Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.00.11 - кожные и венерические болезни

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ В РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ АУТОИММУННЫХ БУЛЛЕЗНЫХ ДЕРМАТОЗОВ

МАХНЕВА Н.В.

Москва - 2009

Работа выполнена в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии

Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского и лаборатории трансплантационной иммунологии ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор Молочков Владимир Алексеевич

Доктор медицинских наук, профессор Белецкая Людмила Вячеславовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Кочергин Николай Георгиевич

Доктор медицинских наук, профессор Бутов Юрий Сергеевич

Доктор медицинских наук, профессор Резайкина Анна Васильевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита состоится «____»__________ 2009 г. в _____ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.115.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУ «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий»

107076 г. Москва, ул. Короленко, д. 3, корп. 4

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий»

Автореферат разослан «____»__________ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат медицинских наук Иванова Наталья Константиновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

За последние три-четыре десятилетия накоплены фундаментальные знания по поводу клиники и иммунопатологии аутоиммунных буллезных дерматозов. Несмотря на достигнутые успехи, изучение патогенеза этих дерматозов на уровне молекулярно-биологических исследований остается одной из важных проблем в дерматологии и в настоящее время. Это связано с необходимостью преодоления развития таких тяжких, порой угрожающих жизни, заболеваний как аутоиммунная пузырчатка, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз.

Современная медицина обладает целым рядом эффективных средств, позволяющих успешно подавлять развитие иммунопатологического процесса при аутоиммунных состояниях [Уоллис Д. и др., 2000; Hertl M., 2005; Laffitte E., Borradori L., 2005; Schmidt E. et al., 2006]. Однако те же средства обладают нередко побочным действием, нарушающим функцию ряда физиологических систем организма. К ним, в частности, относятся кортикостероиды, азатиоприн, метотрексат, циклоспорин. Принцип лечения аутоиммунных заболеваний, при которых одним из основных патогенетических факторов являются аутоантитела, направленные к антигенам тканевых структур, сходен для многих аутоиммунных заболеваний. Однако разные формы патологии, включая аутоиммунные буллезные дерматозы, требуют различные схемы лечения, в частности разные дозировки, назначаемых препаратов. Учитывая возможные осложнения, необходимо подбирать оптимальные дозы, позволяющие достигать терапевтического эффекта, не нанося вред организму больного. Оптимальные дозы препаратов при таких заболеваниях как истинная пузырчатка, буллезный пемфигоид, приобретенный буллезный эпидермолиз и линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, также как и схемы их лечения, значительно отличаются друг от друга [Bystryn J-C., Rudolph J.L., 2005; Hertl M., 2005], в связи с чем необходима тщательная дифференциальная диагностика.

Нередко клиническое сходство буллезных дерматозов, а порой и атипичные их проявления на ранних этапах развития патологического процесса с сомнительными результатами феномена Никольского не позволяют клиницисту у постели больного поставить с уверенностью клинический диагноз. Существующие данные [Цветкова Г.М. и др., 2003; Mihai S., Sitaru C., 2007] свидетельствуют о том, что применение гистологических и ряда иммунологических методов, в том числе метода меченых антител, в дополнение к клиническому обследованию, во многих случаях позволяет уточнить диагноз. Полученные нами результаты подтверждают эти наблюдения [Белецкая Л.В., Махнева Н.В., 2000]. Однако и эти методы имеют свои ограничения. Так, гистологическое исследование на основании определения уровня образования пузыря способствует диагностике и дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов только между различными их группами, такими как группа пузырчатки и группа буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения, но затрудняет проведению дифференциальной диагностики среди буллезных дерматозов одной группы, таких как буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз [Eming R., Hertl M., 2006]. Сложности могут возникнуть и при использовании методов прямой и непрямой иммунофлюоресценции [Millns J.L. et al., 1980; Coscia-Porzzi L. et al., 1985; Махнева Н.В., Белецкая Л.В., 2007]. Это требует дополнительных методов диагностики.

Разнообразие клинических проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов и поиск новых методов терапии заставляет специалистов продолжать исследования по изучению механизмов и факторов, способствующих как проявлению в латентной форме заболевания, так и развитию этих буллезных дерматозов de novo. Исследования по изучению молекулярно-биологической структуры кожи (система межклеточного и дермо-эпидермального соединений, белки поверхности кератиноцитов и десмосом) позволяют более полно выяснить состояние различных белковых структур и клеточных элементов кожи при различных аутоиммунных буллезных дерматозах. Известно, что молекулы адгезии вовлечены во все физиологические процессы, обеспечивая функциональную целостность кожи. В кожной патологии некоторые молекулы адгезии выступают в качестве мишеней для аутоиммунных антител, например, при пузырчатке, а другие страдают опосредованно - как при буллезном пемфигоиде [Kitajima Y., 2002; Koeser J. Et al., 2003; Getsios S. et al., 2004]. До сих пор дискутируется роль системы комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов [Dubelsteen E., 1998; Yancey K.B., 2005; Leighty L. et al., 2007].

Принимая во внимание возможность участия самых различных молекулярно-биологических механизмов, эта проблема нуждается в дальнейшем изучении и развитии. При этом целесообразно изучение клинико-морфологических особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов конкретно больных дерматозами в Московской области. В процессе исследования клинико-патогенетических особенностей буллезных дерматозов следует изучить: влияние величины титров циркулирующих аутоантител и степени интенсивности фиксации иммунных комплексов на течение аутоиммунных буллезных дерматозов; участие ранних компонентов комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов; степень экспрессии некоторых антигенов десмосом и цитоскелета как показателя характера поражения эпидермиса. Поскольку предметом исследований является патология, связанная с нарушениями в иммунной системе (аутоиммунные процессы) необходима оценка экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA I и II классов) на клетках тканей кожи, как одного из показателей участия антигенов гистосовместимости в развитии изучаемой патологии. Использование иммуногистохимических методов с целью изучения некоторых сторон патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов и антигенной структуры эпидермиса в норме и при патологии способствуют разработке дополнительных методов диагностики и тактики ведения больных.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение клинико-морфологических и иммунологических особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов на примере больных Московской области и совершенствование способа их ранней диагностики и лечения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить клинико-морфологические особенности аутоиммунных буллезных дерматозов, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз на современном этапе.

2. Научно обосновать сущность возникновения симптома Никольского с точки зрения иммунопатологии и оценить его прогностическую ценность при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.

3. Изучить роль и влияние циркулирующих аутоантител и фиксированных иммунных комплексов на течение аутоиммунных буллезных дерматозов.

4. Исследовать участие ранних компонентов комплемента (C4, C4d, C3) в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов.

5. Определить степень экспрессии некоторых антигенов десмосом (десмосомальный протеин, кадгериновый комплекс) и цитоскелета (цитокератин 5) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

6. Изучить экспрессию некоторых антигенов базальной мембраны эпидермиса (коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

7. Провести оценку экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA I и II классов) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

8. Разработать на основе полученной молекулярно-биологической характеристики состояния различных структур тканей кожи схему детального иммуноморфологического анализа биопсии кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами с использованием моноклональных и поликлональных антител к белкам тканевых структур (кадгерины, десмосомальный протеин десмоплакин, цитокератин 5, коллаген IV типа, протеиновый комплекс основного вещества базальной мембраны lamina densa, HLA I класса и HLA-DR антигены).

9. Разработать алгоритм ранней диагностики и контроля эффективности лечения аутоиммунных буллезных дерматозов.

2. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. На современном этапе в регионе Московской области выявлена следующая закономерность распространения аутоиммунных буллезных дерматозов. Среди 267 больных аутоиммунными буллезными дерматозами 61,4% составили больные, страдающие аутоиммунной пузырчаткой, 33,3% - буллезным пемфигоидом, 3,4% - приобретенным буллезным эпидермолизом и 1,9% - линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом. При этом у 6% больных из 267 выявлен аутоиммунный буллезный дерматоз, протекающий на фоне неоплазии (паранеопластическая пузырчатка - 62,5%, буллезный пемфигоид - 25% и приобретенный буллезный эпидермолиз - 12,5%).

2. При аутоиммунных буллезных дерматозах патогенетическую роль могут играть аутоантитела, относящиеся к иммуноглобулинам классов G и/или А, и иммунные комплексы в растворимой и нерастворимой формах. При этом мишенями могут быть не только специфические антигены, характерные для определенной группы буллезного дерматоза, но и антигены ряда других структур органов и тканей. Наличие такого широкого спектра антител к различным антигенам-мишеням объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, например, в частности при паранеопластической пузырчатке.

3. Установлен факт участия ранних компонентов комплемента как в местах локализации антител, так и вне зоны антигенов-мишеней. При этом С4d как наиболее стойкий компонент комплемента может служить дополнительным маркером гуморального ответа в оценке патологического процесса.

4. Наличие симптома Никольского (механическая отслойка эпидермиса) как одного из первых «инструментов» в диагностике аутоиммунной пузырчатки (71,9%) в случаях буллезного пемфигоида (3,4%) и приобретенного буллезного эпидермолиза (66,7%) обуловлено вовлечением в патологических процесс системы десмосомального аппарата.

5. Получена с помощью моноклональных и поликлональных антител к ряду антигенов кожи (кадгериновый комплекс, десмосомальный протеин, цитокератин 5, коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa, антигены главного комплекса гистосовместимости) дополнительная молекулярно-биологическая характеристика изменений в коже при аутоиммунных буллезных дерматозах. Это позволило оценить глубину происходящих иммунопатологических процессов, эффективность проводимой терапии, а в ряде случаев получить дополнительный диагностический способ при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Ш Разработан алгоритм включения методов дифференциальной диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов: клинические проявления с определением симптома Никольского; цитологический метод с выявлением акантолитических клеток (клетки Тцанка); гистологический метод с определением уровня образования пузыря; иммунологический и иммуногистохимический методы исследования с определением наличия в сыворотке крови больных аутоантител и фиксированных иммунных комплексов в тканях; определение степени экспрессии ряда белковых компонентов в тканях.

Ш Для дополнительной характеристики иммунопатологического процесса при аутоиммунных буллезных дерматозах использован молекулярно-биологический подход с применением антител к антигенам тканевых структур кожи.

Ш Впервые детально изучена значимость вовлечения циркулирующих аутоантител, фиксированных иммунных комплексов и ранних компонентов комплемента и их взаимосвязь с особенностями клинического течения ряда аутоиммунных буллезных дерматозов.

Ш Впервые проведена оценка клинической специфичности и патогенеза симптома Никольского у больных, страдающих различными аутоиммунными буллезными дерматозами, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предлагаемый комплекс иммунологических и иммуноморфологических исследований для получения дополнительных сведений о патологических процессах, происходящих при аутоиммунных буллезных дерматозах, с целью установления и/или уточнения их диагноза будет способствовать назначению адекватной терапии (с учетом патогенетических механизмов) и оценки степени ее эффективности.

ВНЕДРЕНИЕ РАБОТЫ

Результаты работы внедрены в практику отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, на кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ, на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М.Сеченова, Московского областного кожно-венерологического диспансера. Опубликованы: монография «Меченые антитела в нормальной и патологической морфологии» (М., 2000); медицинская технология «Метод стабилизации растворимых иммунных комплексов в биоптатах кожи больных буллезными дерматозами» (Москва, 2008 г.). Получен патент № 2097768 на изобретение «Способ диагностики пузырчатки» от 27.11.1997 г. Получено решение о выдаче патента на изобретение № 2008108389/15 (009070) «Способ диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов» от 27.10.2008. В ФИПС подана заявка № 2008144767 на изобретение «Способ прогнозирования возможности изменения клинической формы пузырчатки» от 13.11.2008.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Диссертация апробирована на научной конференции сотрудников отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии, кафедры дерматовенерологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, кафедры кожных и венерических болезней ФППО ММА им. И.М. Сеченова. Материалы диссертации доложены на VII Российском съезде дерматовенерологов (Россия, Казань, 1996 г.), VIII, IX и X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Россия, Москва, 2001, 2005 и 2008 г.г.), научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИКВИ (Россия, Москва, 1996 г.), научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматоонкологии. Новые лекарственные препараты в практике дерматовенерологии» (Россия, Москва, 2002 г.), IV международной конференции «Экспериментальная и клиническая медицина» (Грузия, Тбилиси, 2002 г.), Первом Российском конгрессе дерматовенерологов (Россия, Санкт-Петербург, 2003 г.), конференции, посвященной памяти Машкиллейсона Асафа Львовича (Россия, Москва, 2004, 2008 г.г.), научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи» (Россия, Москва, 2006 г.), VI-VII научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика» (Россия, Москва, 2006 и 2008 г.г.), XIII-XIV-XV Российском национальном конгрессе «Человека и лекарство» (Россия, Москва, 2006, 2007 и 2008 г.г.), научно-практических конференциях «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» (Россия, Москва, 2007 и 2008 г.г.), II Форуме Национального Альянса дерматологов и косметологов (Россия, Ростов-на-Дону, 2008 г.), I Международном Форуме медицины и красоты (Россия, Москва, 2008 г.).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе 1 монография.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 357 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 85 рисунками, заключающими в себе 231 микрофотографию.

Библиографический указатель включает 125 отечественных и 831 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на основании клинического обследования и изучения биопсийного материала больных аутоиммунными буллезными дерматозами. За период с 1992 по 2006 год установлен первичный диагноз буллезного дерматоза аутоиммунного происхождения 267 больным, из них 164 больным диагносцирована аутоиммунная пузырчатка (вульгарная, вегетирующая, листовидная, себорейная, паранеопластическая), 89 больным - буллезный пемфигоид, 5 больным - линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и 9 больным - приобретенный буллезный эпидермолиз. Обследование больных проводилось в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии ГУ МОНИКИ (Московский областной научно-исследовательский клинический институт) им. И.М.Владимирского, в Московском областном кожно-венерологическом диспансере (МОКВД) и ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (лаборатория трансплантационной иммунологии).

В каждом случае диагноз заболевания ставился на основании анамнестических сведений, клинической картины с определением симптома Никольского, результатов цитологического, патоморфологического, иммунологического и иммуноморфологического исследований.

Цитологическое и патоморфологическое исследования проводились в лаборатории МОКВД и в отделении патоморфологии ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, соответственно. Иммунологические и иммуноморфологические исследования проведены лично автором на базе лаборатории трансплантационной иммунологии ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (с 1988 по 2004 год заведующая, к.б.н. Баранова Ф.С.; в настоящее время заведуюший, к.м.н. Абрамов В.Ю.).

Метод определения симптома Никольского и оценка его чувствительности, специфичности и прогностической ценности для постановки клинического диагноза. Симптом Никольского вызывался стандартным способом [Глухенький Б.Т., С.А.Грандо, 1990]. При этом использовали две его модификации: «прямой» и «краевой» (маргинальный). В первом случае отслойка верхних слоев эпидермиса возникала на видимо «здоровой» коже при легком скользящем трении пальцем по ней. Во втором - при потягивании за обрывок покрышки пузыря отслойка эпителия происходила за пределы зоны поражения в виде постепенно суживающейся ленты по направлению к видимо здоровой коже. Необходимо отметить, что у всех обследуемых 267 больных симптом Никольского определялся в активной стадии патологического процесса до назначения глюкокортикостероидной и иммуносупрессивной терапии.

С целью определения специфичности, чувствительности и прогностической ценности симптома Никольского в диагностике пузырчатки учитывался ряд параметров, ранее предложенных S.Uzun и М. Durdu [Uzun S., Durdu M., 2006] - 1) чувствительность (истинно положительный/ (истинно положительный + ложноотрицательный); 2) специфичность (истинно отрицательный/истинно отрицательный + ложноположительный); 3) положительная прогностическая ценность (истинно положительный/ истинно положительный + ложноположительный) и 4) отрицательная прогностическая ценность (истинная отрицательная/(истинно отрицательная + ложноотрицательная).

Истинно положительным результат признавался при положительном симптоме Никольского у больных аутоиммунной пузырчаткой; ложноположительным - при положительном симптоме Никольского у больных буллезным пемфигоидом, линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и приобретенным буллезным эпидермолизом; истинно отрицательным результат - при отрицательном симптоме Никольского у больных с буллезным пемфигоидом, линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и приобретенным буллезным эпидермолизом; ложноотрицательным - у больных пузырчаткой с отрицательным симптомом Никольского.

Метод выявления циркулирующих аутоантител. Метод непрямой иммунофлюоресценции при исследовании циркулирующих в крови больных аутоантител был использован в принятой форме [Белецкая Л.В., Данилова Т.А., 1977; Beutner E.H., Jordon R.E., 1964]. При изучении циркулирующих в крови антител криостатные срезы готовили из тканей кожи человека и ряда видов лабораторных животных (мыши, крысы, кролики, обезьяны), так как аутоантитела при акантолитической пузырчатке и буллезном пемфигоиде направлены к тканеспецифическим антигенам, имеющимся в органах большинства видов животных класса млекопитающих [Koch H., Schaller J., Haustein U.F., 1992]. Различия в реакциях на срезах тканей разных видов животных носили лишь количественный характер. Наиболее чувствительными в наших опытах оказались ткани губы крысы и пищевода кролика. Криостатные нефиксированные срезы толщиной 5 мкм тщательно промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), рН 7,0-7,4, в течение 10 мин, затем срезы сначала обрабатывали исследуемой (промежуточной) немеченной сывороткой. Эту сыворотку применяли в максимально большом числе разведений. Учитывали самое большое разведение, которое давало четкую положительную реакцию. Обработку срезов проводили во влажной камере при комнатной температуре в течение 45-60 мин. Далее срезы промывали в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,4), обрабатывали меченой сывороткой против иммуноглобулина (Ig) человека класса G в течение 30 мин, вновь промывали 3-5 мин PBS и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Одновременно ставили положительный и отрицательный контроли. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку (человека или животного) в тех же разведениях и инкубировали на срезе столько же времени, как и испытуемую сыворотку, содержащую антитела. В качестве положительного контроля использовали сыворотку, содержащую антитела против изучаемого антигена.

Первичная обработка биопсийного материала. Под местной анестезией 2,0% раствором новокаина проводилась биопсия кожи (из пораженных и клинически непораженных участков) размером 0,3 х 0,5 см. Кусочки тканей кожи замораживали при минус 20?С. Срезы толщиной 4-5 мкм готовили в криостате (минус 20?С) и использовали часть серийных срезов в нефиксированном виде. Часть криостатных серийных срезов, фиксированных 96? этанолом, окрашивали гематоксилином и эозином с целью морфологического контроля.

Метод выявления фиксированных антител (иммуноглобулинов) и полных иммунных комплексов. Применяли классические методы прямой и непрямой иммунофлюоресценции [Белецкая Л.В., Данилова Т.А., 1977; Beutner E., Chorzelski T.P. et al., 1973] с использованием моноспецифических люминесцирующих сывороток против IgG, IgA, IgM (НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва), люминесцирующих сывороток против С4 и С3 компонентов комплемента (НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН РФ; CHEMICON, Австралия), моноклональных антител против C4d компонента комплемента (QUIDEL, США) и сыворотки против фибриноген/фибрин (DAKO CYTOMATION, Дания).

Серийные криостатные срезы помещали на предметное стекло, подсушивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывали РВS (рН 7,0-7,4) в течение 3-5 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывали люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против IgG, IgМ, IgА и С3 компонента комплемента в течение 30 мин (метод прямой иммунофлюоресценции). С4 и С4d компоненты комплемента выявляли методом непрямой иммунофлюоресценции. После нанесения антител срезы оставляли на 45 мин при комнатной температуре или на ночь при температуре 4?С, промывали PBS (3-5 мин) и обрабатывали 30 мин люминесцирующими антителами к Ig кролика или мышей (ИМТЕК, Москва), соответственно. Затем вновь промывали РВS в течение 3-5 мин и заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. С целью предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляли пара-фенилендиамин [Лейси А., 1992]. Для контроля одновременно проводили изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином в световом микроскопе.

Мониторинг экспрессии некоторых белков кожи при аутоиммунных буллезных дерматозах осуществлялся с помощью методов непрямой иммунофлюоресценции и ферментной метки с использованием моноклональных или поликлональных антител (табл. 1). В непрямой иммунофлюоресценции применяли люминесцирующие сыворотки против иммуноглобулинов мыши или кролика (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва). В методе ферментной метки - сыворотки против иммуноглобулинов мыши или кролика, меченные пероксидазой (ИМТЕК, Москва).

Серийные криостатные срезы толщиной 4-5 мкм готовили в криостате (минус 20?С) и использовали в нефиксированном или фиксированном виде (см. табл. 1). Подсушивали, промывали PBS (pH 7,0-7,5) в течение 3-5 мин с

Таблица 1. Некоторые белки кожи (антигены-мишени) и условия их выявления

Примечание: МкАТ - моноклональные антитела; ПкАТ - поликлональные антитела. 1) - мышиные антитела; 2) - кроличьи антитела

* - МкАТ любезно предоставлены Э.И. Дробышевской последующим нанесением антител на срезы. После каждой инкубации препараты промывали в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,5), подсушивали и при использовании метода непрямой иммунофлюоресценции заключали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Исследовали препараты с помощью люминесцентного микроскопа LABORLUX фирмы LEIKA с объективом х 40.

При использовании метода ферментной метки после инкубации препаратов с сывороткой, меченной пероксидазой, промывали в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,5), подсушивали и наносили свежеприготовленный раствор 3,3-диаминобензидина - DAB (SIGMA, США) на 10-15 мин. Затем вновь промывали в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,5) и наносили для усиления окрашивания 0,5% раствор осмия на 30 сек с последующей промывкой в течение 2-4 мин PBS (pH 7,0-7,5) и в течение 1 мин дистиллированной водой. Далее срезы докрашивали 1% раствором альциановым синим или гематоксилином и эозином и заключали под покровное стекло в канадский бальзам. Препараты изучали в световом микроскопе (МИКРОМЕД-2, Санкт-Петербург).

Статистическая обработка. Статистическая обработка полученных данных проведена на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Office Excel 2003», «БИОСТАТ», «Statistica 6.0 for Windows».

Результаты представлены в абсолютных значениях и относительных частотах. В ходе работы были составлены таблицы сопряжения (частотные таблицы), результаты которых обрабатывали с помощью статистического анализа категорированных данных. Для выявления различий между группами использовали критерий І и точный критерий Фишера с построением четырехпольных таблиц. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.

Применяли также корреляционный анализ по Пирсону. При анализе корреляции симптома Никольского с отложениями иммунных комплексов в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами считали ее незначимой при значении модуля коэффициента корреляции от 0 до 0,3; значимой - от 0,3 до 0,75; высокой - выше 0,75.

Для выявления зависимости клинической формы пузырчатки от локализации иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах и степенью интенсивности иммунофлюоресцентной реакции использовали однофакторный анализ с расчетом коэффициента корреляции (r) и его уровня значимости (p).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Аутоиммунные буллезные дерматозы - это хронические заболевания, связанные с иммунным ответом против собственных структурных белковых компонентов, которые участвуют в поддержании межклеточных и клеточно-матриксных контактов (адгезия) многослойного плоского эпителия.

На основании клинических, гистопатологических и иммунопатологических критериев, аутоиммунные буллезные дерматозы делят на три группы - пузырчатка, буллезный пемфигоид и приобретенный буллезный эпидермолиз [Eming R., Hertl M., 2006]. Однако такое деление аутоиммунных буллезных дерматозов условно, т.к. и до настоящего времени продолжаются поиски по изучению их патогенетических механизмов на молекулярно-биологическом уровне.

Группа аутоиммунной пузырчатки включает в себя угрожающие жизни буллезные дерматозы, характеризующиеся образованием внутриэпидермального пузыря в результате потери адгезии кератиноцитов, и ассоциируется с аутоантителами к антигенам десмосом (система межклеточных соединений или межклеточная субстанция по старой терминологии). Буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз характеризуются наличием субэпидермального пузыря в результате потери прикрепления кератиноцитов базального слоя к базальной мембране и ассоциируется с отложениями иммунных комплексов в зоне базальной мембраны или дермо-эпидермальном соединении. Патогенетическая роль аутоантител, уже доказанная клиническими наблюдениями, окончательно подтверждена и продемонстрирована экспериментально. Эти аутоантитела обладают высокой тканевой специфичностью и относятся к классу иммуноглобулинов G и/или А. Антигенами-мишенями при этом являются различные молекулы десмосомального аппарата (кадгерины, плакины) и белковые компоненты базальной мембраны эпидермиса (молекулы полудесмосом, ламинины, коллаген VII типа) при аутоиммунной пузырчатке и аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения, соответственно.

Учитывая разнообразие клинических и нередко атипичных форм проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов, клиницисты все чаще сталкиваются с необходимостью использования дополнительных методов исследования для постановки точного диагноза, а также дифференциальной диагностики с целью назначения адекватных схем лечения. Благодаря изучению аутоиммунных буллезных дерматозов на молекулярно-биологическом уровне стало возможным более широкое и углубленное исследование патогенеза этих заболеваний на современном этапе и расширение практических клинических знаний. Учитывая выше отмеченное, мы провели оценку чувствительности и специфичности клинического симптома Никольского, а также методов иммунофлюоресценции как наиболее перспективных методов диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов. На молекулярно-биологическом уровне с использованием специфических поликлональных и моноклональных антител к антигенам различных структур многослойного плоского эпителия были изучены некоторые стороны патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов и тем самым найдены дополнительные маркеры, позволяющие провести их дифференциальную диагностику при поэтапном обследовании больного.

Работа выполнена на базе данных клинического обследования и изучения биопсийного материала 267 больных аутоиммунными буллезными дерматозами, из них 164 больных аутоиммунной пузырчаткой, 89 - буллезным пемфигоидом, 5 - линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и 9 - приобретенным буллезным эпидермолизом. Каждое заболевание служило контролем по отношению друг к другу. Многолетняя динамика заболеваемости (1992-2006 г.г.) в Московской области продемонстрировала устойчивую тенденцию к постепенному увеличению роста числа больных аутоиммунными буллезными дерматозами (рис. 1).

Рисунок 1. Многолетняя динамика общей заболеваемости аутоиммунными буллезными дерматозами на основе календарных лет.

Основную группу из них составляли больные с аутоиммунной пузырчаткой (61,4%) и буллезным пемфигоидом (33,3%). Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз (1,9%) и приобретенный буллезный эпидермолиз (3,4%) диагносцировались крайне редко (рис.2).

Среди больных, страдающих аутоиммунными буллезными дерматозами, были как мужчины, так и женщины в возрасте от 18 до 87 лет (средний возраст 61,8±14,5 лет). Женщины страдали чаще, чем мужчины (соотношение женщин к мужчинам составляет 2,5:1). При этом пик заболеваемости у женщин приходился на возраст от 61 года до 70 лет, а у мужчин - от 51 года до 60 лет (рис. 3).

Рисунок 2. Процентное соотношение аутоиммунных буллезных дерматозов по отношению друг к другу.

Рисунок 3. Заболеваемость аутоиммунными буллезными дерматозами среди мужчин и женщин с учетом возрастных категорий.

Среди факторов, способствующих развитию аутоиммунных буллезных дерматозов, отмечены избыточная инсоляция (26,6%), стрессовые ситуации (22,1%) и прием лекарственных препаратов, в том числе и антибиотиков (17,2%). Учитывая, что одним из провоцирующих факторов возникновения данной патологии может быть неоплазия, всем больным было проведено комплексное обследование. Сочетание буллезного дерматоза на фоне неопластического процесса было выявлено у 16 (6%) больных из 267. При этом в структуре аутоиммунной пузырчатки частота сочетания с неоплазией составила 6,1% (рис. 4), буллезного пемфигоида - 4,5% (рис. 5), приобретенного буллезного эпидермолиза - 22,2% (рис. 6). При линейном IgA-зависимом буллезном дерматозе неоплазии выявлено не было ни в одном случае.

Рисунок 4. Клинические варианты аутоиммунной пузырчатки.

Рисунок 5. Клинические варианты буллезного пемфигоида.

Рисунок 6. Клинические варианты приобретенного буллезного эпидермолиза.

Кроме того, при комплексном обследовании больных выявлена ассоциация аутоиммунных буллезных дерматозов с другими аутоиммунными заболеваниями и патологическими процессами, сопровождающимися аутоиммунными реакциями. Это сахарный диабет II типа (74 случая - 27,7%), аутоиммунный тиреоидит и ревматоидный артрит (по 33 случая - 12,4%), анемия (22 случая - 8,2%) и бронхиальная астма (18 случаев - 6,7%) (рис. 7). Необходимо отметить также, что все аутоиммунные буллезные дерматозы протекали на фоне патологии со стороны сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь) и/или желудочно-кишечного тракта (холецистит, панкреатит, гастродуоденит).

Рисунок 7. Ассоциация аутоиммунных буллезных дерматозов с другими болезнями.

Постановка диагноза с момента проявления первых признаков заболевания составляла от 1 месяца до 5 лет, в среднем - около шести месяцев. У большинства больных аутоиммунными буллезными дерматозами патологический процесс локализовался преимущественно на коже (93,6%) с одновременным вовлечением слизистых оболочек органов в 53,2% случаев. В отдельных случаях (6,4%) было отмечено поражение только слизистой оболочки полости рта без клинических проявлений на коже. Кроме того, как и большинством авторов [Castanet J. et al., 1990; Hertl M., 2004; Vaillant L., 1991], нами отмечено, что клиническая картина аутоиммунных буллезных дерматозов на современном этапе претерпевает эволюцию. Нередко наблюдается не только клиническое сходство среди разных аутоиммунных буллезных дерматозов (например, как в случае линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза и буллезного пемфигоида), но и клиническая имитация другими кожными заболеваниями, такими как многоформная экссудативная эритема, синдром Стивенса-Джонсона, синдром Лайела, пруриго, герпетиформный дерматит Дюринга. Такое разнообразие клинических проявлений можно наблюдать и в случаях аутоиммунных буллезных дерматозов, протекающих на фоне неоплазии, и в период продромального развития буллезного пемфигоида с его атипичными проявлениями. Все это не способствует своевременной постановке клинического диагноза и вынуждает клинициста прибегать к использованию различных диагностических методов. Одним из первых методов является симптом Никольского в двух его модификациях («прямой» и «косвенный»). Его сущность заключается в механической отслойке эпидермиса вследствие разрыва межклеточных контактов (акантолиз) и образования внутриэпидермальных пузырей, как следствие цитотоксического действия аутоантител. Высокая специфичность данного симптома позволяет непосредственно у постели больного заподозрить такое угрожающее жизни заболевание как аутоиммунная пузырчатка. Однако отрицательные результаты в ряде случаев аутоиммунной пузырчатки (28%) и выявление подобного симптома при других аутоиммунных буллезных дерматозах, таких как буллезный пемфигоид (3,4%) и приобретенный буллезный эпидермолиз (66,7%) не позволяет провести дифференциальную диагностику между этими дерматозами. Подобные наблюдения описаны и другими авторами [Глухенький Б.Т. и др., 2003; Grunwald M.H. et al., 1984; Polifka M., Krusinski P.A., 1980; Urbano F.L., 2000]. Такое «необычное поведение» феномена Никольского требует научно-обоснованного подхода к его оценке с точки зрения иммунопатологии. В стратегических целях это будет обсуждено ниже.

При сомнительных результатах симптома Никольского как первого диагностического «инструмента» в руках клинициста врач вынужден обращаться к лабораторно-диагностическим исследованиям. Наиболее простыми и доступными для лечебных учреждений являются цитологический и патоморфологический методы исследования. Однако и здесь в ряде случаев возникают сложности в постановке точного диагноза. Так, на наш взгляд цитологическое исследование содержимого пузыря или мазков-отпечатков материала со дна эрозий недостаточно информативно, т.к. акантолитические клетки (клетки Тцанка), характерные для аутоиммунной пузырчатки, обнаруживаются не только при этой патологии (76,2%), но и при буллезном пемфигоиде (9,9%) и приобретенном буллезном эпидермолизе (11,1%). Подобные наблюдения описывают и при других болезнях кожи [Глухенький Б.Т., Грандо С.А., 1990].

Патоморфологическое исследование биопсийного материала из очага поражения позволило выявить типичную морфологическую картину пузырчатки в 79,9% случаев, буллезного пемфигоида в 83,1% случаев и ни в одном случае линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза и приобретенного буллезного эпидермолиза. В двух последних случаях патоморфологическая картина соответствовала буллезному пемфигоиду. Наш диагноз основывался на иммунологических и иммуногистохимических критериях. Несмотря на достаточно высокую информативность гистологического метода, сходные морфологические изменения обязывают дерматологов обращаться к более совершенным и надежным методам исследования с использованием прямой и непрямой иммунофлюоресценции с целью выявления циркулирующих аутоантител и фиксированных иммунных комплексов.

Известно, что основную патогенетическую роль при аутоиммунных буллезных дерматозах играют циркулирующие аутоантитела, направленные к антигенам-мишеням межклеточной субстанции (десмосомального аппарата) и базальной мембраны многослойного плоского эпителия при аутоиммунной пузырчатке и аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения, соответственно (табл. 2). Эти аутоантитела, образуя иммунные комплексы в тканях, оказывают на нее цитотоксическое действие. При аутоиммунной пузырчатке это приводит к разрушению межклеточных контактов с последующим разрывом связей между отдельными клеточными элементами, развитию акантолиза и образованию внутриэпидермальных пузырей. При аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения (приобретенный буллезный эпидермо-

Таблица 2. Циркулирующие аутоантитела при аутоиммунных буллезных дерматозах

Примечание: * - циркулирующие аутоантитела, ответственные за развитие аутоиммунного буллезного дерматоза; ** - сопутствующие антитела к антигенам различных структур тканей и органов.

Достоверных различий по частоте встречаемости аутоантител к антигенам межклеточной субстанции и базальной мембраны при аутоиммунной пузырчатке и паранеопластической пузырчатке выявлено не было (p>0,05). Однако надо отметить, что титр аутоантител был достоверно выше при аутоиммунной пузырчатке (1:586 и 1:30 к антигенам межклеточной субстанции и базальной мембране, соответственно), чем при паранеопластической пузырчатке (1:40 к антигенам межклеточной субстанции). Частота выявления циркулирующих аутоантител к антигенам различных структур эпидермиса и дермы, изотропных дисков скелетной мускулатуры, миодных клеток тимоцитов, соединительно-тканных структур печени и ядрам ее клеточных элементов (АНФ), дисков поперечно-полосатой мускулатуры и капилляров миокарда была достоверно выше при паранеопластической пузырчатке, чем при аутоиммунной пузырчатке (p<0,05). При этом титр аутоантител к антигенам дисков поперечно-полосатой мускулатуры (1:118), капиллярам миокарда (1:118) и АНФ (1:25) при паранеопластической пузырчатке было достоверно выше (p<0,05), чем при аутоиммунной пузырчатке. лиз, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз) под действием специфических аутоантител и фиксированных иммунных комплексов происходит разрушение структурных компонентов базальной мембраны с последующим ее расщеплением и образованием подэпидермальных пузырей.

Некоторые авторы считают, что определение титров антител и выявление в тканях фиксированных иммунных комплексов во многих случаях позволяет не только подтвердить диагноз, но и прогнозировать дальнейшее течение заболевания [Ежов Н.Я., 1974; Friedman H. Et al., 1989; Sams W.M.Jr., Jordon R.E., 1971; Titzpatrick R.E., Newcomer V.D., 1980]. В наших исследованиях с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции специфические аутоантитела в сыворотке крови больных различными аутоиммунными буллезными дерматозами были выявлены в 80,3% случаев. При этом титры антител (от 1:5 до 1:10240) не всегда коррелировали с клиническими проявлениями. Это связано со способностью кожи сорбировать иммунные комплексы с целью их элиминации. Поэтому при обширных поражениях кожи, порой с захватом целых анатомических областей и слизистой оболочки, циркулирующие аутоантитела не всегда удается выявить, особенно в случаях аутоиммунной пузырчатки (65,8%) и буллезного пемфигоида (29,4%). И, наоборот, в случае локального патологического процесса титр аутоантител может достигать высоких цифр до 1:10240. иммунный буллезный дерматоз антиген

Кроме основных патогенетически значимых антител в ряде случаев были выявлены «дополнительные» антитела (см. табл. 2). Так, при паранеопластической пузырчатке выявлен широкий спектр антител к антигенам многих структур органов и тканей, таких как миоидные клетки тимуса, диски поперечнополосатой мускулатуры, капилляры миокарда, соединительнотканные структуры печени и ядра ее клеточных элементов (гепатоцитов). Это объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, протекающей на фоне неоплазии. Кроме того, наличие «мозаики» антител при данной форме патологии позволяет рассматривать паранеопластическую пузырчатку как мультиорганный синдром. Об этом имеется ряд сообщений и других авторов [Lane J.E. et al., 2004; Nguyen V.T. et al., 2001].

В случаях приобретенного буллезного эпидермолиза выявлено, что патогенетическую роль могут играть или IgG, или IgG и IgA антитела одновременно. При этом антигенами-мишенями могут быть молекулярные соединения и lamina densa, и lamina lucida. Вовлечение последней, по-видимому, связано с опосредованным влиянием этих аутоантител на адгезивную функцию молекул.

Если циркулирующие аутоантитела при аутоиммунных буллезных дерматозах не всегда удается выявить в связи с иммунной сорбцией в тканях, то фиксированные иммунные комплексы были обнаружены во всех исследованных случаях (100%). При этом наряду с основными иммуноморфологическими диагностическими признаками каждого аутоиммунного буллезного дерматоза выявлен ряд дополнительных интересных фактов. Известно, что одним из диагностических маркеров аутоиммунной пузырчатки является обнаружение иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах эпидермиса (p<0,05) (рис. 8). При вульгарной и вегетирующей пузырчатке фиксация иммуноглобулина класса G наблюдается в межклеточных пространствах шиповатого слоя, а при себорейной и листовидной пузырчатке - в зернистом слое эпидермиса. Однако в наших исследованиях была выявлена несколько иная иммуногистохимическая картина. Так, при пузырчатке независимо от клинических форм ее проявления в патологический процесс всегда были вовлечены антигены десмосомального аппарата шиповатого слоя. При этом в случаях вульгарной пузырчатки в патологический процесс одновременно вовлекалось и межклеточное пространство базального слоя эпидермиса (p=0,032), а в случаях листовидной или себорейной пузырчатки - межклеточное пространство зернистого слоя с наиболее интенсивной иммуногистохимической реакцией в ней (p=0,027 и p=0,000012, соответственно).

Рисунок 8. Фиксированные иммунные комплексы (%) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.