Актуальность проблемы

В последние годы в России отмечается увеличение частоты бесплодных браков, которая достигает в некоторых регионах Сибири 15% - 17,4% [Филиппов О.С., 1999; Кулаков В.И., Лопатина Т.В., 2005].

Одной из ведущих причин бесплодия являются эндокринные нарушения, составляющие в структуре бесплодного брака до 30-40% [Филиппов О.С., Радионченко А.А., Болотова В.П. и др., 1997; Аншина М.Б., 2004; Назаренко Т.А., Дуринян Э.Р., Чечурова Т.Н. и др., 2005], при этом синдром поликистозных яичников выявляется у 8,5% - 73% [R. B. Barnes в 1998г; И.Б. Манухин, 2004], гиперпролактинемический гипогонадизм - у 40%; дисфункции яичников - у 12% женщин с бесплодием [Овсянникова Т.В., 2006; Fluckiger E., Del Pozo E., von Werden K., 1982].

Значительно увеличилась частота гормонозависимых заболеваний в структуре женского бесплодия. Так, частота миомы матки по данным многих исследователей составляет 30-51% [Вихляева Е.М., Паллади Г.А., 1982; Савицкий Г.А., Савицкий А.Г., 2000], эндометриоза - 43-70% [Адамян Л.В., 2006; Ермолова Е.В., 2006; Кузьменко Е.Т., 2007]. Однако ведущей причиной репродуктивных нарушений при гормонозависимых заболеваниях являются нарушения в гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системе, так гиперпролактинемия, гиперандрогения, неполноценная лютеиновая фаза выявляются у значительной доли женщин с данной патологией и требуют проведения патогенетически обоснованной гормональной терапии [Т.В. Овсянникова, Т.Д. Гуриев, 2002]. Отмечается уменьшение частоты "изолированных форм" и рост сочетаний нескольких факторов, приводящих к бесплодию (до 85%) [Кулаков В.И., Назаренко Т.А., 2003]; особенно эндокринного, трубно-перитонеального фактора и эндометриоза [Адамян Л.В., 2006]. Так в сочетании с НГЭ миома матки является причиной бесплодия в 44% случаев, а с трубно-перитонеальным фактором - в 36% (Dubuisson J. B., Chapron C.Н., Fauconnier A., 1977; Pritts E. A., 2001). Около 10 % женщин с миомой матки подлежат лечению с помощью методов вспомогательных репродуктивных технологий (Т.В. Овсянникова, Т.Д. Гуриев, 2002; Darai E., Dechaud H., 1997).

По данным многих исследователей, одной из причин возникновения репродуктивных нарушений могут служить "поломки" аллельных вариантов генов суперсемейства глютатион-S-трансфераз, продукты которых ответственны за биотрансформацию и детоксикацию ксенобиотиков [О.Н. Беспалова, О.Н. Ажалова, И.Н. Иващенко и др., 2001; Т.С. Ковалевская, Н.Н. Вассерман, С.М. Тверская, А.В. Поляков, 2003; F. Sata, H. Yamada, T. Kondo et al., 2003; Баранов В.С., 2004]. Повреждающее действие ксенобиотиков может реализоваться на этапах гаметогенеза, оплодотворения, имплантации и эмбриогенеза [И.Н. Фетисова, Т.С. Бескоровайная, Л.В. Посисеева и др., 2006].

В условиях длительного воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды на репродуктивную систему особое значение имеет его индивидуальная чувствительность к данным воздействиям [Гичев Ю.П., 2000, Прохоров Б.Б., Рященко А.Б., Косолапов А.Б. и др., 2002 Айламазян Э.К., Арутюнян А.Г. 1999, 2004], в том числе - состояние гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы, гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной систем [C. С.К. Йен, Р.Б. Джаффе, 1998, Арутюнян А.В., Степанов М.Г., 1999; Сутурина Л.В., 2002; Шолохов Л.Ф., 2004], процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной защиты [Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г., 1988, Никифорова Н.Г., 2002; Колесникова Л.И., 2004]. Хотя существует ряд работ, посвященных гормональным, метаболическим аспектам патогенеза нарушений репродуктивной функции женщин в Сибирском регионе [Колесникова Л.И., Сутурина Л.В., Шолохов Л.Ф., 1996, 2001], данные о характере и частоте генетических и гормонально-метаболических нарушений при различных сочетанных формах бесплодия отсутствуют.

Все вышеизложенное определило целесообразность проведения научно-исследовательской работы по данной теме, и сформулировать следующие цель и задачи:

Цель:

Выявить частоту, структуру, клинические особенности и основные механизмы формирования эндокринных форм бесплодия в Иркутской области

Задачи:

1. Изучить частоту, структуру и основные клинические формы эндокринного бесплодия в Иркутской области.

2. Изучить состояние основных звеньев нейроэндокринной регуляции овариальной функции, гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной системы и функции надпочечников у женщин с эндокринными формами бесплодия и гормонозависимыми заболеваниями.

3. Изучить особенности метаболизма эстрогенов при различных формах эндокринного бесплодия.

4. Оценить состояние процессов пероксидации липидов и антиоксидантной защиты у женщин с эндокринным бесподием

5. Установить наиболее информативные показатели гормонально-метаболических нарушений при различных формах эндокринного бесплодия

6. Провести анализ делеционного полиморфизма в генах системы детоксикации у пациенток с различными формами эндокринного бесплодия.

Научная новизна:

Впервые установлено, что в патогенезе репродуктивных нарушений у женщин с эндокринным бесплодием и гормонозависимыми заболеваниями, не зависимо от вида патологии, происходит активация пролактинергической функции гипофиза и глюкокортикоидной функции надпочечников.

Новыми являются данные о нарушениях метаболизма эстрогенов при различных формах эндокринного бесплодия и гормонозависимых заболеваниях. Установлено, что дисбаланс пролиферативно нейтральных и пролиферативно активных метаболитов эстрогенов определяется существенным снижением у женщин с эндокринным бесплодием метаболизма по пути образования 2-гидрокси-эстрона с закономерным уменьшением соотношения 2/16 метаболитов. Показано, что наиболее существенные изменения метаболизма эстрогенов отмечаются у бесплодных пациенток с миомой матки, за счет повышения концентрации пролиферативно активного 16-б-ОН-эстрона.

Впервые установлено, что у всех пациенток с эндокринным бесплодием состояние антиоксидантной системы характеризуется повышением общей антиокислительной активности сыворотки крови и снижением содержания ретинола и цинка по сравнению с контрольной группой фертильных женщин.

Впервые на основе изучения полиморфизма генов системы глутатион-S - трансфераз выявлены новые факторы риска развития некоторых форм эндокринного бесплодия. Установлено, что носительство гаплотипов GSTM1+/GSTT1+ наиболее характерно для женщин с бесплодием и СПКЯ; носительство GSTM1-0/GSTT1+ и нулевых аллелей генов GSTM1-0/GSTT1-0 - для женщин с эндометриозом (а также при сочетаниях эндометриоза с миомой матки, гиперпластическими процессами эндометрия и эндокринными нарушениями).

Практическая значимость работы

Результаты проведенного исследования позволяют обосновать исследование соотношения пролиферативно нейтральных и активных метаболитов эстрогенов, продуктов перекисного окисления липидов и антиоксидантов (ретинол, цинк, МДА), а также генов системы глутатион-S - трансфераз GSTM1 и GSTT1 в качестве значимых диагностических маркеров гормонально-метаболических нарушений у женщин репродуктивного возраста с наличием эндокринных нарушений и гормонозависимых заболеваний.

эндокринное бесплодие гормональное метаболическое нарушение

Установленные закономерности изменений гормональной регуляции, метаболизма эстрогенов, процессов ПОЛ-АОЗ и ассоциации с носительством определенных аллелей генов системы глутатион-S - трансфераз GSTM1 и GSTT1 могут служить основой для разработки эффективных, патогенетически - оправданных методов прогнозирования и лечения бесплодия.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Универсальными механизмами патогенеза репродуктивных нарушений у женщин с изученными эндокринными формами бесплодия и гормонозависимыми заболеваниями, наряду с гонадотропной дисфункцией и нарушениями пролактинергической функции гипофиза, являются: активация глюкокортикоидной функции надпочечников, относительное снижение продукции эстрадиола в фолликулярной фазе менструального цикла с повышением эстрона и нарушение метаболизма эстрогенов со снижением соотношения 2-ОН/16-ОН-эстрона.

2. Активация пролактинергической функции гипофиза у женшин с эндокринными формами бесплодия и гормонозависимыми заболеваниями ассоциирована с возрастанием общей антиокислительной активности, на фоне дефицита ретинола и цинка. У женщин с дисфункцией яичников и гиперпролактинемией активность процессов пероксидации липидов, ограничена благодаря действию антиоксидантов различной природы, тогда как пациентки с СПКЯ характеризуются развитием оксидативного стресса на фоне истощения антиоксидантной защиты.

3. Фактором риска развития эндокринного бесплодия является носительство мутантных "нулевых" гаплотипов GSTT1 и GSTM1. Носительство гаплотипов GSTM1+/GSTT1+ наиболее характерно для женщин с бесплодием и СПКЯ; GSTM1-0/GSTT1+ и GSTM1-0/GSTT1-0 - для женщин с гормонозависимыми заболеваниями.

4. Информативными показателями гормонально-метаболических нарушений у женщин с бесплодием являются: при гиперпролактинемии и миоме матки - соотношение 2-ОН/16-ОН-эстрона и ретинол; при СПКЯ и дисфункции яичников - малоновый диальдегид и ретинол; и при эндометриоз-ассоциированном бесплодии - ретинол; субстраты пероксидации липидов; трийодтиронин и тестостерон.

Апробация диссертационного материала проведена на заседании Ученого совета учреждения РАМН "Научный Центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН" 22.09.2009.

Материалы диссертации представлены в докладах на VIII и IX Международных форумах "Мать и дитя" (Москва, 2003-2007гг.); XIII и IX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2006-2008гг.); Международном конгрессе "Практическая гинекология" (Москва, 2006-2008гг.); Областных конференциях акушеров, гинекологов, неонатологов (Иркутск, 2004-2008гг.); 11-й научно-практической конференции "Актуальные вопросы акушерства и гинекологии" (Кемерово, апрель 2007), Межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные вопросы бесплодного брака" (Иркутск, май 2007), Всероссийской конференции "Проблемы медико-демографического развития и воспроизводства населения в России и регионах Сибири" (Иркутск, 2007), XVII-XIX ежегодных международных конференциях РАРЧ "Репродуктивные технологии сегодня и завтра" (Казань, 2007; Самара, 2008; Иркутск, 2009); XIII международном конгрессе по приполярной медицине (Новосибирск, 2006); IV съезде акушеров-гинекологов России (Москва, 2008).

На международных конгрессах: the 2^nd Asian pacific congress "Controversies in obstetrics gynecology & infertility" (Shanghai, China, 2007); 13^th World Congress of Gynecological Endocrinology. - Florence, Italia, 2008; the 10^th Congress of the European Society of Contraception (Prague Czech Republic, 2008); the 11^th World Congress on Contraversies in Obstetrics, Gynaecology & Infertility (COGI) (Paris France, 2008), the 3d Asia Pacific Congress on Controversies in Obstetrics, Gynecology & Infertility (COGI) Beijing, China, 2009.

Публикации: по материалам выполненных исследований опубликовано 72 печатных работы, из них - 12 в журналах, рекомендованных к публикациям ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений. Работа иллюстрирована 111 таблицами и 46 рисунками и схемами. Библиографический указатель включает 411 источников, из них 163 - иностранных авторов.

Объекты и методы исследования

Работа выполнена в период с 2004 по 2009 гг. на базе лабораторий, входящих в состав ГУ "Научный центр медицинской экологии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН": лаборатории гинекологической эндокринологии (зав. лабораторией д. м. н., профессор Л.В. Сутурина), лаборатории патофизиологии репродукции (зав. лабораторией член-корреспондент РАМН, д. м. н., профессор Л.И. Колесникова), лаборатории физиологии и патологии эндокринной системы (зав. лабораторией д. м. н. Л.Ф. Шолохов), лаборатории генетико-биохимических проблем онтогенеза (зав. лабораторией, д. б. н.В.А. Шенин); лаборатории мониторинга состояния здоровья матери и ребенка (и. о. зав. лабораторией к. м. н. Кулеш Д. В.). Обследование женщин с бесплодием проводилось на базе Центра инновационной медицины клиники ГУ "НЦ МЭ Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН" (главный врач д. м. н. проф. Долгих В. В.) и в гинекологическом отделении Иркутской областной ордена Знак Почета клинической больницы (главный врач к. м. н.П.Е. Дудин, зав. отд. к. м. н. М.А. Шарифулин).

В работе с больными соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000 ред. ).

На первом этапе работы проводилось исследование частоты и структуры бесплодия в браке в популяции женщин репродуктивного возраcта методом анкетирования в городах (г. Иркутск, г. Шелехов, г. Братск, г. Усолье-Сибирское) и сельской местности (п. Белореченский, с. Хомутово) Иркутской области. Всего проанкетировано 4900 женщин.

На втором этапе для уточнения структуры бесплодия проводилось комплексное клинико-лабораторное обследование 335 пациенток, состоящих в бесплодном браке. Обследование проводилось по стандартному протоколу, включающему обязательное эндоскопическое исследование для всех бесплодных женщин.

На третьем этапе для изучения структуры эндокринного бесплодия и патогенетических механизмов его развития проводилось углубленное исследование 890 женщин с эндокринным бесплодием и / или бесплодием, ассоциированным с гормонозависимыми заболеваниями, репродуктивного возраста (от 27 до 45 лет), проживающих в Иркутске и Иркутской области.

Было сформировано 5 групп бесплодных женщин с различными наиболее распространенными эндокринными факторами бесплодия и гормонозависимыми заболеваниями: I-женщины с бесплодием и гиперпролактинемией (N=349); II - с бесплодием и СПКЯ (N= 322); III-с бесплодием и нормогонадотропной дисфункцией яичников (N= 140); IV - с эндометриоз-ассоциированным бесплодием (N=155); V - с бесплодием и миомой матки (N=99).

Контрольную группу составили фертильные женщины без нейроэндокринных нарушений (N=141; средний возраст 26,8±5,6 лет). Критерием включения в контрольную группу было: наличие в анамнезе беременности, закончившейся родами в течение последних 2х лет; отсутствие нейроэндокринных нарушений и лактации; регулярный менструальный цикл; отсутствие тяжелой соматической патологии.

I - диагностическими критериями включения в группу исследования женщин с бесплодием гиперпролактинемией (N=349; средний возраст 28,4±5,6 лет) были: повышение уровня ПРЛ выше 600 МЕ/мл в сыворотке крови в фолликулиновую фазу менструального цикла (при повышении выше референтных значений не менее 2х циклов); отсутствие у пациенток беременности при регулярной половой жизни без контрацепции в течение года и более; нарушения менструального цикла по типу олигоменореи на фоне ановуляции или недостаточности лютеиновой фазы (НЛФ), или НЛФ с регулярным ритмом менструаций; галакторея. Обязательное МСКТ или МРТ гипофиза для исключения/подтверждения органической патологии гипофиза и пограничных областей: микро - и макроаденомы гипофиза, синдрома пустого турецкого седла, опухолей ЦНС [Дедов И.И. и др., 2004].

Группу сравнения (2) составили 429 женщин с бесплодием без гиперпролактинемии (средний возраст 29±5,7 лет).

II - диагностическими критериями включения в группу исследования женщин с бесплодием и СПКЯ (N=322; средний возраст 27,5 ± 5,2 г.), согласно заключительному документу международного симпозиума по проблемам диагностики СПКЯ (Роттердамский консенсус, 2003г.), были наличие двух из трех следующих признаков: симптомы избыточной активности или избыточной секреции андрогенов; олигоовуляция или ановуляция; поликистозные яичники при ультразвуковом исследовании (если при этом исключены другие причины, способные вызвать поликистоз яичников).

Критериями включения в группу сравнения женщин с бесплодием без СПКЯ (N=453, средний возраст 29,7 ± 5,2 лет) было отсутствие клинических, эхографических и лаборатрных признаков СПКЯ.

III - диагностическими критериями включения в группу исследования женщин с бесплодием и дисфункцией яичников (N=140, средний возраст 29,4 ± 5 лет) были: отсутствие у пациенток беременности при регулярной половой жизни без контрацепции в течение года и более; нарушения менструального цикла по типу опсо - олигоменореи, дисменореи, ациклических маточных кровотечений на фоне ановуляции или НЛФ; отсутствие клинических, эхографических и лабораторных признаков СПКЯ при наличии других эндокринных и гормонозависимых нарушений.

Группу сравнения составили 456 женщин с бесплодием без дисфункции яичников (средний возраст 29±5,7 лет).

IV - диагностическими критериями включения в группу исследования женщин с бесплодием и миомой матки (N=99, средний возраст 28,4 ±5,2 лет) были: отсутствие у пациенток беременности при регулярной половой жизни без контрацепции в течение года и более; наличие миомы матки любой локализации и размеров узлов на основании клинических, эхографических и лапароскопических критериев диагностики.

Диагностическими критериями включения в группу сравнения женщин с бесплодием без миомы матки (N=456; средний возраст 28±5,4 лет) было отсутствие миомы матки.

V - диагностическими критериями включения в группу исследования женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием (N=155, средний возраст 31,3 ±5,4 года) были: отсутствие у пациенток беременности при регулярной половой жизни без контрацепции в течение года и более; наличие аденомиоза или НГЭ любой локализации на основании клинических, эхографических и лапароскопических критериев диагностики.

Диагностическими критериями включения в группу сравнения женщин с бесплодием без эндометриоза (N=456, средний возраст 28,2±5,6 лет) было отсутствие эндометриоза любой локализции.

Женщины всех групп были сопоставимы по возрасту и ИМТ; возрасту menarche и длительности бесплодия.

В дальнейшем в группах женщин с бесплодием был проведен анализ клинических, инструментальных и лабораторных показателей в зависимости от наличия или отсутствия этих факторов, а также в сравнении с контрольной группой.

Рис. 1.

Дизайн исследования женщин с бесплодием в зависимости от наличия или отсутствия: гиперпролактинемии, СПКЯ, дисфункции яичников, миомы матки и эндометриоза

Методы исследования

Анкетирование и анализ медицинской документации: сбор информации проводился путем анкетирования, выкопировки данных из первичных медицинских документов: медицинской карты амбулаторного больного, выписки из историй болезни, протоколы лапароскопических операций.

Общеклиническое обследование: объективный осмотр включал оценку физического развития по индексу массы тела, предложенному G. Brey в 1978 году (отношение массы тела в килограммах к длине тела в метрах, возведенной в квадрат); измерение артериального давления (АД), температуры тела; оценка наличия или отсутствия трофических изменений кожи Гирсутизм регистрировался по диаграмме и шкале, разработанными D. Ferriman, I. Galwey, 1961году (Ю.А. Гуркин, 2000). Проводился осмотр молочных желез, гинекологическое бимануальное исследование, применялись тесты функциональной диагностики (измерение ректальной температуры, шеечные тесты). Все женщины были осмотрены терапевтом, гинекологом, венерологом и психологом. По показаниям был проведен осмотр невропатологом, окулистом с исследованием глазного дна и ЛОР - врачом.

Венерологическое исследование: лабораторную диагностику ИППП проводили в соответствии с Методическими материалами и действующими приказами МЗ России (№ 936, 1570, 286, 415) на базах лаборатории кожной клиники ГОУ ВПО ИГМУ Минздрава России, микробиологического отдела центральной научно - исследовательской лаборатории Иркутского государственного медицинского университета и Иркутского городского центра молекулярной диагностики. Метод световой микроскопии применялся для исследования осадка свежевыпущенной утренней мочи и мазков, окрашенных метиленовым синим, по Грамму и Романовскому - Гимзе, с целью обнаружения N. gonorrhoeae, T. vaginalis, G. vaginalis, Mobiluncua, Leptotrihii и грибы рода Candida. С помощью культурального метода диагностировали N. gonorrhoeae, T. vaginalis, Ur. urealyticum, M. hominis, M. genitalium, Chl. trachomatis выявляли двумя методами: реакцией прямой иммунофлуоресценции в материале, взятом из цервикального канала и уретры и методом иммуноферментного анализа или полимеразной цепной реакцией.

Инструментальные методы исследования

Ультразвуковое исследование органов малого таза проводилось на базе Центра инновационной медицины ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН при помощи прибора "Aloka-5500" с вагинальным датчиком 7 МГц в режиме двухмерной визуализации. Объем яичников вычислялся по формуле (М.В. Медведев, В.В. Митьков, 1997): U = L _* H _* F _* 0,52, где L - длина яичника, H - толщина яичника, F - высота яичника, 0,52 - коэффициент.

Для оценки анатомического состояния щитовидной железы проводили

ультразвуковое исследование при помощи прибора "Aloka-5500" с каротидным датчиком 5 МГц. Степень увеличения щитовидной железы устанавливали согласно принятой классификации ВОЗ, Женева, 1994г.

Проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости (оценивали анатомическое состояние и структуру печени, поджелудочной железы, селезенки, желчного пузыря) и почек.

Проходимость маточных труб уточняли с помощью методов Гистеросальпингографии (ГСГ), с использованием цифрового рентгеновского аппарата PHILIPS DIAGNOST-94" (Япония); и гидрогистеросальпингоэхографии (ГГСЭГ) - с использованием аппарата Toshiba Nemio (Япония). Гистероскопия и лапароскопия были проведены на базе гинекологического отделения Иркутской областной клинической больницы с использованием аппарата "OLIMPUS" (Япония) и "STORZ" (Германия).

Рентгенография черепа и турецкого седла проводилась для исключения органической патологии селлярной области с использованием цифрового рентгеновского аппарата PHILIPS "DIAGNOST-94" (Япония); магниторезонансная томография (МРТ) головного мозга с использованием аппарата PHILIPS "GYROSCAN T5-NT" со сверхпроводящим магнитом мощностью 0,5 Тесла (Япония).

Лабораторные методы исследования

Определение концентраций гормонов: пролактина (ПРЛ), тиреотропного гормона (ТТГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), тироксина (Т4) проводилось радиоиммунологическим набором "Диас" (Россия) с использованием анализатора "Иммунотест", уровень содержания трийодтиронина (Т3) и сексстероидсвязывающего глобулина (СССГ) оценивали иммуноферментным методом с использованием тест-систем "АЛКОР-БИО" (Россия) и анализатора EL 808 (США). Концентрацию гормонов ПРЛ, ТТГ, ЛГ, ФСГ выражали в мЕД/мл, Т3, Т4 - в нмоль/л, нормативные показатели которых следующие: ПРЛ (72 - 480 мЕД/мл), ТТГ (0,5-5,0 мЕД/мл), ЛГ (фол. фаза 0,5-5,0 мЕД/мл), ФСГ (фол. фаза 1,8-10,5 мЕД/мл), Т3 (1,0-3,0 нмоль/л), Т4 (53,0-158,0 нмоль/л). Определение свободного тестостерона (св. тестостерон) проводили с помощью наборов реактивов "DLabs" USA (референтные значения 4,16-22,9 пМ/л), инсулина - с помощью наборов реактивов "Accub-Bind" USA (референтные значения 0,7 - 9,0 мкЕд/мл). Забор крови для гормональных и биохимических исследований осуществлялся с учетом фаз менструального цикла (на 5-9 день цикла) или на фоне аменореи в утренние часы, натощак из локтевой вены.

Особенности конверсии эстрогенов оценивали, определяя соотношение в моче 2-гидроксиэстрона, не обладающего пролиферативной активностью и 16-альфа гидроксиэстрона, являющегося агонистом рецепторов к эстрогенам (2OHE1/16OHE1), c использованием набора "ESTRAMET 2/16 ELISA" - основан на конкурентном методе твердофазного иммуноферментного анализа.

В качестве материала для биохимических исследований использовали сыворотку, плазму крови и гемолизат, приготовленный из эритроцитов. На спектрофлюорофотометре Shimadzu RT=5000 (Япония) измеряли содержание малонового диальдегида (МДА, мкмоль/л) по методу В.Б. Гаврилова с соавт. (1987); измерение активности супероксиддисмутазы (СОД, усл. ед.) методом H. P. Misra, I. Fridovich (1972); определение концентраций - токоферола и ретинола (мкмоль/л) методом Р.Ч. Черняускене с соавт. (1984); уровни восстановленного и окисленного глутатиона (GSH, GSSG, мкмоль/л) методом P. Y. Hissin, R. Hilf (1976).

Спектрофотометрическими методами определяли содержание в сыворотке крови общих липидов (ОЛ, г/л) с помощью набора реагентов PLIVA-Lachema, Чешская Республика; общего холестерина (ОХС, ммоль/л), липопротеидов высокой плотности (ХСЛПВП, ммоль/л) и триглицеридов (ТГ, ммоль/л) с использованием коммерческих наборов Bio Systems (Испания). Измерения производили на биохимическом анализаторе BTS-330 (Испания). Содержание субстратов с сопряженными двойными связями (Дв. св.) регистрировали по методу И.А. Волчегорского с соавт. (1989). Диеновые коньюгаты (ДК), кетодиены и сопряженные триены (КД-СТ) определяли тем же методом, основанном на интенсивном поглощении конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов в области 220 (Дв. св), 232 (ДК) и 278 (КД-СТ) нм. Содержание Дв. cв., КД-СТ, ДК выражали в усл. ед. и в мкмоль/л (ДК). Оценку общей антиокислительной активности крови (АОА, усл. ед.) проводили по методу Г.И. Клебанова с соавт. (1988). Определение аскорбиновой кислоты (мкмоль/л) проводили колориметрическим методом (Н.И. Портяная с соавт., 1990).

Определение содержания биоэлементов: Mg (мМ/л), Zn (мкМ/л) и Cu (мкМ/л) в сыворотке крови проводилось с помощью стандартных сертифицированных методик спектрофотометрическим способом с наборами реактивов фирмы "Биокон".

Исследование генов семейства глутатионтрансфераз GSTT1 и GSTM1 проводилось методом ПЦР - типирования. Образцы ДНК были выделены у 85 женщин из группы с бесплодием и у 31 фертильной женщины из контрольной группы (всего было исследовано 116 образцов ДНК). Венозная кровь с ЭДТА антикоагулянтом объёмом 0,5 мл собиралась на базе Центра инновационной медицины ГУ "НЦ медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН". Для выделения ДНК использовали наборы реактивов "DNA Prep". Исследовали делеционный полиморфизм генов глютатион S-трансфераз GSTM1, GSTТ1.

Фрагменты генов GSTM1 и GSTT1 были амплифицированы в мультиплекстном формате (набор реагентов для ПЦР амплификации ООО "Центр Молекулярной Генетики", г. Москва). Продукты амплификации анализировались в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиум бромида. Нормальные "+" аллели определялись по наличию ампликона 213 п. н. для GSTM1 и 459 п. н. для GSTT1. В качестве внутреннего контроля амплифицировался фрагмент гена в-глобина 375 п. н. При отсутствии ампликонов 213 п. н. или 459 п. н. препарат ДНК типировался как GSTM10/0 и GSTT10/0 соответственно. Гетерозиготы +/0 данной системой типирования не различаются от гомозигот +/+.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ StatSoft Statistica 6.0. Для представления качественных данных использовали как абсолютные, так и относительные показатели (n, %). Поскольку выборка характеризовалась преимущественно неправильным распределением, для сравнительного анализа использовали непараметрический анализ для независимых выборок с использованием критериев Манна-Уитни (Mann-Whitney U-Test), Вальда-Вольфовица (Wald-Wolfowitz Runs Test (W-W test) и Колмогорова-Смирнова (Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test (К-S test). Для представления количественных данных приводили описательные статистики: среднее, стандартное отклонение, медиана, 25-й и 75-й процентиль в случае ненормально распределенных величин. Для оценки различий относительных величин использовали анализ таблиц сопряженности (ч2). Выбранный критический уровень значимости равнялся 5 % (0,05), что является общепринятым в медико-биологических исследованиях (Флетчер Р. и др., 2004; Гринхальх Г., 2006). Для анализа внутригрупповой взаимосвязи количественных признаков применялся корреляционный анализ Пирсона (для нормально распределенных величин) и непараметрический метод Спирмана. Для оценки информативности отдельных показателей гормонально-метаболических систем и степени их влияния на развитие бесплодия применяли метод многофакторного дискриминантного анализа, с помощью модуля ANOVA/MANOVA ППП STATISTICA (В.И. Юнкеров, С.Г. Григорьев, 2002).

Результаты собственных исследований

Частота и структура бесплодия в Иркутской области (по данным эпидемиологического исследования).

Клинико-эпидемиологическая характеристика женщин с эндокринным бесплодием.

Рис. 2. Распределение женщин по группам фертильности в Иркутской области (n = 4900)

На первом этапе нашей работы было проведено эпидемиологическое исследование методом анкетирования 4900 женщин репродуктивного возраста, проживающих на территории Иркутской области. При анкетировании 4900 женщин все респондентки были разделены на пять категорий в соответствии с классификационным алгоритмом ВОЗ: фертильные, предположительно фертильные, первично бесплодные, вторично бесплодные, с неизвестной фертильностью. В результате проведенного исследования частота бесплодия в Иркутской области составила 19,56 ± 1,1% [рис.2].

Таким образом, эпидемиологическое исследование позволило ответить на вопрос о частоте бесплодия в Иркутской области, значительно превышающей установленный ВОЗ "15%" рубеж, при котором бесплодный брак значительно влияет на демографические показатели, превышая суммарное воздействие невынашивания беременности и перинатальной патологии [Маргиани Ф.А., 2002]. Однако проведенное эпидемиологическое исследование не позволило ответить на вопрос о частоте и структуре эндокринных форм бесплодия, так как для этого требуется проведение комплекса диагностических мероприятий, установленных ВОЗ.

На втором этапе для установления структуры бесплодия нами было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 335 пациенток, состоящих в бесплодном браке (из них 200 женщин проживали в городе, 135-в сельской местности; средний возраст 29,24± 4,5 лет). Обследование проводилось по стандартному протоколу, включающему обязательное эндоскопическое исследование для всех бесплодных женщин.

При углубленном исследовании причин бесплодия в браке на первом месте было женское бесплодие трубного происхождения (N 97.1) - 62%, на втором месте - женское бесплодие, связанное с нарушением овуляции (N 97.0) - 56%, на третьем месте по частоте встречаемости оказались эндометриоз (N 80) - 37% и женское бесплодие, связанное с мужским фактором (N 97.4) - 36%, что подтверждается данными многих исследователей [Кулаков В.И., 2003; Адамян Л.В., 2006; Ермолова Е.В., 2006]. Достаточно редко встречалось женское бесплодие маточного происхождения (N 97.2) - 0,7% и бесплодие невыясненного генеза (N 97.9) - 2%) [рис.3].

Характерной особенностью женщин из бесплодных супружеских пар было сочетание нескольких факторов бесплодия, так, у 83 % женщин наблюдалось сочетание двух и более причин бесплодия.

Рис. 3. Структура женского бесплодия по данным углубленного исследования супружеских пар.

На третьем этапе при изучении структуры эндокринного бесплодия ведущими оказались гиперпролактинемический гипогонадизм (N 97.0) - 39,2% и СПКЯ (Е 28.2) - 36,2%, а также нормогонадотропная дисфункция яичников (Е 28) - 15,7%.

Гипофункция яичников, связанная со сниженной продукцией гонадотропинов (Е 23) или повышенной продукцией гонадотропинов в ответ на преждевременное прекращение функции яичников (Е.28.3) была выявлена у 34 человек, что составило 6% от группы исследования. Также достаточно редко (4,5%) в нашем исследовании были выявлены женщины с врожденной дисфункцией коры надпочечников (Е 25). У женщин с эндокринным бесплодием частота эндометриоза составила 21%; миомы матки - 11%; гиперпластических процессов эндометрия - 6,5 %. Выявлена высокая частота ПМС и ФКМ у женщин с бесплодием (13% и 15,7%).

При анализе клинических и анамнестических характеристик у женщин с бесплодием в сформированных группах (I - с гиперпролактинемией; II с бесплодием и СПКЯ; III с бесплодием и дисфункцией яичников; IV - с бесплодием и миомой матки; V - с эндометриоз-ассоциированным бесплодием) были выявлены некоторые особенности. Так, первичное бесплодие чаще встречалось у женщин с гиперпролактинемией; СПКЯ и дисфункцией яичников; вторичное бесплодие - у женщин с бесплодием и наличием гормонозависимых заболеваний (миома матки и эндометриоз).

Ановуляция, являющаяся наиболее характерной для женщин с СПКЯ и бесплодием, достаточно часто встречалась и в других группах, а НЛФ была наиболее характерной для групп женщин с бесплодием и дисфункцией яичников и миомой матки. Поликистозные изменения яичников, помимо группы с СПКЯ, часто встречались у женщин с гиперпролактинемией, а также у женщин с эндометриоз - ассоциированным бесплодием.

В группе женщин с бесплодием и гиперпролактинемией изолированная гиперпролактинемия (как единственный фактор бесплодия) был выявлен у 41 женщины, что составило 11,7% от группы женщин с гиперпролактинемией в целом; и 4,6% от всей группы женщин с бесплодием. У остальных 308 (87,3%) женщин из группы исследования гиперпролактинемия сочеталась с другими факторами: с трубно-перитонеальным фактором в 32,3%; ПКЯ - в 46,1%; миомой матки - в 14,3%; эндометриозом - в 19,3%. МАГ была выявлена у 43 женщин (12,4%) с гиперпролактинемией. Таким образом, гиперпролактинемия как самостоятельное патологическое состояние встречается крайне редко - менее 5%, в основном являясь "симптомом" других патологических состояний, хотя несомненна роль гипепролактинемии в развитии ановуляции и НЛФ.

СПКЯ как единственная причина бесплодия был выявлен у 31 женщины (3,5%). Чаще всего СПКЯ сочетался с гиперпролактинемией (51,1%), трубный фактор выявлен у 20% женщин с СПКЯ и бесплодием, эндометриоз - у 11,8%, патология эндометрия - у 9,4%, миома матки - у 5,5%; надпочечниковая гиперандрогения - у 6,6%. Группа женщин с СПКЯ и бесплодием характеризовалась также большой частотой гиперпластических процессов эндометрия; ожирения и ГСНЭФ, а также НМЦ (аменорей; олиго-и - опсоменорей; ациклических маточных кровотечений). У женщин с бесплодием и СПКЯ реже встречались: эндометриоз; миома матки; дисменореи; предменструальный синдром и дисгормональная мастопатия; трубно - перитонеальный фактор; ВЗОМТ и спаечный процесс ОМТ. У женщин с бесплодием и СПКЯ частота 2-го бесплодия была значимо ниже; в анамнезе было меньше медицинских абортов и их осложнений; но значимо больше - частота невынашивания беременности.

Группа женщин с бесплодием и дисфункцией яичников, кроме присущих ей НЛФ и НМЦ, характеризовалась большой частотой ВЗОМТ, хронического эндометрита, трубно-перитонеального фактора, невынашивания беременности, ПМС, дисгормональной мастопатии, диффузного нетоксического зоба.

Группа женщин с бесплодием и миомой матки отличалась большой частотой невынашивания беременности; сочетаний миомы с эндометриозом; трубно-перитонеальным фактором; наличием гиперпластических процессов эндометрия; фолликулярных кист яичников; хронического эндометрита и хронического сальпингита, высокой частотой патологии щитовидной железы (диффузного нетоксического зоба, АИТ, эутиреоза). У женщин бесплодием и миомой матки НЛФ встречалась в 2 раза чаще, а ановуляция в 1,4 раза реже, чем у женщин бесплодием без миомы матки.

Группа женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием характеризовалась большой частотой: трубно-перитонеального фактора бесплодия, сочетаний с миомой матки, гиперпластическими процессами эндометрия, фолликулярными кистами и доброкачественными опухолями яичников; высокой частотой гипергонадотропных состояний, большой частотой медицинских абортов и неразвивающихся беременностей; высокой частотой ВЗОМТ, хронического эндометрита и сальпингита; дисменорей; ПМС и диффузной мастопатии по сравнению с группой женщин с бесплодием без эндометриоза. Отличительной особенностью группы женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием было увеличение частоты АИТ; низкая частота ПКЯ и ановуляторного менструального цикла; олиго - и - оспоменорей; а также ожирения по сравнению с группой женщин с бесплодием без эндометриоза.

Состояние основных звеньев нейроэндокринной регуляции, овариальной функции и метаболизма эстрогенов у женщин с эндокринным бесплодием

Группа женщин с бесплодием и гиперпролактинемией, кроме закономерного повышения концентраций пролактина, по сравнению с контрольной группой фертильных женщин, характеризовалась значимым повышением ЛГ и ФСГ, снижением концентраций эстрадиола в фолликулиновую фазу и периовуляторный период, повышением концентраций эстрона, свободных фракций тестостерона, кортизола и 17-ОН-прогестерона (в пределах референтных значений); снижением концентраций метаболитов эстрогенов: 2-ОН-прогестерона на 67,6%; 16-ОН - прогестерона на 45,4%; соотношения 2-ОН/16-ОН на 47% по сравнению с контрольной группой [табл.1-5].

При сравнении с группой женщин с бесплодием без гиперпролактинемии у женщин с бесплодием и гиперпролактинемией было выявлено, наряду с характерным повышением ПРЛ, значительное снижение соотношений ЛГ/ФСГ (в 2,4 раза) и соотношений метаболитов эстрогенов 2-ОН/16-ОН; снижение концентраций инсулина в 3 раза; повышение уровней кортизола без отличий по концентрация 17-ОН-прогестерона и ДГЭА-С [табл.1-5].

Группа женщин с бесплодием и СПКЯ наряду с характерным для СПКЯ повышением уровней ЛГ, соотношения ЛГ/ФСГ, уровней общего и свободного тестостерона, инсулина, являющихся группообразующими факторами, отличалась от фертильных женщин повышением пролактина, эстрона, 17-ОН-прогестерона и кортизола, снижением содержания эстрадиола в фолликулиновую фазу, снижением метаболитов эстрогенов и их соотношений, снижением концентраций СССГ [табл.1-5].

Группа женщин с бесплодием и дисфункцией яичников отличалась от фертильных женщин относительным повышением уровней ПРЛ, ЛГ, ФСГ, свободного тестостерона без отличий по концентрациям общего тестостерона, инсулина, СССГ и соотношений ЛГ/ФСГ; повышением кортизола в пределах референтных значений; повышением содержания эстрона и снижением эстрадиола в фолликулиновую фазу, снижением метаболитов эстрогенов и их соотношений [табл.1-5].

От группы женщин с бесплодием без дисфункции яичников женщины с дисфункцией яичников и бесплодием отличались повышенным содержанием ЛГ и ФСГ (в пределах референтных значений); снижением соотношений ЛГ/ФСГ и уровней инсулина, снижением эстрадиола и повышением эстрона в фолликулиновую фазу, без значимых отличий концентраций эстрадиола в периовуляторный период, а также метаболитов эстрогенов в моче и их соотношений [табл.1-5].

Группа женщин с бесплодием и миомой матки отличались от контрольной группы фертильных женщин повышением уровней пролактина и ФСГ и снижением концентраций прогестерона. Метаболизм эстрогенов у женщин с миомой и бесплодием характеризовался снижением уровней эстрадиола в фолликулиновую фазу с параллельным повышением эстрона; снижением уровня 2-ОН-прогестерона в 3 раза; 16-ОН - прогестерона в 1,5 раза и соотношения 2-ОН/16-ОН в 2,3 раза по сравнению с контрольной группой [табл.1-5]. Группа женщин с миомой матки и бесплодием не отличалась от здоровых фертильных женщин по медианам концентраций общего тестостерона, СССГ, инсулина, 17-ОН-прогестерона и ДГЭА-С. Однако нами выявлено повышенное содержание активного свободного тестостерона и кортизола у женщин с миомой матки, а также снижение соотношения 2-ОН/16-ОН (на 21%) у женщин с миомой и бесплодием по сравнению с группой женщин с бесплодием без миомы матки (за счет повышения (на 24,4%) 16-ОН - прогестерона) [табл.1-5].

Группа женщин с эндометриоз-ассоциированным бесплодием отличались от контрольной группы фертильных женщин повышением уровней пролактина, ЛГ и ФСГ при отсутствии значимых различий по соотношениям ЛГ/ФСГ; снижением эстрадиола в фолликулиновую фазу и периовуляторный период. Кроме того, группа женщин с эндометриоз ассоциированным бесплодием характеризовалась снижением концентраций прогестерона; повышением свободного тестостерона, кортизола, снижением уровня 2-ОН-прогестерона в 3 раза; 16-ОН - прогестерона в 1,8 раза и соотношения 2-ОН/16-ОН в 1,7 раза по сравнению с контрольной группой [табл.1-5].

В группе женщин с эндометриозом и бесплодием по сравнению с группой женщины с бесплодием без эндометриоза отмечалось повышение концентраций ФСГ со снижением ЛГ и соотношений ЛГ/ФСГ; эстрона, общего тестостерона [табл.1-5].

Таблица 1. Концентрации гормонов гипофиза у женщин с эндокринным бесплодием и гормонозависимыми заболеваниями

* - р < 0,05 по отношению к контролю; - значимые различия у данной группы женщин с бесплодием от группы сравнения (при наличии различий не менее 2-х из 3-х критериев (Mann-Whitney U-Test), Wald-Wolfowitz Runs Test (W-W test) и Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test (К-S test), при р < 0,05).

Таблица 2. Концентрации половых стероидов, инсулина и сексстероидсвязывающего глобулина у женщин с эндокринным бесплодием и гормонозависимыми заболеваниями

* - р < 0,05 по отношению к контролю; - значимые различия у данной группы женщин с бесплодием от группы сравнения (при наличии различий не менее 2-х из 3-х критериев (Mann-Whitney U-Test), Wald-Wolfowitz Runs Test (W-W test) и Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test (К-S test), при р < 0,05).

Таблица 3. Концентрации эстрогенов и их метаболитов у женщин с эндокринным бесплодием и гормонозависимыми заболеваниями

* - р < 0,05 по отношению к контролю; - значимые различия у данной группы женщин с бесплодием от группы сравнения (при наличии различий не менее 2-х из 3-х критериев (Mann-Whitney U-Test), Wald-Wolfowitz Runs Test (W-W test) и Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test (К-S test), при р < 0,05).

Таблица 4. Концентрации надпочечниковых гормонов у женщин с эндокринным бесплодием и гормонозависимыми заболеваниями

* - р < 0,05 по отношению к контролю; - значимые различия у данной группы женщин с бесплодием от группы сравнения (при наличии различий не менее 2-х из 3-х критериев (Mann-Whitney U-Test), Wald-Wolfowitz Runs Test (W-W test) и Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test (К-S test), при р < 0,05).

Таблица 5. Концентрации тиреотропного и тиреоидных гормонов у женщин с эндокринным бесплодием и гормонозависимыми заболеваниями

* - р < 0,05 по отношению к контролю; - значимые различия у данной группы женщин с бесплодием от группы сравнения (при наличии различий не менее 2-х из 3-х критериев (Mann-Whitney U-Test), Wald-Wolfowitz Runs Test (W-W test) и Kolmogorov-Smirnov Two-Sample Test (К-S test), при р < 0,05).

Исследование процессов ПОЛ-АОЗ у пациенток с эндокринным бесплодием и гормонозависимыми заболеваниями

Состояние процессов ПОЛ-АОЗ у женщин с бесплодием и гиперпролактинемией в сравнении с контрольной группой фертильных женщин характеризовалось повышением концентраций ДВ. св, КД-СТ, ДК; снижением МДА; снижением концентраций ретинола, GSH с повышением АОА; снижением концентраций цинка [табл.6].