Закономерности морфологических изменений надпочечников при острой алкогольной интоксикации и общем переохлаждении организма

Размещено на http://www.allbest.ru//

38

Размещено на http://www.allbest.ru//

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

14.00.24 - судебная медицина

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Закономерности морфологических изменений надпочечников при острой алкогольной интоксикации и общем переохлаждении организма

Алябьев Федор Валерьевич

Новосибирск - 2008

Работа выполнена в Сибирском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (г. Томск).

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Логвинов Сергей Валентинович

доктор медицинских наук, профессор Новоселов Владимир Павлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Машак Светлана Владимировна

доктор медицинских наук, профессор Бураго Юрий Иванович

доктор медицинских наук, профессор Суходоло Ирина Владимировна

Ведущая организация: Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится ___.__________ 2008 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.062.05 при Новосибирском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета Росздрава.

Автореферат разослан ___ ____________ 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессорА.В. Волков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Надпочечники являются основным эффекторным звеном гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и по состоянию этого органа можно судить об адекватности реагирования адаптивной системы на сильные стрессорные воздействия [Селье Г., 1960; Алисиевич В. И., 1995; Бернет Ф., 1971; Маршани З. М. 1983; Мухаметов Р. Ю. и др. 1973; Обут Т. А., 1992, 1994; Ольховик В. П., 1971, 1974; Стабровский Е. М., Кнорре З. Д., 1973; Прошина Ю. В., 2007]. При слабых стрессорных воздействиях реакция надпочечников регистрируется в первую очередь в клубочковой зоне коркового вещества [Перельмутер В. М., Гуревич М. Е., Диденко Н. П. и др. 1989; Перельмутер В. М., Заматринский А. В., Диденко Н. П. и др. 1993], при длительном действии стрессора более выраженно реагируют пучковая и сетчатая [Алисиевич В. И., 1974, 1976, 1995; Ханов В. Г., 1965; Уткина Т. М., 1972]. Реакция на сильные стрессорные воздействия характеризуется практически одновременным, но различным по степени вовлечением всех морфофункциональных зон надпочечников в единую адаптивную реакцию организма [Осьминкин В. А., 1990; Стабровский Е. М., Кнорре З. Д., 1973; Ольховик В. П., 1971, 1974; Алисиевич В. И., 1957-1995]. При исследовании реакции надпочечников на экстремальные воздействия представляет интерес выделение среди совокупности изменений морфофункционального состояния неспецифических, отражающих силу и длительность воздействия и идентичных при действии различных стрессоров и признаков, отражающих особенности определенного танатогенного стрессора. Особенно актуален такой подход при одновременном действии на организм человека нескольких танатогенных факторов [Бурлаков Г. И., 1990, 1991; Десятов В. П., Шамарин Ю. А., Шнайдер А. Д., Бунин Ю. Н., 1982; Корсаков А. Л., 1972; Стабровский Е. М., Кнорре З. Д., 1973; Уткина Т. М., 1977; Пиголкин Ю. И., 2006].

Единичные работы посвящены изучению морфологии надпочечных желез при смерти от общего переохлаждения организма [Шамарин Ю. А., Мельчиков А. С., 1997], отравления окисью углерода [Тиунов Л. А., Кустов В. В., 1969], острой алкогольной интоксикации [Алисиевич В. И., 1965, Коршенко Д. М., Алисиевич В. И., 1998]. Однако в имеющихся работах не достаточно раскрываются механизмы возникновения изменений надпочечников. Кроме того, в доступной литературе отсутствуют сведения о сравнительном изучении морфофункционального состояния надпочечников при комбинированном действии различных стрессоров. Наличие подобных исследований помогло бы в решении спорных вопросов при действии на организм нескольких повреждающих факторов, каждый из которых сам по себе мог бы привести к смерти.

Наименее изученным является морфофункциональное состояние надпочечников при комбинированном действии различных стрессоров разной силы и продолжительности. Одним из наиболее сильных стрессоров является общее переохлаждение организма [Майстрах Е. В., 1972, 1975; Десятов В. П., 1977; Шамарин Ю. А., Мельчиков А. С., 1997; Шигеев В. Б., Шигеев С. В., Колударова, 2004; Югов К. М., 2004]. В единичных работах описаны морфологические изменения надпочечников при многократном охлаждении животных в эксперименте, а также при смертельном переохлаждении у людей. При этом отсутствуют работы, в которых дана информация об изменении состояния надпочечников в динамике холодового стресса, остаются не изученными тканевые механизмы регуляции функции надпочечников при общем переохлаждении организма. Часто встречаются случаи действия общего переохлаждения на организм человека, находящегося в состоянии алкогольного опьянения различной степени [Шамарин Ю. А., Мельчиков А. С., 1997; Мальцев С. В., Ивкин А. А., Спиридонова Н. Н., 2006; Алексеев И. В., Зайцев А. П., Исаев Ю. С., Проскурин В. И., Югов К. М., 2006; Леонов Н. В., Цывцына Л. Ф., 2006; Афанасьев С. А., Южакова Т. П., 2006; Панченко И. В., Лысый В. И., Чикун В. И., 2007], при этом реакция адаптивной системы на холод изменяется, что приводит к развитию более быстрого летального исхода [Десятов В. П., 1977; Шамарин Ю. А., Мельчиков А. С., 1997; Шигеев В. Б., Шигеев С. В., Колударова, 2004; Югов К. М., 2004]. Однако в имеющихся работах не дана оценка влияния различной степени алкогольной интоксикации на модификацию морфофункционального состояния надпочечников при общем переохлаждении организма. Кроме того, в судебной медицине до сих пор не разработаны критерии дифференциальной диагностики причины смертельного исхода от действия низкой температуры и алкогольной интоксикации, приводя к тому, что выводы о причине смерти не всегда являются категоричными и доказанными.

Учитывая вышеизложенное, изучение морфофункционального состояния надпочечников при алкогольной интоксикации и общем переохлаждении является насущно необходимым для более полного понимания тканевых механизмов формирования ответной системной реакции организма при действии чрезвычайных по силе факторов.

Цель исследования: установить закономерности изменения морфофункционального состояния надпочечников при различных вариантах и исходах изолированного и комбинированного действия острой алкогольной интоксикации и общего переохлаждения организма.

Задачи исследования:

Изучить на экспериментальных животных морфофункциональное состояние надпочечников в динамике алкогольной интоксикации при интрагастральном введении 40 % раствора этанола в различных дозах (2, 4, 8 мл/кг).

Изучить на экспериментальных животных морфофункциональное состояние надпочечников в динамике общего переохлаждения организма при различной температуре (-10° С и -18° С).

Изучить на экспериментальных животных морфофункциональное состояние надпочечников в динамике общего переохлаждения организма при различной температуре (-10° С и -18° С) на фоне сопутствующей алкогольной интоксикации, вызванной интрагастральным введением 40 % раствора этанола в различных дозах (2, 4, 8 мл/кг).

Изучить на экспериментальных животных взаимосвязи морфофункционального состояния надпочечников с параметрами углеводного обмена (содержание глюкозы в крови, глюкозы и гликогена в печени, мозге, скелетной мышце) при изолированном и комбинированном действии алкогольной интоксикации при интрагастральном введении 40 % раствора этанола в различных дозах (2, 4, 8 мл/кг) и общего переохлаждения организма при различной температуре (-10° С и -18° С).

Сравнить с учетом зонального строения органа морфофункциональное состояние надпочечников человека при летальной алкогольной интоксикации, при сопутствующей не смертельной алкогольной интоксикации, в случаях смерти от общего переохлаждения организма.

Оценить вклад сопутствующей алкогольной интоксикации в формирование морфофункционального состояния надпочечников при летальном исходе общего переохлаждения организма.

Среди параметров морфофункционального состояния надпочечников выявить наиболее информативные для дифференциальной диагностики летального исхода от отравления этиловым спиртом и общего переохлаждения организма, на основании которых разработать способы дифференциальной диагностики смерти от данных причин.

Научная новизна. Впервые детально изучены закономерности изменения морфофункционального состояния надпочечников в динамике алкогольной интоксикации при интрагастральном введении 40 % раствора этанола в различных дозах (2, 4, 8 мл/кг) и общего переохлаждения организма при температуре -10° С и -18° С.

Показано, что при алкогольной интоксикации морфофункциональное состояние надпочечников зависит от дозы введенного этанола, концентрации этанола в крови и длительности алкогольной интоксикации. Морфологические признаки нарастания функциональной активности надпочечников регистрируются через один час воздействия. Алкогольная интоксикация, вызванная введением этанола в дозе 8 мл/кг, приводит к появлению морфологических признаков гипофункции клубочковой зоны надпочечников, которые регистрируются в обеих железах через два часа воздействия. интоксикация алкогольный переохлаждение надпочечник

Впервые установлено, что взаимосвязь морфофункционального состояния надпочечников с содержанием глюкозы в крови и глюкозы и гликогена в печени, мозге и скелетной мышце при алкогольной интоксикации выше, чем при изолированном действии низкой атмосферной температуры, комбинированном действии алкогольной интоксикации и низкой температуры. При этом наибольшее влияние на содержание углеводов в тканях зарегистрировано со стороны правого надпочечника при летальном исходе комбинированного действия алкогольной интоксикации и низкой атмосферной температуры.

Показано, что действие алкогольной интоксикации при различных дозах интрагастрально введенного этанола (2, 4, 8 мл/кг) и низкой атмосферной температуры -10 С и -18° С, а также различные варианты комбинированного воздействия этих факторов не изменяет p-53 и bcl-2 опосредованные механизмы апоптоза в надпочечниках.

Установлено, что межзональное взаимодействие в левом и правом надпочечниках, а также межнадпочечниковое взаимодействие усиливаются при увеличении силы изолированно или комбинированно действующих стрессоров.

Впервые описаны тканевые механизмы возникновения морфофункциональных изменений секреторного аппарата и сосудов надпочечников при изучаемых стрессорных воздействиях. Установлены различия межтканевых взаимодействий, обусловленные различными вариантами и исходами изолированного и комбинированного действия алкогольной интоксикации и общей гипотермии.

Практическое значение. Изученные закономерности изменения морфофункционального состояния надпочечников в динамике алкогольной интоксикации и общего переохлаждения организма могут быть использованы для диагностики вклада каждого из стрессоров в формирование адаптивной реакции.

На основе выявленных различий морфофункционального состояния надпочечников при смерти от отравления этиловым спиртом, общего переохлаждения организма и механической травмы разработаны прогнозные уравнения, положенные в основу способов дифференциальной диагностики непосредственной причины смерти при комбинированном действии указанных факторов на организм.

Полученные данные могут быть использованы в процессе преподавания гистологии, нормальной и патологической физиологии, патологической анатомии, судебной медицины, эндокринологии, токсикологии, в клинической и секционной практике.

Положения, выносимые на защиту:

В динамике однократного несмертельного изолированного и комбинированного действия алкогольной интоксикации и общего переохлаждения организма выраженность морфофункциональных изменений надпочечников возрастает пропорционально силе и длительности воздействия.

Алкогольная интоксикация и общее переохлаждение организма при различных вариантах изолированного и комбинированного действия по-разному меняют межзональное взаимодействие в левом и правом надпочечниках и межнадпочечниковое взаимодействие. Действие более сильного стрессора или комбинации стрессоров приводит к большему усилению внутринадпочечникового и межнадпочечникового взаимодействия.

Общее переохлаждение организма на фоне алкогольной интоксикации уменьшает зависимость морфофункционального состояния секреторных клеток и сосудов надпочечников от концентрации этанола в крови.

Морфофункциональное состояние надпочечников в случаях смерти от отравления этиловым спиртом и общего переохлаждения организма различно. На основании этих различий возможна дифференциальная диагностика причины смерти от отравления этиловым спиртом и общего переохлаждения организма путем расчета в процентах вероятности отнесения случая к той или иной группе.

Апробация работы. Основные материалы исследования были представлены на: региональной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (Томск, 2004), VI и VIII конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005, 2007), четвертой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), VI Всероссийском съезде судебных медиков «Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики» (Тюмень, 2005), научно-практической конференции «Проблемы теории и практики судебной медицины», посвященной 115-летию основания кафедры судебной медицины Сибирского государственного медицинского университета (Томск, 2005), VIII конгрессе международной ассоциации морфологов (Орел, 2006), конференции, посвященной 70-летию Тверской государственной медицинской академии и 100-летию со дня рождения основателя кафедры анатомии человека профессора И.С. Кудрина (Тверь, 2006), научно-практической конференции «Проблемы теории и практики судебной медицины», посвященной 115-летию систематического преподавания судебной медицины в Сибири (Томск, 2006), конференциях межрегиональной ассоциации «Судебные медики Сибири» (Барнаул, 2004; Новосибирск, 2005, 2006; Красноярск, 2007).

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедр: гистологии, эмбриологии и цитологии, морфологии и общей патологии, судебной медицины с курсом токсикологической химии СибГМУ (г. Томск), судебной медицины НГМУ (г. Новосибирск). Практические рекомендации внедрены в работу бюро судебно-медицинской экспертизы Иркутской, Новосибирской, Омской областей, Красноярского края, ФГУ КБ № 81 г. Северска.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 49 научных работ, из них 2 монографии, 22 публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, получено 5 патентов на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав «Материал и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 408 страницах машинописного текста, включают 94 таблицы, 97 рисунков, из них 58 фотографий. В списке литературы приведено 613 работ, из них 278 на русском языке и 335 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика экспериментальной модели

Для эксперимента использованы 260 беспородных крыс самцов в возрасте 3-4 месяцев массой 250-300 грамм. Эксперимент проводился в осенне-зимний период. За сутки до эксперимента животные были лишены пищи. Время начала воздействий в каждой серии эксперимента 9 часов 00 минут.

В первой серии экспериментов крыс (n = 80) подвергали охлаждению при температурах (-10С - -12С; -18С - -20С) путем помещения клетки с животными на открытый воздух на срок 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 часов, после чего животных выводили из эксперимента. Во второй серии проводили алкоголизацию животных (n = 120) путем введения через интрагастральный зонд (приспособленный подключичный катетер) в полость желудка 40 % раствора этилового спирта в дозах 2, 4, 8 мл 100 % этилового спирта на 1 кг массы животного. Длительность наблюдения за животными после введения дозы алкоголя составляла срок 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 часов, после чего животных выводили из эксперимента. В третьей серии осуществляли комбинированное воздействие: а) после интрагастрального введения 40 % раствора этилового спирта в дозе 2 мл 100 % этилового спирта на 1 кг массы животных (n = 30) помещали в клетке на открытый воздух при температурах окружающей среды (-10С - -12С; -18С - -20С) на срок 3, 5, 7 часов, после их выводили из эксперимента, б) после интрагастрального введения 40 % раствора этилового спирта в дозе 4 мл 100 % этилового спирта на 1 кг массы животных (n = 30) помещали в клетке на открытый воздух при температурах окружающей среды (-10С - -12С; -18С - -20С) на срок 3, 5, 7 часов, после чего их выводили из эксперимента, в) после интрагастрального введения 40 % раствора этилового спирта в дозе 8 мл 100 % этилового спирта на 1 кг массы животных (n = 10) помещали в клетке на открытый воздух при температурах окружающей среды (-10С - -12; -18С - -20С) на срок 3, 5, 7 часов, после чего их выводили из эксперимента.

Интрагастральное введение зонда и раствора этилового спирта лабораторным животным производили под эфирным наркозом. Длительность процедуры не превышала 4-5 минут, что исключало возможность развития ответных морфологических изменений надпочечников [Хмельницкий О. К., Медведев Ю. А., 1972]. По достижении экспериментальной временной точки животных под эфирным наркозом подвергали декапитации. Некоторые животные в сериях эксперимента с комбинированным воздействием погибали, не доживая до планируемой временной точки вывода из эксперимента. Для динамического контроля использовали 10 животных.

После декапитации производили забор крови в пенициллиновый флакон для исследования содержания глюкозы и этанола, после чего животных вскрывали, изымали левую и правую надпочечные железы, а также кусочки печени, мозга, скелетной мышцы для исследования на содержание глюкозы и гликогена. Надпочечники отпрепаровывали от окружающих тканей и помещали в фиксирующие растворы в зависимости от планируемой гистологической методики.

Секционный материал

Объектом исследования служили надпочечники мужчин, погибших от общего переохлаждения организма (ОПО) (19 случаев), погибших от ОПО на фоне алкогольной интоксикации (28 случаев), а также от отравления этиловым алкоголем (ОЭА) (22 случая).

В качестве контроля использованы надпочечники мужчин, погибших от несовместимой с жизнью механической травмы, повлекшей наступление смерти без развития агонального периода (28 случаев) и погибших от механической травмы на фоне алкогольной интоксикации (33 случая). Основным танатогенетическим фактором являлись несовместимые с жизнью повреждения внутренних органов. Выбор контрольной группы определялся результатами исследований, доказавших что быстрое, в течение 5 - 6 мин от начала действия танатогенного воздействия, развитие летального исхода не сопровождается возникновением существенных изменений в структуре надпочечников [Хмельницкий О. К., Ступина А. С., 1989]. Выбор для исследования мужчин, которым свойственна большая устойчивость гормонального фона, позволил исключить вероятные искажения полученных результатов, связанные с половыми различиями.

В исследовании были использованы надпочечники лиц в возрасте от 21 до 58 лет, что позволило исключить различия морфометрических параметров надпочечников, обусловленные онтогенетически [Асфандияров Р. И., Лазько М. В., Лозовская Н. А., 2003], а также изменения, связанные с характерным для детского и юношеского возраста становлением нейроэндокринной системы, а для пожилого и старческого - инволютивных изменений и более частой соматической патологии.

Группы статистически значимо не отличались по возрасту, а также срокам от момента наступления смерти до проведения вскрытия (таблица 1).

В ходе аутопсийного и последующего гистологического исследования внутренних органов (головного мозга, легких, сердца, печени, почек, органов внутренней секреции) были исключены случаи с выраженной соматической патологией, погибшие в состоянии лекарственного или наркотического опьянения, а также страдавшие хроническим алкоголизмом. Сведения о наличии или отсутствии алкоголизма и наркомании были получены в профильных диспансерных учреждениях.

В каждом случае диагноз верифицировался с учетом наружного осмотра и внутреннего исследования: аутопсии с последующим гистологическим исследованием. Определяли концентрацию алкоголя в крови из бедренной вены и моче [Новиков П. И., 1967] методами газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии, а в случаях, подозрительных на прием наркотических и сильнодействующих веществ - проводилось судебно-химическое исследование крови, мочи и внутренних органов. Концентрация этилового спирта в крови среди погибших в состоянии алкогольного опьянения в контрольной группе колебалась от 0,4 до 3,1 ‰, в группе погибших от общего переохлаждения организма от 0,2 до 5,8 ‰, у погибших от отравления этиловым алкоголем от 4,1 до 6,6 ‰ (таблица 1).

Таблица 1. Характеристика групп наблюдения

Примечание: M - средняя арифметическая, m - ошибка средней арифметической.

В ходе вскрытия надпочечники извлекали с окружающей жировой клетчаткой, фиксировали в нейтральном кальций-формоле в течение 24 часов, очищали от жира и взвешивали. Затем на трех параллельных равноудаленных срезах, делящих железу на четыре равные по длине части с помощью сетки Автандилова [Автандилов Г. Г., 1990], определяли количество точек, соответствующих корковому и мозговому веществу. На основании рассчитанного процентного соотношения зон вычисли массу коркового и мозгового вещества и отношение массы коркового вещества к массе мозгового вещества. Исследования проводились раздельно в левом и правом надпочечнике.

Микроскопическая оценка морфофункционального

состояния надпочечников

Для гистологического исследования секционного материала взяты фрагменты из средней части надпочечников, на которых имелись все зоны коркового вещества и мозговое вещество. Надпочечники лабораторных животных брали рассеченными напополам. На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, по 4-балльной системе оценено состояние клубочковой, пучковой и сетчатой зон коркового вещества и мозгового вещества. Оценка распределения липидов выполнена на окрашенных суданом черным срезах. В каждом случае были оценены: наличие и выраженность очаговой и диффузной мононуклеарной инфильтрации, число лимфоцитов, моноцитов, плазмоцитов и фибробластов, расположенных в соответствующих зонах коркового вещества, степень кровенаполнения и отека различных зон, количество в них эндокриноцитов с пикнотичными ядрами. В сетчатой зоне оценивались распределение секреторных клеток с липофусцином и степень насыщения им цитоплазмы. В мозговом веществе оценены объем цитоплазмы адреналоцитов, степень её вакуолизации и базофилии.

На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, с помощью сетки Автандилова произведен расчет паренхиматозностромальных соотношений в каждой зоне коркового вещества и в мозговом веществе надпочечников.

Часть надпочечника для электронной микроскопии фиксировали в 2,5 % растворе глутарового альдегида на какодилатном буфере рН 7,4, постфиксировали в 1 % четырехокиси осмия, дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпон-аралдит. Срезы готовили на ультратоме LKB-III. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Электронная микроскопия проводилась на микроскопе “JEM-100 CXII” (“JEOL”, Япония) с апертурной диафрагмой 25-30 мкм при ускоряющем напряжении 80 кВ. На электронограммах пучковой зоны рассчитаны удельный объем (в %) ядра, ядрышка, липидных включений, интактных митохондрий и митохондрий с деструктивными изменениями, оценено состояние комплекса Гольджи.

Для иммуногистохимического исследования на маркеры апоптоза P-53 и bcl-2, а также иммуноглобулины G и М окрашивали срезы толщиной 3 мкм.

На аппарате КФК-3 фотоколориметрически глюкозооксидазным методом исследовано содержание гликогена и глюкозы в печени, головном мозге, скелетной мышце и глюкозы в крови.

Кариометрическое исследование [Хесин Я. Е., 1967] проводилось на телеметрической установке, состоящей из светового микроскопа «Micros», персонального компьютера «Celeron-2001», фотокамеры «Nikon», с использованием программы Adobe PhotoShop 6.0 for Windows. Изображение поля зрения светового микроскопа после предварительной калибровки с помощью объекта-микрометра вводилось в компьютер с помощью фотокамеры. На полученных фотографиях каждой зоны коркового вещества в программе Adobe PhotoShop 6.0 пользуясь опцией «лассо», позволяющей измерять площадь неправильных фигур, обводили контуры не менее 30 ядер [Лакин Г. Ф., 1980]. Рассчитывали среднюю площадь ядер эндокриноцитов и коэффициент её вариабельности.

Морфометрические и кариометрические характеристики контралатеральных надпочечников сравнивались в каждой группе наблюдения. Кроме того, проводилось межгрупповое сравнение по всем исследованным показателям.

По формуле:

где Dd - величина правого параметра, Ds - величина левого параметра,

рассчитывали коэффициент и силу асимметрии параметров с непрерывным распределением величин в вариационном ряду.

В итоге морфофункциональное состояние надпочечников в исследуемых группах проведено по 181 параметру. Для избежания предвзятости в оценке использован двойной слепой контроль. Номера гистологических препаратов и микрофотографий надпочечников были зашифрованы, расшифровка материала была проведена после завершения обработки случаев.

Статистическая обработка осуществлена с помощью пакета программ STATISTIСA 6.0 for Windows и SAS 6.12. Использован t-тест для зависимых и независимых величин, непараметрические тесты Вилкоксона, Манна-Уитни, корреляционный анализ Спирмэна и Пирсона, логистический регрессионный анализ. Параметрические тесты применяли с учетом условий, ограничивающих возможности их обоснованного использования: непрерывность распределения величин в вариационном ряду, равенство дисперсий, нормальность распределения величин в вариационном ряду. Проверка нормальности распределения величин в вариационном ряду проводилась с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Данные, полученные на экспериментальном материале, обработаны с помощью непараметрических критериев. Статистически значимыми результаты считались при p < 0,05, о выраженной тенденции судили при p < 0,1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показало проведенное исследование, алкогольная интоксикация, вызванная интрагастральным введением этанола в дозах 2, 4 и 8 мл/кг, вызывает повышение морфофункциональной активности надпочечников. Однако, выраженность морфологических проявлений, отражающих это усиление при различных дозах введенного этанола различна. В большей степени в адаптивную реакцию вовлекаются пучковая и сетчатая зоны, что согласуется с литературными данными, полученными на различных биологических моделях [Обут Т. А., 1992, 1994; Алисиевич В. И., 1995; Перельмутер В. М., 1995; Frank S. M. et al., 1997; 2003; Farrace S. et al., 2003; Мамедов В. К., Морозов Ю. Е., Пиголкина Е. Ю., 2004; Мамедов В. К., Морозов Е. Ю., 2004; Богомолова И. Н. и др., 2004; Зороастров О. М., 2005; Pajovic S. B. et al., 2006; Popova N. K. et al., 2006; Прошина Ю. В., 2007].

При введении этанола в дозе 2 мл/кг основными критериями, свидетельствующими о повышении морфофункциональной активности являются увеличение кровенаполнения зон и размеров ядер секреторных клеток. Изменения количественных показателей ультраструктурных компонентов эндокриноцитов пучковой зоны выражены минимально. При алкогольной интоксикации, вызванной введением дозы этанола 4 мл/кг признаки повышения морфофункциональной активности выражены больше. Помимо увеличения кровенаполнения зон и размеров ядер секреторных клеток изменяются количественные соотношения ультраструктурных компонентов эндокриноцитов пучковой зоны: увеличивается доля митохондрий и ядра, уменьшается - липидных включений. Причем, в отличие от интоксикации, вызванной введением 2 мл/кг этанола, признаки повышения морфофункциональной активности характеризуются плавностью нарастания в динамике всего периода наблюдения,. При введении этанола в дозе 8 мл/кг изменения пучковой и сетчатой зон коркового вещества и мозгового вещества аналогичны тем, которые возникают при введении 4 мл/кг, однако выражены в большей степени. При этом изменения в клубочковой зоне левой и правой желез носят принципиально иной качественный характер - в динамике воздействия происходит плавное уменьшение кровенаполнения и уменьшение размеров ядер гломерулярных эндокриноцитов уже в течение первого часа интоксикации.

Известно, что клубочковая зона подвергается наибольшему влиянию алкоголя. Алкоголь усиливает экскрецию ионов калия с мочой [Шишов В. И., 1974], тем самым повышает отношение натрий/калий в организме [Петров Н. С., Беляев В. Е., Новицкий В. А., 1977] и снижает чувствительность адренокортикоцитов к ангиотензину II, результатом чего является резкое уменьшение синтеза альдостерона [Nieminen M. M., Linkola J., Fyhrquist F. et al., 1985]. Морфологическим подтверждением этого является статистически значимое уменьшение площади ядер адренокортикоцитов клубочковой зоны в динамике алкогольной интоксикации у крыс (при введении этанола в дозе 8 мл/кг), а также у погибших от отравления этанолом и от механической травмы в состоянии алкогольного опьянения. При этом негативное влияние этанола на активность клубочковой зоны подтверждено отрицательными корреляциями между размерами ядер ее эндокриноцитов и концентрацией этанола в крови не только у погибших от отравления этанолом, но и в динамике алкогольной интоксикации у крыс, в динамике комбинированного воздействия алкогольной интоксикации и низкой атмосферной температуры, а также у погибших от гипотермии в состоянии алкогольного опьянения. Объяснением депрессивного действия алкоголя на клубочковую зону может явиться и то, что он является антагонистом АДГ [Петров Н.С., Беляев В.Е., Новицкий В. А., 1977], стимулирующего минералокортикоидную активность [Gallo-Payet N., 1993]. Не исключено и прямое угнетающее действие алкоголя и его метаболитов на секреторные клетки клубочковой зоны.

Влияние острой алкогольной интоксикации в динамике воздействия на морфофункциональную активность пучковой зоны выражается в ее активации, что согласуется с литературными данными [Шишов В. И., 1974]. При этом степень усиления функционирования тем выше, чем выше доза введенного этанола. У погибших от травмы на фоне АИ выявлена положительная корреляционная связь между концентрацией этанола в крови и размерами ядер адренокортикоцитов пучковой зоны правого надпочечника, что может явиться подтверждением этого положения. Однако, у погибших от отравления этанолом и от механической травмы пьяными размеры ядер эндокриноцитов пучковой зоны меньше, чем в контрольной группе. Допустимо, что подобное расхождение данных, полученных на экспериментальном и секционном материале, может являться следствием видовых различий, обусловливающих разные темпы элиминации этанола, а также восприимчивость организма к введению высоких его доз. Нельзя исключить, что причинной отличий является то, что крысам этанол вводился впервые, а мужчины исследуемых групп этанол употребляли в течение жизни неоднократно. При этом необходимо учитывать тот факт, что забор экспериментального материала производился сразу после выведения животного из эксперимента, а секционного - практически через сутки после наступления смерти. Однако, несмотря на это, влияние летальных концентраций алкоголя на активность пучковой зоны больше похоже на действие хронической алкогольной интоксикации [Шишов В. И., 1974], при которой выработка глюкокортикоидов снижается. Причем, судя по величине коэффициентов вариабельность площади ядер адренокортикоцитов пучковой зоны, в левой железе происходит уменьшение доли секреторных клеток с крупными, активно функционирующими ядрами, при этом коэффициент вариабельности снижается, а в правой - доли эндокриноцитов с ядрами средних размеров, при этом коэффициент вариабельности увеличивается.

Как известно, нормальная и повышенная андрогенная функция повышает устойчивость к алкоголю [Петров Н. С., 1977]. Это полностью подтверждается экспериментальными данными, которые показали, что морфофункциональная активность сетчатой зоны увеличивается в динамике алкогольной интоксикации более других зон надпочечников. У мужчин, погибших от отравления этанолом, размеры ядер секреторных клеток сетчатой зоны левой и правой желез наименьшие среди всех исследованных групп, при этом кровенаполнение, судя по величине паренхиматозностромального соотношения, практически не отличается от контроля. Учитывая доказанный факт способности клеток сетчатой зоны синтезировать не только половые гормоны, но и глюкокортикоиды [Обут Т. А., 1992; Филаретов А. А., Данилова О. А., 1994] можно допустить, что при смертельном отравлении этанолом снижается синтез и тех и других. Дополнительным признаком снижения функционирования адренокортикоцитов сетчатой зоны при смертельном отравлении этанолом является большое количество адренокортикоцитов с липофусцином.

Важную роль в процессе адаптации к токсическому влиянию алкоголя играет мозговое вещество. Кровенаполнение его в динамике интоксикации увеличивается, причем наибольшее увеличение характерно при введении этанола в дозе 4 мл/кг. При введении этанола в дозе 8 мл/кг выявлено уменьшение объема цитоплазмы адреналоцитов и выраженности вакуолизации, что видимо, является следствием активного выделения катехоламинов [Adams M. A., Hirst M., 1984] и энкефалинов [Беляев Н. А., Колесанова Е. Ф., 1990] под влиянием алкоголя. А увеличение числа секреторных клеток с пикнотичными ядрами при введении высоких доз этанола может свидетельствовать о негативном влиянии алкогольной интоксикации на хромаффинную ткань. При этом введение малых доз этанола (2 мл/кг) наоборот приводит к уменьшению в динамике воздействия кариопикноза в секреторных клетках мозгового вещества. Степень опьянения, определяемая по концентрации этанола в крови, влияет на данный признак противоположным образом.

На воздействие низкой атмосферной температуры -10 С и -18 С надпочечные железы отвечают повышением морфофункциональной активности различных отделов. Как известно, активность клубочковой зоны регулируется несколькими факторами. К ним относятся увеличение концентрации калия, снижение - натрия и кальция, а также гипотония. В случаях смерти от переохлаждения обнаружено уменьшение содержания в надпочечниках ионов натрия и кальция [Балаев В. В., Табакман М. Б., 1968]. Факт снижения артериального давления при общем переохлаждении не подлежит сомнению. Это позволяло некоторым исследователям утверждать, что именно сосудистый коллапс из-за холодового угнетения сосудодвигательного центра приводит к смерти [Буков Е. А., Егоров Ю. Н., Ласси Н. И., 1961]. Гипотония приводит к стимуляции синтеза ренина юкстагломерулярным аппаратом почечных клубочков. Ренин в свою очередь повышает образование ангиотензина II, основного прямого стимулятора синтеза альдостерона [Алешин Б. В., 1971; Бернет Ф., 1971; Хэм А., Кормак Д., 1983]. Альдостерон, действуя на почечные канальцы, увеличивает реабсорбцию ионов натрия, что в свою очередь ведет к реабсорбции воды по градиенту осмотического давления и увеличению объема циркулирующей крови, являющемуся одним из механизмов повышения артериального давления. Повышение артериального давления нивелируется за счет согласованного действия минералокортикоидов и катехоламинов. Катехоламины централизуют кровообращение и заставляют кровь циркулировать в ядре тела, а минералокортикоид альдостерон не дает жидкости уйти через почки. Однако, помимо почечного механизма активации клубочковой зоны важнейшую роль играет центральный - вазопрессиновый, так как известно, что антидиуретический гормон напрямую стимулировать клубочковую зону [Шмидт Р., Тевс Г., 1996].

В конечном итоге именно срыв даже некоторых звеньев из вышеописанных механизмов адаптации и приводит к развитию коллапса, играющего важнейшую роль в танатогенезе при длительном воздействии низкой температуры. С другой стороны, нельзя исключить, что при сбое одного из звеньев поддержания артериального давления на нормальном уровне при продолжении действия низкой температуры произойдет каскадный сбой остальных.

Выявленное в динамике гипотермии повышение морфофункциональной активности пучковой зоны, несомненно, связано с ее глюкокортикоидной функцией. Учитывая многогранное влияние глюкокортикоидов на обменные процессы в организме активацию пучковой зоны при холодовом воздействии вполне можно объяснить с позиции их физиологического действия. Во-первых, эти гормоны, запуская процессы глюконеогенеза и расщепления триглицеридов, что приводит к повышению в крови уровня глюкозы и свободных жирных кислот [Jungermann K., Mohler H., 1980], обеспечивают организм энергетическим материалом. Другой важной функцией глюкокортикоидов является выполнение пермиссивной роли в действии катехоламинов на гладкую мускулатуру сосудов [Шмидт Р., Тевс Г., 1996], что наряду с минералокортикоидной функцией способствует повышению артериального давления. В результате повышения сосудистого тонуса происходит перераспределение кровотока с увеличением поступления крови, богатой кислородом и питательными веществами к жизненно важным органам. При летальном исходе гипотермии морфофункциональная активность пучковой зоны оказывается сниженной, о чем свидетельствует статистически значимое уменьшение размеров ядер секреторных клеток пучковой зоны, хотя кровенаполнение остается повышенным.

Обнаруженное повышение активности сетчатой зоны при воздействии «мягкого» стрессора (-10 С), подтвержденное кариометрическим и гистохимическим исследованиями, на первый взгляд противоречит некоторым литературным данным [Akwa Y., Young J. et al., 1991; Orchinik M., McEwen K., 1993; Обут Т. А., 1998], утверждающим, что эндогенная активация сетчатой зоны коры надпочечников наблюдается только при хроническом, а не при остром стрессорном воздействии. Однако в проведённом исследовании атмосферная температура -10 С вызывала постепенное нарастание активности пучковой зоны, что, несомненно, влекло увеличение выброса в сосудистое русло вырабатываемых ее секреторными клетками глюкокортикоидов. Кроме того, учитывая, что половые гормоны участвуют в метаболизме белков и жиров, специфика которого составляет биохимическую основу для формирования холодовой адаптации [Шварева Н. В., 1992], роль половых гормонов в относительно краткосрочных адаптивных реакциях [Чепурненко Н. Б. и др., 1983; Шварева Н. В., 1988] можно считать доказанной. Также половые гормоны обладают вазоактивным действием [Караченцев А. Н., Сергеев П. В., 1997] и, возможно, совместно с альдостероном клубочковой зоны и катехоламинами мозгового вещества представляют механизм эффективной поддержки артериального давления, так как при гипотермии с течением времени неизбежно развивается гипотония [Mitsuki I., 1960]. Даже у погибших от переохлаждения зарегистрированы признаки, свидетельствующие о повышении морфофункциональной активности сетчатой зоны в виде увеличения кровенаполнения (величина этого признака наибольшая среди исследуемых групп), а также увеличения по сравнению с контролем размеров ядер составляющих ее адренокортикоцитов.

Различный темп нарастания в динамике гипотермии положительного морфофункционального ответа коры надпочечников, вероятно, связан с силой воздействующего фактора. Чем сильнее стрессор, тем активнее и быстрее даст ответ стрессируемый орган. Однако это может привести и к более быстрому истощению. Подтверждением начинающегося истощения адаптивных возможностей является обнаружение в конечных экспериментальных точках воздействия низкой температурой -18 С в секреторных клетках сетчатой зоны обоих надпочечников липофусцина. Положительная корреляционная взаимосвязь содержания «пигмента старения» с длительностью воздействия низкой температуры указывает на развитие напряженного адаптивного ответа на выраженный по силе стрессор, что согласуется с литературными данными о прямой взаимосвязи выраженности липофусциноза и силы стрессорного воздействия [Рыжавский Б. Я., 1992].

Участие эндокриноцитов мозгового вещества в защитной реакции организма на охлаждение при температуре-10 С и -18 С морфологически подтверждается уменьшением по сравнению с контролем объема их цитоплазмы, количества и размеров вакуолей с параллельным увеличением кровенаполнения мозгового вещества обоих надпочечников. Это, скорее всего, обусловлено резким снижением в клетках количества катехоламинов [Tigyi А., Puppy А., Lissak К., 1959] и выделением их в кровеносное русло. Известно, что повышение секреции катехоламинов является важным фактором поддержания температуры тела в условиях холода. Именно катехоламины обеспечивают быструю мобилизацию углеводов из депо для несократительного термогенеза [Майстрах Е. В., 1975].

Особого рассмотрения заслуживает эффект комбинированного действия алкоголя и низкой температуры. Если на секционном материале можно было выделить группы погибших от отравления этанолом или действия низкой температуры трезвыми, то на экспериментальном материале, наоборот, за исследуемый период времени - 8 часов - ни одно животное не только не погибло от изолированного действия алкогольной интоксикации или низкой температуры, но даже и не имело тенденции к наступлению летального исхода. Алкоголизированные крысы даже при введении этанола в дозе 8 мл/кг уже к 7 часам пришли в чувство и до конца наблюдения проявляли полноценную двигательную активность. Подвергнутые действию холода весь период наблюдения были в сознании, но двигательную активность не проявляли, постоянно находились в сгруппированном состоянии с поджатым хвостом и взъерошенной шерстью, дрожали. Аналогичные поведенческие реакции проявляли крысы, подвергнутые действию холода -10 С и -18 С при предварительном введении доз этанола 2 и 4 мл/кг. Лишь единичных животных в конце наблюдаемого периода постиг летальный исход. Комбинация алкогольной интоксикации при введении 8 мл/кг этанола и холодового воздействия -10 С и -18 С проявила максимальный танатогенный эффект - ни одно животное не дожило до 5-часовой отметки.

Чем же отличаются морфологические изменения надпочечников при комбинированном действии стрессоров? Несомненно, морфологические параметры, отражающие усиление морфофункциональной активности надпочечников в динамике воздействия комбинации стрессоров, те же самые, что и в динамике изолированного: усиление кровенаполнения, увеличение размеров ядер эндокриноцитов, изменение содержания в цитоплазме секреторных клеток суданофильных липидов, митохондрий. Однако, в действии алкогольной интоксикации и холода есть принципиальное хронологическое различие: после введения этанол всасывается из желудочно-кишечного тракта, при этом его концентрация в крови нарастает, утяжеляя алкогольное опьянение. Сразу же начинается элиминация этанола, которая после достижения пика концентрации в крови начинает преобладать над процессами всасывания. Низкая же температура начинает свое действие сразу с такой же силой, как и к окончанию наблюдения. И от действия этого фактора организм никакими путями избавиться не может. Единственным выходом продления жизнедеятельности является приспособление к вновь возникшим условиям. Если этанол сразу после поступления в кровь может оказывать на надпочечники прямое действие, то низкая температура - нет. Для формирования морфологических изменений адреналовых желез и тот и другой стрессор в первую очередь должны оказывать влияние на механизмы регуляции их деятельности. При этом холод и алкогольная интоксикация являются стрессорами разнородными, и могут воздействовать на различные чувствительные системы организма по-разному. Реализация такого разнородного влияния логично должна приводить к различным физиологическим эффектам надпочечников.

Комбинация охлаждения при -10 С и -18 С и алкогольной интоксикации при введении этанола в дозе 2 мл/кг в динамике воздействия практически не отличается от изолированного действия холодового фактора соответствующей силы по направленности и количественным значениям признаков, отражающих состояние надпочечников.

Комбинация охлаждения при -10 С и -18 С и алкогольной интоксикации при введении этанола в дозе 4 мл/кг приводит к изменениям количественных значений параметров морфофункционального состояния надпочечников практически идентичным по выраженности и направленности тем, которые развиваются при изолированном действии стрессоров. При этом летальной данная комбинация внешних воздействий оказывается также как и при введении этанола в дозе 2 мл/кг лишь для единичных животных в конце периода наблюдения.

При комбинации охлаждения при -10 С и -18 С и алкогольной интоксикации при введении дозы этанола 8 мл/кг такие параметры морфофункционального состояния как кровенаполнение зон и размеры ядер эндокриноцитов достигают высоких значений, сопоставимых со значениями при меньших дозах введенного этанола к окончанию 7-часового периода наблюдения, уже к трем часам воздействия (до 5-часовой экспериментальной точки ни одно животное не дожило), что свидетельствует о большей скорости нарастания морфофункциональной активности надпочечников при комбинации более сильных воздействий. При этом уменьшение содержания липидов в цитоплазме секреторных клеток центрального отдела пучковой зоны, а также увеличение доли ядра к 3 часу комбинированного воздействия успевает развиться только при действии температуры -18 С. Доля митохондрий в клетках увеличивается значимо по сравнению с контролем и при -10 С и при -18 С.

При летальном исходе комбинированного воздействия на экспериментальном материале выявлено увеличение кровенаполнения всех морфофункциональных зон левого и правого надпочечников, за исключением клубочковой, увеличение размеров ядер адренокортикоцитов все зон, что свидетельствует о напряженном функционировании желез, доля митохондрий и ядра значимо увеличена по сравнению с контролем.

На секционном материале у погибших от переохлаждения на фоне алкогольной интоксикации выявлены признаки, которые можно расценить как отражающие гипофункцию соответствующих зон: уменьшение размеров ядер адренокортикоцитов клубочковой и пучковой зон левого и правого надпочечников по сравнению с контролем. При этом ядра секреторных клеток клубочковой зоны больше, чем у погибших от травмы в состоянии алкогольного опьянения и от отравления этанолом. Это может свидетельствовать о том, что гипотермия и алкогольная интоксикация по-разному влияют на активность гломерулярных адренокортикоцитов, а эффект комбинированного действия «суммируется». Ядра секреторных клеток сетчатой зоны обеих желез значимо больше, чем у погибших от отравления этанолом. В этом показателе реакция зоны аналогична реакции на действие только гипотермии или несмертельной алкогольной интоксикации.

Следует отметить, что на секционном материале, в отличие от экспериментального, стало возможным выявление различий между группами по весовым параметрам надпочечников. Если несмертельная алкогольная интоксикация приводит к увеличению массы мозгового вещества левого и правого надпочечников, то масса коркового снижается. Смертельная алкогольная интоксикация не приводит к появлению различий по массе коркового и мозгового вещества левой или правой желез с чистым контролем. Однако, по сравнению с погибшими от травмы на фоне АИ, масса коркового вещества выше, а мозгового вещества - ниже. По сравнению с погибшими от переохлаждения трезвыми соотношения масс аналогичные за исключением мозгового вещества правого надпочечника. Интересные изменения массы коркового и мозгового вещества выявлены у погибших от переохлаждения на фоне АИ. По сравнению с чистым контролем выявлено лишь увеличение массы мозгового вещества правого надпочечника на 21,5 %. По сравнению с погибшими от холода трезвыми за счет уменьшения массы коркового вещества правого надпочечника у последних у погибших на фоне АИ выше масса коркового вещества правого и обоих надпочечников, а также масса правого и обоих надпочечников. Подобное различие масс коркового и мозгового вещества привело к межгрупповым различиям и их соотношений. По сравнению с погибшими от отравления этанолом у погибших от переохлаждения в состоянии алкогольного опьянения масса мозгового вещества правой и обеих желез больше, что наряду с изменившимися соотношениями масс коркового и мозгового вещества в этих группах может быть использовано для дифференциальной диагностики причины смерти.

Важным аспектом, отражающим морфофункциональные изменения надпочечников при изучаемых воздействиях является зависимость состояния желез от параметров, характеризующих алкогольную интоксикацию, главным из которых является концентрация этанола в крови. Как показали результаты корреляционного анализа (таблица 2), наибольшее влияние степень этанолемии оказывает на состояние надпочечников при АИ, вызванной введением этанола в дозах 2 и 8 мл/кг, а также в динамике комбинированного воздействия атмосферной температуры -18 С и АИ при введении этанола в дозе 8 мл/кг.

Таблица 2. Количество корреляционных взаимосвязей параметров морфофункционального состояния надпочечников с концентрацией этанола в крови

У мужчин, погибших от различных причин, наибольшее число корреляций выявлено при монодействии АИ. Действие низкой температуры на фоне АИ приводит к уменьшению зависимости состояния надпочечников от концентрации этанола в крови, а при введении дозы этанола 2 мл/кг - зависимость исчезает. Наиболее вероятной причиной этого является использование этанола как источника энергии для поддержания постоянной температуры тела при продолжающемся действии холода. В таких случаях концентрация этанола в крови не отражает истинной степени опьянения [Югов К. М., Исаев Ю. С., 2000, 2004; Алексеев И. В., Зайцев А. П., Исаев Ю. С., Проскурин В. И., Югов К. М., 2006].