения вакцинного вируса Лен 17/Н5 после 1-й вакцинации и ревакцинации составила 5,5 суток, что согласуется с ранее полученными данными о замедленной репродукции ХА реассортантов птичьих вирусов в клетках млекопитающих (Suguitan et al., 2006). Ввиду того, что у нескольких волонтеров положительный результат выделения вакцинного вируса был получен несколько раз на разные сроки после прививки, интерес представляло изучение возможных изменений фенотипических и генотипических признаков этих реизолятов. Показано, что реизоляты, полученные от одних и тех же добровольцев на разные сроки после вакцинации, сохранили ts фенотип и все мутации в генах внутренних и неструктурных белков, охарактеризованные для донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Иммуногенность. РТГА проводили с использованием в качестве антигенов гомологичного вируса Лен 17/Н5 и реассортантного штамма подтипа А(H5N1) А / Индонезия/05/2005 c модифицированным методом обратной генетики НА, полученного на основе штамма А/PR/8/34. После первичной иммунизации выявлено 5,9% 4-х кратных приростов специфических антител (рис. 4) к вирусу А(H5N2). Повторная иммунизация с интервалом в 21 день значительно усиливала иммунный ответ, приросты гомологичных антител после ревакцинации были выявлены в 47,1% случаев (р=0,02). Показатели приростов среднегеометрических титров антител (СГТ) возрастали с большей интенсивностью у повторно привитых по сравнению с первично привитыми и составили 1,3-2,8 (р=0,005).

4-х кратные и более поствакцинальные сероконверсии нейтрализующих антител к вирусу А(H5N2) были выявлены у 4-х волонтеров после первой прививки (20%) и у 10 (50%) - после повторной вакцинации (рис. 4).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Иммунный ответ на введение вакцины «Орвакс», n=20

Прирост СГТ нейтрализующих антител после первичной иммунизации составил в среднем 1,9, после ревакцинации этот показатель увеличился до 2,9 (р=0,01). Число лиц с титрами ?1:20 антигемагглютинирующих и нейтрализующих антител к гомологичному вирусу А(H5N2), составил после первичной вакцинации 17,7 и 25% соответственно. После ревакцинации эти показатели составили 47,1% и 55% (рис. 4).

У волонтеров было выявлено образование перекрестно-реагирующих антител к реассортантному штамму подтипа A(H5N1), принадлежащему к антигенно и генетически удаленной линии вирусов подтипа Н5. Поствакцинальные титры антигемагглютинирующих антител ?1:20 к вирусу A(H5N1) были выявлены среди 11,8% обследованных после первой прививки и у 29,4% - после ревакцинации (р<0,05), приросты СГТ к вирусу A(H5N1) составили 1,2 после первичной вакцинации и 1,6 - после ревакцинации.

Для непрямого варианта ИФА 96-луночные панели покрывали 0,5 мкг/мл очищенного НА штамма Лен 17/Н5, предоставленного ФГУП НПО «Микроген». Применение ИФА позволило выявить в сыворотках крови 4-кратные сероконверсии вирус-специфических IgG у 35% волонтеров после первой прививки и у 55% - после повторной вакцинации. При этом 4-кратные сероконверсии вирус-специфических IgА наблюдались у 45% волонтеров после первой прививки и у 60% - после повторной вакцинации. Средняя кратность приростов IgG составила 1,6 после первой прививки (р=0,03) и 2,5 - после ревакцинации (р<0,001). В отношении сывороточных IgА этот показатель составил соответственно 1,9 (р=0,02) и 3,2 (р=0,002). Необходимо отметить, что специфичность данного метода при оценке иммунного ответа к гриппу у взрослых людей может быть недостаточной, поскольку в этом случае часто наблюдается неспецифическое реагирование, в частности с ревматоидным фактором или аутоантителами (Salonen et al., 1992, Huang et al, 1992). При этом могут выявляться также антитела к антигенным детерминантам внутренних белков вирусов гриппа (в случае, если в качестве антигена используется цельный вирус). Если же в качестве антигена использовать очищенный или рекомбинантный НА, то неспецифическое реагирование может объясняться наличием общих антигенных эпитопов в НА вирусов подтипов Н1, Н2 и Н5 (Rowe et al., 1999) или конформационными изменениями в молекуле НА в процессе адсорбции на твердой фазе, делающими консервативные эпитопы более доступными для распознавания. В обоих случаях при исследовании сывороток взрослых людей наблюдается высокий иммунологический фон до прививки. Так, средний уровень сывороточных IgG до прививки в нашем исследовании составил 1:5000. В этом отношении более показательным оказалось изучение сывороточных IgА, средний титр которых до прививки составил 1:100. После вакцинации и ревакцинации эти показатели возросли соответственно до 1:256 и 1:400, при этом наблюдалась корреляция с уровнем локальных IgА в носовых секретах. Показано значительное (р=0,03) увеличение числа 4-х кратных сероконверсий секреторных IgA (SIgA) после ревакцинации (65%) по сравнению с первичной вакцинацией (30%). СГТ секреторных антител после ревакцинации составили 1:16.

Были проанализированы суммарные данные вирусологического подтверждения выделения вакцинного вируса от привитых и развития сероконверсий антител к гомологичному вирусу A(H5N2) по данным различных серологических тестов. Частота 4-х кратных сероконверсий по данным РТГА, РН и ИФА (IgG) не зависела от положительного или отрицательного результата выделения вакцинного вируса из носовых ходов привитых ни после первичной иммунизации, ни после ревакцинации (р>0,05).

Таким образом, результаты 1 фазы клинических испытаний показали, что количество реакций после введения вакцины «Орвакс» не превышало регламентированных норм, установленных Фармакопейной статьей на ЖГВ. Для получения реизолятов вакцинного вируса от привитых потребовалось не менее 2-3 пассажей на чувствительных культурах, что говорит о крайне незначительном содержании вируса в мазках из полости носа и свидетельствует о безопасности вакцины для окружающих. Показатели иммунного ответа после однократной иммунизации гриппозной вакциной подтипа Н5 были несколько ниже, чем при иммунизации сезонными гриппозными вакцинами, что является вполне закономерным в серонегативной популяции. Двукратная иммунизация значительно усиливала показатели иммуногенности вакцины «Орвакс». Европейским комитетом по контролю медицинских препаратов были установлены следующие критерии иммуногенности вакцинных препаратов на основе как эпидемических, так и потенциально пандемических вирусов гриппа: кратность приростов антител не менее 2,5 для лиц 18-60 лет и развитие достоверных сероконверсий у 40% привитых. Как видно из вышеприведенных данных, вакцина «Орвакс» подтипа А(H5N2) при двукратном введении соответствовала Европейским критериям иммуногенности по числу сероконверсий (47,1%) и по кратности приростов антигемагглютинирующих антител (2,8). В отношении числа лиц с защитным титром антител после прививки, до сих пор остается не выясненным вопрос, какой титр антигемагглютинирующих антител можно считать защитным в отношении потенциально пандемических вирусов - 1:20 или 1:40.

Тест микронейтрализации, который ранее был рекомендован для изучения антительного ответа в сыворотках лиц, перенесших инфекцию вирусами А(H5N1) (ВОЗ, 2005), оказался достаточно чувствительным и специфичным в выявлении поствакцинальных штаммоспецифических вирус-нейтрализующих антител после иммунизации ЖГВ. Необходимо отметить, что при оптимизации теста микронейтрализации желательно использовать клеточные линии MDCK, поддерживающие оптимальную репродукцию используемого в тесте вируса (Rowe et al., 1999), прошедшие не более 20-25 пассажей до замораживания в жидком азоте.

Изучение поствакцинального секреторного иммунитета показало, что вакцина способна вызывать значительный уровень иммунного ответа вирус-специфических IgA в ВДП, то есть непосредственно во входных воротах инфекции.

Необходимо отметить, что обычно рекомендуемая инфекционная активность ЖГВ из реассортантных штаммов вирусов гриппа А подтипов А(H1N1) и А(H3N2) составляет не менее 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл. Однако, учитывая, что это был первый опыт применения среди людей ЖГВ подтипа H5, была использована сниженная доза вакцинного вируса (6,9 lg ЭИД₅₀/0,5 мл). При этом после двукратной вакцинации с интервалом в 21 день удалось вызвать выраженный иммунный ответ. При проведении 2-го этапа клинических испытаний на 42 добровольцах, дважды получивших вакцину с интервалом в 21 день, доза вакцинного вируса была увеличена до 8,3 lg ЭИД₅₀/0,5 мл. Данные по безвредности и реактогенности препарата полностью подтвердили ранее полученные показатели: отсутствовали температурные реакции и не было выявлено какого-либо неблагоприятного действия на организм привитых по данным инструментального и лабораторного обследования. По результатам иммуногенности за два года исследования был проведен суммарный анализ поствакцинального иммунного статуса привитых по данным двух серологических тестов (РТГА и РН) с учетом кратности вакцинации и дозы вакцинного вируса. Было показано, что после первичной иммунизации ЖГВ в дозе 6,9 lg ЭИД₅₀/0,5 или 8,3 lg ЭИД₅₀/0,5 мл общее число 4-х кратных сероконверсий сывороточных антител составило 23-50% соответственно, а после ревакцинации - 71-74% (рис. 5). При этом число сочетанных конверсий у одних и тех же лиц было относительно невысоким 0-2,4% после первой вакцинации и 14-24% после ревакцинации (r=-0,64-0,12, р>0,05).

Рис. 5. Суммарный уровень сероконверсий в сыворотках крови привитых вакциной «Орвакс» по данным РТГА и РН

Таким образом, по результатам 2-х исследований было установлено, что при оценке ЖГВ подтипа Н5 сочетанное применение тестов РТГА и МН для изучения гуморального иммунного ответа позволяет получить наиболее полную информацию о развитии сероконверсий в ответ на прививку.

Разработка стратегии и тактики вакцинопрофилактики гриппа с помощью ЖГВ в интерпандемический период и при подготовке к очередной пандемии

Вакцинация против гриппа во всем мире в первую очередь рекомендована лицам с высоким риском возникновения осложнений, в том числе пожилым людям старше 60 лет и лицам, страдающим хроническими соматическими заболеваниями, а также тем, кто в наибольшей степени подвержен риску заболевания гриппом и заражения других лиц. Из 3-х пандемий 20-го столетия две (1957 и 1968 гг.) вызвали наибольшую заболеваемость и смертность среди маленьких детей, пожилых и хронически больных людей (Potter, 2001).

Применение ЖГВ в группах высокого риска последствий заболевания гриппом. В настоящее время доля лиц в возрасте старше трудоспособного в общей численности населения России составляет 20,5% (26,8 млн. человек), а к 2025 г. по прогнозам она возрастет до 26,7%. По программе ВОЗ совместно со специалистами из Центра по контролю и предупреждению заболеваний США на базе домов престарелых Санкт-Петербурга и Ленинградской области были разработаны схемы иммунизации лиц преклонного возраста и больных, страдающих хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой системы и нарушениями обмена веществ, с использованием ХА реассортантной ЖГВ. Всего под наблюдением находилось 1177 человек в возрасте от 65 до 90 лет с различными диагнозами и уровнями функциональной активности Полученные данные клинического и лабораторного обследования престарелых и хронически больных, привитых ЖГВ, показали, что ХА тривакцина не вызывала каких-либо неблагоприятных реакций у этой группы лиц. Наиболее эффективным методом иммунизации в пожилом возрасте признано сочетанное введение ЖГВ+ИГВ с последующей ревакцинацией ЖГВ. Изучение особенностей поствакцинального ответа на введение ЖГВ у лиц пожилого возраста показало, что в этой возрастной группе живой антиген не уступает инактивированному в стимуляции циркулирующих сывороточных антител. У пожилых людей ЖГВ стимулировала образование секреторных IgA в титрах не ниже, чем у лиц молодого возраста, при этом их концентрация в секретах ВДП не снижалась на протяжении 3-х месяцев. В соавторстве с А.Н. Найхиным и др. (2002) было изучено влияние возрастных изменений на функцию клеточного иммунного ответа при иммунизации гриппозными вакцинами. Показано, что ЖГВ активно индуцировала продукцию Th1-маркерных цитокинов (ИЛ-2 и ИФН-г) лимфоцитами периферической крови, стимулированными in vitro вирусом A(H1N1), как у молодых людей, так и у пожилых, тогда как ИГВ - только у молодых. Результаты продукции Th1-маркерных цитокинов хорошо согласуются с данными об индукции клеточного иммунного ответа в ответ на введение ЖГВ. Показатели ПАЛ у пожилых и молодых людей оказались соответственно в 2 и 1,5 раза выше после введения ЖГВ по сравнению с ИГВ, при введении которой увеличение этого показателя составило у пожилых не более 1,3, а у молодых людей отсутствовало.

Оценка эффективности вакцинации против гриппа в домах престарелых показала, что в эпидемический по гриппу период среди лиц, привитых ЖГВ, имело место снижение заболеваемости в 1,6-2,0 раза по сравнению с непривитыми.

Таким образом, было показано, что иммунизация ЖГВ лиц пожилого возраста является не только безвредной, но и имеет преимущество в отношении стимуляции локального и клеточного компонентов иммунного ответа. По данным проведенных исследований были разработаны методические рекомендации «Вакцинопрофилактика гриппа с помощью живой гриппозной вакцины среди лиц пожилого возраста».

Применение тривалентной ЖГВ, включающей реассортантные вакцинные штаммы на основе донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2), среди детей дошкольного возраста. По данным ВОЗ, начиная с 1997 г. 50% всех заболевших гриппом А(H5N1) составили лица до 18 лет, а 90% - лица до 37 лет (ВОЗ, 2007). По прогнозам ВОЗ, в случае возникновения пандемии, вызванной вирусами А(H5N1), наибольшему риску заболевания могут подвергнуться дети, подростки и люди молодого возраста. Дети дошкольного и школьного возраста являются основными распространителями гриппозной инфекции в обществе. В то же время имеются данные о том, что при массовой вакцинации детей резко снижается заболеваемость невакцинированных лиц более старшего возраста (Monto et al., 1999).

Для вакцинации детей в детских садах Ленинградской области применялась коммерческая тривалентная ЖГВ для взрослых, включающая реассортантные штаммы, подготовленные в отделе вирусологии НИИЭМ РАМН на основе штаммов, рекомендованных ВОЗ на 1999-2001 эпидемические сезоны: A/17 / Пекин/95/25 (H1N1), A/17 / Новая Каледония/99/50 (H1N1), A/17 / Сидней/97/76 (H3N2) и B/60 / Петербург/95/20. Данный раздел работы был выполнен в рамках совместной с ГИСК им. Л.А. Тарасевича «Программы исследований по оценке безвредности и иммуногенности живой гриппозной вакцины для детей в возрасте 3-6 лет как единого препарата для взрослых и детей». Исследования проводили в сотрудничестве с руководителем клиники НИИ гриппа РАМН проф., д.м.н. В.П. Дриневским и руководителем лаборатории испытаний новых средств защиты против вирусных инфекций д.м.н. М.К. Ерофеевой.

В течение 2-х эпидемических сезонов было обследовано и привито 369 детей. По суммарным данным 2-х лет исследования показано, что ЖГВ, включающая реассортантные вакцинные штаммы на основе донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2), была ареактогенной при применении у детей 3-6 лет. ЖГВ не оказывала какого-либо побочного влияния на организм детей по данным частоты соматической и аллергологической патологии в течение 6 месяцев после прививки. Во время прививочного сезона 1999-2000 г. титры антигемагглютинирующих антител к вирусам гриппа А 1:40 после вакцинации наблюдались у 45-53% вакцинированных (к вирусу В-у 30%), кратность приростов СГТ антител к вирусам гриппа А и В у привитых детей составила 3,2-3,6. Анализ не выявил статистически значимых различий между количественными параметрами иммунного ответа в группах привитых однократно и двукратно.

В 2000 г. в состав вакцины был включен штамм А(H1N1) новой антигенной разновидности - A/17 / Новая Каледония/99/50. Перед началом вакцинации подавляющее большинство детей (98%) были серонегативными к этому штамму. Сероконверсии сывороточных антител к вирусу А(H1N1) наблюдались в 26,4% случаев, при этом 4-х кратные приросты секреторных IgA к этому антигену наблюдались у 44% обследованных. Таким образом, даже при условии, что подавляющее большинство детей перед прививкой были серонегативными, при однократном применении взрослого варианта ЖГВ удалось стимулировать выраженный иммунный ответ. По данным 2-х эпидемических сезонов вакцинация привела к значительному снижению заболеваемости ОРЗ и гриппом в период эпидемического подъема среди привитых, коэффициент эффективности вакцинации ЖГВ в отношении гриппа и ОРЗ составил 64%.

На основании полученных результатов тривалентная ЖГВ для взрослых, включающая реассортантные штаммы современных эпидемических вирусов на основе доноров аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2) и В/СССР/60/69, рекомендована для применения среди детей от 3-х лет и взрослых без ограничения возраста, в связи с чем внесены изменения в фармакопейную статью на ЖГВ ФСП 42-0504-4097-04.

Изучение на экспериментальной модели оптимальной схемы иммунизации реассортантным штаммом подтипа Н5. В случае формирования пандемического штамма одним из важнейших условий эффективности вакцины нового подтипа будет являться разработка стратегии и тактики ее применения как во время пандемического подъема, так и после него, в период стабилизации эпидемиологической ситуации, а именно: кратность применения, целесообразность включения в состав существующей поливалентной вакцины и возможности сочетания с другими профилактическими средствами. В связи с этим необходимо проводить исследования в направлении изучение взаимодействия вакцинных штаммов подтипа Н5 с реассортантными штаммами современных эпидемических вирусов, изучение иммуногенности и эффективности при различных схемах введения, включающих в себя комбинированное введение с ИГВ. На экспериментальной модели были изучены прививочные свойства вакцинного штамма Лен 17/Н5 при введении в составе поливалентной вакцины. Для оценки на мышах линии CBA инфекционной активности и иммуногенности реассортантного штамма Лен 17/Н5 при смешанном введении с реассортантами современных эпидемических вирусов было проведено интраназальное заражение ХА реассортантными штаммами Лен 17/Н5, А/17 / Новая Каледония/99/145 (H1N1), А/17 / Висконсин/05/84 (H3N2) и В/60 / Малайзия/04/898 раздельно и в сочетании при заражающей дозе 6 lg ЭИД₅₀ каждого вируса. Репродуктивную активность в легких определяли на 3-и сутки после инфекции по результатам титрования суспензии органов в РКЭ. Сыворотки крови для оценки иммуногенности были собраны через 28 дней после иммунизации. Результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14. Прививочные свойства реассортантного штамма Лен 17/Н5 при введении мышам раздельно и в составе дивалентной или поливалентной ЖГВ

Было показано, что введение каждого из реассортантных вирусов, а также их сочетания - A(Н1N1)+A(Н5N2), A(Н1N1)+A(Н3N2)+В, A(Н1N1)+A(Н3N2)+В+A(Н5N2) - не приводило к снижению массы тела животных более чем на 5%. При раздельном введении наибольший уровень репродуктивной активности в легких мышей наблюдался для реассортантов А(Н1N1) и В (4,6 и 3,9 lg ЭИД₅₀/мл соответственно). Использование штамма Лен 17/Н5 как в виде дивакцины в сочетании с реассортантом А(Н1N1), так и в составе тетравакцины, не приводило к дополнительному снижению массы тела животных по сравнению с раздельным заражением.

При смешанном заражении реассортантами А(Н1N1)+А(H5N2) наблюдалось достоверное снижение выделения смеси вирусов из легких по сравнению с показателями репродукции обоих штаммов, введенных по отдельности. При одновременном введении трех реассортантных вирусов современных циркулирующих разновидностей A(Н1N1)+A(Н3N2)+В уровень репродукции в легких не превышал таковых для отдельно взятых реассортантов А(Н1N1) или В. Добавление к трем реассортантам эпидемических вирусов штамма Лен 17/Н5 приводило к снижению титров выделения вирусной смеси из легких, хотя различия не были статистически значимыми.

Через 28 дней после иммунизации штаммом Лен 17/Н5 отдельно или в сочетании с реассортантным штаммом подтипа А(Н1N1) в сыворотках крови определялись сходные по значению титры нейтрализующих антител к вирусу подтипа Н5, в то время как при введении в составе тетравакцины наблюдалось достоверное снижение титров нейтрализующих антител (р=0,03). Результаты ИФА с использованием в качестве подложки очищенного НА гомологичного вируса Лен 17/Н5 подтвердили это наблюдение. После иммунизации моновакциной Лен 17/Н5 или дивакциной А(Н5N2)+А(Н1N1) средние титры специфических IgG к вирусу Н5 составили 3,4 и 3,2 lg соответственно. При введении реассортантного штамма Лен 17/Н5 в составе тетравакцины уровень вирус-специфических IgG не превышал 2,5 lg, то есть был достоверно ниже (р<0,001). Таким образом, было показано, что сочетанное введение реассортантов А(Н5N2) и А(Н1N1) не приводило к снижению иммуногенности в отношении компонента Н5, в то время как в составе тетравакцины реассортант Лен 17/Н5 оказался менее иммуногенным, чем при отдельном введении. Это явление согласуется с ранее полученными данными, когда в опытах in vitro было показано, что при равных заражающих дозах штаммы вируса гриппа В в гетерогенных смесях оказывались более сильными конкурентами по сравнению со штаммами типа А (Амвросьева с соавт., 1983).

Ранее в клинических испытаниях сезонных гриппозных вакцин было показано, что иммунизация моновалентной или дивалентной ЖГВ в сочетании с ИГВ приводит к появлению хорошо выраженного добавочного эффекта в отношении сероконверсий как сывороточных, так и секреторных антител (Powers et al., 1989, Rudenko et al, 2001). Сочетанное применение ИГВ и ЖГВ может позволить прийти к компромиссу по затрате материальных и временных ресурсов при применении пандемической вакцины. В связи с этим в эксперименте было проведено изучение иммуногенности при различных схемах последовательного введения ЖГВ и ИГВ из штамма Лен17/Н5. В качестве положительного контроля использовали сыворотки мышей, иммунизированных в/м субъединичной инактивированной вакциной из вируса А(H5N2) c гидроокисью алюминия производства ФГУП «Микроген». Результаты представлены в таблице 15.

Наиболее высокий уровень СГТ антигемагглютинирующих антител к очищенному НА вируса А(H5N2) наблюдался после сочетанной иммунизации ЖГВ с ревакцинацией ИГВ. СГТ нейтрализующих антител, напротив, были наиболее выраженными (1:80) при вакцинации по сочетанной схеме ИГВ с последующей ревакцинацией ЖГВ. В этом случае также наблюдались существенные приросты локальных IgG (p=0,03) и IgA (p=0,05).

Таблица 15. Иммуногенность ЖГВ и ИГВ подтипа А(H5N2) при введении мышам раздельно и в сочетании

Таким образом, в эксперименте было показано, что двукратная сочетанная иммунизация с использованием ЖГВ и ИГВ позволила повысить СГТ антигемагглютинирующих антител в 10 раз, в то время как применение ИГВ с адьювантом - в 2,5 раза. Использование ИГВ для первичной вакцинации и ЖГВ для ревакцинации позволило добиться не только повышения интенсивности гуморального иммунного ответа, но и сочетанности продукции секреторных IgA и антител в сыворотке крови.

Выводы

1. Сравнительный анализ нуклеотидных замещений в генах холодоадаптированного штамма А / Москва/21/17/65 (H2N2) и его предшественника - варианта А / Москва/21/65 (H2N2) показал, что основные изменения, ответственные за проявления холодовой адаптации, локализуются в гене РВ2. Свойства холодовой адаптации и аттенуации, наследуемые реассортантами на основе штамма А / Москва/21/17/65 (H2N2), позволяют обосновать его использование не только в качестве холодоадаптированного вакцинного штамма в случае пандемии, вызванной вирусом гриппа подтипа А(Н2N2), но и как потенциальный новый донор аттенуации для получения реассортантных вакцинных штаммов.

2. Результаты секвенирования донора аттенуации В/СССР/60/69 для сезонной тривалентной ЖГВ подтвердили полученные ранее данные об аттенуации этого донорского штамма и дали возможность модифицировать ОТ-ПЦР рестрикционный метод применительно к генам внутренних и неструктурных белков реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В.

3. Впервые получена уникальная коллекция высокорепродуктивных реассортантов вирусов гриппа А(Н5N2), А(Н7N3) и А(Н9N2), устойчиво проявляющих ts-, ca- и att - фенотип, с использованием стандартного метода генетической реассортации на основе холодоадаптированного донора аттенуации А / Ленинград/134/17/57 (H2N2).