Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Вирусологический мониторинг как ключевой элемент контроля выполнения в Российской Федерации программы ликвидации полиомиелита

03.00.06 - вирусология

14.00.30 - эпидемиология

Иванова Ольга Евгеньевна

Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Дроздов Сергей Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Семёнов Борис Фёдорович

доктор медицинских наук, профессор, Карпович Лидия Григорьевна

доктор биологических наук, профессор Тихонова Нина Тимофеевна

Ведущая организация: ФГУН "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора

Защита состоится "__" ______________2009 г. в ____часов___минут на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат разослан "___"________________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Медведкина О.А.

Общая характеристика работы

Методические указания

1. Сбор и концентрирование кишечных вирусов из воды с помощью водопроницаемых пакетов с сорбентом. - Минск-1997.

2. Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика. МУ 3.1.1.2130-06. - Москва. - 2006.

3. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов. МУК 4.2.2029-05. - Москва. - 2006.

4. Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции. МУ 3.1.1.2363-08. - Москва. - 2008.

5. Организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП). МУК 4.2.2410-08. - Москва. - 2008.

6. Организация и проведение вирусологических исследований на полиомиелит, другие (неполио) энтеровирусы материала из объектов окружающей среды. МУ 3.1.1.2357-08. - Москва. - 2008.

7. Эпидемиологический надзор за полиомиелитом и острыми вялыми параличами в постсертификационный период. МУ 3.1.1.2360-08. - Москва. - 2008.

Материалы диссертационной работы были использованы при подготовке практического руководства "Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней" (под ред. академика РАМН, профессора Г.Г. Онищенко и чл-корр. РАМН, профессора В.В. Кутырева. - Москва. - "Медицина". - 2009. - 470 С.)

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для реализации программы ликвидации полиомиелита в РФ создана система вирусологического мониторинга ПВ, которая основана на исследовании материалов, полученных при выполнении эпидемиологического надзора за полиомиелитом и ОВП и дополнительных видов надзора за ПВ в соответствии с алгоритмом вирусологических исследований, рекомендованным ВОЗ.

2. Существование ограниченной территории (региона) с низким уровнем коллективного иммунитета к ПВ в неэндемичной стране (регионе) с высоким общим уровнем коллективного иммунитета является фактором риска для возникновения случаев (вспышки) заболевания полиомиелитом в случае заноса дикого ПВ из эндемичного очага. Поэтому мероприятия по иммунизации против полиомиелита и надзору за ПВ в РФ не могут быть прекращены и должны поддерживаться на уровне, рекомендованном ВОЗ.

3. С 1996 г. в РФ прекращена циркуляция дикого ПВ. Выделение дикого ПВ в РФ в 2004 г. было фактом внутрилабораторной контаминации.

4. Уровень заболеваемости и основные характеристики ВАПП в РФ в период применения для иммунизации против полиомиелита ОПВ (1998-2005 гг.) были такими же, как в развитых странах мира, применяющих ОПВ. Факторами риска для развития ВАПП являются иммунодефицитное состояние и неблагополучный преморбидный статус ребёнка.

5. В хорошо иммунизированной популяции возможна длительная скрытая циркуляция вирусов-производных ОПВ, которая может привести к формированию высоко нейровирулентных вариантов вакцинородственных полиовирусов. Изменение стратегии применения полиовирусных вакцин в РФ - прекращение применения ОПВ и замена её ИПВ - позволит предотвратить случаи ВАПП у реципиентов вакцины, значительно снизить риск возникновения VDPV.

6. При сохранении эндемичных резервуаров дикого ПВ исследования сточных вод являются важнейшей частью мониторинга ПВ в РФ. Роль этого вида надзора для выявления VDPV будет возрастать по мере сокращения использования ОПВ

7. Система вирусологического мониторинга ПВ может быть использована для решения задачи надзора за неполиомиелитными ЭВИ. Уровень циркуляции НПЭВ среди здорового населения РФ в целом без учёта возрастных, сезонных и географических факторов в межэпидемический период составляет 5±0,46%. "Эпидемическими" серотипами НПЭВ в период 1999-2007 гг. были вирусы CBV 1-6, Е7, 30, 11, 6.

Апробация работы состоялась на заседании межлабораторного Учёного совета Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН 28 апреля 2009 г.

Материалы исследований были представлены и обсуждены:

на научных конференциях - Х Международном Вирусологическом Конгрессе (Иерусалим, Израиль, 1996); Научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии" (Москва, 1999); Научно-практической конференции "Инфекционные болезни на рубеже ХХI века" (Москва, 2000); Научной конференции "Достижения отечественной эпидемиологии в ХХ веке. Взгляд в будущее" (Санкт-Петербург, 2001); 12-ой конференции Европейской Научной Группы по молекулярной биологии пикорнавирусов (Sea Creast, США, 2002); Международном конгрессе "Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы" (Санкт-Петербург, 2003.); 6-м международном форуме по глобальной вакцинологии "Вакцины и иммунизация" (Минск, Беларусь, 2003); Всероссийской научно-практической конференции "Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск" (Санкт-Петербург, 2003); 7-м международном симпозиуме по позитивным РНК-содержащим вирусам (Сан-Франциско, США, 2004); 6-м международном конгрессе "Вода: экология и технология" ЭКВАТЭК-2004 (Москва, 2004); конференции "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004); Научной конференции, посвящённой 50-летию ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (Москва, 2005); VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (Волгоград, 2005); Всероссиийской научной конференции "Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций" (Санкт-Петербург, 2005); IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации" (Москва, 2007); Международном медицинском форуме "Индустрия здоровья", Симпозиум "Полиомиелит - прошлое, настоящее и будущее (к 100-летию установления вирусной этиологии болезни)" (Москва, 2008); Национальной конференции "Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы" (Москва, 2008); Совместном заседании Восточно-Европейского совета экспертов в области вакцинопрофилактики и Совета экспертов по профилактике вирусных гепатитов (Москва, 2008); 4-ой международной конференции, посвящённой 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2008); VII Конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2008);

на совещаниях ВОЗ - 1-м Совещании Европейской Региональной Комиссии по сертификации ликвидации полиомиелита (Париж, Франция, 1996); Совещании по совершенствованию надзора за полиомиелитом и контролю за дифтерией (Берлин, 1996); 3-м совещании ВОЗ по вопросам координации операции МЕКАКАР (Ташкент, Узбекистан, 1996); 2-м консультативном совещании Глобальной лабораторной сети ВОЗ по полиомиелиту (Женева, Швейцария, 1996); 1-м совещании рабочей группы по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде (Женева, Швейцария, 1997); Внутрирегиональном координационном совещании ВОЗ по вопросам эпиднадзора и сертификации ликвидации полиомиелита (Киев, Украина, 1998); Совещании Региональной сертификационной комиссии по ликвидации полиомиелита по рассмотрению документации отдельных стран СНГ и Югославии (Кишинёв, Молдова, 2000); Суб-Региональном совещании координаторов по безопасному лабораторному хранению диких полиовирусов (Вена, Австрия, 2001); Совещании по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде (Копенгаген, Дания, 2002); 12-м консультативном совещание глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ (Женева, Швейцария, 2006); Совещании Европейской Региональной лабораторной сети по диагностике полиомиелита (Рим, Италия, 2006); Объединённом совещании по вопросам контейнмента и лабораторной сети по полиомиелиту Европейского региона ВОЗ (Мальта, Ст. Джулиан, 2007);

на пленуме "Вакцинопрофилактика полиомиелита в современных условиях" проблемной комиссии "Полиомиелит и другие энтеровирусные инфекции" (ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, Москва, 2008);

Публикации. По результатам работы опубликовано 70 печатных работ; основные материалы представлены в 26 статьях в реферируемых научных журналах, из них 8 опубликованы за рубежом, в одной монографиии, 2 статьях в сборниках.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав (6 глав включают данные литературы, описание использованных материалов и методов, результаты собственных исследований), обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 284 источника (67 отечественных и 217 иностранных). Работа содержит 39 таблиц и 17 рисунков.

Содержание работы

Материалы и методы исследований

Для выполнения разделов работы, посвящённых вирусологическим результатам надзора за ОВП, исследованию приоритетных ("горячих") случаев ОВП, случаев ВАПП, дополнительному надзору за ПВ, безопасному лабораторному хранению диких ПВ, были исследованы различные материалы, собранные в РФ с 1999 по 2007 гг. в соответствии с нормативными документами РФ в ходе выполнения программы ликвидации полиомиелита. При изучении вспышки полиомиелита в ЧР в 1995 г. исследовали клинические материалы от больных детей, госпитализированных в 1-ю инфекционную больницу г. Москвы, больных детей из Республики Ингушетия (РИ) и здоровых контактных лиц из этих республик. Обоснование оптимизации традиционной схемы вирусологических исследований выполнили на основании результатов исследований материалов, полученных от случаев ОВП и здоровых контактных лиц во время проведения эпиднадзора за ОВП в РФ и странах СНГ (Армении, Азербайджане, Беларуси, Грузии, Казахстане, Кыргызстане, Молдове, Таджикистане, Туркменистане, Узбекистане, Украине) в 2004-05 гг. Полевые наблюдения в разделе работы, посвящённом исследованию сточных вод, выполняли в Доме ребёнка г. Омска в 2004-05 гг. Результаты наблюдения за циркуляцией НПЭВ в РФ в 1999-2007 гг. получены при исследовании материалов, собранных при выполнении надзора за ОВП, дополнительного надзора за ПВ, от спорадических случаев и вспышек ЭВИ. Сбор материалов в рамках надзора за ОВП проводили сотрудники Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ (Роспотребнадзор) и служб здравоохранения стран СНГ в соответствии с нормативными документами стран и рекомендациями ВОЗ. Виды материалов и объём исследований, соответствующие направлениям работы, представлены в табл.1.

Алгоритм вирусологического исследования образцов фекалий (сточных вод) соответствовал рекомендациям ВОЗ (WHO, 1997; WHO, 2004; WHO, 2003) и включал следующие этапы: подготовку фекальных проб (проб сточных вод) для исследования; выделение вируса на культуре клеток; идентификацию вируса; внутритиповую дифференциацию (ВТД) ПВ; генетическую характеристику (при получении противоречивых результатов в одном из двух методов ВТД).

Использовали культуры клеток, референс-штаммы (вакцинные штаммы Сэбина 3-х типов) и диагностические системы, рекомендованные и полученные из источников ВОЗ. Выделение ПВ и НПЭВ из образцов фекалий и сточных вод проводили на культурах клеток RD, HEp-2, L20B, полученных из RIVM, Bilthoven, Нидерланды и CDC, Атланта, США. Идентификацию выделенных изолятов проводили в реакции нейтрализации микрометодом. Для идентификации ПВ использовали поликлональные моноспецифические кроличьи анти-сыворотки (RIVM), для идентификации НПЭВ - пулы иммунных к НПЭВ лошадиных сывороток (RIVM), позволяющих идентифицировать 20 серотипов вирусов ЕСНО (Е), вирус Коксаки А9 (САV9), серотипы 1-6 вирусов группы Коксаки В (СВV). Идентификацию штаммов НПЭВ, которые не могли быть идентифицированы в реакции нейтрализации, выполняли методом анализа частичной нуклеотидной последовательности для области генома VP1 (Nix et al, 2006; секвенирование выполнено А.Н. Лукашевым).

ВТД проводили с помощью а) иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием перекрёстно-адсорбированных кроличьих антисывороток к вакцинным и диким штаммам ПВ трёх серотипов (van Wezel and Hazendonk, 1979; van der Avoort et al., 1995) производства RIVM и б) метода диагностической полимеразной цепной реакции (ПЦР), разработанного Yang et al., 1991, с праймерами, специфичными к вакцинным штаммам Сэбина,

Таблица 1

Виды материалов и объем выполненных исследований

предоставленными CDC, Атланта, США. Генетическая характеристика ПВ получена на основании определения нуклеотидной последовательности вирусного генома на участке, кодирующем белок VP1 (~ 900 nt) методом частичного секвенирования (Cherkasova et al., 2002). Молекулярно-биологические исследования выполнены сотрудниками НИИ физико-химической биологии им.А.Н. Белозерского МГУ им. Ломоносова Е.А. Коротковой, Е.А. Черкасовой, М.Л. Яковенко.

Изучение нейровирулентности штаммов ПВ с помощью теста на трансгенных мышах (TgPVR-21), полученных из Центрального Института экспериментальных животных, Токио, Япония, было проведено по инициативе автора Е.М. Драгунской в Администрации по контролю пищевых и лекарственных продуктов (FDA), США (Abe et al., 1995; WHO, 2002).

Уровень нейтрализующих гуморальных антител определяли в реакции микронейтрализации со штаммами Сэбина 3-х типов на культуре клеток НЕр-2. Вакцинные штаммы Сэбина были предоставлены Национальным Институтом Биологических Стандартов и Контроля (NIBSC), Великобритания.

Анализ состояния иммунитета детей с ВАПП выполнен проф.Л.И. Краснопрошиной на основании результатов исследований, проведённых в НИИВС им. Мечникова или в медицинских учреждениях, где были госпитализированы больные, по нашей инициативе. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили с помощью моноклональных АТ к CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD16⁺, CD72⁺ и CD20⁺ (ООО "Сорбент"), меченых ФИТЦ ("МедБиоспектр") на проточном цитофлюориметре (Jackson, 1990). Содержание сывороточных IgG, IgM, IgA определяли методом радиальной иммунодиффузии по Mancini (Mancini et al., 1970). Функциональную активность фагоцитарной системы изучали в реакции фагоцитоза со стафилококками и в НСТ-тесте (спонтанный и активированный зимозаном кислородный метаболизм) (Хаитов и др., 1995).

При исследовании сточных вод использовали а) одномоментный метод отбора воды (1,0 л) и концентрирование вирусов с помощью двухфазного разделения (одномоментный метод) и б) метод сорбции вирусов с помощью пакетов с сорбентом - макропористым стеклом (МПС) (сорбционный) и последующую элюцию (WHO, 2003).

Оценку качества работы лабораторий по диагностике полиомиелита РФ выполняли на основании анализа документов, используемых в глобальной лабораторной сети ВОЗ: ежемесячных и еженедельных форм лабораторного отчёта, листов ежегодной аккредитации лаборатории. Классификацию случаев ОВП проводили на основе "вирусологической схемы" (WHO, 1998), классификацию случаев ВАПП - в соответствии с рекомендациями ВОЗ (ВОЗ, 1998) Для классификации и характеристики случаев ОВП и ВАПП использовали карты эпидемиологического расследования случая полиомиелита и ОВП (части I, II - с результатами повторного осмотра ребёнка через 60 дней от начала паралича, III - с заключением Национальной комиссии по диагностике полиомиелита и ОВП), выписки из историй болезни. При анализе результатов исследований использовали компьютерные программы EpiInfo, Excel, таблицы Генеса (Генес, 1967). Для расчётов частоты возникновения случаев ВАПП использовали подход, применённый Kohler et al., 2002.

Результаты

Вспышка полиомиелита в Чеченской республике в 1995 г. До начала выполнения программы ликвидации полиомиелита в 1996 г., системы вирусологического мониторинга ПВ в РФ не существовало. Контроль за полиомиелитом основывался на клиническом выявлении случаев заболевания. Подтверждением присутствия диких ПВ в РФ стала вспышка полиомиелита в ЧР в 1995 г. Предпосылками её возникновения были низкий уровень вакцинации против полиомиелита в ЧР (в 1994 г. вакцинация не проводилась), неудовлетворительные санитарные условия и массовая миграция населения, связанные с военным конфликтом на территории ЧР.

Вспышка продолжалась с марта по декабрь, большинство случаев заболевания пришлось на июль-август. Географически она охватила всю территорию ЧР, затем вышла за её пределы (последний случай заболевания выявили в РИ в декабре). Всего заболело 146 детей, 6 из них умерли.

Демографический анализ (выполнен по выборкам, для которых были доступны данные) показал, что возраст больных (58 детей) не превышал 11 лет, преобладали дети в возрасте до 1 года. Среди 53 больных было 34 мальчика и 19 девочек. Все дети не были привиты против полиомиелита, за исключением 3-х, которые получили 1-2 прививки. У всех заболевание имело характерное для полиомиелита развитие и течение со стойкими остаточными парезами и параличами.

Дикий ПВ типа 1 выделяли 72% (38 из 53 обследованных больных) и 60% (3 из 5 обследованных больных) из ЧР и РИ, соответственно.

При исследовании сывороток больных установили наличие нейтрализующих антител к ПВ типа 1 в высоких титрах и отсутствие антител к ПВ типа 2 и 3 (табл.2). В сыворотках взрослых контактных лиц выявили присутствие антител ко всем 3-м типам ПВ, у многих - в высоких титрах. При этом значительное количество контактных было вовлечено в эпидемический процесс: 7% (2 из 27 обследованных) и 21% (15 из 71 обследованного) здоровых контактных лиц из ЧР и РИ, соответственно, выделяли дикий ПВ, что могло быть связано с массивной инвазией вируса в кишечник, превосходящей протективный уровень секреторных антител. Картину широкого распространения эпидемического ПВ среди частично или полностью вакцинированной популяции наблюдали во время многих вспышек в развивающихся странах (Patriarca et al., 1997).

Таблица 2

Результаты серологического исследования больных и контактных лиц

Распространение дикого ПВ в популяции поддерживалось за счёт больных, достаточно долго выделявших вирус: 11 детей (50%) в течение месяца после начала заболевания, 9 детей (41%) - в течение 2-х месяцев, 2 ребёнка (9%) - более двух месяцев (время прекращения экскреции не было установлено, так как дети выбыли из наблюдения). На фоне продолжающейся вспышки в ЧР и появления первых клинических случаев в РИ, провели однократную кампанию вакцинации ОПВ. Циркуляция диких ПВ в РИ не была прервана, на что указывает спектр вирусов, выделенных от контактных из РИ: 13 человек выделяли дикий ПВ типа 1, 8 - вакцинный ПВ типа 1, 2 - одновременно вакцинный и дикий ПВ типа 1, по одному контактному выделяли вакцинный ПВ типа 2 и смесь вакцинных ПВ типа 1 и 3.

Генетический анализ нескольких случайно выбранных штаммов дикого ПВ типа 1 из ЧР и РИ позволил установить их тесную связь друг с другом и принадлежность к Т-генотипу (Черкасова и др., 1996; Ivanova et al., 2001). Штаммы этого генотипа циркулировали на территории бывшего СССР в 90-х годах прошлого века, с ними были связаны вспышки полиомиелита в 1993-1994 гг. (Таджикистан, Украина, Узбекистан), они обнаруживали родство со штаммами, выделенными в Пакистане в 1991 и 1995 гг. (Липская и др., 1998; Черкасова и др., 1996) Это позволило предположить, что в 90-х годах прошлого века происходило глобальное распространение дикого ПВ типа 1 с Индийского субконтинента через Центральную Азию в Европейский регион (Lipskaya et al., 1996; Липская и др., 1998).

Таким образом, эпидемиологические характеристики и клинические проявления этой вспышки были такими же, как у классических вспышек полиомиелита в развивающихся странах в до-вакцинальную эру; как и большинство вспышек того времени она была связана с диким ПВ типа 1 (Patriarca et al., 1997). Следствием интенсивной миграции жителей из эпидемического очага могли стать заносы дикого ПВ в другие регионы РФ, но отсутствие системы мониторинга ПВ не позволило оценить масштабы распространения вируса.

Национальная сеть лабораторий по диагностике полиомиелита РФ. Анализ качества работы. С 1998 г. вирусологические исследования в рамках программы ликвидации полиомиелита в РФ проводятся в Национальной сети лабораторий (НЛС) по диагностике полиомиелита (Приказ МЗ РФ № 386). Она состоит из Национальной лаборатории (НЛ) в ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН и 6 Суб-национальных лабораторий (СНЛ) на базе вирусологических лабораторий ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора в Свердловской области, г. Екатеринбург, Ставропольском крае, г. Ставрополь, Омской области, г. Омск, Хабаровском крае, г. Хабаровск, в г. Москве и ФГУН Институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург.

Порядок взаимодействия в НЛС соответствует функциональным обязанностям лабораторий по диагностике полиомиелита разного уровня, рекомендованным ВОЗ (WHO, 2004) и закреплённым нормативно-методическими документами РФ (Онищенко Г.Г. и др., 2008). Материалы от случаев ОВП и контактных лиц исследуются только в соответствующих СНЛ и НЛ. СНЛ выполняют выделение вирусов из образцов фекалий и их идентификацию. Все изоляты ПВ и НПЭВ, оригинальные образцы фекалий, из которых они были выделены, пересылают в НЛ. НЛ проводит повторное исследование позитивных образцов фекалий, ре-идентификацию изолятов, ВТД штаммов ПВ и молекулярно-генетические исследования.

Выделение и идентификация вирусов должны быть закончены в течение 28 дней от момента получения фекальных образцов, ВТД - в течение 7 дней после получения изолята ПВ или его идентификации. НЛ проводит ре-идентификацию и ВТД всех штаммов ПВ, выделенных из любых материалов (сточных вод, от здоровых лиц и проч.) любыми вирусологическими лабораториями РФ. НЛ снабжает все лаборатории, участвующие в реализации Программы ликвидации полиомиелита, референс-материалами (культурами клеток, вакцинными штаммами Сэбина, диагностическими и тестовыми материалами), что обеспечивает стандартность исследований в разных лабораториях.

Все лаборатории НЛС проходят процедуры внешнего и внутреннего контроля качества в виде ежегодной аккредитации, профессионального тестирования (детекция и идентификация вирусов в зашифрованном наборе образцов фекалий), подтверждения идентификации изолятов в НЛ. Результаты исследования и показатели качества работы в виде еженедельных отчётов направляются в НЛ и Европейское региональное бюро ВОЗ. Анализ и оценка показателей качества работы НЛС в 1999-2007 гг. (табл.3) показал, что они соответствуют требованиям ВОЗ.

Таблица 3

Качество работы НЛС РФ в 1999-2007 гг. (критерий ВОЗ - не менее 80%)

*индекс эпиднадзора рассчитывается путём умножения показателя заболеваемости неполиомиелитными ОВП на 100 тыс. детей в возрасте до 15 лет на процент случаев с адекватными пробами стула, собранными в течение 14 дней после начала паралитического заболевания.

Таким образом, НЛС РФ обеспечивает высокую достоверность и оперативность вирусологических исследований.

Вирусологические результаты надзора за ОВП в РФ. В течение 9 лет (1999-2007 гг.) в НЛС РФ на основании первичных донесений были исследованы 5126 случаев ОВП. Впоследствии Национальная комиссия по диагностике полиомиелита и ОВП окончательно классифицировала как ОВП 3692 случая. "Разрыв" между обследованными в лаборатории и окончательно классифицированными случаями ОВП был наибольшим до сертификации Европейского региона как "свободного от полиомиелита" в 1999-2001 гг. (до 317 случаев в 2000 г.), что объяснялось, главным образом, несовершенством клинической диагностики заболеваний с синдромом ОВП. Разрыв постепенно уменьшился в последующие годы (до 88 случаев в 2007 г.). Учитывая, что индекс эпиднадзора за полиомиелитом и ОВП на этапе после сертификации соответствовал требованиям ВОЗ и превышал показатели досертификационного периода (табл.3), следует признать, что надзор за полиомиелитом и ОВП в РФ достиг оптимального качества.

Система верификации в НЛ материалов от случаев ОВП, из которых в СНЛ были выделены ПВ и НПЭВ, и от 10% "негативных" случаев обеспечивает высокую надёжность получаемых результатов. В 1999-2007 гг. НЛ обследовала материалы от 842 случаев ОВП. В целом в течение 9 лет в НЛС было исследовано 10301 образец фекалий от больных с синдромом ОВП и 2235 образцов фекалий от здоровых контактных лиц. Частота выделения ПВ от больных с ОВП постепенно снижалась в течение периода наблюдения от 14,4% в 1999 г. до 5,5% в 2007г. (в среднем 7,9 ± 0,27%), от контактных лиц была наибольшей в 1999 г. (5,9%), составляя в среднем 4,4 ± 0,43%. Наиболее высокое выделение ПВ в 1999 г. совпадало с проведением в РФ массовых кампаний по дополнительной иммунизации против полиомиелита, отражает интенсивность циркуляции вирусов-производных ОПВ среди населения, может быть объяснена несовершенством клинической диагностики ОВП на первоначальных этапах надзора. В целом среди 465 случаев ОВП, связанных с выделением ПВ, преобладали (p < 0,05) случаи, от которых выделяли ПВ типа 3 и смеси ПВ по сравнению с ПВ типа 1 и 2 (33,3 ± 2,2%, 27,3 ± 2,1%, 21,5 ± 1,9% и 17,9 ± 1,8%, соответственно).

В течение 8 лет (2000-2007 гг.) 5588 штаммов ПВ, выделенных из различных источников, были подвергнуты ВТД, результаты которой подтвердили их вакцинное происхождение и отсутствие циркуляции (или заноса) диких ПВ на территории РФ. На основании этого в 2002 г. Европейская Региональная Сертификационная Комиссия признала за РФ статус "страны, свободной от полиомиелита", который сохраняется в последующие годы.

Молекулярно-генетический анализ 67 штаммов, проявлявших противоречивые свойства в одном из методов ВТД, позволил идентифицировать 6 из них как VDPV - вакцинородственные, значительно (> 1% нуклеотидных замен на участке генома VP1) дивергировавшие от гомотипичного вакцинного предка (WHO, 2002) (табл.4). Был установлен факт длительной независимой эволюции от вакцинных предков наиболее изменённых штаммов RUS 11262-99 и RUS 11264-99, выделенных от невакцинированной иммунокомпетентной 7-месячной девочки и здорового контактного из дома ребёнка г. Пермь: "возраст" штаммов к моменту их изоляции составлял около двух и полутора лет, соответственно (Cherkasova et al., 2002; Cherkasova et al., 2003). Выявление VDPV-штаммов показало, что возможности для скрытой циркуляции вирусов-производных ОПВ, которая может привести к формированию высоконейровирулентных вариантов вакцинородственных ПВ, существуют не только среди недостаточно иммунизированного населения, но и в хорошо иммунизированной популяции.

Оптимизация традиционной схемы вирусологических исследований. Скорость, достоверность, полнота вирусологических исследований важны для принятия адекватных противоэпидемических решений в ответ на случай (или вспышку) заболевания полиомиелитом. Согласно традиционной схеме вирусологического исследования образцов фекалий (WHO, 1997; 2004), главная цель которого - выделение ПВ, общая продолжительность наблюдения за

Таблица 4

Характеристики VDPV-штаммов, выявленных в РФ в 1999-2007 гг.

* - не сходный по антигенным свойствам с вакцинным штаммом (non-Sabin-like, NSL);

** - штамм не взаимодействует с сыворотками специфичными к вакцинному и дикому штамму ПВ;

*** - штамм, имеющий вакцинное происхождение (WHO, 2004).

зараженными культурами клеток должна составлять не менее 14 дней. Мы провели ретроспективный анализ процедуры и результатов лабораторных исследований 1638 образцов фекалий от случаев ОВП и здоровых контактных лиц из РФ и стран СНГ, выполненных в НЛ в 2004-05 гг., в 557 (34%) из которых были детектированы различные вирусы (табл.5). Культуры клеток RD, L20B и Hep-2 оказались практически одинаково чувствительны для выделения ПВ, но клетки RD позволяли выделять широкий спектр различных цитопатогенных НПЭВ.

Таблица 5

Спектр цитопатогенных вирусов, выделенных из образцов стула на различных культурах клеток

Анализ появления выраженного (4+) цитопатического эффекта (ЦПЭ) при исследовании образцов стула, содержащих полиовирусы, на различных культурах клеток показал, что большинство образцов проявляли ЦПЭ в течение 5 дней при первичном заражении культур клеток RD и L20B (97,4% и 92,2% образцов, соответственно). Во время следующего пассажа все образцы проявили 4+ ЦПЭ в течение 5 дней. Скорость появления 4+ ЦПЭ на культуре клеток RD при инокуляции фекальных суспензий с установленным присутствием ПВ как в первичном заражении (56,9±32,2 часа), так и при последующем пассаже (28,1±13,5), была достоверно выше (p < 0,05), чем на культуре клеток L20B (71,8±33,3 и 31,8±17,2 часа, соответственно).

При использовании только одной культуры клеток возможны "потери" ПВ: наблюдали расхождение результатов при выделении ПВ на различных культурах (для 10 образцов из 1638 - 4 "негативных" образца при исследовании на культуре RD, 6 - на культуре L20B, 5 - на культуре HEp-2).

Таким образом, общее время исследования образцов может быть сокращено до 10 дней: алгоритм исследования образца фекалий "5 дней наблюдения для первичного заражения, 5 дней - для первого пассажа" обеспечивает высокую достоверность выделения ПВ. Оптимальной схемой является одновременное параллельное исследование образца на культурах RD и L20B, дополнительным преимуществом которой является возможность выделения широкого спектра цитопатогенных вирусов, главным образом группы ЕСНО. Лаборатории НЛС РФ используют также культуру HEp-2. Это позволяет дополнительно детектировать CBV, некоторые другие цитопатогенные вирусы (например, аденовирусы), что важно для расширения знаний об этиологии неполиомиелитных ОВП.

Совершенствование надзора за полиомиелитом и ОВП. С 2002 г. в систему надзора за полиомиелитом и ОВП внедрено определение "приоритетнй ("горячий)" случай ОВП" (Письмо № 21ФЦ/1505 от 15.04.02 г.), к которым относятся случаи ОВП у детей, не привитых/неполностью привитых против полиомиелита, прибывших из зон военных конфликтов, эндемичных по полиомиелиту стран, беженцев, а также случаи, в которых можно заподозрить полиомиелит, у лиц любого возраста (МУ3.1.1.2360, Москва, 2008).

Для полного лабораторного исследования материалов от "горячего" случая ОВП, включая ВТД ПВ в случае его выделения, в максимально короткий срок, материалы в течение 72 часов от момента отбора доставляются в НЛ. В течение 6 лет (2002-2007 гг.) 308 "горячих случаев" ОВП было зарегистрировано и исследовано в НЛ. Непривитые против полиомиелита дети составляли 32,8%, 67,3% из них были старше 3-х месяцев. Среди последних дети, относящиеся к "группам риска" составляли меньшинство (36,8%). Большая часть непривитых детей старше 3-х месяцев - "домашние" дети, которые не посещают организованные детские коллективы, являясь, таким образом, группой риска.

Частота выделения ПВ из образцов фекалий от "горячих случаев" (от 28,9% до 41%) значительно превышала частоту выделения ПВ от случаев ОВП в целом (максимально - 8,6%). Таким образом, приоритетные "горячие" случаи ОВП - это эпидемиологически точно выбранная группа, вирусологические исследования материалов из которой позволяют получать значительный объём информации о ПВ, циркулирующих в РФ.

Паралитический полиомиелит в РФ в 1998-2005 гг. Выполнена комплексная (клиническая, вирусологическая, эпидемиологическая) характеристика случаев полиомиелита, зарегистрированных в РФ в период применения ОПВ с 1998 по 2005 гг. Среди 3294 зарегистрированных случаев ОВП 93 (2,8 %) были случаи с клинической картиной полиомиелита (табл.6), которые классифицировали следующим образом: 58 (62,4%) ВАПП у реципиентов ОПВ, 25 (26,9%)"контактный" ВАПП, 8 (8,6%) случаев ОВП, "совместимых с диагнозом полиомиелит", 2 случая (2,2%) полиомиелита неясной этиологии. Случаи полиомиелита неясной этиологии и 6 случаев, "совместимых с диагнозом полиомиелит", Национальная комиссия экспертов отнесла к случаям ВАПП у реципиентов ОПВ. Ещё 2 "совместимых" случая с большой степенью вероятности не были связаны с диким ПВ (Иванова и др., 2007). Таким образом, за 8 лет в РФ зарегистрирован 91 случай ВАПП (66 "реципиентных" и 25 "контактных).