Клинико-иммунологическая характеристика кишечных инфекций вирусной этиологии у взрослых

1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Клинико-иммунологическая характеристика кишечных инфекций вирусной этиологии у взрослых

14.00.10 - Инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Сагалова Ольга Игоревна

Москва 2009

Работа выполнена в Клинике Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Малеев Виктор Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Грачева Нина Михайловна

доктор медицинских наук, профессор Лучшев Владислав Иванович

доктор медицинских наук, профессор Малов Валерий Анатольевич

Ведущая организация: ГОУ ДПО “Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию”.

Защита состоится «___» ___________ 2009 г. в ______ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.114.01 при ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора» по адресу 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора».

Автореферат разослан «___» ___________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Вирусные кишечные инфекции относятся к «вновь возникающим инфекционным болезням», значение которых в последние годы постоянно возрастает [Hall G. et al., 2005]. Начиная с 1972 года были открыты основные известные на сегодняшний день вирусные возбудители острых кишечных инфекций (ОКИ) - норо-, рота- астро- сапо- и аденовирусы гр F [KapikianA.Z. et al., 1972; Bishop R.F. et al., 1973; Madeley C.R., Cosgrove B.P., 1975; Chiba S. et al., 1979; Johansson M.E. et al., 1980], доказана их роль в возникновении кишечных инфекций у людей, разработаны высокочувствительные и специфичные методы диагностики [Logan C., O'Sullivan N., 2008].

Актуальность проблемы кишечных инфекций вирусной этиологии определяется их повсеместным распространением, высокой заболеваемостью и значительным социально-экономическим ущербом [A.W. Mounts et al., 1999; Lopman B. et al., 2008]. Вирусы вызывают от 60 до 90% верифицированных кишечных инфекций у детей раннего возраста [Подколзин А.Т. и соавт., 2004; Parashar U. et al., 2003; Simpson R. et al., 2003]. Основными возбудителями диарейных заболеваний у детей являются ротавирусы (Рв) [Pang X.L. et al., 1999; Parashar U. et al., 2003, 2006; Ushijima H. et al., 2008]. Однако в последние годы все чаще причиной госпитализации становятся гастроэнтериты норовирусной этиологии [Подколзин А.Т. и соавт., 2004; Koopmans M., 2008; Ushijima H. et al., 2008]. На третьем месте по частоте возникновения - астровирусная инфекция (АвИ) [Marie-Cardine A. et al., 2002; Domнnguez A. et al., 2008; Koopmans M., 2008].

У взрослых вирусы вызывают многочисленные вспышки ОКИ с различными путями передачи инфекции [Lopman B. et al., 2002, 2004; Feeney S.A. et al., 2006; Svraka S. et al., 2007], основными возбудителями которых являются норовирусы второго генотипа (Нв G2) [Glass R.I. et al., 2000; Blanton L.H. et al., 2006; Koopmans M., 2008]. Особое внимание в экономически развитых странах уделяется высокой частоте возникновения внутрибольничных вспышек норовирусной инфекции (НвИ) у взрослых и детей [Lopman B. et al., 2005, 2006; Hansen S. et al., 2007], во время которых было установлено, что лица пожилого возраста и больные с нарушениями иммунитета, наряду с детьми раннего возраста относятся к группе высокого риска по заболеваемости, развитию осложнений и летальности [Mattner F. et al., 2006; Harris J.P. et al., 2008].

Роль норо-, сапо- и астровирусов (Ав) в возникновении спорадических случаев ОКИ у взрослых была показана отдельными зарубежными авторами только в последние годы [de Wit M. et al., 2001; Pager C.T., Steele A.D., 2002; Huhulescu S. et al., 2009]. Их значимость повсеместно недооценивается [Foley B. et al., 2000; Kittigul L. et al., 2009]. В РФ из всех известных вирусных возбудителей ОКИ на практике выявляются только ротавирусы, причем даже у детей отмечается существенная гиподиагностика ротавирусной инфекции (РвИ) [Информационный сборник статистических и аналитических материалов. М., 2006; Подколзин А.Т. и соавт., 2004]. Другие вирусные патогены стали исследоваться в отдельных научно-исследовательских учреждениях РФ в качестве этиологических агентов вспышек ОКИ только в последние годы.

Следовательно, в России вклад норо-, сапо-, астро- и аденовирусов гр F в этиологическую структуру спорадических ОКИ остается неизвестным, что определяется преобладанием в структуре кишечных инфекций у взрослых и подростков заболеваний неуточненной этиологии, которые составляют от 65 до 71% [Информационный сборник статистических и аналитических материалов. М., 2004, 2006]. Сложившаяся ситуация обусловлена низкой результативностью традиционно доступной для широкого практического применения рутинной микробиологической диагностики, спектр которой ограничен детекцией бактериальной флоры и не позволяет эффективно решать вопросы этиологической диагностики ОКИ [Подколзин А.Т. и соавт., 2004; Brandhof W.E. et al., 2006].

Малочисленные данные в доступной литературе о возрастном распределении и клинико-эпидемиологических особенностях спорадических вирусных ОКИ у взрослых обосновывают актуальность их изучения. Так, сведения об особенностях клинической картины и течения спорадических норо- и саповирусной инфекций можно встретить лишь в единичных работах [Rockx B. et al., 2002], а информация об АвИ- отсутствует. Сравнительных исследований клинического течения вирусных ОКИ у взрослых не проводилось, в то время как у детей наиболее тяжело протекала ротавирусная инфекция, наиболее легко - астровирусная. Тяжесть РвИ была обусловлена максимальной продолжительностью и выраженностью всех основных синдромов [Bon F. et al. 1999; Pang X.L. et al., 1999; Dennehy P.H. et al., 2001; Jakab F. et al., 2004]. Согласно данным отдельных авторов, определенное влияние на течение вирусных ОКИ мог оказывать генотип возбудителя, однако представленные в литературе сведения неоднозначны [Cunliffe N.A. et al., 2002; Griffin D.D. et al., 2002, Friesema I. et al., 2007). В РФ данные о молекулярно-генетической характеристике норо-, рота- и астровирусов у взрослых практически отсутствуют.

Актуальным направлением исследования вирусных ОКИ является изучение вопросов патогенеза и формирования иммунного ответа, которые во многом остаются неисследованными или спорными, что в значительной степени связано с невозможностью выделения возбудителей и отсутствием экспериментальной модели на животных для норовирусной инфекции. В частности, многие аспекты мукозального иммунитета, который может играть принципиальную роль в иммунной защите организма [Graham D.Y. et al., 1994; Estes M.K. et al., 2000] от кишечных вирусов, остаются неизвестными.

Таким образом, для повышения эффективности диагностики и лечения кишечных инфекций представляется необходимым исследование значимости вирусов в этиологической структуре ОКИ у взрослого населения РФ на основе применения молекулярно-генетических методов, а также эпидемиологических, патогенетических и клинических аспектов норо-, сапо- и астровирусной инфекций у взрослых, выявление групп риска по тяжелому течению и развитию осложнений.

Цель исследования: выявление вклада вирусов в структуру заболеваемости, оптимизация диагностики и определение клинико-иммунологических особенностей вирусных кишечных инфекций у взрослых.

Задачи исследования:

1. Определить на основе использования молекулярно-генетических и иммунологических методов лабораторного исследования долевое участие рота-, калици-, астро- и аденовирусов гр F в этиологии спорадических кишечных инфекций у взрослых.

2. Выявить молекулярно-эпидемиологические аспекты мониторинга вирусных кишечных инфекций.

3. Исследовать особенности их сезонного и возрастного распределения.

4. Оценить особенности иммунного ответа на мукозальном уровне при рота- и норовирусной инфекциях.

5. Представить сравнительную характеристику клинических симптомов вирусных диарейных заболеваний в динамике болезни.

6. Выявить группы риска по тяжелому течению и развитию осложнений.

7. Охарактеризовать особенности клинических проявлений внутрибольничных кишечных инфекций вирусной этиологии.

8. Разработать алгоритм диагностики вирусных кишечных инфекций.

Научная новизна

1. Выявлена впервые в России распространенность острых кишечных инфекций вирусной этиологии у госпитализированных в инфекционное отделение взрослых, установлена возможность внутрибольничного инфицирования норовирусами.

2. Впервые установлены особенности иммунного ответа слизистых оболочек кишечника у взрослых пациентов с норо- и ротавирусной инфекциями.

3. Выявлены высокая активность провоспалительных эндогенных систем мукозального иммунитета, участие антиколонизационного и микробоцидного барьеров в иммунной защите у больных рота- и норовирусной инфекциями.

4. Впервые в России представлены симптоматика и сравнительная характеристика клинического течения спорадических норо-, астро- саповирусной инфекций у взрослых.

5. Выявлены диагностические критерии «новых» вирусных и бактериальных кишечных инфекций на основе использования современных лабораторных технологий. кишечный инфекция вирус заболеваемость

Практическая значимость работы заключается в:

- оптимизации диагностики вирусных кишечных инфекций на основе разработанного стандартного алгоритма обследования больных, включающего оценку клинического течения болезни и использование молекулярно-генетических методов исследования,

- разработке дифференциально-диагностических критериев вирусных и бактериальных кишечных инфекций,

- прогнозировании течения вирусных кишечных инфекций.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Вклад вирусов в этиологическую структуру кишечных инфекций у взрослых сопоставим, а в ряде случаев превосходит вклад патогенных бактерий.

2. Норовирусы второго генотипа являются основными возбудителями внутрибольничных кишечных инфекций в соматических стационарах.

3. При норо- и ротавирусной инфекциях отмечается нарушение врождённого мукозального иммунитета в виде подавления факторов антиколонизационного барьера (муцина), нарастание эндогенных провоспалительных (СРБ и TNFб) и микробоцидных компонентов (лактоферрин, активность лизоцима), более выраженное при норовирусной инфекции.

4. Не существует патогномоничных симптомов, позволяющих различать вирусные кишечные инфекции. Диагностика вирусных кишечных инфекций должна основываться на клинических проявлениях и применении молекулярно-генетических методов с учетом сезонности.

5. В группе вирусных кишечных инфекций наиболее тяжело протекает ротавирусная инфекция.

6. Люди пожилого возраста относятся к группе риска по тяжелому течению и развитию осложнений при вирусных кишечных инфекциях.

7. Вирусные кишечные инфекции в сравнении с бактериальными имеют более короткое и благоприятное течение.

Внедрения

Основные положения и результаты исследования используются в повседневной практической работе инфекционных отделений Челябинской области, Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Челябинской области.

Для осуществления практической деятельности с учетом результатов исследования подготовлены клинико-организационное руководство Министерства здравоохранения Челябинской области для врачей инфекционных стационаров “Протоколы ведения взрослых больных острыми кишечными инфекциями в стационаре” (2005 г.) и “Временный территориальный стандарт медицинской помощи больным ротавирусной инфекцией” (2005 г.).

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах инфекционных болезней, микробиологии, иммунологии и аллергологии, лабораторной диагностики ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии, на циклах усовершенствования врачей-инфекционистов ГОУ ДПО Уральской государственной медицинской академии последипломного образования.

Апробация материалов диссертации

Основные положения и результаты работы были представлены и доложены на совместных заседаниях областного научного общества инфекционистов и эпидемиологов г. Челябинска (Челябинск, 1999, 2004), межобластной научно-практической конференции, посвященной 10-летию Челябинского областного клинического терапевтического госпиталя ветеранов войн (Челябинск, 2001), научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционных болезней», посвященной 70-летию кафедры инфекционных болезней РМАПО (г. Москва, 2002 г.), VI Российском съезде инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003 г.), Зальцбург-Корнелльском медицинском семинаре “Infectous Diseases Updates” (Зальцбург, 2004), областных научно-практических конференциях врачей-инфекционистов и эпидемиологов (Челябинск, 2004, 2005, 2008), Российской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных болезней" (Новосибирская область, 2005), 12th International Congress for Infectious Diseases (Лиссабон, 2006), VII Российском съезде инфекционистов “Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней” (Нижний Новгород, 2006 г.), Совещании инфекционистов Уральского ФО (Тюмень, 2006 г.), Международной научно-практической конференции “Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков”(Алматы, 2006), 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Молекулярная диагностика-2007” (Москва, 2007), Международной научно-практической конференции “Молекулярная диагностика инфекционных болезней” (Минск, 2007), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), юбилейной научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедры инфекционных болезней РМАПО Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (Москва, 2008), I Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ, из них 7 в рекомендуемых ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 247 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов работы и заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 46 отечественных и 385 зарубежных источников. Текст диссертации иллюстрирован 31 таблицей и 29 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. В соответствии с поставленными задачами были обследованы 1745 пациентов спорадическими кишечными инфекциями в возрасте от 15 до 94 лет на основе разработанных критериев включения. Из них мужчин - 834 (47,8%), женщин - 911 (52,2%).

Сбор материала от больных и стандартную процедуру обследования осуществляли в 2003 - 2008 гг. в инфекционном отделении и клинико-диагностических подразделениях Клиники ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, г. Челябинск. Диагностический алгоритм наряду со стандартной процедурой обследования больных включал в себя исследование образцов фекалий с применением комплекса диагностических тестов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (Москва).

Больные поступали в отделение преимущественно на ранних сроках заболевания и 81% из них был госпитализирован в первые три дня. Обязательным условием включения в исследование был одновременный сбор образцов фекалий для молекулярно-генетических и бактериологических исследований в течение 48 часов от момента поступления больных в стационар. У всех включенных в исследование подробно собирали анамнез заболевания и жизни, эпидемиологические данные. Осмотр и физикальное обследование пациентов осуществляли в динамике до момента выписки из отделения. Данные фиксировали в медицинских картах стационарного больного.

Анализируя клиническое течение вирусных кишечных инфекций, выделяли три степени тяжести инфекционного процесса: легкую, среднюю и тяжелую. При ее определении учитывали выраженность синдромов интоксикации и гастроэнтерита, особенности температурной реакции, а также наличие той или иной степени дегидратации, которую определяли в соответствии с классификацией степеней обезвоживания по В.И. Покровскому, В.В. Малееву (1978). В ряде случаев в клинической картине преобладали проявления одного из синдромов, к примеру, интоксикационного. В таких случаях ориентировались на степень выраженности ведущего синдрома.

Эпидемиологическая, клиническая информация о пациентах фиксировалась также в картах клинических наблюдений, разработанных в рамках данного исследования. Впоследствии данные о каждом больном были внесены в компьютерную базу данных в формате “Microsoft Access 2003” для хранения и математической обработки информации.

Группу сравнения составили 126 взрослых, не имевшие в течение 14 дней перед обследованием повышения температуры тела, рвоты и диареи, а также общения с больными кишечными инфекциями.

Стандартная процедура обследования состояла из общеклинических исследований (гемограмма, общий анализ мочи, копроскопия), биохимических исследований (определение электролитов в сыворотке крови на анализаторе AVL-988-4; определения уровня мочевины, креатинина в сыворотке крови на анализаторе ФП-901М, «Лабсистемс»), двухкратного бактериологического исследования фекалий для выявления шигелл, сальмонелл, условно-патогенной микрофлоры, однократного исследования испражнений методом иммуноферментного анализа (ИФА) на ротавирусный антиген (Рв аг) у больных с синдромом гастроэнтерита, по показаниям - бактериологического исследования промывных вод желудка, исследования фекалий для идентификации иерсиний и кампилобактеров, а также исследования парных сывороток методом РПГА с целью выявления антител к шигеллам Флекснера и Зонне, микроорганизмам рода Salmonella.

Детекцию возбудителей ОКИ молекулярно-генетическими методами и выборочное типирование норо-, астро-, сапо- и ротавирусов гр А проводили в ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (Москва). Большая часть работы была выполнена в рамках проекта МНТЦ BTEP 58 / ISTC 2935 “Эпидемиология вирусных кишечных инфекций в России: разработка новых подходов для выявления и характеристики возбудителей”.

Для диагностики методом ПЦР образцы фекалий собирали согласно методическим указаниям МУ 1.3. 1794 - 03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности». Для сбора материала использовались одноразовые пластиковые шпатели. Образцы фекалий в объеме 1- 1,5 мл (г) помещались в одноразовые пластиковые контейнеры с транспортной средой, содержащей криопротектор и консервант (фосфатный буфер с 0,05% раствором азида натрия и 20% раствором глицерола). Каждая емкость с фекалиями упаковывалась в отдельный zip-пакет с идентификационной карточкой. Дальнейшее их хранение до проведения исследований осуществляли при температуре -15-20⁰С не более 1 - 1,5 месяцев. Транспортировка образцов фекалий проводилась в условиях холодовой цепи, с последующим хранением при температуре -70⁰C для дальнейших исследований.

Тестирование собранных образцов фекалий выполняли с использованием реагентов производства ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (Лицензия № 99-04-000058). Для выделения нуклеиновых кислот из фекалий использовались комплекты реагентов «Рибо-сорб» и «ДНК-сорб В» указанного производителя. Комплементарную ДНК получали с использованием комплекта «Реверта-L».

Исследование осуществлялось в две стадии: первая - скрининг образцов для выявления теоретически наиболее распространенных возбудителей ОКИ (ротавирусов группы А, норовирусов 1 и 2 генотипов, астровирусов, аденовирусов, шигелл и энтероинвазивных E. Coli (EIEC), сальмонелл, термофильных кампилобактеров), вторая - целенаправленное исследование образцов, не содержащих искомых возбудителей, на наличие ротавирусов гр С и саповирусов.

В 2003 - 2005гг. материал исследовался с применением разработанных ранее в ЦНИИЭ тест-систем с электрофоретической детекцией продуктов амплификации АмплиСенс (Москва): «АмплиСенс Shigella species, EIEC» - для выявления ДНК микроорганизмов рода Shigella и EIEC, «АмплиСенс Salmonella species», «АмплиСенс Campylobacter species» «АмплиСенс Rotavirus-290», «АмплиСенс Norovirus 1, 2 genotypes» (раздельная детекция), «АмплиСенс Astrovirus-165», «АмплиСенс Adenovirus-462». В дальнейшем тестирование осуществлялось с использованием комплекта реагентов для мультиплексной гибридизационно-флуоресцентной детекции наиболее распространенных возбудителей ОКИ - «АмплиСенс ОКИ-скрин». Аналитическая чувствительность метода для различных возбудителей составила от 500 до 1000 ГЭ/мл.

Для типирования ротавирусов применялась мультиплексная ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, разработанная в ЦНИИЭ в 2006 году. Нетипируемые данным методом изоляты исследовались с применением методики типирования на биочипах.

Для норо- и астровирусов применяли методики типирования на основе применения специфических праймеров и зондов. Для выявления редких типов норовирусов использовали метод прямого секвенирования. Для оптимизации работ по выявлению редких типов норовирусов 2 генотипа в 2006 году были выбраны олигонуклеотиды, специфичные для превалирующего в настоящее время на территории РФ генетического кластера G2.4 (Бристоль).

Кроме того, 63 больных, у которых эпидемиологически выявлялись признаки внутрибольничного инфицирования, были подвергнуты целенаправленному дополнительному клинико-эпидемиологическому исследованию. Анализ материалов ВБИ проводился на основе признанных на международном уровне определений случаев [Lopman B.A. et al., 2004]:

1. Возникновение симптомов желудочно-кишечной дисфункции в срок не ранее, чем через 48 часов от момента госпитализации в соматическое отделение.

2. Наличие 2 и более эпизодов рвоты, 3 и более эпизодов диареи или одновременное обнаружение данных симптомов в течение 24 часов.

3. Критериями внутрибольничной вспышки считали возникновение двух или более случаев ОКИ в отделении больницы с интервалом не более 7 дней.

Дополнительно были также проанализированы данные по водной вспышке ОКИ в г. Златоусте, Челябинской области в 2005 году с численностью заболевших 41.

Исследования показателей мукозального иммунитета ЖКТ у больных вирусными кишечными инфекциями были выполнены на кафедре иммунологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» под руководством заведующей кафедрой, д.м.н., профессора С.Н. Тепловой. В исследуемые группы были включены взрослые больные норо- и ротавирусной моноинфекциями, а также здоровые добровольцы. Исследование показателей секреторного иммунитета проводилось в 20% экстрактах фекалий в растворе Хенкса, осветлённых 20-минутным центрифугированием при 2000-3000 об/мин.

Сбор копрофильтратов для оценки секреторного иммунитета осуществлялся в течение 48 часов от момента поступления больных в стационар.

В копрофильтратах изучались факторы антиколонизационного (содержание муцина по методу Э.Н. Коробейниковой (2002), микробоцидного (активность лизоцима по методу О.В. Бухарина (1974), содержание лактоферрина методом ИФА) и воспалительного барьеров врожденного иммунитета (общая активность комплемента по 50% гемолизу (СН50) и активность отдельных компонентов классического пути активации комплемента (С1, С2, С3, С4, С5) по методу Красильникова А.П. и соавт. (1984) и Tanaka S. et al. (1986), количество С-реактивного белка и TNFб методом ИФА), а также факторы приобретенного мукозального иммунитета (количество иммуноглобулинов - sIgA, субклассов IgG - G1, G2, G3, G4, методом ИФА). Для иммуноферментного анализа использовали тест-системы производства НПО «Вектор-Бест», Новосибирск.

Обработку данных с последующим статистическим анализом осуществляли в соответствии с общепринятыми методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных статистических программ Statistica for Windows ver 6.0. Для сопоставления групп по количественным признакам в связи с отсутствием нормального распределения совокупности использовали U-критерий Манна - Уитни и/или двухвыборочный критерий Колмогорова - Смирнова (при сравнении двух выборок), Крускаля-Уоллиса (при сравнении нескольких групп). При проведении анализа качественных признаков в двух независимых группах (анализ таблиц 2 х 2) применяли точный критерий Фишера р (одно- и двустороннего), “Хи-квадрат” с поправкой Йетса [Реброва О.Ю., 2002]. Для оценки взаимосвязей между изучаемыми иммунологическими показателями определяли коэффициент корреляции (r). Различия в группах и коэффициенты корреляции считали статистически значимыми при р < 0,05.

Основные результаты работы и их обсуждение

Характеристика этиологической структуры спорадических кишечных инфекций у взрослых. В результате проведенных исследований было установлено, что эффективность метода ПЦР в диагностике кишечных инфекций была в 2,1 раза выше в сравнении со стандартной процедурой обследования, включавшей бактериологические методы в сочетании с исследованием фекалий на ротавирусы методом ИФА, и составила 53,1% (Рис. 1). Эффективность молекулярной диагностики у взрослых была ниже только в сравнении с группой детей младшего возраста, что объясняется в первую очередь существенно более частым обнаружением у них ротавирусов и ассоциаций вирусных возбудителей [Подколзин А.Т. и соавт., 2004].

Рис. 1 Частота выявления и спектр возбудителей ОКИ, выделенных при стандартном алгоритме обследования (А.) и методом ПЦР (Б.)

Доля ОКИ установленной этиологии в настоящей работе коррелировала с данными проспективного исследования B. Svenungsson и соавт. (2002) и была почти в два раза выше, чем в исследовании M. de Wit и соавт. (2001) - 24,6%. Столь существенная разница могла объясняться, в первую очередь, отличавшимся контингентом обследованных больных. M. de Wit и соавт. (2001) изучали этиологию кишечных инфекций у амбулаторных больных с признаками диарейных заболеваний, в то время как исследование B. Svenungsson и соавт. (2002), а также настоящая работа были выполнены в условиях стационара.

Вирусы в настоящем исследовании были выделены у 27,8% больных, в том числе у 22,5% - были единственными возбудителями, у 5,3% - входили в состав микробных ассоциаций. Полученные данные свидетельствовали о существенном вкладе вирусов в спорадическую заболеваемость ОКИ у госпитализированных взрослых, что согласуется с результатами работы A. Jansen и соавт. (2008). В то же время в большинстве зарубежных исследований частота обнаружения вирусов у взрослых была гораздо ниже и составляла от 4,6 до 9,4% [de Wit М. et al., 2001; Svenungsson B. et al., 2002; Kittigul L. et al., 2009]. Столь существенная разница могла объясняться применением более чувствительных методов диагностики, региональными особенностями распространения и, возможно, возрастающей ролью вирусных возбудителей ОКИ в патологии взрослых [Hedlund K-O. et al., 1998; Simpson R. et al., 2003; Lopman B. et al., 2004; Jansen A. et al., 2008].

О возрастающей роли вирусов мог свидетельствовать и тот факт, что вирусы и бактерии обнаруживали у взрослых практически с одинаковой частотой (22,5% и 23,4%), то есть в соотношении 1:1, что близко к данным исследования A. Jansen и соавт. (2008), но значительно выше, чем в исследованиях зарубежных авторов предыдущих лет.

У взрослых данные о частоте одновременной детекции двух и более патогенных возбудителей при спорадических ОКИ и их составе практически отсутствуют. В единственном доступном исследовании частота одновременного обнаружения двух и более возбудителей составила 16% [Jansen A. et al., 2008], причем 3/4 ассоциаций были вирусно-бактериальными.

В настоящем исследовании ассоциации патогенных микробов методом ПЦР выделяли у больных ОКИ намного чаще, чем при рутинном скрининге (соответственно в 7,1% и 0,1% случаев). Наиболее частым вариантом ассоциаций были вирусно-бактериальные (46%). В то же время частота одновременной детекции двух и более вирусных или бактериальных патогенов была примерно одинакова (29% и 25%) и существенно выше, чем в исследовании А. Jansen и соавт. (2008).

Выделенные ассоциации состояли преимущественно из двух возбудителей (81%). Одновременное обнаружение трех и более возбудителей ОКИ наблюдалось преимущественно у лиц, страдавших хроническим алкоголизмом (2/3 полимикробных ассоциаций). Высокая частота детекции полимикробных ассоциаций у данной категории больных могла косвенно свидетельствовать о роли иммунологических нарушений [Tшnnesen H. et al., 2009] и дисбактериоза в формировании длительного выделения возбудителей после перенесенной ОКИ, на фоне которой с большей вероятностью происходило инфицирование другими патогенами. На сегодняшний день установлено, что вирусовыделение даже после нетяжелой кишечной инфекции при иммунодефицитах может быть длительным - от 120 дней до двух лет [Kaufman S. S. et al., 2003; Nilsson M. et al., 2003; Gallimore C. et al., 2004; Siebenga J.J. et al., 2008]. Возможно поэтому в комплекс возбудителей наряду с кампилобактерами, для которых характерна длительная персистенция после наступления клинического выздоровления [Чайка Н.А. и соавт., 1988], наиболее часто входили вирусы, в то время как сальмонеллы и шигеллы - реже. Кроме того, хроническое воспаление и атрофические изменения желудка и кишечника, снижение внешнесекреторной активности органов ЖКТ, разнообразные нарушения микробиоценоза кишечника при хроническом алкоголизме [Махов В.М., 2006] также могли способствовать более длительному выделению патогенных микроорганизмов.

Косвенным подтверждением взаимосвязей между длительностью персистенции возбудителей после перенесенных ОКИ, частотой повторного инфицирования и иммунодефицитом служит также максимальная частота обнаружения микробных ассоциаций у больных в возрасте старше 60 лет.

Вопрос об одномоментном или последовательном заражении остается неясным. Одновременное инфицирование двумя и более патогенами описано при водных вспышках [Maurer A.M., Sturchler D., 2000; Taylor M.B. et al., 2003; Hoebe C.J. et al., 2004, O'Reilly, C.E. et al., 2007]. Действительно, во время вспышки кишечных инфекций с водным путем передачи в г. Златоусте у 67% больных в испражнениях обнаруживали одновременно от двух до четырех бактериальных и вирусных патогенов. Возможно, одновременное инфицирование несколькими возбудителями у небольшого числа пациентов могло происходить и в случаях спорадических ОКИ.

1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2 Вклад отдельных возбудителей при кишечных инфекциях уточненной этиологии

По результатам настоящего исследования наиболее значимыми среди вирусных возбудителей спорадических ОКИ оказались норовирусы (Рис. 2), которыми было вызвано 25,3% всех уточненных моноинфекций. Обращал на себя внимание тот факт, что вклад норовирусов был лишь немногим меньше, чем сальмонелл - 28,1%, и значительно превышал долю ротавирусов (14,2%), шигелл и энтероинвазивных E. сoli (13,6%), а также кампилобактеров (9,2%). Соотношение норовирусов первого и второго генотипа (1:7,8) соответствовало данным исследований зарубежных авторов о повсеместном преобладании при спорадической и эпидемической заболеваемости возбудителей второго генотипа [Glass R.I. et al., 2000; Phan T. et al., 2004; Siebenga J.J., et al., 2007; Koopmans M., 2008; Tu E. et al., 2008].

В отличие от структуры возбудителей ОКИ у детей, где бесспорными лидерами являются ротавирусы [Chen S-Y. et al., 2007; Anderson E.J., 2008], у взрослых они занимали только третье ранговое место, уступая норовирусам и сальмонеллам, но все же были единственной причиной 6,3% случаев ОКИ и 14,2% - уточненных моноинфекций, что соответствует данным отдельных зарубежных исследований или превышает их [de Wit М. et al., 2001; Kittigul L. et al., 2009]. В результате исследования изолятов ротавирусов была установлена их принадлежность к числу наиболее распространенных в мире [P]G-типов [Bishop R.F., 1996; Heide R. et al., 2005; Feeney S.A. et al., 2006]. Редкие типы ротавирусов у взрослых не были обнаружены. Доминирующим оказался P[8]G1 тип, доля которого составила 55,4%. Удельный вес генотипов P[8]G4 и P[4]G2 был примерно одинаковым - 21,6% и 23% соответственно. Тем не менее, даже на протяжении короткого периода времени происходило динамическое изменение соотношения основных циркулирующих типов ротавирусов: в 2005 г. лидирующее положение занимал P[4]G2-тип, в 2006 - 2007 гг. - P[8]G1 тип. Принадлежность возбудителей в сезон 2005 года преимущественно к P[4]G2-типу коррелировала с данными зарубежных исследований последних лет об их доминирующей роли у взрослых при спорадических заболеваниях и вспышках [Iturriza-Gуmara M. et al., 2000; Griffin D.D. et al., 2002]. Циркуляция у взрослых ротавирусов наиболее распространенных в мире генотипов позволяет предположить, что приобретенный в детстве типоспецифический иммунитет не обеспечивает адекватный уровень защиты взрослого населения от инфицирования, что объясняет довольно высокий уровень спорадической заболеваемости РвИ.

Более высокая частота детекции Рв в настоящем исследовании в сравнении с российскими данными официальной статистики, согласно которым доля РвИ в структуре ОКИ у взрослых в 2008 г. составила 1,8% [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях, 2008], свидетельствует о ее гиподиагностике среди взрослого населения. В первую очередь она обусловлена использованием минимального набора бактериологических тестов во многих ЛПУ. В то время как применение относительно недорогих отечественных тестов для иммуноферментной диагностики позволило подтвердить диагноз РвИ у 9,8% больных ОКИ.

Полученные данные также свидетельствуют о недостаточно высокой чувствительности и специфичности тест-систем «Рота-антиген» (Аквапаст, СПб) для иммуноферментного анализа. У 29% больных при сопоставлении результатов скрининга Рв гр А в фекалиях методами ИФА и ПЦР наблюдались дискордантные результаты, в том числе у 22% - ложноположительные, в половине из которых методом ПЦР были обнаружены норовирусы. Высокая частота ложноположительных реакций наблюдалась также при тяжелых формах сальмонеллеза и реже дизентерии, что, возможно, было проявлением выраженной поликлональной реакции организма при тяжелой бактериальной инфекции, и в подобных ситуациях к ним следует относиться с недоверием.

Полученные результаты согласуются с данными Жираковской Е.В. и соавт. (2005), которые наблюдали несовпадение результатов ПЦР и ИФА при использовании тех же тест-систем в 30% случаев. На более низкую чувствительность метода ИФА в сравнении с ПЦР указывают и другие авторы [Glass R.I., 2000; Duizer E. et al., 2007]. Тем не менее, определение поверхностного антигена Рв группы А методом ИФА является простым и удобным для повседневного скрининга РвИ в учреждениях практического здравоохранения.

Астровирусы в сравнении с норо- и ротавирусами вызывают спорадические гастроэнтериты и вспышки ОКИ значительно реже. По мнению ряда авторов, АвИ обычно болеют дети младшего возраста [McIver C. et al., 2000; Matsui S.M., 2002; Soares C.C. et al., 2008]. Тем не менее, в последнее десятилетие в отдельных работах была показана этиологическая роль астровирусов в возникновении спорадических гастроэнтеритов у взрослых [Chikhi-Brachet R. et. al., 2001; de Wit М. et al., 2001; Pager C.T., Steele A.D., 2002].

По данным настоящего исследования Ав в качестве единственного патогена были обнаружены у 2,4% обследованных больных при общей частоте выявления - 3,7% и занимали третье ранговое место среди вирусных возбудителей ОКИ. Протипированные астровирусы принадлежали к трем генотипам: ѕ возбудителей астровирусной моноинфекции - ко второму (HАstV2), остальные - к четвертому (HАstV4). Доминирующие в человеческой популяции астровирусы первого генотипа [Glass R.I. et al., 1996; Oh D-Y. et al., 2003; Marshall J.A. et al., 2007] в настоящей работе были обнаружены только в 12% микробных ассоциаций.

Сапо-, аденовирусы гр F и ротавирусы гр С выделяли соответственно у 0,8%, 0,8% и 0,5% больных ОКИ в возрасте от 15 до 77 лет в разное время года, что противоречит данным отдельных исследований, в которых сапо- и аденовирусы вызывали спорадические кишечные инфекции только у детей в возрасте младше 5 лет [Chiba S. et al., 2000; Pang X.L. et al., 2000]. Одной из причин редкого обнаружения сапо- и ротавирусов гр С в данном исследовании мог быть истинный невысокий уровень заболеваемости у взрослых. Другой причиной могло быть более легкое течение у взрослых саповирусной инфекции (СвИ), которое наблюдалось у 64% больных в настоящем исследовании, в связи с чем большинство случаев могло оказаться не диагностированным. Все исследованные методом прямого секвенирования саповирусы принадлежали к 1 генотипу, разновидности G1/2, аналогичной референтным изолятам Parkville/1994/US и Houston/1990/US.

Сопоставление результатов молекулярно-генетических и традиционно применяющихся в практическом здравоохранении бактериологических методов детекции возбудителей кишечных инфекций. Применение молекулярно-генетических методов оказалось эффективным не только для выявления вирусных агентов ОКИ, но позволило также уточнить вклад патогенных бактерий в структуру спорадических кишечных инфекций у взрослых и информативность применяющихся на практике бактериологических методов. Результаты скрининга бактерий методом ПЦР продемонстрировали более высокую его эффективность в сравнении с рутинной микробиологической диагностикой для всех определявшихся возбудителей: микроорганизмы рода Shigella spp. + EIEC выявляли 2,1 раза чаще (p < 0,01), Salmonella spp. - в 1,4 раза (p > 0,05). Более частое обнаружение микроорганизмов рода Shigella spp. + EIEC объяснялось не только дополнительной детекцией шигелл в случаях поздней госпитализации пациентов. Использование тест-систем «AmpliSens Shigella species, EIEC» и «AmpliSens ОКИ скрин» позволяло также выявить энтероинвазивные эшерихии, не найденные при бактериологических исследованиях.

Особенно демонстративные результаты были получены для кампилобактериоза, эффективность микробиологической диагностики которого в настоящем исследовании была крайне низкой (0,1%), но приближалась к данным официальной статистики: в 2008 году в РФ доля кампилобактериоза в структуре ОКИ у взрослых составила 0,03% [Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях, 2008]. В то же время кампилобактеры методом ПЦР были обнаружены у 6,5% больных, в том числе у 4,2% - являлись причиной моноинфекции. Полученные результаты совпадают с данными зарубежных авторов, согласно которым кампилобактериоз в настоящее время занимает одно из первых мест в этиологической структуре ОКИ и в экономически развитых странах выявляется чаще, чем сальмонеллезы и шигеллезы [Svenungsson B. et al., 2002; Sanders, J.W. et al., 2007; Jansen A. et al., 2008]. Т.о., внедрение молекулярно-генетических методов существенно повышает уровень диагностики кампилобактериозов [Jansen A. et al., 2008] и позволяет своевременно назначать этиотропную терапию.

Эффективность молекулярно-генетических методов в диагностике кишечных инфекций неуточненной этиологии. При формулировке заключительного диагноза кишечной инфекции в отсутствие микробиологического подтверждения врачи практического здравоохранения вынуждены опираться только на клинико-эпидемиологические и лабораторные данные. Нередко устанавливаемый ими диагноз не соответствует действительности. Подтверждением тому могут служить результаты молекулярно-генетических исследований у больных кишечными инфекциями неуточненной этиологии (КИНЭ).

Так, в группе с заключительным диагнозом “Острая дизентерия”, установленным на основании клинических и копрологических данных (шифр МКБ-10 - А03.9), генетический материал шигелл был обнаружен методом ПЦР только у 33 из 79 больных (41,7%), в том числе у 14% - в составе микробных ассоциаций. Микроорганизмы рода Shigella spp. + EIEC в анализируемой группе выделяли в среднем на шестой день от начала заболевания, что, очевидно, было связано с более высокой чувствительностью метода. Часть неверифицированных случаев кампилобактериоза (с воспалительными копрологическими изменениями) также попадала в группу клинически установленной дизентерии (13%). У 16% больных заболевания были вызваны сальмонеллами, вирусами и их ассоциациями. И хотя в целом частота обнаружения возбудителей кишечных инфекций в данной группе была выше, чем среди всех обследованных больных (p = 0,03), в 1/3 случаев этиологию заболевания установить не удалось.

В группе так называемых прочих ОКИ неустановленной этиологии - “Пищевая токсикоинфекция” (код МКБ-10 - А05.9), “Острый гастроэнтерит неуточненной этиологии” (код МКБ-10 - А09) - молекулярно-генетическими методами удалось уточнить этиологию у 45% из 687 больных (табл. 1). В этой группе среди выделенных микроорганизмов лидировали норовирусы, которыми было обусловлено 1/5 всех заболеваний. На долю других вирусных моноинфекций пришлось 9,6%. То есть, около трети заболеваний неустановленной этиологии из группы прочих кишечных инфекций были вызваны вирусами.

Таблица 1

Частота выявления различных возбудителей методом ПЦР в группе кишечных инфекций неуточненной этиологии

Результат исследования	Частота выявления, n = 687
	Абс.	%
Отрицательный	380	55,3
Положительный, в т.ч. обнаружены:	307	44,7
- шигеллы	17	2,5
- сальмонеллы	28	4,1
- кампилобактеры	28	4,1
- ротавирусы группы А	14	2,0
- астровирусы	18	2,6
- норовирусы G1	17	2,5
- норовирусы G2	120	17,5
- аденовирусы	16	2,3
- саповирусы	11	1,6
- ротавирусы гр С	7	1,0
- ассоциации вирусов	13	1,9
- ассоциации вирусов и бактерий	16	2,3
- ассоциации бактерий	2	0,3

Таким образом, шигеллёзы и пищевые токсикоинфекции даже при чётко установленном клиническом симптомокомплексе нередко являются ничем иным как вирусными гастроэнтеритами, и, следовательно, в течение достаточно длительного времени могут быть причиной инфицирования окружающих [Walter J., Mitchell D.K., 2003; Tu E.T. et al., 2008].

В контрольной группе вирусы обнаруживались гораздо реже (у 3,2% обследованных добровольцев) в сравнении с больными ОКИ. Тем не менее, результаты, полученные в группе здоровых лиц, свидетельствуют о циркуляции вирусных агентов диарейных заболеваний среди взрослого населения, подтверждают существование вирусоносительства и субклинических форм вирусных кишечных инфекций, благодаря которым происходит их распространение в стационарах, детских учреждениях, домах престарелых и пр. [Lopman B., 2004; Hansen S. et al., 2007].

Сезонность и особенности возрастного распределения спорадических кишечных инфекций. При оценке возрастного распределения госпитализированных с ОКИ пациентов выявлялось преобладание лиц более молодого возраста: медиана возраста больных - 30,5 лет. Доля больных в возрасте до 30 лет составила 45%, затем происходило снижение частоты госпитализации, минимальный ее уровень наблюдался в возрастной группе от 50 до 60 лет (8,8%), а после, у больных старше 60 лет, частота регистрации ОКИ снова возрастала (17,5%) и превышала таковую в возрастной группе 30 - 60 лет.

Результаты частоты обнаружения различных возбудителей ОКИ в каждом возрастном диапазоне отличались. Как можно было ожидать, высокая частота обнаружения возбудителей ОКИ наблюдалась у больных в возрастной группе от 15 до 20 лет - 56,4% (рис. 3), однако, максимальная - была характерна для больных в возрасте старше 60 лет (63,3%). Причем частота идентификации патогенных микроорганизмов в вышеуказанных группах была статистически значимо выше в сравнении с возрастной группой от 30 до 50 лет (p < 0,05).

При анализе относительных величин распространенности возбудителей в каждом возрастном диапазоне наблюдалась тенденция к возрастанию доли бактериальных агентов с увеличением возраста (рис. 3). Частота ОКИ вирусной этиологии, напротив, снижалась с 31,6% у больных 15 - 20 лет до 15 - 16% к 30-60 годам и снова увеличивалась у лиц в старшей возрастной группе. Причем вклад вирусов и бактерий в структуру ОКИ в данной возрастной группе был практически одинаковым - 25,4% и 26,9%. Распределение возбудителей в зависимости от возраста пациентов в настоящем исследовании отличалось от приведенного в работе M. de Wit и соавт. (2001), в которой доля ОКИ вирусной этиологии снижалась с увеличением возраста пациентов и в группе старше 60 лет не превышала 8%.

Наиболее высокая частота обнаружения рота- и норовирусов у подростков (у 12 и 15,8% обследованных соответственно), возможно, объясняется частыми их контактами с детьми младшего возраста (группа риска) в семьях и школах, а также недостаточным соблюдением правил личной гигиены.

У лиц старше 60 лет повышение заболеваемости вирусными инфекциями (рота- и норовирусы выявили у 10,3% и 11,5% больных данной группы) может объясняться как угасанием механизмов мукозального иммунитета, так и высоким риском инфицирования в процессе ухода за внуками наряду с несоблюдением общегигиенических правил.

Рис. 3 Изменение суммарной частоты выявления вирусных, бактериальных агентов и их ассоциаций у пациентов с ОКИ в зависимости от возраста

Астровирусная моноинфекция наиболее часто регистрировалась у больных в возрасте старше 60 лет (3,6% при средней частоте выявления - 2,4%). Аналогичные данные (3,9%) приводят в своих исследованиях M. de Wit и соавт. (2001).

Для сальмонеллеза, шигеллеза и энтероинвазивного эшерихиоза наблюдался постепенный рост доли заболевших с увеличением их возраста. Хотя после 60 лет происходило некоторое снижение частоты выявления сальмонелл, что вероятно связано с уменьшением потребления продуктов животного происхождения пожилыми пациентами. Зависимости частоты выявления кампилобактериоза от возраста больных не наблюдали.

При оценке среднегодовых абсолютных показателей заболеваемости в разные месяцы отмечалось увеличение случаев госпитализации в весенне-летний период. Относительная частота обнаружения суммы вирусных агентов, вызывающих ОКИ, была максимальной в зимне-весенние месяцы, бактериальных агентов - в июне - сентябре (рис. 4).

К характерным особенностям сезонности заболеваний, вызванных вирусными возбудителями следует отнести превалирование ротавирусов гр А в зимне-весенний период с максимальной частотой госпитализации больных РвИ в марте и отчетливый подъем заболеваемости норовирусной инфекцией в январе - феврале с достаточно высокой круглогодичной заболеваемостью и некоторым ее снижением в июне-июле (рис. 4). Данные в отношении НвИ несколько отличались от приводимых зарубежными исследователями для спорадической заболеваемости НвИ у взрослых [Mounts A.W. et al., 2000; Kroneman A. et al., 2008]:



Рис. 4 Среднемноголетняя частота обнаружения патогенов у больных спорадическими ОКИ в различные месяцы на протяжении года (2005 - 2008 гг.)

резкое повышение числа заболевших наблюдали только в январе и феврале, в то время как во многих странах подъем заболеваемости был растянут во времени и продолжался с ноября по март.

Сезонность при Ав на сегодняшний день является спорным вопросом [Walter J., Mitchell D.K., 2003]. По данным R. Glass и соавт. (1996) пик госпитализаций по поводу АвИ наблюдался зимой и совпадал с пиком заболеваемости РвИ. Однако, по данным настоящего исследования максимальное число госпитализаций по поводу АвИ наблюдалось раньше подъема заболеваемости рота- и норовирусной инфекциями (рис. 4).

Для шигеллеза была характерна традиционная летне-осенняя сезонность, при кампилобактериозе отмечался двухволновой подъем заболеваемости: весной и в начале лета, а также в октябре - ноябре. Сальмонеллез регистрировался круглогодично с некоторым снижением заболеваемости в зимние месяцы.

Ассоциации микроорганизмов выделяли круглогодично с пиком в июне и декабре-январе. В июне рост частоты выделения двух и более микроорганизмов был обусловлен бактериальными и вирусно-бактериальными ассоциациями при отсутствии вирусных, в то время как зимний пик объяснялся в первую очередь сезонным подъемом АвИ: астровирусы входили в состав 58,8% выделенных в эти месяцы ассоциаций, а также подъемом заболеваемости НвИ и РвИ.

Применение комплекса тестов для молекулярной диагностики позволило верифицировать этиологию заболеваний в осенние и зимние месяцы примерно с одинаковой частотой - 54 - 59%, максимальное выделение кишечных патогенов наблюдалось в апреле (62%) и мае (65%) за счет еще сохраняющейся высокой частоты детекции норо- и ротавирусов и начинающегося подъема заболеваемости бактериальными инфекциями. В летние месяцы наблюдалась минимальная частота выделения возбудителей - 37 - 47%.

В то же время доля КИНЭ даже в зимние месяцы оставалась довольно высокой. Основная их часть, особенно в теплое время года, могла быть связана с наличием пищевых токсикоинфекций бактериальной этиологии, инфекций, вызванных анаэробными возбудителями, алиментарных гастроэнтеритов. В то же время, у определенной части больных, особенно имевших заболевания ЖКТ в анамнезе, нельзя исключить гипердиагностику кишечных инфекций на основании клинических данных.