Результаты применения клеточных технологий в лечении пациентов с хронической сердечной недостаточностью

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2009

2. Содержание работы

Клиническая характеристика больных и методы исследования

В основу настоящей работы положены результаты применения клеточных технологий у 119 пациентов (с 2003 года по 2008 год): 27 пациентов с ХСН ишемического генеза или ишемической кардиомиопатией (ИКМП), 26 пациентов ХСН не ишемического генеза или с идиопатической дилатационной кардиомиопатией (ДКМП) и 66 пациентов с аномалией Эбштейна. Пациенты были разделены на две группы - исследуемую группу, которым вводился используемый клеточный материал изолированно или в сочетании с различными операциями и группу плацебо, которым также изолированно или в сочетании с различными операциями вводилась бессывороточная среда точного химического состава, не содержащая компоненты животного происхождения. Из 27 пациентов с ишемической кардиомиопатией, 3 были включены в пилотное исследование с применением аллогенных скелетных миобластов в сочетании с аортокоронарным шунтированием. Остальные 24 пациента с ишемической кардиомиопатией, 26 пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией и 66 пациентов с аномалией Эбштейна были включены в плацебо-контролируемое исследование с использованием аутологичных костно-мозговых эндотелиальных клеток-предшественников CD133+ изолированно или в сочетании с различными операциями.

Все пациенты, включённые в исследование, были отнесены к III-IV ФК хронической сердечной недостаточности по классификации Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA).

В качестве клеточного субстрата были использованы аллогенные скелетные миобласты в лечении пациентов с ишемической кардиомиопатией (n=3) и аутологичные эндотелиальные клетки - предшественники CD133+ в лечении пациентов с кардиомиопатиями ишемического и не ишемическго генеза (n=50) и пациентов с аномалией Эбштейна (n=66).

Аллогенные скелетные миобласты были получены у здоровых молодых доноров мужского пола (возраст 20±9 лет; исследование было одобрено этическим комитетом Международного института клеточной трансплантологии США (директор института Питер Ло), и доноры давали согласие об участии в исследовании) и культивированы по специально запатентованной технологии в США в лаборатории класса сGMP/ISO 9001, отвечающей международным GMP - стандартам, в результате чего было получено 3,64х10⁹ чистых десмин-иммуно-позитивных миобластов с жизнеспособностью 91,5%, и отрицательной реакцией на наличие эндотоксина, микоплазмы, грам-положительных и грам-отрицательных бактерий из расчета на их использование у 3-х пациентов с ишемической кардиомиопатией в сочетании с аорто-коронарным шунтированием (АКШ). Выбор на аллогенные скелетные миобласты пал в связи с их потенциальной способностью к интеграции и миогенезу в поврежденном рубцово-измененном миокарде по данным экспериментальных и предварительных результатов пилотных клинических исследований, а также в связи с их большей жизнеспособностью по сравнению с аутологичными клетками пациентов среднего возраста или пожилых пациентов. Аллогенные клетки могут использоваться при наличии инфекционных или генетических заболеваний у реципиентов и позволяют создать банк здоровых клеток, что наряду с быстрой методикой культивирования может обеспечить доступность во времени и пространстве. Кроме того, получение аллогенных скелетных миобластов является абсолютно безопасным и не приводит к какой-либо функциональной недееспособности доноров. Тем не менее, в отличие от аутологичных клеток, применение чужеродных клеток требует проведения иммуносупрессорной терапии, что и было осуществлено нами. Для иммуносуппресии мы использовали пероральный циклоспорин у пациентов до и после операции в течении 2-х месяцев.

Аутологичные эндотелиальные клетки - предшественники CD133+ были получены из пунктата костного мозга подвздошной кости пациентов и далее выделены с помощью запатентованной CLINIMACS технологии магнитной сепарации (к.б.н. Еремеевой М.В. в лаборатории клеточных технологий НЦ ССХ им.А.Н. Бакулева РАМН), что позволяло получить чистую популяцию клеток CD133+ с высокой выживаемостью (87%) и сохраненными функциями. Время получения чистой популяции CD133+ занимало в среднем 3-4 часа. Введение клеток производилось в аутологичной сыворотке в средней дозе 2х10^6. Выбор на них пал в связи с быстрой технологией их получения, характеристиками и обнадеживающими результатами рандомизированных клинических исследований. По своим характеристикам, это клетки обладающие паракринными/ангиогенными свойствами, колониеобразующей, миграционной и адгезивной способностью, и дифференцирующиеся только во взрослые эндотелиальные клетки. Т.е. они демонстрируют свойства, характерные как для эндотелиальных, так и для гематопоэтических клеток. Свидетельства дифференцировки эндотелиальных клеток-предшественников в эндотелиальные клетки, способность интегрироваться в миокард и оказывать паракринное действие (выделять локально действующие субстанции - паракринные факторы, стимулирующие выживаемость клеток и процессы васкулогенеза) были получены лишь в экспериментальных исследованиях. По результатам рандомизированных клинических исследований эндотелиальные клетки-предшественники способствовали нестойкому (до 6 месяцев) улучшению глобальной сократимости миокарда ЛЖ (наблюдалось достоверное уменьшение конечно-систолического объема и увеличение фракции выброса левого желудочка; достоверных изменений конечно-диастолического объема левого желудочка не отмечалось), уменьшению дефектов перфузии у пациентов с ИКМП и не оказывали влияния на параметры ремоделирования миокарда. Поскольку не было получено веских прямых или косвенных доказательств о трансдифференцировке этих клеток в кардиомиоциты, объяснением вышеуказанных изменений стали называть их способность к паракринному воздействию. Хотя убедительных доказательств последнего также пока не получено в клинических исследованиях.

В качестве плацебо нами использовалась бессывороточная среда точного химического состава (0,45% NaCl, 2,5% D-Glucose, L-glutamine) с физиологическими PH и осмолярностью, не содержащая компоненты животного происхождения, разработанная коммерческим производителем PAA (Austria) в соответствии со строгими международными стандартами GMP для применения в клинических исследованиях.

Обследование пациентов до и после введения привносимого материала проводилось по следующему протоколу:

1. Стандартная электрокардиография (ЭКГ)

2. Тредмил - тест (Bruce protocol)

3. 6-минутный тест с ходьбой

4. Холтеровское мониторирование ЭКГ

5. Рентгенологическое исследование

6. Трансторакальное эхокардиографическое исследование (ЭХОКГ), Трансэзофагеальное ЭХОКГ при необходимости; помимо оценки традиционных показателей при сердечной недостаточности, проводилась оценка параметров деформации (strain) и скорости деформации миокарда (strain rate) - режимы цветового тканевого допплера по методу speckle tracking QLAB на аппарате Ei33 в динамике до и после введения привносимого материала, а также оценка характера движения миокарда с помощью методики цветового кинеза QLAB

7. Радионуклидные методы исследования (ОФЭКТ - однофотонная эмиссионная компьютерная томография миокарда с технецием Tc99m и ПЭТ - позитронно-эмиссионная компьютерная томография миокарда с 18 фтор-дезоксиглюкозой FDG)

9. Магнитно-резонансная томография миокарда (МРТ)

10. Коронарография, вентрикулография

11. В плазме артериальной и венозной крови (используя в качестве антикоагулянта ЭДТА) мы определяли содержание ангиогенных факторов - человеческого васкулоэндотелиального фактора роста VEGF (Hu VEGF-165), щелочного фактора роста фибробластов FGFb, плацентарного фактора роста PlGF - маркера ишемического повреждения миокарда и сосудистого воспаления, ангиогенина (Angiogenin), ангиопоэтина-1 (Angiopoetin-1), ангиопоэтина-2 (Angiopoetin-2); матриксной металлопротеиназы MMP-9 (цинк-зависимой эндопептидазы, содержание которой определялось в сыворотке, т.к. ЭДТА разрушает ее); фактора некроза опухоли TNF- (цитокина воспаления) - маркера повреждения тканей и индикатора прогрессирования сердечной недостаточности, антиангиогенного фактора - эндостатина (Endostatin); SDF-1б (стромального фактора роста), являющегося необходимым фактором хоуминга костно-мозговых стволовых клеток в ткани сердца и NTpro-BNP (конечного неактивного продукта синтеза мозгового предшественника натрийуретического пептида - зрелая форма BNP) - известного маркера прогрессирования сердечной недостаточности до и после введения клеток с помощью иммуноферментного анализа.

Сроки наблюдения составили 1,3,6,12 месяцев и далее после введения

Контрольную группу (n=25) составили 10 лиц женского пола и 15 лиц мужского пола (средний возраст 47,0±17,5 лет), у которых после проведенного обследования, включавшего стандартную ЭКГ в 12 отведениях, эхокардиографическое исследование и коронарографию было исключено наличие заболеваний сердца. У них также определяли в плазме артериальной и венозной крови содержание вышеуказанных факторов (VEGF₁₆₅, FGFb, MMP-9, TNF-, PLGF, ангиогенина, эндостатина, ангиопоэтина-1, ангиопоэтина-2, SDF-1, NTpro-BNP).

Статистическая обработка данных проведена на персональном компьютере с помощью программы «Statistica 6.0 for Windows”.

Результаты представлены как Му (среднее значение ± стандартное отклонение). Для сравнения количественных показателей в исследуемых группах и определения различий между ними использовали критерий Стьюдента и непараметрический U критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Для выявления различий между группами по частоте встречаемости различных признаков использовали критерий ч2 и точный критерий Фишера с построением четырехпольных таблиц. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

Связь между исследуемыми показателями оценивали с помощью корреляционного анализа с определением коэффициента корреляции (r) и его уровня значимости (р). Коэффициент корреляции считали достоверным и значимым при р < 0,05.

Статистической обработкой материала предусматривалось получение комбинационных таблиц, диаграмм, графиков и аналитических показателей: структуры (р), средних величин (М) и стандартных отклонений ( sd). В ходе анализа использовались три уровня значимости различий: p<0.05; p<0.01; p<0.001 - достоверность различий 95%, 99% и 99.9%.

Чувствительность, специфичность и диагностическая надежность рассчитывалась по стандартным формулам:

Чувствительность = число больных с признаком / общее число больных

Специфичность = число здоровых без признака / общее число здоровых

Диагностическая надежность = число больных с признаком + число здоровых без признака / общее количество больных и здоровых.

Для сравнительного анализа различный методов лечения ХСН мы производили расчет показателя NNT (Number Needed to Treat) - количество пациентов, которых необходимо лечить испытуемым вмешательством для предотвращения одного случая нежелательного исхода. NNT является числовым отражением эффективности исследуемого метода лечения. Это нормализованный показатель клинической эффективности, который позволяет сравнивать различные методы лечения.

Расчет показателя NNT производится следующим образом:

· Определяется разница между уровнями риска нежелательных явлений в группе предполагаемого вмешательства и в группе без применения этого вмешательства;

· После этого находится обратное значение разницы в уровнях риска (1/разница рисков x 100).

ARR=[EER-CER] (разность абсолютного риска в исследуемой группе и контрольной группе)

NNT = 1/ARR Ч100

Чем больше NNT, то тем меньше эффективность лечения и наоборот, и с годами значение этого показателя становится еще более актуальным и значимым.

Результаты исследований и обсуждение полученных данных

О результатах применения аллогенных скелетных миобластов у пациентов с ишемической кардиомиопатией

Результаты проведенного нами в 2003 году в сотрудничестве с Международным институтом клеточной трансплантологии США пилотного исследования по применению аллогенных скелетных миобластов в лечении 3-х пациентов с ишемической кардиомиопатией (одобренного Президентом РАМН, академиком В.И. Покровским, Ученым советом и этическим комитетом НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН) показали осуществимость процедуры интрамиокардиального введения скелетных миобластов в сочетании с операциями аортокоронарного шунтирования в условиях искусственного кровообращения. В раннем послеоперационном периоде мы наблюдали развитие жизнеугрожающих желудочковых аритмий у всех пациентов (до операции у пациентов не отмечалось желудочковых нарушений ритма) и один пациент 64 лет перенесший после операции рецидивирующие мелкоочаговые ИМ, умер на 35-е сутки от не купирующихся медикаментозно и хирургически (с помощью радиочастотной аблации) желудочковых аритмий.

При световой микроскопии миокарда ЛЖ этого пациента были выявлены интегрированные в рубцы (в местах инъекций) скопления скелетных миобластов, наряду с участками их отторжения лимфоцитами, несмотря на адекватную иммуносупрессивную терапию, подтвержденную отсутствием клинико-лабораторных проявлений иммунологического отторжения и адекватным содержанием циклоспорина в плазме крови. У выживших пациентов желудочковые аритмии были эффективно купированы терапией амиодароном. Через 1 месяц после операции по 24-часовому холтеровскому мониторированию ЭКГ нарушений ритма на поддерживающих дозах амиодарона не наблюдалось. Медикаментозная терапия амиодароном в целом продолжалась 6 месяцев, после её прекращения нарушений ритма также не отмечалось.

Таким образом, в нашем исследовании подтвердился аритмогенный потенциал скелетных миобластов, наблюдаемый во всех, проводимых до настоящего времени исследованиях после изолированного или сочетанного с аортокоронарным шунтированием интрамиокардиального введения аутологичных скелетных миобластов. Поэтому о безопасности их применения в лечении пациентов с ишемической кардиомиопатией не приходится. В проводимых в последнее время рандомизированных клинических исследованиях (например, в исследовании SEISMIC) всем пациентам с ИКМП за 6 месяцев до изолированного трансэндокардиального введения аутологичных скелетных миобластов имплантировали кардиовертеры-дефибрилляторы и проводили профилактическую терапию амиодароном в течение 1 месяца до и после процедуры.

Безусловно понятно, что у 40%-64% пациентов с хронической сердечной недостаточностью наблюдаются жизнеугрожающие желудочковые нарушения ритма, в связи с чем имеется высокий риск развития внезапной сердечной смерти и по показаниям им имплантируют кардиовертеры-дефибрилляторы, но протоколы исследования SEISMIC и некоторых других исследований, согласно которым всем пациентам за 6 месяцев до начала исследования профилактически имплантируется кардиовертер-дефибриллятор и проводится фармакологическая профилактика амиодароном при его переносимости, с нашей точки зрения не совсем согласуется с утверждением из консенсуса Европейского общества кардиологии о том, что «оценка клинической эффективности клеточных технологий исключает использование традиционных до-клинических методов фармакологического и нефармакологического лечения и профилактики» (Bartunek J. et al, март 2006г). Это не позволит проводить адекватную оценку истинных эффектов используемых клеточных технологий.

Согласно консенсусу специальной комиссии Европейского общества кардиологии оценивающей клинические исследования по использованию аутологичных взрослых стволовых клеток для репарации сердца «фаза I клинических исследований явно показала осуществимость методик введения скелетных миобластов и выявила потенциальный риск аритмий. Однако, присущая рубцово-измененному миокарду аритмогенная природа затрудняет окончательное суждение о причинно-следственной связи аритмий с введением миобластов» (Bartunek J. et al, март 2006г). В связи с этим, несмотря на выявленный аритмогенный потенциал, в настоящее время проводятся многоцентровые исследования случай-контроль с изолированным транскатетерным введением скелетных миобластов для лечения пациентов с ИКМП. Продолжаются вторая и третья фазы рандомизированных плацебо-контролируемых исследований SEISMIC, MYOHEART и MARVEL, об окончательных результатах которых мы узнаем в 2009 году.

Итак, взвешивая все плюсы и минусы скелетных миобластов на основании собственных наблюдений и результатов рандомизированных плацебо-контролируемых исследований невозможно не отметить факты:

1) гибели скелетных миобластов после их привнесения в миокард в первые 48 часов вследствие пока неразгаданного многофакторного процесса, поэтому многими исследователями рассматривается путь применения иммуносупрессии даже при использовании аутологичных клеток, что показало значительное улучшение их выживаемости, однако все это ставит под сомнение вопрос о резистентности скелетных миобластов к ишемии;

2) различия электрофизиологических свойств скелетных миобластов и кардиомиоцитов, поэтому с нашей точки зрения, скелетные миобласты будут нести в себе аритмогенный потенциал даже при условии их искусственной трансфекции белком коннексином-43 для образования щелевых контактов с резидентными кардиомиоцитами. Тем не менее, некоторыми исследователями ставится под сомнение вопрос о необходимости экспрессии белка коннексина-43 скелетными миобластами, поскольку есть свидетельства интеграции скелетных миобластов в рубцово-измененный миокард и улучшение диастолической и систолической его функций в силу пока не установленных механистических и/или паракринных эффектов (Menasche 2006г, Dib 2005г, Pagani 2006г); также как был продемонстрирован факт интеграции аллогенных скелетных миобластов в виде колоний в рубцово-измененный миокард на 35-ые сутки после их внедрения в нашем исследовании, наряду с зонами их отторжения, и

3) невозможности самостоятельной оценки эффективности скелетных миобластов вне зависимости от положительных эффектов аортокоронарного шунтирования, которое выполнялось этим пациентам, что согласуется с мнением других исследователей, приостановивших в этой связи многоцентровое рандомизированное исследование MAGIC после анализа результатов использования скелетных миобластов в сочетании с операциями аортокоронарного шунтирования у 95 пациентов с ИКМП.

По данным рандомизированного исследования SEISMIC, оценивающего эффективность и безопасность изолированного трансэндокардиального введения аутологичных скелетных миобластов, через 6 месяцев не наблюдалось достоверного улучшения ни глобальной, ни региональной сократимости миокарда ЛЖ по сравнению с контрольной группой, также как не отмечалось достоверного увеличения толерантности к физическим нагрузкам. Поэтому авторы исследования пока говорят об осуществимости данного вмешательства у пациентов с ИКМП и возможном облегчении симптоматики, но не об эффективности изолированного использования скелетных миобластов при хронической сердечной недостаточности (ХСН).

Таким образом, в настоящее время трансплантация аллогенных скелетных миобластов с целью регенерации рубцово-измененного миокарда у пациентов с ишемической кардиомиопатией осуществима, но не безопасна и не эффективна.

О результатах применения аутологичных клеток-предшественников эндотелиоцитов CD133+ у пациентов с ишемической и идиопатической дилатационной кардиомиопатиями

В исследование по оценке применения аутологичных клеток-предшественников эндотелиоцитов CD133+ были включены 50 пациентов: 24 пациента с ишемической кардиомиопатией (ИКМП) и 26 пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией (ДКМП). Все пациенты относились к III-IV ФК СН по NYHA и отвечали следующим критериям включения и исключения из исследования:

Критериями включения в исследование для пациентов с ишемической болезнью сердца являлись следующие:

Ш Фракция выброса левого желудочка >20% и ?45%

Ш Перенесенный в анамнезе инфаркт миокарда (рубцовая фаза инфаркта миокарда или постинфарктный кардиосклероз)

Ш Невозможность реваскуляризации зоны инфаркта (нешунтабельная и/или непригодная для транслюминальной балонной ангиопластики коронарная артерия)

Ш Возможность осуществления реваскуляризации смежных областей миокарда или отсутствие такой возможности

Ш Наличие рубцовой зоны с жизнеспособным миокардом по данным стресс-эхокардиографии, радионуклидных методов исследования (однофотонной компьютерной эмиссионной компьютерной томографии с 99mTc, позитронно-эмиссионной томографии с 18FDG)

Ш Согласие больного (пациенты, вошедшие в исследование, подписали информированные согласия)

Критериями исключения из исследования являлись следующие:

Ш Острый инфаркт миокарда

Ш Недавний (менее 6 недель до начала исследования) инсульт

Ш Наличие указаний на диагностированные злокачественные новообразования в течение последних 5 лет,

Ш Выраженная дисфункция почек (мочевина крови > 50 мг/дл, креатинин более или равный 2,5 мг/дл),

Ш Выраженная дисфункция печени (аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза в 5 раз превышающие верхнюю границу нормы),

Ш Иммунокомпрометирующий статус,

Ш Наличие активной инфекции любого типа,

Ш Тяжелое легочное заболевание,

Ш Алкоголизм

Включенные в исследование пациенты с идиопатической дилатационной кардиомиопатией имели фракцию выброса ЛЖ >20% и ?45% относились к III-IV ФК ХСН по NYHA и не имели вышеуказанных критериев исключения из исследования.

Пациенты были разделены на группы в зависимости от а) вида привносимого материала: аутологичные клетки-предшественники эндотелиоцитов CD133+ [исследуемая группа] или плацебо [группа плацебо], б) способа введения привносимого материала: изолированно транскатетерно интракоронарно или трансэндокардиально под флюороскопическим контролем с помощью гибкой иглы с аксиальной системой доставки, регулятором глубины вкола для интрамиокардиальной пункции (0,3мм) и дозатором введения, изобретенной Н.А. Чигогидзе (НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева), или интраоперационно трансэпикардиально путем введения привносимого материала в зоны интереса с помощью инсулиновых игл в сочетании с открытыми операциями на сердце.

Дизайн нашего исследования был построен на применении как современных неинвазивных и инвазивных методов обследования пациентов с ХСН для оценки динамики параметров ремоделирования, перфузии и метаболизма миокарда после клеточной терапии, так и оценке целого ряда биомаркеров в плазме крови у пациентов до и после клеточной терапии в сравнении с группой плацебо с целью выявления возможных паракринных эффектов клеточной терапии и суждения о динамике ремоделирования миокарда. Аналогов подобного дизайна исследования в клинической практике по оценке эффективности клеточной терапии мы не встречали.

В группу пациентов с изолированным введением аутологичных костно-мозговых эндотелиальных клеток-предшественников CD133+ и плацебо вошли 32 пациента: 14 пациентов с ишемической кардиомиопатией и 18 пациентов с идиопатической дилатацонной кардиомиопатией. В исследуемую группу, которым вводили аутологичные костно-мозговые эндотелиальные клетки-предшественники CD133+, вошли 14 пациентов (7 пациентов с ДКМП и 7 пациентов с ИКМП), а в группу плацебо - 18 пациентов (11 пациентов с ДКМП и 7 пациентов с ИКМП).

В группу пациентов с сочетанным введением аутологичных костно-мозговых эндотелиальных клеток-предшественников CD133+ и плацебо вошли 18 пациентов: 10 пациентов с ишемической кардиомиопатией (6 пациентам вводили плацебо, 4-м - CD133+) и 8 пациентов с идиопатической дилатацонной кардиомиопатией (4-м вводили плацебо и 4-м - CD133+). Интраоперационное трансэпикардиальное введение привносимого материала осуществлялось с помощью инсулиновых игл в зоны интереса во время открытых операций на сердце (у пациентов ИКМП - в 7 случаях в сочетании с аортокоронарным шунтированием, в 2-х случаях с аортокоронарным шунтированием в комбинации с трансмиокардиальной лазерной реваскуляризацией миокарда, в 2-х случаях с аортокоронарным шунтированием и вентрикулопластикой левого желудочка (ЛЖ) по Дору, в 1 случае с аортокоронарным шунтированием в комбинации с аннулопластикой митрального клапана на кольце Карпантье; в 8 случаях в сочетании с аннулопластикой митрального клапана на кольце Карпантье в комбинации с вентрикулопластикой ЛЖ в 6 случаях и в комбинации с пластикой трикуспидального клапана на кольце Карпантье в 2-х случаях у пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией).

Динамика ФК СН и толерантности к физическим нагрузкам. В послеоперационном периоде в общем в исследуемой группе и группе плацебо отмечалась тенденция к достоверному уменьшению ФК СН и увеличению толерантности к физическим нагрузкам, однако статистически значимой разницы между группами плацебо и исследуемой группой выявлено не было, возможно потому, что 39% пациентам введение клеток осуществлялось в сочетании с различными операциями, что не позволяет адекватно оценивать эффективность непосредственно клеточной терапии.

Проанализировав результаты динамики толерантности к физическим нагрузкам, мы пришли к выводу, что для оценки истинной эффективности клеточной терапии необходимо ориентироваться на данные изолированного использования клеточных технологий у пациентов с ИКМП и ДКМП. При анализе сочетанных вмешательств представлялось не возможным интерпретировать эффекты клеточной терапии вне зависимости от положительных результатов выполненного спектра операций. Поэтому далее мы проанализировали результаты только изолированного транскатетерного интракоронарного и трансэндокардиального введения привносимого материала у пациентов с ИКМП и ДКМП (n=32).

При отдельном анализе пациентов с ИКМП с введением привносимого материала изолированно, без сочетанных операций до 6 месяцев после данной процедуры наблюдалось достоверное увеличение толерантности к физическим нагрузкам в исследуемой группе по сравнению с плацебо (в сроки через 6 месяцев не отмечалось достоверной динамики толерантности к физическим нагрузкам по сравнению с толерантностью к физическим нагрузкам в сроки через 3 месяца в исследуемой группе), а через 1 год достоверной разницы между группами не наблюдалось.

При отдельном анализе пациентов с ДКМП с введением привносимого материала изолированно, не наблюдалось достоверной динамики толерантности к ФН по тесту 6-минутной ходьбы как в исследуемой группе, так и в группе плацебо (р>0,05 между исследуемой группой и группой плацебо).

Динамика ЭХОКГ показателей ремоделирования ЛЖ. По данным ЭХОКГ исследований мы наблюдали нестойкую (в течение 3-6 месяцев) динамику достоверного уменьшения объемов ЛЖ с умеренным увеличением ФВ ЛЖ в группе пациентов с ИКМП после изолированного интрамиокардиального введения аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиальных клеток CD133+ по сравнению с группой плацебо. При этом не наблюдалось достоверных изменений других важнейших глобальных индексов ремоделирования, таких как масса миокарда ЛЖ и объем ЛП, и не происходило регресса митральной недостаточности. Через 3 месяца после изолированного интрамиокардиального введения аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиальных клеток CD133+ у пациентов с ИКМП также отмечалось умеренное, но статистически значимое улучшение региональной сократимости в зонах интереса по сравнению с «нелеченными» зонами, группой плацебо и по отношению к исходным значениям. Через 6 месяцев по сравнению с данными от 3 месяцев существенной положительной динамики не отмечалось. В дальнейшие сроки наблюдения (через 1 год и далее) эти изменения нивелировались. После изолированного интракоронарного введения аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиальных клеток CD133+ в группе пациентов с ИКМП не происходило достоверных изменений по сравнению с группой плацебо. Что касается пациентов ДКМП, то у них не наблюдалось достоверных изменений индексов ремоделирования ЛЖ (конечного-диастолического размера КДР и конечно-диастолического объема КДО ЛЖ, массы миокарда ЛЖ и объема левого предсердия), соответственно фракции выброса (ФВ) ЛЖ и митральной недостаточности как после изолированного интрамиокардиального введения, так и после интракоронарного введения аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиальных клеток CD133+ по сравнению с группой плацебо.

Кроме того как у пациентов с ИКМП, так и у пациентов ДКМП не наблюдалось достоверного изменения индекса производительности миокарда (MPI - myocardial performance index or index Tei) - допплеровского параметра, используемого для оценки систоло-диастолической функций левого и правого желудочков, независимого от частоты сердечных сокращений, артериального давления и от геометрической конфигурации сердца, и высоко коррелирующего с инвазивными параметрами ХСН.

Динамика перфузии и метаболизма миокарда по данным ОФЭКТ и ПЭТ. Прежде чем изложить результаты этих исследований, следует отметить, что пациентам c ишемической кардиомиопатией изолированное транскатетерное трансэндокардиальное введение привносимого материала осуществлялось на основании результатов ОФЭКТ и ПЭТ миокарда в зоны рубцово-измененного, но жизнеспособного миокарда и зоны ишемии в 79% случаев, а в 21% случаев - в зоны нежизнеспособного миокарда. На основании данных этих исследований 93% пациентам ИКМП изолированное транскатетерное трансэндокардиальное введение привносимого материала осуществлялось в задне-боковые сегменты ЛЖ, 57% - в задне-нижние сегменты ЛЖ помимо задне-боковых сегментов и 64% в верхушечные сегменты ЛЖ наряду с задне-боковыми сегментами ЛЖ. Таким образом, в нашем исследовании не было случаев трансэндокардиального введения привносимого материала в переднюю стенку миокарда ЛЖ у пациентов с ИКМП.

Изолированное транскатетерное интракоронарное введение привносимого материала осуществлялось у 8 пациентов с ИКМП - в 4-х случаях в ПМЖВ - переднюю межжелудочковую артерию (во всех случаях отмечались стенозы ПМЖВ в с/3 от 95% до 99%; а эти пациенты переносили передне-перегородочно-верхушечные ИМ) и в 4-х случаях в ПКА - правую коронарную артерию (во всех случаях отмечалась окклюзия д/3 ПКА и стенозы с/3 ПКА от 75 до 99%; а эти пациенты переносили ИМ по задней стенке ЛЖ).

Пациентам с идиопатической дилатационной кардиомиопатией изолированное транскатетерное трансэндокардиальное введение привносимого материала осуществлялось на основании результатов ОФЭКТ, ПЭТ миокарда и левой вентрикулографии - в зоны с дефектами перфузии, нарушениями метаболизма и наиболее выраженным гипокинезом по данным ЛВГ. Исходно для этих пациентов характерным являлось наличие зон с умеренным снижением перфузии и метаболизма миокарда, свидетельствующее о наличии фиброзированного и в то же время жизнеспособного миокарда на фоне глобального снижения сократительной способности ЛЖ с диффузным гипокинезом стенок. На основании данных этих исследований 100% пациентам с идиопатической ДКМП изолированное транскатетерное трансэндокардиальное введение привносимого материала осуществлялось в задне-диафрагмальные сегменты ЛЖ, а 44% пациентам ДКМП - помимо задне-диафрагмальных сегментов введение привносимого материала осуществлялось в передне-боковой и верхушечный сегменты ЛЖ. Введение в зону межжелудочковой перегородки не производилось ни пациентам с ишемической болезнью сердца, ни пациентам с идиопатической дилатационной кардиомиопатией ввиду известной уязвимости этой области в плане высокой вероятности возникновения жизнеугрожающих аритмий. 2-м пациентам с ДКМП введение привносимого материала осуществляли интракоронарно в систему левой и правой коронарных артерий - ПМЖВ и ПКА.

Результаты анализа данных ОФЭКТ и ПЭТ показали, что после изолированного использования аутологичных клеток-предшественников CD133+ у пациентов ИКМП и ДКМП:

· Перфузия миокарда умеренно, но достоверно улучшалась после изолированного интрамиокардиального введения аутологичных клеток-предшественников CD133+ в зоны дефектов перфузии с жизнеспособным миокардом у 79% пациентов ИКМП в отличие от пациентов с ДКМП и в отличие от интрамиокардиального введения плацебо при ИКМП и ДКМП

· Перфузия миокарда достоверно не менялась при интракоронарном способе введения CD133+ у пациентов ИКМП и ДКМП, так же как не менялась при интракоронарном способе введения плацебо у этих пациентов

· Достоверное улучшение перфузии у 79% пациентов ИКМП отмечалось в «леченных» сегментах (преимущественно на нагрузке, меньше в покое) с исходно умеренным и значительным снижением перфузии, но сохранным метаболизмом ¹⁸ФДГ (фтор-дезоксиглюкозы), к 3-6 месяцам после изолированного интрамиокардиального введения CD133+ по сравнению с плацебо. Через 1 год этот эффект нивелировался. В нелеченных сегментах перфузия не менялась.

· У 21% пациентов с ИКМП, которым изолированное интрамиокардиальное введение аутологичных клеток-предшественников CD133+ производилось в зоны дефектов перфузии с нежизнеспособным миокардом по данным ПЭТ, достоверных изменений метаболизма не наблюдалось как в самой группе по сравнению с исходными значениями, так и по сравнению с группой плацебо

· Процент жизнеспособных и нежизнеспособных сегментов по данным ПЭТ достоверно не менялся после клеточной терапии по сравнению с плацебо.

Динамика биомаркеров - ангиогенных факторов, цитокинов воспаления и маркеров ремоделирования ХСН. В плазме артериальной и венозной крови мы определяли 11 биомаркеров у 4-х групп пациентов: 1) в здоровой группе (n=25; средний возраст 47±17,5 лет), 2) исследуемой группе (n=14; средний возраст 55,3±13,4 лет) и 3) группе плацебо (n=18; средний возраст 51,7±15,3 лет), включающих пациентов с ишемической и идиопатической дилатационной кардиомиопатиями с ФВ ЛЖ<45% до и после изолированного интрамиокардиального введения привносимого материала, а также 4) в группе пациентов с ишемической болезнью сердца с ФВ ЛЖ >50% до и после операций АКШ без искусственного кровообращения или стентирования коронарных артерий (n=36; 61,3±8,6 лет).

Через 14 дней после изолированного транскатетерного интрамиокардиального введения аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиоцитов CD133+ (исследуемая группа) мы наблюдали достоверное увеличение концентрации SDF-1б и VEGF только в венозной крови и достоверное снижение концентрации PlGF в венозной крови. При отдельном анализе динамики биомаркеров в подгруппах пациентов с ишемической и идиопатической дилатационной кардиомиопатией оказалось, у пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией наблюдалось достоверное повышение концентрации в плазме крови SDF-1б наряду с достоверным повышением концентрации NT-proBNP, а у пациентов с ишемической кардиомиопатией наблюдалось лишь достоверное снижение концентрации PlGF, при этом концентрация NT-proBNP у них не менялась. В группе плацебо каких либо изменений не отмечалось. При сравнительном анализе послеоперационной (в сроки через 14 дней после изолированного введения привносимого материала) концентрации биомаркеров в исследуемой группе и группе плацебо, в исследуемой группе достоверно выше были показатели SDF-1б и VEGF. Однако при сравнительном анализе послеоперационной концентрации биомаркеров у пациентов 2-х подгрупп в исследуемой группе - ИКМП и ДКМП, оказалось, что у пациентов с идиопатической ДКМП достоверно выше были послеоперационные концентрации Angiopoetin-2, SDF-1б и NT-proBNP чем у пациентов с ишемической кардиомиопатией, различий в концентрации других показателей выявлено не было.

При оценке дальнейшей динамики наблюдавшихся изменений концентраций SDF-1б, VEGF, PlGF, NT-proBNP и Angiopoetin-2 в исследуемой группе после изолированного интрамиокардиального введения аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиоцитов CD133+, оказалось, что в сроки через 1 месяц после данной процедуры нивелировались изменения концентраций SDF-1б, VEGF и Angiopoetin-2 в подгруппе ДКМП, а изменения концентрации PlGF в подгруппе ИКМП - через 3 месяца. Концентрация NT-proBNP в исследуемой группе и группе плацебо достоверно не менялась.

Вышеуказанные результаты означают, что у пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией аутологичные костно-мозговые предшественники эндотелиоцитов CD133+ попадают в кровоток, что отражается повышением концентрации SDF-1б у этих пациентов, так как из-за сниженной активации факторов хоуминга в ткани сердца они не мигрируют т.е. не попадают в зоны поражения сосудистого эндотелия и миокарда (поэтому мы и наблюдаем увеличение содержания SDF-1б в крови при отсутствии или значительном снижении их экспрессии в миокарде, в отличие от пациентов с ИКМП), что подтверждается клиническими данными (отсутствовало изменение ФК СН по NYHA), объективными методами обследования (не наблюдалось достоверного уменьшения объемов сердца и увеличения фракции выброса, уменьшения дефектов перфузии), лабораторными методами (у этих пациентов наблюдалось достоверное увеличение концентрации NT-proBNP после процедуры, что является не благоприятным прогностическим признаком), частотой госпитализаций и выживаемостью этих пациентов в ближайшем и отдаленном периодах. Т.е. указанная терапия не приводила к какому-либо торможению или регрессу ремоделирования миокарда у этих пациентов. Вышеуказанные изменения концентрации SDF-1б нивелировались в сроки через месяц после изолированного введения, возвращаясь к исходным значениям, которые, тем не менее, были значимо выше, чем у пациентов с ИКМП, и по сравнению с нормой.

У пациентов с ишемической кардиомиопатией из биомаркеров наблюдалось только достоверное снижение концентрации PlGF после изолированного интрамиокардиального введения аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиоцитов CD133+, которая исходно у них была значимо больше чем у пациентов с ДКМП. Это является прогностически благоприятным признаком, поскольку в настоящее время доказано и нами также было продемонстрировано, что концентрация этого специфического для ишемической болезни сердца маркера сосудистого воспаления и проангиогенного фактора прогрессивно возрастает по мере увеличения ФК СН по NYHA (р=0,00012), достоверно коррелирует с NT-proBNP (r=0,56, р=0,015) и с ФВ ЛЖ (r=-0,56, р=0,023). Таким образом, чем больше тяжесть поражения миокарда у пациентов ИБС, тем выше концентрация PlGF. Поэтому его рассматривают в качестве прогностического маркера сердечной недостаточности у пациентов с ишемической кардиомиопатией. Тем не менее, в послеоперационном периоде корреляции PlGF с NT-proBNP выявлено не было, возможно из-за того, что 1) в сроки через 14 дней не происходило столь стремительного и достоверного снижения конечно-диастолического объема ЛЖ, конечно-диастолического давления ЛЖ и массы миокарда ЛЖ, для того чтобы уменьшился выброс NT-proBNP, что мы собственно и наблюдали, так как изменения концентрации NT-proBNP в послеоперационном периоде мы не отмечали, так же как и других изменений, и 2) данное снижение концентрации PlGF нивелировалось в сроки через 3 месяца после введения CD133+, возвращаясь к исходному значению, превышающему таковое у пациентов с ДКМП.

Вышеизложенное свидетельствует о том, что у пациентов с ИКМП CD133+ мигрируют и попадают в зону повреждения миокарда (о чем свидетельствует достоверно более низкая концентрация фактора хоуминга SDF-1б в крови по сравнению с пациентами с ДКМП) вследствие более высокой активности экспрессии факторов хоуминга в рубцово-измененном миокарде в отличие от миокарда пациентов с ДКМП, что выражалось в достоверном снижении концентрации PlGF и положительной клинической динамике (по ФК СН, улучшению толерантности к ФН, результатов ЭХОКГ и данных перфузии миокарда) в сроки через 1-3 месяца. В сроки через 6 месяцев по сравнению с данными от 3-х месяцев существенной положительной динамики в клинических показателях и объективных методах исследования не отмечалось.

Таким образом, однократное изолированное транскатетерное интрамиокардиальное введение аутологичных предшественников эндотелиальных клеток CD133+ у пациентов с ИКМП приводило к нестойкой слабовыраженной положительной динамике. Мы отмечаем слабовыраженной, поскольку в данной группе по сравнению с группой плацебо не происходило достоверных изменений массы миокарда ЛЖ, допплеровского индекса производительности миокарда, объема левого предсердия и митральной недостаточности - т.е. большинства важнейших индексов ремоделирования ЛЖ. Отмечалось лишь достоверное уменьшение объемов ЛЖ по сравнению с таковыми в группе плацебо с умеренным увеличением ФВ ЛЖ (р=0,045 по сравнению с исходными значениями, и в группе CD133+; р=0,049 по сравнению с плацебо) и достоверное улучшение перфузии в леченных сегментах по сравнению с нелеченными сегментами в сроки до 6 месяцев при отсутствии изменений метаболизма миокарда. Эти изменения нивелировались в сроки через 6 месяцев после введения CD133+, и достоверных различий между исследуемой группой и группой плацебо не отмечалось.

Необходимо также отметить, что пациенты из исследуемой группы и группы плацебо после поступления в НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева получали более агрессивную медикаментозную терапию по сравнению с до-госпитальным этапом. При поступлении в стационар пациенты в среднем получали 3,4 препарата, а во время и после госпитализации в среднем 7,2 препарата (р=0,03 по сравнению с количеством принимаемых препаратов до госпитализации в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН), что существенно улучшало клиническое состояние в большей степени пациентов с ИКМП, чем ДКМП.

Сравнив концентрацию биомаркеров у пациентов с ИКМП в сроки через 14 дней после изолированного интрамиокардиального введения привносимого материала (аутологичных предшественников эндотелиальных клеток CD133+ или плацебо) с концентрацией биомаркеров у операбельных пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) в такие же сроки после операций АКШ без искусственного кровообращения (ИК) и стентирования коронарных артерий, оказалось, что концентрация PlGF была значимо меньше после изолированного интрамиокардиального введения аутологичных предшественников эндотелиальных клеток CD133+, чем после изолированного интрамиокардиального введения плацебо и операций АКШ без ИК и стентирования коронарных артерий, что является проявлением паракринного эффекта аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиоцитов CD133+. Что касается NT-proBNP, то через 14 дней после изолированного интрамиокардиального введения привносимого материала в исследуемой группе и группе плацебо оно было достоверно больше, чем после операций АКШ без ИК или стентирования в эти же сроки, что объясняется большей тяжестью состояния пациентов в исследуемой группе и группе плацебо как исходно, так и после изолированного интрамиокардиального введения привносимого материала. Но в любом случае, концентрация NT-proBNP достоверно не менялась у пациентов ИКМП после изолированного интрамиокардиального введения аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиоцитов CD133+, так как не происходило достоверного снижения конечно-диастолического объема ЛЖ, конечно-диастолического давления ЛЖ и массы миокарда ЛЖ, для того чтобы уменьшился выброс NT-proBNP.

Подводя итог оценки паракринной активности аутологичных костно-мозговых предшественников эндотелиальных клеток CD133+ после их однократного изолированного интрамиокардиального введения пациентам с ДКМП и ИКМП, можно сказать, что 1) паракринные свойства этих клеток проявляются, но не эффективны у пациентов с идиопатической ДКМП, и 2) малоэффективны и нестойки у пациентов с ИКМП.

Выживаемость, частота госпитализаций и сравнение с другими методами лечения хронической сердечной недостаточности. За 5-летний период наблюдения в течение 1-го года после операций изолированного интракоронарного/интрамиокардиального введения привносимого материала в исследуемой группе процент выживших составил 77%, а в группе плацебо - 80% (р=0,67). Соответственно летальность в исследуемой группе составила 23%, а в группе плацебо - 20% (р=0,81). Из них, как в исследуемой группе, так и в группе плацебо по одному летальному исходу приходилось на пациентов с ишемической кардиомиопатией - биологическая смерть наступала от прогрессирующей левожелудочковой недостаточности, урежения сердечного ритма и фибрилляции желудочков. Остальные летальные исходы наблюдались у пациентов с идиопатической ДКМП (возраст составил от 22 до 48 лет) - они умерли от внезапной сердечной смерти.

За период наблюдения после выписки из НЦ ССХ им. А. Н. Бакулева высокой была частота госпитализации выживших пациентов в связи с ухудшением состояния - декомпенсацией сердечной недостаточности.