Нейропротекторные свойства и механизм действия новых производных аналогов гамма-аминомасляной кислоты

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

14.00.25 Фармакология, клиническая фармакология

аминомасляный кислота нейропротекторный

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Нейропротекторные свойства и механизм действия новых производных аналогов гамма-аминомасляной кислоты

Бородкина Людмила Евгеньевна

Волгоград 2009

Работа выполнена на кафедре фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Тюренков Иван Николаевич

Официальные оппоненты:

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Александр Алексеевич Спасов

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Татьяна Александровна Воронина

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Константин Михайлович Резников

Ведущая организация: Российская военно-медицинская академия

Защита состоится «_____»____________2009 г. в __________часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1

Автореферат разослан «_____»_______________2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

доктор медицинских наук,

профессор А.Р. Бабаева

Актуальность

Мозг является органом-мишенью для различных повреждающих факторов (стресс, интоксикации, нарушения кровообращения и др.), воздействие которых ведет к органическому поражению структур мозга и нарушению его функциональной активности. Ввиду многообразия этиологических факторов нейродегенеративная патология представляет собой гетерогенный клинический синдром (Бурчинский С.Г., 2008; Новиков В.Е., 2007; Muresanu D.F., 2003, 2007) «ключевыми» звеньями патогенеза которого, независимо от этиологического фактора, являются: 1) снижение мозгового кровотока; 2) гипоксия; 3) энергодефицит; 4) глутаматная «эксайтотоксичность»; 5) осмотический стресс; 6) интенсификация свободнорадикального окисления; 7) апоптоз, гибель нейронов (Бурчинский С.Г., 2008; Кадыков А.С., Шахпаронова Н.В., 2009; Muresanu D.F., 2003, 2007). Каждый этап этого патологического «каскада» является своеобразной мишенью для терапевтического воздействия, что приводит в реальной практике к полипрогмазии. С другой стороны, воздействия только на одно звено этой цепи недостаточно, поэтому теоретически идеальный нейропротектор должен являться антагонистом сразу нескольких повреждающих факторов и иметь широкий профиль активности (Гусев Е.И., Скворцова В.И. 2001; Елисеев Е.В., Корюкова И.В., Румянцева С.А. и др., 2008).

Многочисленные данные экспериментальных и клинических исследований указывают на перспективность фармакотерапии нейродегенеративной патологии путем воздействия на систему гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) (Гаевый М.Д., Ковалев Г.В., 1985; Мирзоян Р.С., 2003). Установлено, что ГАМК-ергические вещества могут улучшать кровоснабжение головного мозга (Гаевый М.Д., 1985, 2000; Мирзоян С.А., 1985; Акопян В.П., 2003; Мирзоян Р.С., 1995, 2003); улучшать ауторегуляцию мозгового кровотока (Гаевый М.Д., Ковалев Г.В., 1985; Акопян В.П., 2003; Мирзоян Р.С., 2005; Smith W.S., 2004); подавлять глутаматно-кальциевый каскад (Кулинский В.И., Михельсон Г.В., 1997; Луньшина Е.В., 2003; Островская Р.У., 2003; Мирзоян Р.С., 2005; Hasbani M.J. et al., 2001); предупреждать перекисное окисление липидов (ПОЛ) и повышать активность антиоксидантных систем (Ганнушкина И.В., Коплик Е.В. и др., 2004; Smith W.S., 2004); оказывать мембранопротекторное действие (Мирзоян Р.С., Луньшина Е.В., 2003); улучшать утилизацию глюкозы и нивелировать явления энергодефицита (Розанов В.А., 1989; Pascual J.M. et al., 2001; Shwartz-Bloom R.D., Sah R., 2001). Приведенные данные делают очевидной перспективность разработки эффективных нейропротекторов на основе ГАМК-ергических веществ. Доказано, что оригинальные отечественные препараты фенибут и фенотропил обладают высокой нейропротекторной и ноотропной активностью (Ковалев Г.В., 1985, 1990; Тюренков И.Н., 1985; Петров В.И., 1985, 1991; Спасов А.А., 1985, Островский О.В., 1985; Савченко А.Ю., 2005).

Волгоградскими фармакологами в тесном сотрудничестве с химиками Российского Государственного Педагогического Университета имени А.И. Герцена (г. Санкт-Петербург) ведется поиск активных и эффективных соединений при нейродегенеративном повреждении головного мозга среди различных производных ГАМК. Одним из этапов данного сотрудничества является синтез ряда солей и композиций структурных аналогов линейной и циклической формы ГАМК с биологически активными карбоновыми кислотами, изучению нейропротекторных свойств которых посвящено настоящее исследование.

Цель исследования. Создание на основе солей и композиций органических кислот новых производных ГАМК нового класса эффективных нейропротекторных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний головного мозга.

Задачи исследования.

1. Провести в ряду солей и композиций структурных аналогов линейной и циклической формы ГАМК с метабоактивными органическими кислотами скрининг веществ, обладающих выраженными нейропротекторными свойствами на моделях максимального электрошока (МЭШ) и электроконвульсивного шока (ЭКШ).

2. Изучить зависимость доза-нейропротекторне действие для наиболее активного нового производного ГАМК.

3. Изучить эффективность наиболее активного по результатам скрининга нового производного ГАМК с использованием комплексного морфофункционального подхода на различных экспериментальных моделях нейропатологии: генерализованных судорог, острой тотальной ишемии головного мозга, острого и хронического стресса, субхронической и хронической алкогольной интоксикации.

4. Исследовать гемодинамические основы нейропротекторного действия наиболее активного нового производного ГАМК: влияние на мозговое кровообращение, микроциркуляцию, реологические свойства крови, а также на устойчивость к острой генерализованной гипоксии.

5. Изучить возможные механизмы психо- и нейропротекторного действия наиболее активного нового производного ГАМК методами нейрофармкологического анализа: взаимодействие с агонистами и антагонистами рецепторов основных нейромедиаторов ЦНС in vivo, влияние на обмен моноаминов и нейроактивных аминокислот в структурах мозга, влияние на межполушарное взаимодействие.

6. Изучить влияние наиболее активного нового производного ГАМК на метаболические процессы в головном мозге: влияние на показатели клеточного метаболизма, на процессы ПОЛ, на активность антиоксидантной системы мозга, на статус окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга при экспериментальной патологии мозга.

7. Обосновать перспективность разработки новых нейропротекторных средств на основе солей и композиций структурных аналогов ГАМК линейной и циклической формы с метабоактивными органическими кислотами.

Научная новизна.

Впервые проведен целенаправленный поиск веществ с нейропротекторным действием среди 43 производных ГАМК - солей и композиций фенибута, карфедона, фепирона, баклофена, мефебута и толибута с метабоактивными органическими кислотами (янтарной, лимонной, яблочной и др.), в результате которого найдены вещества с высокой нейропротекторной активностью: цитрат фенибута -соединение под лабораторным шифром РГПУ-147, сукцинат фенотропила - РГПУ-138, малат толибута - РГПУ-159, сукцинат фепирона - РГПУ-171, сукцинат мефебута - РГПУ-177, цитрат баклофена - РГПУ-184. Выделено вещество наиболее перспективное для дальнейшего доклинического изучения в качестве потенциального нейропротектора - соединение РГПУ-147.

Впервые на основании данных предложенного нами комплексного морфофункционального подхода к изучению нейропротекторного действия цитратсодержащего аналога фенибута РГПУ-147, установлено, что данное вещество в условиях судорожного, ишемического, стрессорного и алкогольно-токсического поражения головного мозга уменьшает выраженность когнитивно-мнестических и эмоциональных нарушений, а также препятствует развитию дегенеративных гистоморфологических изменений ткани головного мозга. Изучаемое вещество превосходит по нейропротекторному действию пирацетам, фенибут и фенотропил.

Впервые показано, что механизм нейропротекторного действия нового производного ГАМК РГПУ-147 вероятно связан с наличием у него способности препятствовать снижению мозгового кровотока в период ишемии, сглаживать феномены гипер- и гипоперфузии в постишемическом периоде (во время реперфузии), улучшать микроциркуляцию в ткани головного мозга, оказывать противогипоксическое действие, уменьшать проявления синдрома повышенной вязкости крови, оказывать антиагрегантное действие. Соединение РГПУ-147 ингибирует процессы перикисного окисления липидов и повышает активность антиоксидантных систем. Показано, что соединение РГПУ-147 способно предупреждать нарушения окислительного фосфолирирования митохондрий головного мозга.

Впервые определены нейрохимические аспекты нейропротекторного действия нового производного ГАМК соединения РГПУ-147. Показана его способность стимулировать ГАМК-, Н-холин- и дофаминергическую нейропередачу, повышать обмен дофамина, глицина и таурина в структурах мозга, облегчать межполушарное взаимодействие.

Практическая значимость работы.

Теоретически и экспериментально обосновано новое перспективное направление создания нейропротекторных веществ для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний ЦНС, на основе солей и композиций структурных аналогов линейной и циклической формы ГАМК с метабоактивными органическими кислотами. Разработаны рекомендации химикам по целенаправленному синтезу и поиску новых веществ с нейропротекторными свойствами среди производных гамма-аминомасляной кислоты.

Комплексное морфофункциональное исследование нейропротекторных свойств новых производных ГАМК позволило выделить вещество под лабораторным шифром РГПУ-147 (цитрат фенибута), обладающее высокой нейропротекторной активностью, превосходящее по эффективности широко используемые в практической медицине пирацетам, фенибут и фенотропил, обосновать перспективность создания на его основе эффективного нейропротекторного средства для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний и дать рекомендации по его возможному применению в комплексной терапии судорожных состояний, ишемического инсульта, стрессиндуцированной патологии и алкогольной болезни.

Реализация результатов.

На основании данных диссертационного исследования химиками кафедры органической химии Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И.Герцена (г. Санкт-Петербург) ведется целенаправленный синтез новых соединений с заданными типами фармакологической активности.

Разработанная комплексная морфофункциональная система поиска и доклинического фармакологического изучения веществ с нейропротекторной активностью используется в научно-исследовательской работе кафедры фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета (ВолГМУ), НИИ фармакологии ВолГМУ, кафедрах фармакологии ВолГМУ, Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Полученные результаты о нейропротекторных свойствах новых производных гамма-аминомасляной кислоты включены в раздел учебных программ курса фармакологии на кафедрах фармакологии и биофармации ФУВ, фармакологии, клинической фармакологии и интенсивной терапии Волгоградского государственного медицинского университета, кафедрах фармакологии Пятигорской государственной фармацевтической академии, Воронежской медицинской академии, Ростовского государственного медицинского университета, Курского государственного медицинского университета (акты о внедрении прилагаются).

По материалам настоящей работы получено 2 патента Российской Федерации на изобретения.

По материалам диссертационной работы подготовлен полный комплект документов по доклиническому изучению психотропной и нейропротекторной активности цитрата фенибута РГПУ-147 и передан производителю ОАО «Валента Фарм» для представления в Фармакологический комитет МЗ РФ на получение разрешения к проведению клинических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту:

Поиск нейропротекторных веществ, среди новых солей и композиций аналогов ГАМК, является перспективным направлением в разработке и создании лекарственных препаратов для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний (в комплексной терапии судорожных состояний, ишемического инсульта, стрессиндуцированной патологии и алкогольной болезни).

Перспективным путем поиска веществ с нейропротекторным действием является создание на основе активных линейных и циклических структурных аналогов ГАМК солей и композиций с биологически активными карбоновыми кислотами.

Введение в химическую структуру биологически активных карбоновых кислот практически не меняет направленности действия производных ГАМК, но позволяет одновременно снизить дозу исходного вещества, повысить активность и уменьшить токсичность.

В ряду солей и композиций линейных и циклических аналогов ГАМК с биологически активными карбоновыми кислотами наибольшей нейропротекторной активностью в условиях генерализованных судорог, ишемии головного мозга, острого и хронического стресса, субхронической и хронической алкогольной интоксикации обладает цитратсодержащее производное фенибута соединение РГПУ-147, превосходящее по эффективности широко применяемые в практической медицине препараты пирацетам, фенибут и фенотропил.

Нейропротекторная активность РГПУ-147 связана с наличием у него противогипоксического эффекта, способности улучшать микроциркуляцию в ткани головного мозга, препятствовать снижению мозгового кровотока в период ишемии, сглаживать феномены гипер- и гипоперфузии в постишемическом периоде, уменьшать проявления синдрома повышенной вязкости крови, оказывать антиагрегантное действие, ингибировать процессы перикисного окисления липидов и повышать активность антиоксидантных систем, предупреждать нарушения окислительного фосфолирирования митохондрий головного мозга, оказывать стимулирующее влияние на ГАМК-, Н-холин- и дофаминергическую нейропередачу, повышать обмен дофамина в структурах мозга, облегчать межполушарное взаимодействие,

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях ВолГМУ (2000-2008 гг.), на заседании проблемной комиссии ВолГМУ (Волгоград, 2003); на Всероссийской научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2004); на пятой научно-практической конференции «Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург, 2005г.); на 8th Еuropean College Neuropsychopharmacology Regional Meeting (Moscow, 2005), на 7-th International scientific and practical conference “Health and education millennium” (Москва, 2006г.), на 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006г.), на 2-ом и 3-ем Съездах Российского Научного Общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии” (Москва, 2003г., г. Санкт-Петербург, 2007г.)

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 64 работы, разрешенных к публикации в открытой печати, из них: 8 публикаций в рецензируемых ВАК журналах, получено 2 патента Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, собственных экспериментальных данных (9 глав), обсуждения результатов, выводов, списка литературы. Материалы диссертации изложены на 445 стр. машинописного текста. Диссертация иллюстрирована 98 рисунками, 56 таблицами. Список литературы содержит 403 источника, из которых 188 на русском языке и 215 на иностранных языках.

Материалы и методы.

Исследование выполнено на 1862 крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г и 210 мышах-самцах линии BALB/C массой 20-25 г, 20 кроликах обоего пола массой 3,5-4,5 кг, содержавшихся в стандартных условиях вивария с естественным 12-часовым свето-темновым циклом, при температуре воздуха 20-21°С и свободном доступе к воде и полнорационному корму. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997г.). При проведении экспериментов учитывались требования Комиссии по проблеме этики отношения к животным Российского национального Комитета по биоэтике при Российской академии наук и этические нормы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985г.). Настоящее исследование одобрено локальным этическим комитетом, протокол заключения № 100-2009 от 27.06.2009г. Животные были получены из Филиала РАМН «Научный центр биомедицинских технологий, питомник «Столбовая» (Россия, Московская область), а также ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН (Россия, Ленинградская область).

В настоящем исследовании изучена потенциальная нейропротекторная активность новых производных аналогов гамма-аминомасляной кислоты. В сотрудничестве с кафедрой органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия) Выражаем искреннюю благодарность зав. кафедрой органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.М. Герцена (Санкт-Петербург, Россия) ЗДН, д.х.н., профессору А.М. Берестовицкой и старшему научному сотруднику, к.х.н. О.С. Васильевой, предоставивших исследуемые вещества для нашей работы. нами были разработаны и получены соединения, в химическую структуру которых к 6 линейным и циклическим структурным аналогам гамма-аминомасляной кислоты, обладающим нейропротекторными свойствами, добавлены различные биологически активные кислоты:

Лимонная (НООССН2)2С(ОН)СООН	Никотиновая С6Н5NО2
Яблочная НООССН(ОН)СН2СООН	Глутаминовая HOOCCH2CH2CH(NH2)COOH
Янтарная НООС(СН2)2СООН	Глицин H2NCH2COOH
Щавелевая НООС-СООН

Добавление естественных метаболически активных агентов, может улучшить биодоступность, потенциировать эффект исходного вещества за счет синергизма действия, снизить токсичность, уменьшить спектр возможных побочных эффектов.

На основании представленной концепции было проведено исследование нейропротекторных свойств 43 производных ГАМК, соединений под лабораторными шифрами РГПУ, разделенных на 6 химических групп, по количеству исходных веществ: группы производных фенибута, карфедона, толибута, баклофена, мефебута и фепирона.

фенибут	баклофен
карфедон	мефебут
толибут	фепирон

Субстанции изучаемых химических соединений, а также препаратов позитивного контроля фенибута и фенотропила были получены на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия). Соединения вводились животным в эквимолярных концентрациях - в дозах, составляющих 1/10 от М (молекулярной массы) (мг/кг) (таблица 1). В качестве растворителя использовали 0,89% раствор хлорида натрия.

Таблица 1.

Дозы изучаемых соединений

Соединения	Дозы (1/10 от М)	Соединения	Дозы (1/10 от М)
фенибут	25 мг/кг	баклофен	25 мг/кг
ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНИБУТА	ПРОИЗВОДНЫЕ БАКЛОФЕНА
РГПУ-147	73 мг/кг	РГПУ-184	83 мг/кг
РГПУ-149	48 мг/кг	РГПУ-185	55 мг/кг
РГПУ-150	49 мг/кг	РГПУ-186	55 мг/кг
РГПУ-151	48 мг/кг	РГПУ-187	52 мг/кг
РГПУ-152	50 мг/кг	РГПУ-188	56 мг/кг
РГПУ-192	43 мг/кг	РГПУ-190	57 мг/кг
карфедон	25 мг/кг	РГПУ-193	50 мг/кг
ПРОИЗВОДНЫЕ КАРФЕДОНА	мефебут	25 мг/кг
РГПУ-138	55 мг/кг	ПРОИЗВОДНЫЕ МЕФЕБУТА
РГПУ-154	63 мг/кг	РГПУ-176	48 мг/кг
РГПУ-155	57 мг/кг	РГПУ-177	50 мг/кг
РГПУ-156	56 мг/кг	РГПУ-178	51 мг/кг
РГПУ-158	58 мг/кг	РГПУ-179	52 мг/кг
толибут	25 мг/кг	РГПУ-180	53 мг/кг
ПРОИЗВОДНЫЕ ТОЛИБУТА	РГПУ-181	58 мг/кг
РГПУ-159	52 мг/кг	фепирон	25 мг/кг
РГПУ-165	48 мг/кг	ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕПИРОНА
РГПУ-166	50 мг/кг	РГПУ-171	44 мг/кг
РГПУ-167	51 мг/кг	РГПУ-172	45 мг/кг
РГПУ-168	53 мг/кг	РГПУ-174	47 мг/кг
РГПУ-169	77 мг/кг	РГПУ-175	51 мг/кг
РГПУ-194	46 мг/кг

На всех этапах исследования контрольные группы животных получали физиологический раствор в эквивалентном объеме. В качестве препаратов позитивного контроля в работе использовались в эффективных терапевтических дозах: фенибут и фенотропил - 25 мг/кг, пирацетам (PIRACETAM; р-р д/инъ 20% 5мл №10; УфаВита (г.Уфа), Россия) - 400 мг/кг.

Для нейрофармакологического анализа возможных механизмов действия соединения РГПУ-147 использовались: неконкурентный антагонист пресинаптических ГАМК-А рецепторов - пикротоксин 5 мг/кг (Sigma, США), блокатор хлорного канала ГАМК-А рецепторного комплекса - коразол 90 мг/кг (Aldrich, Германия), селективный антагонист ГАМК-А рецепторов - бикукуллин 2,7 мг/кг (Fluka, Швейцария), агонист центральных постсинаптических дофаминовых рецепторов - апоморфин 1 мг/кг (Sigma, США), антагонист центральных D2-рецепторов с центральным альфа-адреноблокирующим действием, ингибитор реаптейка и депонирования адреналина - галоперидол 1 мг/кг (Lake Chemikals PVT. LTD, India), агонист центральных пресинаптических б-адренорецепторов - клофелин 0,1 мг/кг (Минмедпром объединение им. 60-летия СССР, Россия), М-холиномиметик - ареколин 25 мг/кг (Aldrich, Германия), агонист центральных и периферических Н-холинорецепторов - никотин 0,2 мг/кг (Sigma, Германия), предшественник серотонина - 5-окситриптофан 300 мг/кг (Sigma, Германия).

Для функциональной оценки психоневрологического статуса животных в условиях моделирования нейропатологии применялись психофармакологические тесты в стандартной модификации: тест «открытое поле» (ОП) (Хаунина Р.А., Лапин И.П. 1976 г., Воронина Т.А. 1982; Гельман В.Я., Кременевская С.И., 1990); тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) (Pellow S. et al., 1985); тест «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П., 1991; Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000), «тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ) (Бондаренко Н.А., 1992.).

Для анализа влияния исследуемых веществ на морфофункциональное состояние структур головного мозга животных, подвергшихся моделированию нейропатологии, забирали образцы головного мозга, которые фиксировали нейтральным 10% формалином в течение 24 часов, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков (Меркулов Г.А., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996), затем окрашивали тионином по методу Ниссля (Лилли Р., 1969; Меркулов Г.А., 1969). Микрофотосъемку гистологических препаратов производили на микроскопе MICROS AUSTRIA (Австрия) цифровой фотокамерой «Olympus» (Япония) на увеличении 100, 400. На срезах, окрашенных по Нисслю, определяли степень поражения нейронов (Чубинидзе А. И., 1972), выполнено морфометрическое исследование.

Таблица 2.

Дизайн исследования: Изучение нейропротекторных свойств и механизма действия новых производных аналогов ГАМК.

№	Модели нейропатологии	Тесты и показатели, использованные для оценки нейропротекторного действия веществ	Вещества и препараты сравнения
Скрининг веществ с нейропротекторной активностью среди 43 структурных аналогов ГАМК
1	максимальный электрошок (МЭШ) (Воронина Т.А., Неробкова Т.Н., 2000, 2005).	продолжительность комы, продолжительность периода до восстановления двигательной активности животных, общая продолжительность судорог, длительность тонической и клонической фаз судорожного приступа	43 структурных аналога ГАМК - соли и композиции фенибута, карфедона, толибута, баклофена, мефебута и фепирона с органическими кислотами (лимонной, янтарной, яблочной, щавелевой, никотиновой, глутаминовой и глицином)
2	электроконвульсивный шок (Воронина Т.А., Неробкова Т.Н., 2000, 2005).	Функциональная оценка психоневрологического статуса и когнетивно-мнестической функции мозга животных, подвергшихся генерализованным судорогам, проводилась с использованием тестов ОП, УРПИ и ТЭИ.
Изучение влияния наиболее активного вещества на морфофункциональное состояние структур головного мозга животных, подвергшихся моделированию нейропатологии
3	электроконвульсивный шок (Воронина Т.А., Неробкова Т.Н., 2000, 2005).	Морфометрическое исследование	Соединение РГПУ-147, пирацетам, фенибут
Изучение зависимости доза-нейропротекторне действие для наиболее активного нового производного ГАМК.
4	Модель глобальной ишемии, вызываемой гравитационной перегрузкой в кранио-каудальном векторе (ГИ), которая воспроизводилась с помощью специально разработанной центрифуги Выражаем большую признательность Д.А. Акулову за изготовление установки а также консультативную и практическую техническую помощь при освоении и внедрении установки в лабораторную практику. (Гаевый М.Д., 2000).	Влияние вещества на выраженность неврологического дефицита оценивали по шкале McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1996). Оценку влияния вещества на психоневрологический статус и когнетивно-мнестическую функцию мозга ишемизированных животных проводили в тестах: «вращающийся стержень» (Караев А. Л, Козлова Г.С. и др., 2004г.), УРПИ, ТЭИ, ОП.	Соединение РГПУ-147 в трех дозах: 1/100, 1/30 и 1/10 от LD50 мг/кг
5	модель острого эмоционально-болевого стресса, вызываемого путем подвешивания животных за дорсальную шейную кожную складку длительностью 24 часа (Островский О.В., Дудченко Г.П., 1985)	Нейропротекторное действие соединений оценивалось по влиянию на психоневрологический статус животных и когнетивно-мнестическую функцию мозга в тестах ОП, ПКЛ, УРПИ и ТЭИ
6	методика принудительной субхронической алкоголизации животных (Воронков А.В., 2003).	Через 7 дней после принудительной алкоголизации изучалось влияние вещества на психоневрологический статус и когнетивно-мнестическую функцию мозга животных в тестах: ОП, ПКЛ, УРПИ и ТЭИ.
Изучение нейропротекторного действия соединения РГПУ-147 в условиях ишемии головного мозга
7	Модель неполной переднемозговой ишемии головного мозга, вызываемой необратимой одномоментной билатеральной окклюзией общих сонных артерий у крыс (ОСА) ( Мирзоян Р.С, 2000).	Регистрация количества выживших животных через 3, 12, 24, 48 и 72 часа после операции.	Соединение РГПУ-147, пирацетам, фенибут и фенотропил
8	Модель глобальной ишемии, вызываемой гравитационной перегрузкой в кранио-каудальном векторе.	Шкала McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1996), тесты: «вращающийся стержень», УРПИ, ТЭИ, ОП. Морфометрическое исследование
Изучение нейропротекторного действия соединения РГПУ-147 в условиях стрессорного поражения ЦНС
9	Модель острого эмоционально-болевого стресса, вызываемого путем подвешивания животных за дорсальную шейную кожную складку длительностью 24 часа.	Нейропротекторное действие соединений в условиях стресса оценивалось по влиянию на психоневрологический статус и когнетивно-мнестическую функцию животных в тестах ОП, ПКЛ, УРПИ и ТЭИ, а также по выраженности «стрессорной триады» - гипертрофии надпочечников, инволюции тимуса и селезенки (определялась относительная масса органов в мг/100г веса животного), степени изъязвления слизистой желудка (по шкале Перцова С.С., 1995). Морфометрическое исследование.	Соединение РГПУ-147, пирацетам, фенибут и фенотропил
10	Модель хронического стресса, вызванного семикратной 24-х часовой депривацией парадоксальной фазы сна. (Воронина Т.А. и др., 1990; Jouvet et al. 1964).
Изучение нейропротекторного действия соединения РГПУ-147 в условиях алкогольно-токсического поражения ЦНСа
11	Модель принудительной субхронической алкоголизации животных. (Воронков А.В., 2003)	Нейропротекторное действие соединений в условиях алкогольной интоксикации оценивалось по влиянию на психоневрологический статус и когнетивную функцию животных в тестах ОП, ПКЛ, УРПИ и ТЭИ. Морфометрическое исследование	Соединение РГПУ-147, пирацетам, фенибут и фенотропил
12	Модель добровольной хронической алкоголизации (Майский А.И., Салимов Р.М., 2000).
Изучение возможных механизмов нейропротекторного действия соединения РГПУ-147:
Изучение влияния вещества на мозговой кровоток и микроциркуляцию, реологию крови, изучение антиагрегантного и антигипоксического действия
Изучение влияния вещества на нейрохимический статус животных:взаимодействие с агонистами и антагонистами рецепторов основных нейромедиаторов ЦНС in vivo, влияние на обмен моноаминов и нейроактивных аминокислот в структурах мозга, влияние на межполушарное взаимодействие.
Изучение влияния вещества на метаболизм головного мозга: влияние на показатели клеточного метаболизма, на процессы ПОЛ, на активность антиоксидантной системы мозга, на статус окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга при экспериментальной патологии мозга.

Изучение возможных механизмов действия соединений с наиболее выраженными нейропротекторными свойствами с применением следующих методов анализа: нейрофармакологического, электрофизиологического, нейрохимического, биохимического.

Для изучение влияния вещества на параметры мозгового кровотока использовалась модель обратимой билатеральной окклюзии общих сонных артерий в сочетании с управляемой гипотензией.(Мирзоян Р.С., 2001). Регистрацию параметров мозгового кровотока проводили в теменной области головного мозга крыс, наркотизированных этаминалом натрия (50 мг/кг) с помощью ультразвукового допплерографа для исследования кровотока ММ-Д-К производства компании «Минимакс» Санкт-Петербург, Россия. Датчик допплерографа УЗДП-010-01с рабочей частотой 25 МГц, диаметром 0,3 см устанавливали на расстоянии 6-7 см дистальнее основания среднемозговой артерии.

Исследование влияния соединения РГПУ-147 на реологические свойства крови проведено на крови 20 кроликов обоего пола, массой 3,5-4,5 кг. Изучение влияния РГПУ-147 на вязкость крови кроликов с экспериментальным синдромом повышенной вязкости крови выполнено по методу воспроизведения нарушений реологических свойств крови in vitro, путем инкубирования крови при 42,5 градусах в течение 60 минут (Плотников М.Б., 1996). Измерения вязкости крови проводились на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия). Влияние РГПУ-147 на агрегацию тромбоцитов исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) научно-производственной фирмы "Биола" (г. Москва) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и соавторов (1989). Величина кислотного гемолиза эритроцитов оценивалась по методу Терского И.А. и Гительзона И.И. (1967). Осмотическую резистентность эритроцитов определяли с использованием спектрофотометра СФ-62 (Россия) при длине волны 540 нанометров.

Изучение противогипоксического действия проводилось на моделях: 1) нормобарическая гипоксия с гиперкапнией («баночная» гипоксия); 2) гемическая гипоксия, вызванная нитритной интоксикацией; 3) гипобарическая гипоксия (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000, 2005).

Влияние соединения РГПУ-147 на состояние окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга крыс при острой черепно-мозговой травме, моделируемой нанесением уколов иглой в мозговую ткань через трепанационное отверстие, регистрировали полярографически с помощью закрытого электрода Кларка, изготовленного в лаборатории им. А.Н.Белозерского (МГУ) (Висмонт Ф.И., Мороз Ю.К.,1980). Выделение митохондрий из ткани головного мозга крыс производилось методом дифференциального центрифугирования в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 0,01 М трис НС1 и 0,0001 М ЭДТА, рН среды 7,4.

Влияние РГПУ-147 на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивалось по содержанию малонового даильдегида по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в гомогенате ткани головного мозга крыс, подвергшихся гравитационной ишемии мозга (Прохорова М.И., 1982). Активность антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы и каталазы измеряли на спектрофотометре SP-ULTRA (OLVEX, Россия) при 406 и 412 нм соответственно (Костюк В.А, Ковалёва Ж.В, Потапович А.И, 1984; Королюк М.А., Л.И Иванова, Майрова И.Г, Токарева В.Е., 1988). Определение содержания лактата крови выполнено энзимным методом, пирувата в крови модифицированным методом Умбрайта (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982). При помощи малого биохимического набора определяли содержание, глюкозы, мочевины, креатинина, АлАТ, АсАТ, метгемоглобина в артериальной и венозной крови крыс.

Нейрофармакологический анализ in vivo возможных механизмов действия соединения РГПУ-147 проведен в соответствии с требованиями "Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" - Фармакологический государственный комитет, МЗ РФ, Москва, 2005".

Нейрохимический анализ влияния вещества РГПУ-147 на содержание моноаминов и их метаболитов определялось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США) (И.И.Мирошниченко, 1988).

Оценку влияния веществ на транскаллозальный ответ (ТКО) проводили в острых опытах по методике, описанной Молодавкиным Г.М. (1998). ТКО получали путем подачи на раздражающий электрод импульсов напряжения (26-29 В, 0.1 мс) с выхода стимулятора MSE-3R (Nihon Kohden, Япония). Для усиления регистрируемой электрической активности использовали усилители Берг-Фурье анализатора (OTE Biomedica, Италия), настроенные на полосу частот в пределах от 0.2 до 500 Гц. Регистрацию и обработку ТКО осуществляли с помощью электрофизиологического комплекса на основе цифрового осциллографа PCS500 (фирма «Velleman Instruments», Голландия), подключаемого к параллельному порту IBM-совместимого компьютера. Влияние исследуемых веществ на транскаллозальный ответ оценивали по усредненным вызванным потенциалам. Усреднение производили с помощью шаблона, специально разработанного для программы Excel, по 20 реализациям с интервалом между стимулами 5 сек.

Методы статистической обработки.

Статистическая обработка результатов исследования в зависимости от характера данных проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, непараметрического U-критерия Манна-Уитни, критерия ч2, метода однофакторного дисперсионного анализа, критерия Стьюдента с поправкой Бонферони для множественных сравнений, а также метода рангового однофакторного анализа Крускала-Уоллиса, критерия Данна для множественных сравнений. Статистически значимыми расценивались эффекты при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При скрининговом изучении нейропротекторного действия новых производных ГАМК выявлены вещества, обладающие выраженной нейропротекторной активностью и ноотропными свойствами: сукцинатсодержащий аналог карфедона - РГПУ-138, цитратсодержащий аналог фенибута - РГПУ-147, малатсодержащий аналог толибута - РГПУ-159, сукцинатсодержащий аналог фепирона - РГПУ-171, сукцинатсодержащий аналог мефебута - РГПУ-177, цитратсодержащий аналог баклофена - РГПУ-184. Данные соединения уменьшали выраженность осложнений приступа генерализованных клонико-тонических судорог, вызванных максимальным электрошоком (таб.3, рис. 1): статистически значимо уменьшали длительность коматозного состояния, количество летальных исходов и время до восстановления двигательной активности у животных, что можно расценивать как проявление ими нейропротекторных свойств.

Таблица 3.

Влияние производных ГАМК на выраженность судорожного синдрома, вызванного максимальным электрошоком.

Группы	Значения показателей (М ± m)	(N/n)/%
	ДКФ	ДТФ	ОДС	ДКОМЫ	КЛИ
Контроль	336,24±30,51	42,27±3,88	385,12±38,54	885,26±76,36	(7/8) 87,5%
РГПУ-138	241,12±23,62*	22,12±1,77**	275,38±26,33*	461,14±49,32**	(2/8) 25%**
РГПУ-147	302,12±30,02	18,24±1,06**	331,07±34,15	436,18±20,09**	(1/8) 12,5%**
РГПУ-159	293,32±31,38	24,35±2,22*	329,22±28,54	493,12±48,52**	(3/8) 37,5%**
РГПУ-171	283,54±27,88	25,38±2,75*	308,28±32,06	637,18±60,53*	(4/8) 50%**
РГПУ-177	275,28±29,33	27,48±2,07*	302,11±24,88*	645,32±62,05*	(5/8) 62,5%**
РГПУ-184	226,32±21,14*	26,45±2,32*	263,45±27,54*	623,21±59,60*	(4/8) 50%**
n=8

Обозначения:

ДКФ - длительность клонической фазы судорог (с.);

ДТФ - длительность тонической фазы судорог (с.);

ОДС - общая длительность судорог (с.);

ДКОМЫ - длительность комы (c.);

КЛИ - количество летальных исходов в группе (N) из общего числа животных в группе (n);

% - процент летальных исходов в группе.

* - p<0,05;** - p<0,01 - - достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных: ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений; критерий ч2; непараметрический U-критерий Манна-Уитни.



Рис. 1. Влияние производных ГАМК на скорость восстановления спонтанной двигательной активности у животных после воздействия максимального электрошока.

Обозначения:

* - p<0,05;** - p<0,01 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных: ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений; непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Перечисленные производные аналогов ГАМК статистически значимо сокращали продолжительность коматозного периода и периода до восстановления двигательной активности животных после МЭШ, а также уменьшали выраженность психоневрологических нарушений у животных, подвергшихся электроконвульсивному шоку: вызывали статистически значимое повышение локомоторной и исследовательской активности в ОП (рис. 2), увеличение латентного периода первого захода в темный отсек и снижение числа животных в группе, зашедших в него в УРПИ (рис. 3), уменьшение времени, затрачиваемого на решение экстраполяционной задачи в ТЭИ (рис. 4).

Рис. 2. Влияние производных ГАМК на поведение животных, подвергшихся воздействию электроконвульсивного шока, в тесте «Открытое поле».

Обозначения:

* - p<0,05;** - p<0,01 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных: ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений; непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Рис. 3. Влияние производных ГАМК на латентный период первого захода в темный отсек у животных, подвергшихся электроконвульсивному шоку в тесте «Условная реакция пассивного избегания».

Обозначения:

* - p<0,05;** - p<0,01 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных: ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений; непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Рис. 4. Влияние производных ГАМК на скорость решения экстраполяционной задачи у животных, подвергшихся воздействию электроконвульсивного шока, в тесте «Экстраполяционного избавления».

Обозначения:

* - p<0,05;** - p<0,01 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных: ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений; непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Результаты скрининга позволили также установить прямую взаимосвязь между выраженностью нейропротекторного эффекта и наличием в составе производного ГАМК янтарной, лимонной и яблочной кислот, способность которых усиливать нейропротекторные эффекты исходных веществ может быть связана с их метаболическим действием: участием в процессах клеточного дыхания, окислительного фосфорилирования и обмене макроэргов, которые нарушаются при различных нейропатологиях.

Проведенный нейрофармакологический скрининг веществ с нейропротекторным действием среди новых производных ГАМК из шести химических рядов позволил выделить высокоэффективное соединение с лабораторным шифром РГПУ-147 (цитрат фенибута), перспективное для дальнейшего углубленного изучения.

При изучении влияния соединения РГПУ-147, на степень морфологических изменений в ткани головного мозга крыс, вызванного максимальным электроконвульсивным шоком установлено статистически значимое уменьшение степени поражения нейронов в таких областях головного мозга как гиппокамп, таламус, собственно теменная и задняя лобная доли церебральной коры, лимбическая, собственно лобная и собственно теменная области коры в сравнении с контрольной группой, а также с пирацетамом и фенибутом (таб. 4).

Таблица 4.

Степень поражения нейронов центральной нервной системы у крыс, при воспроизведении электроконвульсивного шока, на фоне курсового профилактического применения соединения РГПУ-147, пирацетама и фенибута (Значение показателей M±m)

Область головного мозга	Группы
	Контроль+ ЭКШ	Пирацетам+ ЭКШ	Фенибут+ ЭКШ	РГПУ-147+ ЭКШ
Кора:
- затылочная	3,3+0,3	2,9+0,2	3,5+0,3	2,5+0,2
- височная	6,3+0,5	7,1+0,5	5,3+1,6	4,8+0,4*
- передняя теменная	20,9+1,7	19,4+1,3	9,3+0,8*	5,9+0,5*
- собственно теменная	21,7+1,8	18,3+1,7	9,8+0,6*	8,8+0,5*
- задняя лобная	18,3+1,6	4,4+0,4*	5,3+0,4*	5,9+0,5*
- собственно лобная	17,1+1,3	11,2+0,8	9,9+0,4*	6,6+0,3*
- островковая	5,2+0,3	5,5+0,4	6,5+0,3	4,0+0,3*
- лимбическая	26,3+1,9	20,5+1,5*	17,2+1,3*	9,9+0,5*
Гиппокамп	8,1+0,5	5,2+0,4*	3,5+0,3*	2,3+0,2*
Таламус:
- передний	12,7+1,1	13,1+1,1	6,7+0,5*	3,6+0,2*
- средний	11,5+1,0	10,2+0,8	5,2+0,5*	3,4+0,2*
- задний	7,0+0,6	8,3+0,6	4,1+0,3*	3,5+0,3*
Гипоталамус	13,3+1,2	12,7+1,1	10,8+0,8*	5,7+0,3*
Продолговатый мозг
- дорсальный отдел	10,5+0,8	9,3+0,6	8,1+0,7*	4,0+0,2*
- вентральный отдел	9,3+0,5	8,6+0,6	7,8+0,5*	3,3+0,3*

Обозначения: * - p<0,05 - достоверность различий по сравнению с контролем (непараметрический U-критерий Манна-Уитни).

Далее было проведено комплексное морфофункциональное исследование нейропротекторного действия РГПУ-147 в сравннии с препаратами: пирацетамом, фенибутом и фенотропилом на моделях ишемического повреждения ЦНС. Курсовое профилактическое применение РГПУ-147, а также препаратов сравнения пирацетама, фенибута и фенотропила способствовало повышению выживаемости животных в условиях неполной переднемозговой ишемии. При этом наибольшую активность проявило соединение РГПУ-147, курсовое профилактическое введение которого способствовало выживаемости 80% животных (таб. 5).

Таблица 5.

Влияние соединений на выживаемость животных в условиях ишемии головного мозга, вызванной двусторонней необратимой перевязкой общих сонных артерий.

Группы

Время регистрации выживаемости от момента операции, час.

Итого

3 часа

12 часов

24 часа

48 часов

72 часа

n/N

%

n/N

%

n/N

%

n/N

%

n/N

%

n/N

%

Контроль

1/10

10

2/9

22,2

3/7

42,8

1/4

25

1/3

33,3

7/10

70

Пирацетам

1/10

10

2/9

22,2

4/7

57

0/3

0**

0/3

0**

6/10

60

Фенибут

1/10

10

2/9

22,2

2/7

28,5*^

1/5

20

0/4

0**

5/10

50**

Фенотропил

0/10

0**

2/10

20

1/7

14,3**^

1/6

16,7

0/4

0**

4/10

40**

РГПУ-147

0/10

0**

0/10

0**^+

1/10

10**^

1/9

11**

0/8

0**

2/10

20**

N=10

Обозначения: * - p<0,05; ** - p<0,01 - достоверность различий по сравнению с ишемизированной контрольной группой животных

^ - p<0.05 Данные достоверны по отношению к показателям группы пирацетама.

+- p<0.05 Данные достоверны по отношению к показателям группы фенибута.

#- p<0.05 Данные достоверны по отношению к показателям группы фенотропила

(Критерий ч2).

В условиях гравитационной ишемии (ГИ) (9-кратная гравитационная перегрузка) при профилактическом введении в течение 14 дней соединение РГПУ-147 значительно снижало степень неврологического дефицита у животных. Наиболее существенно снижал выраженность неврологической симптоматики у животных цитратсодержащий аналог фенибута РГПУ-147, по выраженности нейропротекторного действия он превзошел все препараты сравнения (таб. 6).

Таблица 6.

Влияние курсового профилактического введения соединения РГПУ-147 на степень неврологического дефицита у животных, подвергшихся ишемии, вызванной воздействием продольных гравитационных перегрузок (9g) в краниокаудальном векторе.

Группы	индекс McGrow, баллы (M ± m)
контроль	8.7±0.15
пирацетам	7.8±0.2*
фенибут	6.1±0.16*^
РГПУ-147	1.85±0.17*^+#
фенотропил	2.75±0.27*^+
N=10

Обозначения:

*- p<0.05 Данные достоверны по отношению к показателям контрольной группы животных.

^ - p<0.05 Данные достоверны по отношению к показателям группы пирацетама.

+- p<0.05 Данные достоверны по отношению к показателям группы фенибута.

#- p<0.05 Данные достоверны по отношению к показателям группы фенотропила. (Ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений).

Вещество РГПУ-147 при ГИ оказывало выраженное нейропротеторное действие. У животных, получавших до и после ГИ соединение РГПУ-147, а также препараты сравнения отмечались достоверно более высокие показатели локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности, когнитивной и мнестической функций у животных в психофармакологических тестах «открытое поле» (таб. 7), «условная реакция пассивного избегания» (таб. 8), «тест экстраполяционного избавления» (таб. 9). В данной серии экспериментов соединение РГПУ-147 по эффективности также превосходило препараты позитивного контроля фенибут, фенотропил и пирацетам.

Таблица 7.

Влияние соединений на двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность у животных в тесте «открытое поле» после гравитационной ишемии.

группы	Значения показателей M±m
	1-е сутки после ишемии	3-сутки после ишемии	7-е сутки после ишемии	14-е сутки после ишемии
	ГДА	СОИА	ГДА	СОИА	ГДА	СОИА	ГДА	СОИА
контроль интактный	32,12± 3,22	9,14± 0,88	31,25± 2,54	8,88± 0,45	30,75± 2,33	8,05± 0,66	29,06± 2,15	7,24± 0,36
контроль+ишемия	12,8± 1,25	3,25± 0,44	11,9± 0,46	2,9± 0,21	13,4± 1,32	3,24± 0,45	14,86± 1,65	4,08± 0,57
пирацетам+ишемия	13,04± 1,36	3,54± 0,24	12,36± 2,14	3,25± 0,58	14,26± 2,31	4,16± 0,25	19,31± 0,86*	4,53± 0,15
фенибут+ишемия	15,31± 2,12	4,05± 0,36	15,18± 2,34	3,54± 0,48	18,46± 1,15*	5,48± 0,27*	22,34± 1,45*	5,56± 0,85*
РГПУ-147+ишемия	20,31± 2,88	5,03± 0,88	20,16± 1,24**	5,12± 0,37**	27,62± 1,48**	6,88± 0,32**	30,12± 1,53**	8,02± 0,37**
фенотропил+ишемия	18,32± 2,48	4,67± 0,24	17,86± 1,15*	4,23± 0,65	25,64± 1,31**	6,12± 0,14**	28,55± 1,62**	7,52± 0,45**
N=8

Обозначения: ГДА - горизонтальная двигательная активность (число пересеченных квадратов); СОИА - суммарная ориентировочно-исследовательская активность (сумма количества вертикальных стоек и заглядываний в отверстия).

* - p<0,05; ** - p<0,01 - достоверность различий по сравнению с ишемизированной контрольной группой животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Дана для множественных сравнений; критерий ч2).

Таблица 8.

Влияние соединений на воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания у животных после гравитационной ишемии.

группы	Воспроизведения УРПИ (значения показателей M±m)
	1-е сутки после ишемии	3-сутки после ишемии	7-е сутки после ишемии	14-е сутки после ишемии
	ЛП	%НЗ (n/N)	ЛП	%НЗ (n/N)	ЛП	%НЗ (n/N)	ЛП	%НЗ (n/N)
контроль интактный	168,0± 20,13**	87,5** (7/8)	156,14± 14,21**	87,5** (7/8)	149,34± 14,24	75** (6/8)	136,55± 12,33**	75** (6/8)
контроль+ишемия	64,25± 18,25*	25 (2/8)	70,14± 20,15	37,5 (3/8)	30,26± 5,34	25 (2/8)	25,12± 3,66	12,5 (1/8)
пирацетам+ишемия	68,65± 11,24	25 (2/8)	75,36± 13,25	37,5 (3/8)	45,31± 14,15	25 (2/8)	44,36± 9,33*	25* (2/8)
фенибут+ишемия	75,26± 10,08	37,5 (3/8)	84,21± 14,11	50 (4/8)	58,32± 13,22*	50** (4/8)	53,42± 10,25**	25* (2/8)
РГПУ-147+ишемия	108,34± 13,65*	50** (4/8)	126,11± 1028**	75** (6/8)	98,32± 9,28**	75** (6/8)	97,38± 9,36**	50** (4/8)
фенотропил+ишемия	96,37± 20,18	50** (4/8)	102,74± 18,23*	50 (4/8)	77,46± 14,62**	50** (4/8)	84,62± 11,38**	50** (4/8)
N=8

Обозначения: ЛП - латентный период первого захода в темный отсек (сек); n/N-количество животных в группе посетивших темный отсек в тесте УРПИ (n) из общего числа животных в группе (N); % - процент животных в группе, посетивших темный отсек в тесте УРПИ.

* - p<0,05; ** - p<0,01 - достоверность различий по сравнению с ишемизированной контрольной группой животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Дана для множественных сравнений; критерий ч2).

Таблица 9.

Влияние соединений на состояние памяти ишемизированных животных в тесте « экстраполяционного избавления» (ТЭИ).

Группы	Воспроизведение ТЭИ
	ЛПП (M±m)	n/N	%
контроль интактный	15,1±0,7**	0/8	100**
контроль+ишемия	69,4±1,1	5/8	62,5
пирацетам+ишемия	51,7±0,9	4/8	50
фенибут+ишемия	51±1,6*	3/8	37,5**
РГПУ-147+ишемия	33,4±0,9**	1/8	12,5**
фенотропил+ишемия	41±2,3*	2/8	25**
N=8

Обозначения: ЛПП - латентный период подныривания (сек.). n/N-количество животных в группе не решивших экстраполяционную задачу в тесте ТЭИ (n) из общего числа животных в группе (N); % - процент животных в группе, не решивших задачу в тесте ТЭИ.

* - p<0,05; ** - p<0,01 - достоверность различий по сравнению с ишемизированной контрольной группой животных (ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса, критерий Данна для множественных сравнений; критерий ч2).

Морфологическое исследование головного мозга животных при моделировании острой гравитационной ишемии на фоне применения соединения РГПУ-147, фенибута и пирацетама показало наличие у них защитного влияния на ткань головного мозга, наиболее выраженное в отношении коры головного мозга, гиппокампа, амигдалярного комплекса, зрительного бугра, мелкоклеточных ядер гипоталамуса и, в меньшей степени, крупноклеточных ядер гипоталамуса, некоторых ядер стволовой части головного мозга. Данный эффект проявлялся уменьшением в данных отделах гиперхромных нейронов, а также клеток находящихся в состоянии вакуольной дистрофии. В отношении образований стриопаллидарной системы, ядер вентральной области продолговатого мозга протекторного действия исследуемых препаратов выявлено не было. По данным морфометрии нейронов различных структур головного мозга после ГИ, у животных, получавших РГПУ-147 степень поражения центральной нервной системы была значительно меньше, чем у животных контрольной группы (таб. 10).

Таблица 10.

Степень поражения нейронов центральной нервной системы у крыс, при моделировании острой гравитационной ишемии, на фоне введения соединения РГПУ-147, пирацетама и фенибута (M+m)

Область головного мозга	Группы животных
	Контроль+ ишемия	Пирацетам+ ишемия	Фенибут+ ишемия	РГПУ-147+ ишемия
Кора: - затылочная - височная - передняя теменная - собственно теменная - задняя лобная - собственно лобная - островковая - лимбическая Гиппокамп Амигдалярный комплекс Таламус: - передний - средний - задний Гипоталамус: -паравентрикулярное ядро -супраоптическое ядро Стриопаллидарная система Продолговатый мозг - дорсальный отдел - вентральный отдел	43,6+3,8 29,54+1,9 16,6+0,9 13,0+0,9 17,0+1,6 25,7+2,4 15,2+1,6 15,3+1,3 31,5+2,6 51,8+3,6 58,3+2,5 51,5+0,8 33,5+0,6 61,9+2,6 38,9+2,2 28,4+2,0 52,5±3,9 57,6±4,1	39,6+2,4 36,4+1,1 10,6+0,8* 8,7+0,6* 6,1+0,5* 24,5+1,8 12,2+1,0 16,4+1,4 32,0+2,7 10,0+1,5* 38,3+1,8* 33,4+0,9* 28,3+0,5 30,5+1,3* 42,7+1,1 21,7+1,4* 46,6±2,9 66,6±4,3	22,0+2,6* 18,1+1,6* 9,0+0,7* 11,7+0,8 7,7+0,8* 27,5+2,1 16,5+1,3 9,6+0,7* 22,4+1,5* 15,2+0,7* 35,3+2,5* 29,6+0,9* 28,2+1,7 27,0+4,5* 39,5+3,1 30,4+2,9 43,9±3,9 55,2±4,1	14,1±1,1* 18,7±1,5* 6,9+0,6* 9,7+0,8* 6,7+0,6* 16,2+1,4* 15,3+0,9 10,2+1,0* 29,3±2,9 13,3±1,1* 22,9±4,2* 20,5±3,9* 19,6±1,9* 24,5±2,1* 33,3±2,9 27,3±1,5 40,1±3,1* 56,3±3,3

Примечание: достоверность различий по сравнению с контролем: * - p<0,05 (U-критерий Манна-Уитни)

Таким образом, при исследовании влияния соединения РГПУ-147 на выживаемость животных, степень неврологического дефицита, поведение, когнитивную функцию, морфологические изменения церебральной ткани при моделировании ишемического повреждения головного мозга было выявлено, что данное вещество проявляет выраженные нейропротекторные свойства и статистически значимо превосходит по активности препараты позитивного контроля пирацетам, фенибут и фенотропил.