Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

морфофункциональная характеристика пульпы зуба и оценка иммунного статуса при кариесе, его осложнениях и заболеваниях пародонта

03.00.25 - цитология, гистология, клеточная биология

14.00.21 - стоматология

Московский Александр Владимирович

Саранск - 2009

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

Научные консультанты:доктор биологических наук, профессор Л.А. Любовцева

доктор медицинских наук, профессор А.В. Шумский

Официальные оппоненты:доктор биологических наук,ьпрофессор П.П. Кругляков

доктор медицинских наук, профессор В.В. Яглов

доктор медицинских наук, профессор Т.Н. Модина

Ведущая организация:Московский государственный медико-стоматологический

университет

Защита диссертации состоится « 24 » апреля 2009 г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.01 в ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва» (430000, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва».

Автореферат разослан «___» _____________ 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук,

профессор Балашов В.П.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Большая распространённость и постоянный рост среди населения заболеваемости кариесом, его осложнений в сочетании с заболеваниями пародонта, роль данной патологии в формировании хронического одонтогенного очага инфекции в организме, трудности лечения и профилактика заболевания вызывают постоянный интерес к этой проблеме (Овруцкий Г.Д. с соавт., 1991; Лукиных Л.Н. с соавт., 1999; Воронин В.В. и соавт., 2001). Основная роль микроорганизмов зубной бляшки в этиологии пародонтита не вызывает сомнения (Логинова Н.К. с соавт., 1995; Канканян А.П., Леонтьев В.К., 1998). Этот патологический процесс, как правило, имеет хроническое течение, что демонстрирует недостаточную эффективность при нём механизмов иммунитета и неспецифической резистентности организма.

В работах последних лет показано, что высокой информативностью при различных воспалительных процессах челюстно-лицевой области отличается оценка иммунного статуса, активности иммунокомпетентных клеток, осуществляющих основные защитные реакции (Бажанов Н.Н. с соавт., 1996; Максимовский Ю.М. и соавт., 2003). Одним из условий, предрасполагающих к развитию осложнений кариеса, является иммунодефицит, что обусловливает необходимость учитывать состояние иммунитета при стоматологических вмешательствах (Сафиуллина А.М., 1996; Stack W.E. et al., 1990; Heumader E. et al., 1995). Однако с учётом локализованности воспалительного очага большой интерес представляет изучение иммунологических показателей не только крови, но и непосредственно ткани пульпы зуба, вовлеченной в патологический процесс (D'Souza R. et al., 1989; Gregoire G. et al., 1990; Ohshima H. et al., 1995; Wu H. et al., 1995; Kamal A.M. et al., 1997; Hahn C.L. et al., 2000; Wu L. et al., 2001; Izumi T. et al., 2002; Anderson L.M. et al., 2002; Angelova A. et al., 2004; Nakanishi T. et al., 2005).

В настоящее время достаточно подробно изучено строение пульпы зуба, детально описаны морфологические изменения при кариесе и пульпите (Иванов В.С. с соавт., 2003). Это связано с тем, что в практику стоматологии всё чаще внедряются различные методы морфологического анализа (Григорьян А.С., 2002). Кроме того, научные исследования в стоматологии в своём большинстве базируются на сопоставлении клинических данных с морфологическими (Гемонов В.В. и соавт., 2002; Родзаевская Е.Б. с соавт., 2004).

Представляют интерес и сообщения об участии нейромедиаторов - катехоламинов (КА), серотонина (СТ), гистамина (Г) - в регуляции биологических процессов в развивающейся, интактной и воспалённой пульпе зуба (Adamkiewicz V.W. et al., 1978; Warita H., 1990; Ibricevic H. et al., 1991; Ngassapa D. et al., 1992; Kerezoudis N.P. et al., 1995; Casasco A. et al., 1995; Schachman M.A. et al., 1995; Moiseiwitsch J.R. et al., 1998; Wang D. et al., 1998; Nagy G. et al., 2000; Nup C. et al., 2001). В пульпе зуба обнаружены рецепторы к катехоламинам, серотонину, гистамину и ферменты, участвующие в их инактивации (Kim S. et al., 1989; Sano M. et al., 1989; Marino V. et al., 1992; Nomura T. et al., 1996; Parker D.A. et al., 1999; Inoue K. et al., 2000; O'Sullivan M. et al., 2002).

В мировой научной литературе также имеются данные о посредническом участии биогенных аминов (БА) в иммунологических реакциях (Божко Г.Х., 1984; Козлов В.И. с соавт. 1984; Гущин Г.В., 1992; Cook-Mills J.M. et al., 1995; Vizi E.S. et al., 1995). Доказано, что состояние резистентности организма во многом определяется содержанием в крови и других тканях биологически активных веществ, что стимулирует изучение их влияния на развитие кариеса зубов (Кунанбаева Т.С., 1973; Насибуллин М.Г., 1985; Vanderas A.P. et al., 1995).

Однако нет полной ясности в трактовке механизмов, лежащих в основе структурных изменений пульпы зуба, связи между нарушением общих и местных механизмов защиты, а также состоянием нейромедиаторного статуса структур пульпы при кариесе и пульпите в сочетании с пародонтитом. В связи с противоречивостью данных о развивающихся при пародонтите нарушениях в иммунной системе, а также отсутствием информации об изменениях в иммунной системе при осложнённом кариесе, сочетающемся с заболеваниями пародонта, представляется актуальным исследование количественного состава и функционального состояния иммунокомпетентных клеток периферической крови при данных нозологиях в комплексе с морфофункциональным исследованием пульпы зуба.

Цель исследования: в сравнительном аспекте изучить морфофункциональные изменения пульпы зуба в процессе одонтогенеза, при кариесе, его осложнениях и заболеваниях пародонта, а также выявить корреляционные связи с иммунным статусом организма.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Выявить хроносопряжённость между появлением биоаминсодержащих структур в развивающемся зубе и становлением его тканей в одонтогенезе человека.

2. Изучить динамику содержания биогенных аминов в структурах пульпы зуба взрослого человека, при кариесе, остром и хроническом пульпите в сочетании с пародонтитом.

3. Изучить в популяции тучных клеток пульпы зуба состояние нейромедиаторов и веществ, регулирующих их содержание: гепарина, моноаминоксидазы, фосфолипидов во время антенатального развития и при сочетанной патологии.

4. Выявить природу структурно-функциональных единиц пульпы зуба, участвующих в регуляции одонтогенеза и в патогенезе кариеса, его осложнений и заболеваний пародонта.

5. Дать качественную и количественную характеристику Т- и В-лимфоцитов, макрофагов пульпы зуба и оценить показатели общего иммунологического статуса пациентов в норме и при изучаемой патологии.

6. Определить серотониновый, гистаминовый индексы и коэффициенты корреляции в биоаминсодержащих структурах пульпы зуба, а также между иммунокомпетентными клетками пульпы зуба и крови в норме и при сочетанной патологии.

Научная новизна. Впервые для повышения эффективности диагностики пародонтита на основе клинико-лабораторных исследований разработаны два новых способа диагностики степени тяжести пародонтита (два приоритета на патенты РФ «Способ диагностики степени тяжести пародонтита» №2008118925 от 13.05.2008 и №2008122725 от 04.06.2008).

С помощью люминесцентно-гистохимических и иммуногистохимических методов исследования впервые описаны качественные и количественные изменения биоаминсодержащих структур и иммунокомпетентных клеток пульпы зуба человека в норме, при кариесе, а также при пульпите в сочетании с пародонтитом (удостоверение на рационализаторское предложение «Способ определения динамики иммунопозитивных клеток в пульпе при диагностике сочетанной патологии зубов и пародонта» №1133 от 28.02.2008).

Новым является количественное исследование обеспеченности катехоламинами, серотонином и гистамином структур развивающегося зуба с 8 по 28 неделю антенатального периода, а также пульпы зуба взрослого человека в норме, при кариесе и пульпите, сочетанном с пародонтитом.

Впервые описаны морфологические и тинкториальные свойства тучных клеток пульпы зуба в норме и патологии. Новым является изучение содержания в них биогенных аминов, состояния гепарина, а также степень тучноклеточной дегрануляции (удостоверение на рационализаторское предложение «Способ определения морфологических и тинкториальных свойств тучных клеток в пульпе при диагностике сочетанной патологии зубов и пародонта» №1135 от 28.02.2008).

В субодонтобластическом слое пульпы выявлена популяция нейроэндокринных клеток, содержащих биогенные амины, моноаминоксидазу, нейронспецифическую энолазу, синаптофизин и обладающих аргирофилией, суданофилией, альдегид-фуксинофилией. Впервые доказано изменение их численности, морфофункциональных свойств при кариесе и пульпите, сочетанном с пародонтитом (удостоверение на рационализаторское предложение «Способ выявления APUD-клеток в пульпе при диагностике сочетанной патологии зубов и пародонта» №1136 от 28.02.2008).

Впервые проведено комплексное клинико-иммунологическое обследование пациентов с поверхностным, средним и глубоким кариесом, очаговым и диффузным пульпитом, фиброзным и гангренозным пульпитом и пародонтитом различной степени тяжести. При этом выявлено, что у обследуемых групп стоматологических больных с высокой интенсивностью поражённости кариесом и неудовлетворительным состоянием гигиены полости рта имеются нарушения в иммунной системе (удостоверение на рационализаторское предложение «Способ определения гигиенических индексов при диагностике сочетанной патологии зубов и пародонта» №1134 от 28.02.2008).

Впервые обнаружена корреляционная зависимость между данными люминесцентно-гистохимического и иммуногистохимического исследования пульпы зуба с показателями общего иммунного статуса в норме, при кариесе и пульпите, сочетанном с пародонтитом (удостоверение на рационализаторское предложение «Способ прогнозирования жизнеспособности пульпы при диагностике сочетанной патологии зубов и пародонта» №1137 от 28.02.2008).

Практическая значимость и реализация работы. Настоящее исследование входит в Координационный план РАМН (№ госрегистрации 01970007431 от 1997 г. и № 0120.0851887 от 2008 г.) по теме «Гистохимия биогенных аминов в морфофункциональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте».

Практическая значимость работы заключается в применении научных данных в терапевтической стоматологии и имплантологии, а также при профилактике врождённых дефектов развития зубо-челюстной системы.

При определении группы риска по хронизации воспалительного процесса в пульпе зуба и периапикальных тканях в неё должны войти больные с высокой поражённостью кариесом и неудовлетворительным состоянием гигиены полости рта. Всем больным этой группы необходимо проводить оценку иммунного статуса. Полученные результаты позволяют рекомендовать практическому здравоохранению направлять больных с кариесом и его осложнениями в сочетании с пародонтитом к клиническому иммунологу на консультацию для обсуждения вопроса о включении в комплексную терапию иммуномодулирующих препаратов, что, возможно, позволит предотвратить формирование одонтогенного очага инфекции и профилактировать его негативное воздействие на организм. Внедрение результатов исследования в практику приведёт к значительному сокращению осложнений, что создаст условия для диспансеризации пациентов стоматологического профиля за счёт сокращения трудозатрат специалистов на лечение патологии и профилактику осложнений.

Результаты проведенных исследований, на наш взгляд, помогут раскрыть механизмы взаимодействия биоаминсодержащих нейроэндокринных и иммунокомпетентных клеток в норме, при кариесе и пульпите, сочетанном с пародонтитом, а также могут стать важной основой для разработки концепции нейро-эндокринно-иммунных связей в пульпе зуба. Выявленные нами новые патогенетические закономерности в развитии осложнений кариеса, сочетанном с пародонтитом, позволяют обоснованно выбирать индивидуальные схемы лечения и делать отдалённый прогноз.

Основные положения, выносимые на защиту:

Образование структур эмалевого органа, появление одонтобластов, начало отложения дентина и эмали на этапах антенатального развития совпадает с максимальным содержанием серотонина и гистамина в тучных, гранулярных люминесцирующих клетках и нервных волокнах.

При глубоком кариесе в сочетании с пародонтитом лёгкой степени повышается содержание гистамина в тучных клетках, а катехоламинов и серотонина - в гранулярных люминесцирующих клетках при низком значении серотонинового индекса. Острое воспаление пульпы в сочетании с пародонтитом средней степени вызывает увеличение содержания биоаминов в окружающих тканях и кровеносных сосудах. При хроническом пульпите наблюдается снижение содержания всех исследуемых биогенных аминов в структурах пульпы зуба.

Часть гранулярных клеток субодонтобластического слоя проявляет свойства APUD-клеток: дает положительную реакцию на биоамины, моноаминоксидазу, хромогранин А, синаптофизин, нейронспецифическую энолазу, альдегид-фуксин, обладает аргентаффинностью, суданофилией. Изменения их морфофункциональных свойств наблюдаются уже при начальном поражении твёрдых тканей зуба и пародонта и предшествуют развитию острого воспалительного процесса в пульпе.

При кариесе и остром пульпите в сочетании с пародонтитом возрастает число в-метахроматичных тучных клеток с признаками начавшейся дегрануляции. При хроническом пульпите в сочетании с пародонтитом тяжёлой степени преобладают слабо люминесцирующие дегранулированные зрелые тучные клетки, не обладающие суданофилией и аргентафинностью.

У пациентов с острым пульпитом в сочетании с пародонтитом средней степени тяжести в пульпе зуба увеличивается число Т- и В- лимфоцитов, происходит активизация системы нейтрофильных гранулоцитов. При хронизации воспалительного процесса в сочетании с пародонтитом тяжёлой степени нарушается соотношение основных субпопуляций Т-клеток крови, снижаются показатели фагоцитарной активности и нарастает концентрация ЦИК, по сравнению с контрольной группой обследуемых.

Показатели числа иммунокомпетентных, нейроэндокринных и тучных клеток пульпы зуба коррелируют с изменением показателей общего иммунного статуса организма при кариесе и пульпите в сочетании с пародонтитом.

Апробация работы. Результаты исследований изложены в материалах научно-практической конференции стоматологов (Уфа, 1999, 2000), научно-практической конференции «Иммунодефицитные состояния в клинике внутренних болезней» (Чебоксары, 1999), научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики и лечения в клинике внутренних болезней» (Чебоксары, 2000), научно-практической конференции «Традиционные и нетрадиционные методы лечения в клинике внутренних болезней» (Чебоксары, 2000), научной конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (Санкт-Петербург, 2001), XVIII съезда Российского физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), VI и VII международных конгрессов по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Нью-Йорк, США, 2000; Эйлат, Израиль, 2001), научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной медицины» (Чебоксары, 2001), IV конгресса Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ, Москва, 2001), IV международной научно-практической конференции по функциональной нейроморфологии (Санкт-Петербург, 2002), научно-практической конференции стоматологов Республики Татарстан «Актуальные вопросы стоматологии» (Казань, 2004), IV Всероссийской конференции «Бабухинские чтения» (Орёл, 2005), научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии» (Белгород, 2006), научно-практической конференции «Структурно-функциональная организация органов и тканей полости рта в норме, патологии и эксперименте» (Тверь, 2006), 7-й международной научно-практической конференции «Health Education Millennium» (Москва, 2006), 8-го международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции РААКИ «Аллергология и клиническая иммунология» (Москва, 2008), IV Сибирского физиологического съезда (Барнаул, 2008), I международного симпозиума «Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины» (Москва, 2008), научно-практической конференции с международным участием «Научный прогресс на рубеже тысячелетий-2008» (Прага, 2008), IV международной научно-практической конференции «Динамика научных исследований» (Днепропетровск, 2008), научно-практической конференции, посвящённой 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Д.А. Жданова (Москва, 2008), IX конгресса международной ассоциации морфологов (Бухара, 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертационный материал изложен на 293 страницах компьютерного исполнения. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 64 рисунками, из которых 18 диаграмм и 46 микрофотографий. Список использованной литературы содержит 322 источника, из них 140 отечественных и 182 иностранных. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.

Публикации по теме диссертации. Основные положения диссертации отражены в 59 опубликованных работах, в том числе в монографии, 20 статьях, из них 12 - в центральных рецензируемых периодических журналах («Морфология», «Стоматология», «Российский стоматологический журнал», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины»).

Материал и методы исследования

1. Материал исследования

В ходе работы проведено исследование морфофункционального состояния пульпы зубов, а также клинического и иммунного статуса 389 человек обоего пола в возрасте от 23 до 49 лет, явившихся на прием в лечебно-консультативное отделение ГУЗ «Республиканская стоматологическая поликлиника» МЗ ЧР и 2-е стоматологическое отделение поликлиники МУЗ «Центральная городская больница» г. Чебоксары. Клинические наблюдения проводились автором в период с 1999 по 2006 г. До начала обследования все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании.

Для работы отбирались случаи, в которых был выставлен диагноз кариес, пульпит и пародонтит. Пациенты были разделены на группы (табл. 1). I группа являлась контрольной, куда вошли 33 пациента, направленные по ортопедическим показаниям на депульпирование интактных зубов в связи с их наклоном, поворотом вокруг оси, расположением вне зубной дуги для дальнейшего препарирования под металлокерамические конструкции.

Объектом гистологического исследования служила пульпа интактных и кариозных зубов в сочетании с пародонтитом лёгкой степени, которую получали путём экстирпации по ортопедическим показаниям в целях рационального протезирования параллельно с лечением кариеса.

Таблица 1

Группы обследуемых лиц

Пульпу зубов при осложнённом кариесе в сочетании с пародонтитом средней и тяжёлой степени для гистологического исследования получали путём экстирпации на терапевтическом приёме больных по поводу лечения пульпита. Всего было депульпировано 418 зубов.

После экстирпации пульпу фиксировали в 10% растворе нейтрального формальдегида. Обезвоживание материала осуществляли в спиртовом ряду возрастающей концентрации с последующей заливкой в парафин. Срезы пульпы толщиной 15 мкм получали на парафиновом ротаторном микротоме МПС-2. кариес парадонт зуб пульпит иммунологический

Для люминесцентно-гистохимических методов использовались криостатные срезы нефиксированной пульпы, полученные непосредственно после экстирпации.

При гистологическом исследовании структур зуба на антенатальном этапе онтогенеза объектом служили развивающиеся ткани зубочелюстной системы 185 эмбрионов и плодов человека в возрасте от 8 до 28 недель, взятые в гинекологических, патологоанатомических отделениях и родильных домах г. Чебоксары.

Материалом для исследования общего иммунного статуса являлась периферическая кровь, взятая из кубитальной вены в сухую пробирку для получения сыворотки и в пробирку с гепарином (25 ЕД) для получения клеток.

Исследование проводили на базе клинико-иммунологической лаборатории ГУЗ «Республиканская клиническая больница №1» Минздравсоцразвития ЧР.

2. Методы исследования

Клиническое обследование больных включало сбор анамнеза, объективный осмотр полости рта, проведение пробы Шиллера-Писарева, вычисление пародонтального индекса Рассела (РI) и РМА, определение степени подвижности зубов по А.И. Евдокимову. Оценку гигиены полости рта проводили с помощью индекса Фёдорова-Володкиной. Для оценки состояния твёрдых тканей зубов определяли интенсивность кариеса по числу поражённых зубов (КПУ) и числу поражённых поверхностей (полостей) (КПп). Классификацию кариозных полостей по локализации проводили по Блеку. Для оценки жизнеспособности пульпы, а также с целью дифференциальной диагностики различных форм кариеса и его осложнений применяли электроодонтометрию (ЭОД). Состояние твердых тканей зуба, периапикальной области и костной ткани альвеолярных отростков оценивали с помощью контактной и окклюзионной интраоральной рентгенографии, которую проводили на дентальном рентгенографическом аппарате.

Иммунологическое обследование групп больных и оценку полученных данных проводили в соответствии с трёхэтапным принципом определения иммунного статуса (Воробьёв Е.И. и соавт., 1985). На I этапе проводили ориентировочные тесты: составляли анкеты иммунологического анамнеза, оценивали общее количество лейкоцитов в 1 л крови, абсолютное и относительное содержание нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и моноцитов.

На II этапе проводили иммунологические тесты 1 уровня (тесты подтверждения иммунодефицита). Процентное содержание и количество Т- и В-лимфоцитов определяли методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием МКАТ к дифференцировочным антигенам CD3 и CD20. Уровень Ig классов A, M, G в крови определяли методом простой радиальной иммунодиффузии в геле по G. Mancini с использованием диагностических моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека. Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов включала определение в микротесте с латексом фагоцитарного числа (ФЧ) - процента нейтрофилов, захвативших частицы, и фагоцитарного индекса (ФИ) - среднего числа поглощённых частиц на 1 клетку.

На III этапе проводили иммунологические тесты 2 уровня (тесты дифференциации повреждённого звена). Процентное содержание T-хелперов и цитотоксических T-лимфоцитов определяли методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием МКАТ к дифференцировочным антигенам CD4 и CD8, проводили вычисление иммунорегуляторного коэффициента. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в крови определяли в реакции преципитации с полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000).

Люминесцентно-гистохимический метод Фалька применяли для выявления катехоламин- и серотонинсодержащих структур пульпы зуба. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса использовали для выявления гистаминсодержащих структур. Метод микроспектрофлуориметрии применяли для количественного измерения содержания серотонина, катехоламинов и гистамина. С целью определения влияния того или иного БА на общий процесс определяли серотониновый (I_СТ/КА) и гистаминовый (I_СТ/Г) индексы, являющиеся средними величинами от суммы частных соотношений содержания БА. Исследование моноаминоксидазы по Гленнеру проводили для определения активности ферментативного расщепления БА. Окраска суданом черным «В» с продлённым гидролизом использована для выявления внутриклеточных комплексно связанных фосфолипидов, которые адсорбируют БА. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна применялась для контроля состояния тканевых мукополисахаридов и гепарина в тучных клетках (ТК). Аргентаффинная реакция Массона-Фонтаны использовалась для гистохимической идентификации индолсодержащих, в том числе серотонинсодержащих структур. Окраска альдегид-фуксином по Гомори применялась для выявления клеток с пептидной секрецией. Представление о количественном распределении форм ТК в популяции получали методом их подсчёта в 10 полях зрения микроскопа при увеличении об. 40, ок. 10 с последующим вычислением для каждого случая среднего арифметического значения.

Иммуногистохимическое исследование проводили методом трёхэтапного непрямого иммуноферментного анализа с использованием первичных МКАТ против антигенных маркёров нейроэндокринных клеток (синаптофизина, нейронспецифической энолазы, хромогранина А) и иммунокомпетентных клеток (CD3, CD20, CD68) на базе Республиканского центра МЗ РТ «Современные технологии в морфологической диагностике» с применением реактивов и согласно рекомендациям фирмы-изготовителя «Dako» (Дания). Позитивные клетки оценивали по плотности распределения на единицу площади гистологического среза - 880 мкм² (подсчёт клеток проводили с помощью программы компьютерного анализа видеоизображений VideoTest).

Корреляционный анализ проводили на персональном компьютере по стандартной программе Microsoft Excel для выявления достоверной взаимосвязи между изучаемыми показателями в норме, при кариесе и его осложнениях в сочетании с пародонтитом. Статистическую обработку полученных цифровых данных проводили с помощью персонального компьютера методом вариационной статистики с оценкой достоверности по t-критерию Стъюдента.

Собственные исследования и их обсуждение

1. Результаты люминесцентно-гистохимического исследования структур развивающегося зуба человека

Проведенное нами исследование выявило, что до 12 недели антенатального периода развития наибольшее содержание биогенных аминов (БА) определяется в эпителии десны полости рта, зубной пластинке и зубных почках. При исследовании содержания БА в развивающемся зубе в периоды закладки, а также в период дифференцировки зубных зачатков биоаминсодержащие гранулярные люминесцирующие клетки (ГЛК) и тучные клетки (ТК) нами не были обнаружены. Таким образом, дифференцировка эмалевых органов на ранних этапах происходит в отсутствие ГЛК и ТК.

На 12 неделе появляются околозубные ТК, содержащие максимальное количество БА, основным из которых является серотонин (СТ). Появление околозубных ТК совпадает с ускорением процессов дифференцировки зачатков зубов, что выражается в образовании на 12 неделе антенатального периода структур первичных эмалевых органов: зубного сосочка, зубного мешочка, внутренних клеток эмалевого органа.

При оценке влияния динамики БА на процессы развития структур зуба нами было отмечено, что на 13-14 неделе развития максимальная концентрация гистамина (Г) определяется в образующихся зубных мешочках и зубном сосочке, что косвенно указывает на его участие в формировании данных структур.

На последующих стадиях развития зуба в зубном сосочке люминесцентно-гистохимическими методами исследования на 18 неделе антенатального периода развития выявляются люминесцирующие кровеносные сосуды, а затем, на 22 неделе, в них определяются нервные волокна, ГЛК и ТК, содержащие БА. Появление первичных кровеносных сосудов в пульпе зуба с большой площадью ветвления совпадает с образованием одонтобластов на 18 неделе антенатального периода, а появление здесь нервных волокон на 22 неделе - с появлением ГЛК, ТК и первичной эмали. В местах расположения ТК, ГЛК, кровеносных сосудов и нервных волокон наблюдаются участки дифференцировки мезенхимы зубного сосочка.

Наибольшее содержание СТ отмечается в энамелобластах на 20 неделе развития, что предшествует началу образования эмали, а также в сосудах пульпы зуба на 22 неделе, что совпадает с появлением нервных волокон. В процессе антенатального периода развития человека, а именно в период гистогенеза твёрдых тканей зуба, спектрофлуориметрический анализ выявляет в ТК Г, СТ и катехоламины (КА). Таким образом, появление ГЛК и ТК совпадает с процессом дифференцировки энамело- и одонтобластов. После появления ГЛК и ТК дифференцировка тканей зуба ускоряется. С увеличением срока антенатального периода увеличивается содержание БА в данных структурах.

Наибольшее количество ГЛК и ТК в пульпе развивающегося зуба выявляется на 28 неделе антенатального периода развития, что совпадает с максимальным содержанием КА и СТ не только в названных структурах, но и в нервных волокнах, а также кровеносных сосудах пульпы зуба. Одновременно со значительным увеличением содержания Г в зубном сосочке на 26 неделе антенатального периода развития происходит формирование гертвиговского корневого эпителиального влагалища.

По нашим данным, перед редукцией эмалевого органа на 22-24 неделе в его структурах происходит постепенное снижение содержания исследуемых БА, в то время как в мезенхимальных структурах - в зубном сосочке, одонтобластах, сосудах пульпы зуба - содержание медиаторов повышается, а в развивающейся пульпе зуба появляются первичные нервные волокна, ГЛК и ТК, являющиеся огромным по ёмкости депо БА. Стабилизация содержания исследуемых БА в структурах развивающегося зуба происходит в конце периода гистогенеза твёрдых тканей зуба, на 26-28 неделе, когда основные структуры уже сформированы.

Таким образом, имеющаяся связь по содержанию БА в эмалевом органе и мезенхимальных структурах развивающегося зуба, а также в биоаминсодержащих клетках и нервных волокнах может быть в основе одного из важных механизмов их взаимного влияния в процессе одонтогенеза. Мы предполагаем, что исследуемые БА могут являться теми сигналами, которые В.Л. Быков (1998) называет индукторами дифференцировки тканей в процессе антенатального развития.

Постановка тетразолевой гистохимической реакции Гленнера на активность МАО, которая может косвенным путём констатировать наличие или отсутствие БА в люминесцирующих структурах развивающегося зуба, показала, что до появления околозубных ТК на 12 неделе антенатального периода развития активность МАО усиливается параллельно с увеличением содержания БА в большинстве структур развивающегося зуба. На 12 неделе развития в околозубной мезенхиме нами выявлены МАО-положительные ТК, а на 22 неделе в развивающейся пульпе зуба - МАО-положительные гранулярные клетки и ТК. Гранулы формазана визуализируются в виде включений разной величины с тёмно-фиолетовым оттенком. В цитоплазме ТК гранулы формазана располагаются плотным кольцом вокруг ядра.

Реакция Массона-Фонтаны, направленная на идентификацию аргентаффинных веществ типа СТ и его метаболитов, позволила выявить нам импрегнацию разной интенсивности в ТК, гладкомышечных клетках, кровеносных сосудах, миелиновых нервных волокнах. На территории развивающейся пульпы зуба гранулярные клетки дали положительную аргентаффинную реакцию, микроспектральным анализом в них определялось высокое содержание СТ.

В срезах ткани развивающейся нижней челюсти человека, окрашенных суданом чёрным «В», суданофильные клетки по топографии полностью совпадали с люминесцирующими и аргентаффинными гранулярными клетками. Положительную реакцию на фосфолипиды дали ТК окружающей мезенхимы, которые содержали в цитоплазме гранулы сероватого оттенка. Резко суданофильными при этой реакции оказались ТК развивающейся пульпы зуба, где межгранулярные пространства почти не просматривались. Одонтобласты развивающейся пульпы зуба дали очень слабую реакцию, однако синеватые оттенки мембран клеток указывали на присутствие здесь фосфолипидов.

При изучении гистологических препаратов, окрашенных полихромным толуидиновым синим по Унна, установлено, что до 20 недели развития эпителий десны окрашивается ортохромно и содержит гепарин-моносульфат с незавершённым синтезом мономеров. Зубной сосочек, зубной мешочек и эмалевый орган имеют в-метахроматичную окраску и содержат созревающий гепарин. Околозубные ТК окрашиваются преимущественно г-метахроматично. Это свидетельствует о более высокой сульфатированности углеводного компонента, что характерно для зрелых ТК. В них происходит инактивация БА гепарином. На 18 неделе антенатального периода развития эмалевый орган приобретает г-метахромазию, что совпадает с появлением в зубном мешочке первичных кровеносных капилляров, заходящих между складками наружного эпителия эмалевого органа.

С 20 недели антенатального периода развития степень созревания гепарина в структурах зуба изменяется. Эпителий десны окрашивается г-метахроматично, зубной сосочек и зубной мешочек приобретают ортохромную окраску, околозубные ТК окрашиваются преимущественно в-метахроматично. Таким образом, с наступлением периода гистогенеза твёрдых тканей зуба сульфатированность гепарина в околозубных ТК, зубном сосочке и зубном мешочке уменьшается, а в эпителии десны повышается.

2. Результаты люминесцентно-гистохимического исследования структур пульпы зуба взрослого человека

При исследовании пульпы по методу Фалька во всех срезах пульпы зубов контрольной группы в центральном слое выявляются адренергические нервные волокна, расположенные по ходу кровеносных сосудов. От нервно-сосудистых сплетений отходят одиночные нервные терминали в виде изумрудно-зелёных нитей с варикозными расширениями, что совпадает с данными по адренергической иннервации пульпы зуба N.P. Kerezoudis et al. (1995), A. Casasco et al. (1995).

По нашим данным, адренергическая иннервация наиболее обильна в субодонтобластическом слое. Здесь же выявляются единичные ГЛК - клетки полигональной формы, со множеством ярких, желтовато-белых глыбовидных гранул, тесно контактирующие с нервными терминалями. Эти данные могут указывать на наличие функциональной связи между названными структурами.

Одонтобласты, а также собственная соединительная ткань пульпы дают диффузное слабое желтовато-зелёное свечение, обозначаемое как «фон». Люминесцентно-гистохимическими методами в пульпе зуба нами также были выявлены клетки, относящиеся к ТК, которые расположены по ходу кровеносных сосудов. Они отличаются от ГЛК меньшими размерами, удлинённой формой, наличием тёмного ядра и мелкозернистых гранул в цитоплазме.

Количественный цитоспектрофлуометрический анализ светящихся структур пульпы зуба показал, что БА в определённых концентрациях содержатся в одонтобластах, собственно соединительной ткани пульпы, нервных волокнах, кровеносных сосудах (табл. 2).

Таблица 2

Интенсивность люминесценции катехоламинов, серотонина, гистамина в структурах пульпы зуба в норме, при кариесе, пульпите и пародонтите (у.е.)

Примечание: ^* - p0,05; ^** - p0,01; ^*** - p0,001.

D. Wang et al. (1998), исследуя методом хроматографии содержание КА в пульпе здоровых зубов, удаленных по ортодонтическим показаниям, также определили высокое содержание норадреналина, что согласуется и с нашими данными. Обработка криостатных срезов пульпы парами ортофталевого альдегида по методу Кросса позволила нам обнаружить Г во всех вышеназванных структурах.

Прямую идентификацию БА в структурах пульпы зубов взрослого человека дополнили используемые нами методы косвенного выявления этих веществ - обнаружение МАО по методу Гленнера, аргентаффинная реакция Массона-Фонтаны на индолсодержащие вещества (СТ и его метаболиты), метод окраски суданом чёрным «В» на фосфолипиды, являющиеся субстратом для связывания БА.

При глубоком кариесе в сочетании с пародонтитом лёгкой степени отмечено повышение содержания Г в ТК и КА, СТ в ГЛК при низком значении серотонинового индекса, что указывает на преобладание в них КА.

Известно, что повышенное содержание в крови и других тканях БА влияет на развитие кариеса зубов. По данным М.Г. Насибуллина (1985), повышенное содержание СТ в крови является фактором, понижающим устойчивость зубов к кариесу. Т.С. Кунанбаевой (1973) доказана роль Г в развитии кариеса зубов.

По-видимому, при прогрессировании кариеса в сочетании с пародонтитом лёгкой степени биоаминсодержащие ГЛК, расположенные в субодонтобластическом слое в непосредственной близости к пульпарно-дентинной границе, и ТК, локализованные преимущественно по ходу кровеносных сосудов, чутко ре-агируют на незначительные патологические сдвиги в пульпе зуба. Эти ранние изменения предшествуют развитию острого пульпита в сочетании с пародонтитом средней степени тяжести.

Известно, что тучные клетки участвуют в воспалительном повреждении при заболеваниях полости рта у человека, в том числе пародонтите (Ledesma-Montes C. et al., 2004), а их ферменты - в разрушении межклеточного матрикса (Verma D.K. et al., 2005). При хроническом пародонтите число ТК значительно увеличивается, они тесно контактируют с макрофагами, через секрецию цитокинов принимают активное участие в регуляции иммунного ответа и клеточной миграции (Batista A.C. et al., 2005; Steinsvoll S., 2006).

Топографическая и функциональная связь ГЛК и ТК пульпы зуба с нервными терминалями и кровеносными сосудами позволяет сделать предположение об их основной роли в биоаминной регуляции гомеостаза пульпы зуба, что приобретает особое значение в развитии патологии. При остром пульпите в сочетании с пародонтитом средней степени БА концентрируются в окружающей соединительной ткани. Это согласуется с данными G. Nagy et al (2000) и C. Nup et al. (2001), которые выявили значительное увеличение катехоламинов в воспаленной пульпе при пародонтите, по сравнению с нормой. Максимальное содержание Г при данных патологиях выявляется в кровеносных сосудах пульпы зуба. По мнению N. Shoji et al. (2006), при пульпите и пародонтите гистамин продуцируется вновь при помощи гистидиндекарбоксилазы пульпы зуба.

Вычисление соотношения СТ к Г показывает высокое влияние данного БА в одонтобластах, кровеносных сосудах, ТК, фоне соединительной ткани, где I_СТ/Г меньше единицы. При остром диффузном, а также хроническом пульпите в сочетании с пародонтитом средней и тяжёлой степени соответственно в нервных волокнах пульпы зуба отмечается преобладание влияния СТ по отношению к КА, что подтверждается наибольшими значениями серотонинового индекса (I_СТ/КА). По данным ряда исследователей, избыточное содержание БА в тканях, которое мы наблюдали при остром пульпите в сочетании с пародонтитом средней степени, может в дальнейшем вызвать угнетение иммунного ответа.

При хроническом пульпите в сочетании с пародонтитом тяжёлой степени наблюдается истощение нейромедиаторной системы пульпы зуба: происходит снижение содержания БА во всех исследуемых структурах, по сравнению с контрольной группой, вследствие чего замедляются процессы регенерации.

3. Результаты корреляционного анализа биогенных аминов в структурах пульпы зуба

При вычислении коэффициентов корреляции между различными БА нами выявлены высокие положительные связи в парах КА-СТ и КА-Г в большинстве структур пульпы зуба в норме и при воспалении. Это свидетельствует об однонаправленной динамике в них названных БА. В паре СТ-Г в ТК, одонтобластах и фоне соединительной ткани пульпы зуба были обнаружены высокие отрицательные коэффициенты корреляции при кариесе, остром и хроническом пульпите в сочетании с пародонтитом лёгкой, средней и тяжёлой степени соответственно, что позволяет сделать предположение о конкурирующих взаимоотношениях СТ и Г при воспалении.При вычислении коэффициентов корреляции между люминесцирующими структурами пульпы зуба обращают на себя внимание высокие отрицательные связи по КА и СТ в парах, образуемых ГЛК с другими структурами: одонтобластами, кровеносными сосудами, нервными волокнами и фоном соединительной ткани при развитии кариеса в сочетании с пародонтитом лёгкой степени. Возможно, это указывает на их биоаминодонорную роль при данных патологиях. При остром воспалении пульпы зуба в сочетании с пародонтитом средней степени эти связи нарушаются.

Преобладание высоких положительных коэффициентов корреляции по КА и СТ в парах одонтобласты - фон соединительной ткани пульпы и одонтобласты - нервные волокна при патологии указывает на сходную динамику в них БА. По-видимому, топографические связи нервных волокон и одонтобластов, на которые указывает K. Fried (1992), дополняются их корреляционной зависимостью.

Следует отметить, что при остром пульпите в сочетании с пародонтитом средней степени в парах, образуемых ТК с другими люминесцирующими структурами, наблюдаются высокие отрицательные корреляционные связи по Г, которые нарушаются при хроническом пульпите в сочетании с пародонтитом тяжёлой степени. Это может свидетельствовать о центральной роли ТК в обеспечении пульпы зуба Г при остром воспалении в сочетании с пародонтитом средней степени.

4. Результаты иммуногистохимического исследования пульпы зуба на нейроэндокринные маркёры

Параллельно проведённое иммуногистохимическое исследование с помощью МКАТ к антигенным маркёрам нейроэндокринных клеток - хромогранину А, синаптофизину, НСЭ - позволило нам выявить положительные клетки в пульпе зуба.

Если в контрольной группе иммунопозитивные клетки единичны, выявляются в субодонтобластическом слое, то при развитии кариозной патологии происходит увеличение их числа с максимумом при глубоком кариесе в сочетании с пародонтитом лёгкой степени, а при воспалении пульпы в сочетании с пародонтитом средней степени их число, наоборот, снижается. Следовательно, изменения их морфофункциональных свойств наблюдаются уже при начальном поражении твёрдых тканей зуба и предшествуют развитию острого воспалительного процесса в пульпе.

Параллельная окраска срезов альдегид-фуксином по Гомори позволила нам выявить в субодонтобластическом слое пульпы зубов контрольной группы единичные альдегидфуксин-положительные клетки, совпадающие по локализации с ГЛК. Динамика этих клеток при кариесе и его осложнениях в сочетании с пародонтитом соответствует динамике ГЛК. Таким образом, гранулярные клетки пульпы зуба дают положительную реакцию на БА, МАО, хромогранин А, синаптофизин и НСЭ, обладают аргентаффинностью, суданофилией и альдегид-фуксинофилией, что заставляет нас, основываясь на литературных данных, отнести их к APUD-системе.

В настоящее время пересмотрен один из фундаментальных постулатов классической биологии о том, что гормональная функция является специализированной функцией лишь эндокринных клеток, имеющих общее происхождение и сходное строение. По мнению И.М. Кветного с соавт. (2003), этот постулат был отчасти уже подвергнут сомнению, когда идентичные БА и пептидные гормоны были обнаружены в нейронах и APUD-клетках различных органов и тканей, объединенных впоследствии в диффузную нейроэндокринную систему. Сейчас общепризнано, что локализованные практически во всех органах и продуцирующие биологические активные вещества клетки диффузной нейроэндокринной системы выполняют роль регуляторов гомеостаза, реализуя своё действие через нейрокринные, эндокринные и паракринные механизмы (Акмаев И.Г. с соавт., 2001). В связи с этим их можно рассматривать как неотъемлемое звено и часть универсальной системы контроля и защиты организма, а секретируемые ими гормональные вещества как сигнальные молекулы для локальной координации межклеточных взаимодействий.

Таким образом, помимо типичных элементов соединительной ткани, пульпа зуба содержит клетки, которые мы относим к нейроэндокринным, поскольку они обладают альдегидфуксинофилией и вырабатывают БА и нейропептиды - НСЭ, синаптофизин и хромогранин А. Наибольшая концентрация иммунореактивных клеток была выявлена в субодонтобластическом слое пульпы. Эти клетки местами тесно контактируют с нервными волокнами, содержащими БА и нейропептиды.

В.В. Яглов (1993) называет APUD-систему диффузной эндокринной системой (ДЭС). Воспринимая информацию из внешней и внутренней среды организма, клетки ДЭС реагируют выделением БА и пептидных гормонов, оказывающих как локальные, паракринные эффекты, так и дистантные, эндокринные влияния. По мнению В.В. Яглова (1993), выделяемые клетками ДЭС и ТК биологически активные вещества регулируют в очаге иммунного воспаления процессы микроциркуляции, метаболизма, пролиферации фибробластов и функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

5. Результаты исследования популяции тучных клеток пульпы зуба

Кроме гранулярных клеток, нами была изучена популяция ТК пульпы зуба, которые являются огромным по ёмкости депо медиаторов (Быков В.Л., 1999). В настоящее время их также относят к числу APUD-клеток (Акмаев И.Г. с соавт., 2001). Благодаря секреции разнонаправленных по действию БА, ТК регулируют просвет и проницаемость сосудов, играя немаловажную роль в патогенезе отёка тканей. Содержание в цитоплазме ТК гистамина и гепарина обусловливает их участие в острых и хронических воспалительных процессах в полости рта (Гемонов В.В. с соавт., 2002).

По нашим данным, спектрофлуориметрический анализ выявляет в ТК пульпы зуба взрослого человека Г, СТ и КА. Однако предпринятое нами вычисление индекса соотношения СТ и Г показало преимущественное преобладание в ТК пульпы зуба Г над СТ во всех исследуемых случаях, кроме хронического фиброзного пульпита в сочетании с пародонтитом тяжёлой степени, где I_СТ/Г превышал единицу. Возможно, благодаря секреции разнонаправленных по действию БА, ТК не только регулируют проницаемость сосудов, но и участвуют в поддержании биоаминного гомеостаза в ходе обмена веществ (Гордон Д.С. с соавт., 2001).

С целью изучения популяции ТК пульпы зуба нами применялся метод Унна, позволяющий оценить состояние тканевых мукополисахаридов и гепарина. В интактной пульпе зуба обнаружены единичные молодые ТК небольших размеров, без признаков дегрануляции, расположенные по ходу кровеносных сосудов, с плотно упакованными ярко-жёлтыми гранулами, высоким содержанием БА, обладающие ортохромазией, аргентафинностью, суданофилией и слабой реакцией на МАО.

В научной литературе вопрос о присутствии ТК в интактной пульпе зуба взрослого человека является предметом дискуссии. Некоторые авторы считают, что ТК пульпы зуба имеются только у детей, а у взрослых в норме отсутствуют (Гемонов В.В. и соавт., 2002). Другие исследователи полагают, что они являются обычными клеточными элементами пульпы, причём при воспалении их число резко увеличивается (Быков В.Л., 1998). Наши данные решают спорный вопрос о присутствии в интактной пульпе ТК положительно. Предыдущие исследователи пытались обнаружить ТК в пульпе, применяя методы деминерализации. Известно, что кислотная деминерализация разрушает люминесцирующие ТК. Используя метод экстирпации пульпы и окрашивание метахроматическими красителями, мы доказали наличие ТК в невоспаленной пульпе.

По нашим данным, при кариесе и остром пульпите в сочетании с пародонтитом возрастает число в-метахроматичных, зрелых клеток с тускло люминесцирующими желтовато-оранжевыми отдельными различимыми гранулами и признаками начавшейся дегрануляции.

Поскольку гепарин, содержащийся в ТК, участвует в инактивации БА (Schwartz L. et al., 1993), полученные результаты могут косвенно свидетельствовать о чрезмерном увеличении уровня медиаторов при воспалении, что подтверждают данные спектрофлуориметрии.

Таким образом, начальное повреждение пульпы в сочетании с пародонтитом приводит к активации процессов дифференцировки ТК, а также повышению их функциональной активности. При прогрессировании воспалительного процесса начинают доминировать дегранулирующие ТК, создающие вокруг себя насыщенное БА микроокружение.