Иммунодиагностика и иммунотерапия туберкулезной инфекции у детей и подростков

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

14.01.16 - фтизиатрия

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Иммунодиагностика и иммунотерапия туберкулезной инфекции у детей и подростков

Мордовская Лариса Ивановна

Москва - 2010

Работа выполнена в НИИ фтизиопульмонологии ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Аксенова Валентина Александровна

Доктор медицинских наук, профессор Владимирский Михаил Александрович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Чугаев Юрий Петрович

Доктор медицинских наук, профессор Гергерт Владислав Яковлевич

Доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович

Ведущее учреждение

Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Марина Петровна Грачева

1. Общая характеристика работы

туберкулезный инфекция легкое

Актуальность проблемы

Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации среди детей и подростков остается весьма напряженной (Аксенова В.А., 2007, Перельман М.И., Михайлова Ю.В., 2008, Шилова М.В., 2008, 2009). Показатель заболеваемости туберкулезом детей и подростков является наиболее чутким индикатором состояния эпидемиологической обстановки. Заболеваемость детей до 14 лет составляет по данным М.В. Шиловой за 2009 г. 15,4 чел на 100 тыс. детского населения, то заболеваемость подростков в два с лишним раза выше - 36,0 на 100 тыс. чел соответствующего возраста. При этом 84,9% случаев приходится на туберкулез легких. Число деструктивных форм туберкулеза легких у подростков составляет 36,8%. В этой возрастной группе отмечается также весьма высокий уровень множественной лекарственной устойчивости.

Современная диагностика первичной туберкулезной инфекции у детей обеспечивается, в основном, с помощью применения туберкулиновых кожных тестов. Инфицированность микобактериями туберкулеза (МБТ) определяется при конверсии («вираж») кожных туберкулиновых проб от отрицательной к положительной. Однако недостаточная специфичность туберкулиновой пробы, отсутствие метода дифференцирования первичного туберкулезного инфицирования от поствакцинальной аллергии не позволяет определить туберкулезную инфекцию с необходимой эффективностью. Недостаточная эффективность диагностики первичной туберкулезной инфекции у детей и подростков, в отсутствие своевременно проводимых курсов профилактических курсов химиотерапии, приводит к развитию локальных форм туберкулеза, главным образом туберкулеза легких.

Иммунологические методы исследования клеточного иммунного ответа детей и подростков, инфицированных МБТ и больных различными формами туберкулеза, позволяют усовершенствовать диагностику первичной туберкулезной инфекции, значительно повысив ее специфичность, оценить уровень иммунного ответа при различном характере течения туберкулеза легких, а также на основе новых знаний выявить новые подходы к иммунотерапии туберкулеза, которые могут быть использованы в качестве дополнительных по отношению к этиотропной химиотерапии, с целью повышения эффективности лечения пациентов.

Провоспалительные цитокины - интерферон-гамма (ИФН-г) и фактор некроза опухолей альфа (ФНО-б) представляют собой ключевые факторы протективного иммунитета при туберкулезной инфекции. На основе антиген-индуцированной продукции ИФН-г в образцах цельной крови в присутствии антигенов МБТ, в том числе рекомбинантных, специфичных для M.tuberculosis антигенов ESAT-6 и CFP-10, разработаны тесты для определения латентной туберкулезной инфекции (Mori T., et al., 2004). В частности, разработанные с использованием специфичных в отношении M.tuberculosis антигенов ESAT-6 и CFP-10 тесты и диагностикумы (QuantiFERON-TB Gold, и QuantiFERON-TB Gold In Tube (образцы крови инкубируются в пробирках) позволяют после количественного анализа ИФН-г в образцах плазмы определить латентную туберкулезную инфекцию с высокой специфичностью. В принципиально подобной тест-системе T-SPOT.TB (Ulrichs T. et al., 2000; Mori T. et al., 2004) определяют количество ИФН-г продуцирующих Т-лимфоцитов.

Однако, эти методы не позволяют дифференцировать латентную туберкулезную инфекцию от активного туберкулезного процесса. Кроме того, в условиях широкого, по разным оценкам 60-80%, распространения туберкулезного инфицирования в нашей стране, применение этих методов у взрослого населения представляется недостаточно эффективным. В то же время проблема дифференцирования специфической туберкулезной инфекции у детей и подростков от поствакцинальной аллергии весьма актуальна.

Лечение больных туберкулезом легких детей и подростков, особенно с распространенными формами, представляет значительную проблему. Несмотря на высокую эффективность (около 90%) лечения (Овсянкина Е.С., Губкина М.Ф. и соавт., 2006), длительность непрерывных химиотерапевтических курсов чрезвычайно велика (12 месяцев и более). Проблема лечения усугубляется наличием множественной лекарственной устойчивости (Емельянова Н.А. и соавт., 2009; Фирсова В.А. и соавт. 2002).

Как известно, существует ряд исследований, демонстрирующих применение различных иммунотропных препаратов в качестве дополнительных средств повышения эффективности лечения туберкулеза, в том числе у детей и подростков (Бармина Н.А., 2008, Позднякова А.С. и соавт., 2010). Однако, не всегда используется важный принцип целевого применения иммуноактивного препарата, в зависимости от анализа параметров иммунного ответа у данного пациента и контроля за изменениями иммунологических реакций, ответственных за противотуберкулезный иммунитет.

В связи с этим, изучение уровня антиген-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов ИФН-г и ФНО-б, а также субпопуляций Т-лимфоцитов и их специфического ответа антигены МБТ в условиях анализа ex vivo представляются существенно важным для оценки уровня иммунологической резистентности или характера иммунопатологии, характерной для туберкулезной инфекции.

Исходя из изложенного, применение вероятного эффективного иммунотропного препарата в качестве дополнительного средства лечения туберкулеза легких должно быть основано на иммунологическом слежении (мониторинге) за иммунологическим ответом к антигенам.

Цель исследования:

Повышение эффективности диагностики туберкулезной инфекции у детей и подростков и лечения туберкулеза легких на основе применения иммунологических методов исследования и применения иммунопотенцирующего препарата.

Задачи исследования:

Разработать новую отечественную тест-систему для определения туберкулезной инфекции у детей и подростков на основе антиген индуцированной продукции интерферона-г в образцах цельной крови ex vivo. Изучить диагностическую эффективность этого метода при первичной туберкулезной инфекции у детей и подростков, в том числе возможности дифференцирования туберкулезной инфекции от поствакцинальной аллергии.

Изучить возможности метода антиген индуцированной продукции интерферона-г в образцах крови ex vivo для анализа уровня иммунного ответа при различных формах туберкулеза легких и в зависимости от эффективности химиотерапии туберкулеза.

Оценить результаты применения метода антиген индуцированной продукции факторов клеточного иммунного ответа (фактор некроза опухоли, индукция перфорина) в образцах крови ex vivo для определения активности туберкулезного процесса.

Изучить значение иммунофенотипирования субпопуляций циркулирующих Т-лимфоцитов с анализом экспрессии различных факторов иммунологической активности противотуберкулезного иммунитета в периоде химиотерапии туберкулеза легких у подростков.

Разработать иммунологические обоснования и изучить эффективность применения иммунотерапевтического препарата аффинолейкина при лечении больных туберкулезом легких подростков.

Научная новизна

Разработана отечественная тест-система определения первичного туберкулезного инфицирования у детей и подростков на основе антиген индуцированной продукции интерферона-гамма (ИФН-г) в образцах цельной крови ex vivo. Использование в качестве индуктора ИФН-г, в отличие от широко известной, международно признанной тест-системы QuantiFeron-TB-Gold, не только специфических рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10, но и туберкулина PPD, позволяет определить как первичное туберкулезное инфицирование, так и идентифицировать поствакцинальную БЦЖ аллергию. Определен пороговый уровень концентрации ИФН-г - 70 пг/мл при индукции специфическими антигенами ESAT-6 и CFP-10, позволяющий установить первичную туберкулезную инфекцию.

Изучение антиген - индуцированной продукции ИФН-г при различных формах туберкулеза легких позволило установить снижение, определяемого с помощью этой реакции, уровня специфического иммунного ответа в образцах крови ex vivo при распространенных и осложненных формах туберкулеза легких у подростков. Показано восстановление иммунного ответа в процессе эффективной химиотерапии. Отсутствие положительной клинической динамики при торпидном характере процесса не сопровождалось восстановлением указанной иммунологической реакции. Полученные данные открывают возможность проведения иммунологического мониторинга с помощью разработанной технологии.

При анализе антиген-индуцированного в образцах крови фактора некроза опухоли альфа (ФНО-б) показан значительно более высокий уровень индукции этого провоспалительного цитокина при активном туберкулезе легких по сравнению с завершенным неактивным туберкулезным процессом или у инфицированных МБТ детей. Эти факты открывают дополнительные возможности мониторинга излечения туберкулезной инфекции у детей и подростков.

Полученные данные об увеличении процентного содержания субпопуляции Т-лимфоцитов, экспрессирующих ИФН-г, субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов, экспрессирующих ИФН-г, а также субпопуляции CD8⁺ T-клеток, экспрессирующих перфорин, после индукции антигенами МБТ в образцах крови, при активном туберкулезном процессе по сравнению с латентной инфекцией, позволяют использовать и эти методы для мониторинга специфического иммунного ответа при туберкулезе. Было также установлено, что сниженное при активном туберкулезе процентное содержание общей субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов, восстанавливается при благоприятном течении процесса химиотерапии.

При контролируемом клиническом изучении иммунотерапевтического препарата аффинолейкин было показано достоверно ускоренное рассасывание инфильтративных очагов: 2,73±0,26 месяца против 3,98±0,33 месяца в контрольной группе; P = 0,0025 при хорошей переносимости препарата. Открываемая возможность увеличения используемых доз и длительности применения аффинолейкина позволяет рассматривать его в качестве перспективного для лечения больных с распространенными формами туберкулеза легких.

Впервые был показан иммунопотенцирующий эффект применения аффинолейкина у больных, выразившийся в увеличении антиген-индуцированной продукции интерферона-гамма, увеличении субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов в периферической крови и снижении гамма-дельта Т-клеток, экспресссирующих ИФН-г.

Практическая значимость

Практическое значение работы состоит в том, что по итогам исследования была разработана новая тест-система - набор реагентов для определения туберкулезного инфицирования, в том числе для дифференцирования туберкулезной инфекции от поствакцинальной БЦЖ-аллергии у детей и подростков. Новая диагностическая тест-система успешно прошла клинические испытания, по итогам которых рекомендована Ученым Советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича для внедрения в практику здравоохранения и проходит необходимые этапы регистрации в качестве нового диагностического препарата.

Практическая ценность применения этой тест-системы заключается также в возможности ее использования для оценки специфического иммунного ответа у больных туберкулезом, позволяющей проводить соответствующее слежение в ходе специфического лечения и определить показания для возможного назначения иммунотерапевтических средств.

Практическая значимость работы также состоит в проведении контролируемого исследования эффективности применения, нового в отношении туберкулезной инфекции, иммунопотенцирующего препарата аффинолейкина, оказывающего не только благоприятное влияние на параметры противотуберкулезного иммунитета, но и на клиническую эффективность, выразившеюся в достоверном ускорении рассасывания инфильтративных изменений легочной ткани.

Основные положения, выносимые на защиту

Разработанная тест-система определения туберкулезного инфицирования на основе индукции ИФН-г в образцах цельной крови ex vivo в присутствии M.tuberculosis специфических рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10 и определение порогового диагностического уровня индукции ИФН-г позволяет установить первичную туберкулезную инфекцию и дифференцировать ее от поствакцинальной БЦЖ-аллергии с чувствительностью 96,3% при 98,0% специфичности.

Уровни антиген-индуцированной продукции ИФН-г в образцах цельной крови ex vivo в присутствии туберкулина PPD и специфического рекомбинантного антигена ESAT-6 у больных распространенными формами туберкулеза легких значительно ниже, чем при ограниченных формах.

Восстановление антиген-индуцированной продукции ИФН-г у больных в процессе лечения коррелирует с клинической динамикой лечения. При положительной динамике лечения через 2,5-3 мес. лечения уровень антиген-индуцированной продукции ИФН-г увеличивается, тогда как при торпидном течении или отрицательной динамике этот показатель не изменяется.

Определение антиген-индуцированной продукции фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-б) в образцах цельной крови ex vivo может быть использовано в качестве дополнительного критерия активности туберкулезного процесса у подростков.

Метод антиген-индуцированной продукции иммунного ответа в образцах крови ex vivo с последующим иммунофенотипированием субпопуляций y лимфоцитов позволяет более глубоко оценить характер протективного иммунитета и активность туберкулезной инфекции.

Применение аффинолейкина в качестве дополнительного иммунопотенцирующего препарата в комплексном лечении больных туберкулезом легких подростков обеспечивает повышение уровня антиген-индуцированной продукции интерферона-г и восстановление субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов в периферической крови. В клиническом отношении применение аффинолейкина обеспечивает также ускоренное рассасывание инфильтративных очагов в легочной ткани.

Внедрение

Метод иммунодиагностики и контроля иммунного ответа при туберкулезной инфекции у детей и подростков на основе антиген-специфической индукции провоспалительных цитокинов интерферона-гамма (ИФН-г) в цельной крови внедрены в НИИ ФП ММА им. И.М. Сеченова, научно-практическом центре «Фтизиатрия» МЗ РС (Я) г. Якутска.

Получен патент на полезную модель № 79337 тест система для иммуноферментной диагностики «ТВ-гамма-интерферон-тест» 25 июня 2008 г.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: Российской конференции по выявлению туберкулеза (Москва, 2006), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Санкт-Петербург, 2006), VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006), Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006), III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006), XII международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Паттая, Таиланд, 2007), VIII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2007), конференции НИИФП ММА им. И.М. Сеченова «Новые методы диагностики туберкулеза» (Москва, 2008), обществе фтизиопедиатров г. Москва (2008), 39 мировой конференции здоровья легких интернационального союза борьбы с туберкулезом и другими легочными заболеваниями (Париж, Франция, 2008), научно - практической конференции «Туберкулез у детей и подростков» (Москва, 2009), конгрессе «Лабораторные технологии при организации медицинской помощи» (Москва, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 20 работ, из них 9 в журналах, включенных в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, получен патент на полезную модель. № 79337 25 июня 2008 г., заявка № 2008125419/22.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Текст изложен на 222 машинописных листах, иллюстрирован 41 таблицей, 32 рисунками. Список литературы включает 364 источника, из них 181 отечественных, 183 зарубежных.

2. Содержание работы

Общая характеристика обследованных больных и методов исследования

В соответствии с поставленной целью и задачами исследования нами был обследован 421 пациент в возрасте от 1 до 17 лет, проходившие обследование и лечение клинике НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова, в детском противотуберкулезном диспансере г. Якутска и детской поликлинике УД президента РФ, с установленными диагнозами: «вираж» туберкулиновой пробы (РППТИ) - 82 пациента; поствакцинальная аллергия (ПВА) - 66 пациентов; дети, инфицированные микобактериями туберкулеза - 56 пациентов; экссудативный плеврит туберкулезной этиологии - 15 пациентов, туберкулез внутригрудных лимфатических узлов (ТВГЛУ) - 45 пациентов; первичный туберкулезный комплекс (ПТК) - 4 ребенка и туберкулез легких - 122 пациента. Обследовали также 31 здорового ребенка с отрицательной или сомнительной пробой Манту.

Согласно поставленным задачам, при решении каждой из них из этих пациентов формировались самостоятельные группы с различной численностью наблюдений. Некоторые больные параллельно участвовали в нескольких фрагментах исследования. Распределение обследованных детей и подростков по полу и возрасту представлено в таблице 1 и 2.

Таблица 1. Распределение детей и подростков по полу и возрасту с различной чувствительностью к туберкулину на пробу Манту 2ТЕ ППД-Л

Таблица 2. Распределение больных туберкулезом детей и подростков по полу и возрасту

Для изучения уровня индукции ИФН - г клетками цельной крови ex vivo в присутствии специфического антигена туберкулезного возбудителя у детей и подростков при первичной туберкулезной инфекции в сравнении с поствакцинной БЦЖ-аллергией проведено обследование 235 детей с установленными диагнозами, с различной степенью чувствительностью к туберкулину при отсутствии рентгенологических признаков локального туберкулеза: «вираж» туберкулиновой пробы - 82 пациента; поствакцинальная аллергия - 66 пациентов; инфицированные микобактериями туберкулеза не более 1 года - 56 пациентов; Обследовали также 31 здорового ребенка с отрицательной или сомнительной пробой Манту.

Для изучения уровня индукции ИФН - г клетками цельной крови ex vivo в присутствии специфического антигена туберкулезного возбудителя у детей и подростков при локальных формах туберкулезной инфекции, для слежения за уровнем специфического иммунного ответа у больных детей и подростков различными формами туберкулеза легких в процессе химиотерапии и в связи с эффективностью лечения, изучения клинико-иммунологической эффективности иммунотерапевтического препарата - аффинолейкина при лечении больных туберкулезом легких подростков проведено наблюдение за детьми и подростками с первичными и вторичными формами туберкулеза - 186 человек.

Структура клинических форм туберкулеза у детей и подростков была представлена как первичными, так и вторичными формами. На долю первичных форм туберкулеза: туберкулез внутригрудных лимфатических узлов (ТВГЛУ) и первичный туберкулезный комплекс (ПТК) пришлось 26,3%, диссеминированный туберкулез был диагностирован у 8 (4,3%) больных, экссудативный плеврит туберкулезной этиологии - у 15 (8,1%) человек. Среди вторичных форм туберкулеза основную группу составили больные с впервые выявленным туберкулезом легких: инфильтративным туберкулезом - 105 (56,5%) пациента, очаговый туберкулез был диагностирован у 6 (3,2%), казеозная пневмония - у 3 (1,6%).

Помимо формы туберкулеза у детей и подростков имеет значение распространенность процесса. К распространенным процессам при туберкулезе органов дыхания относили случаи с поражением более 2-х сегментов легких и (или) не более 2 групп внутригрудных лимфатических узлов, а также случаи с двусторонней локализацией или наличием осложнений туберкулеза в виде диссеминации, деструкции. Случаи с односторонней локализацией, объемом изменений не более 2 сегментов легких и (или) не более 2 групп внутригрудных лимфатических узлов, без осложнений, относили к ограниченным процессам при туберкулезе органов дыхания. Пациенты были распределены в 2 группы по распространенности процесса. 1-ю группу (n=59) составили лица с распространенным процессом туберкулеза легких, чаще с выраженным интоксикационным и бронхолегочным синдромом. Бактериовыделение - у 44 (74,6%) пациентов, МЛУ МБТ - у 8 (27,6%), полирезистентность - у 1 (3,4%) больных.

Во 2-ю группу были включены 63 пациента с ограниченным туберкулезным процессом, без выраженных симптомов интоксикации. Бактериовыделение не определялось у большинства пациентов - 93,7%. Специфический процесс носил односторонний характер, с преимущественной локализацией в правом легком (58,7%) и в верхней доле.

Мы изучали уровень индукции ФНО-б в образцах цельной крови антигенами комплекса ESAT-6 и CFP-10 и туберкулином PPD у различных групп пациентов: 1 - впервые инфицированные МБТ («вираж» туберкулиновой пробы) - 8 чел.; 2 - ранее инфицированные МБТ не более 2 лет - подростки с положительной пробой Манту - 10 чел.; 3 - больные активным туберкулезом легких - 20 пациентов; 4 - пациенты с ограниченными формами туберкулеза в фазе уплотнения и кальцинации - 8 чел.

Для сравнения содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺), гамма-дельта Т-лимфоцитов (CD3⁺гд⁺), интерферон-гамма продуцирующих (CD3⁺ ИФН-г⁺) и гамма-дельта интерферон-гамма продуцирующих (CD3⁺гд⁺ИФН-г⁺) Т-лимфоцитов у инфицированных микобактериями туберкулеза и у больных с туберкулезом легких детей и подростков в исследование включили 12 пациентов, инфицированных МТБ в течение не более 2-х лет при отсутствии рентгенологических признаков локального первичного туберкулеза и 21 больной с впервые выявленным туберкулезом легких.

Для сравнения содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺), перфорин продуцирующих Т-лимфоцитов (CD3⁺ перфорин⁺), содержания CD3⁺ СD8⁺ и перфорин продуцирующих (CD8⁺ перфорин⁺) Т-лимфоцитов у инфицированных микобактериями туберкулеза и у больных туберкулезом легких детей и подростков в исследование включили 11 пациентов, инфицированных МТБ в течение не более 2-х лет при отсутствии рентгенологических признаков локального первичного туберкулеза и 10 больных с впервые выявленным туберкулезом легких.

Всем больным проведен общепринятый комплекс клинико-лабораторных, рентгенологических, микробиологических, биохимических методов обследования пациентов. Особое внимание уделяли иммунологическому методу подтверждения диагноза туберкулеза.

Антиген-специфическая индукция иммунного ответа ex vivo

Для исследования были (с согласия родителей) взяты образцы по 3,5 мл венозной крови с гепарином (10 ед./мл). Образцы крови были разлиты по 1 мл в три различные маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и две опытные пробы, в которые вносили по 10 мкл туберкулина PPD в концентрации по белку 1мг/мл и рекомбинантный антиген ESAT-6 в концентрации по белку 1мг/мл. Конечная концентрация всех антигенов по белку составляла 10 мкг в мл крови. Образцы крови в стерильных пробирках объемом 5 мл с герметично закрывающимися крышками инкубировали при 37єС в течение 20-24 часов. На следующий день отбирали по 200 мкл образцов плазмы, в которых определяли концентрацию ИФН-г и у некоторых пациентов определяли концентрацию ФНО-б с помощью разработанных нами иммуноферментных тест-систем. В некоторых опытах образцы плазмы замораживали и хранили при - 20⁰С в течение 2-х недель.

Определение антиген-индуцированной продукции ИФН-г. Использовали планшеты для иммуноферментного анализа с сорбированными моноклональными антителами (МАТ) к ИФН-г. Для калибровочных разведений стандартного ИФН-г (280 пг/мл) проводили двукратные разведения до 8,25 пг/мл - чувствительность анализа. В лунки вносили по 50 мкл жидкости для разведения образцов и по 50 мкл образцов плазмы. Стандартные и исследуемые образцы помещали в дубле в две соседние лунки; инкубировали 60 минут при 37⁰С, встряхивая на шейкере. После окончания инкубации планшет четырехкратно отмывали фосфатно-солевым буферным раствором с твином и вносили вторые МАТ к рекомбинантному ИФН-г, меченые биотином, по 100 мкл и выдерживали в лунках планшета 30 минут при 37⁰С. После четырехкратного отмывания в лунки вносили по 100 мкл коньюгата (стрептавидин - пероксидаза хрена). После инкубации в течение 30 минут при 37⁰С не связавшийся конъюгат удаляли четырехкратным отмыванием. В качестве субстрата использовали раствор тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратно-фосфатном буферном растворе с перекисью водорода. После истечения 20 минут при комнатной температуре реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку по 100 мкл раствора серной кислоты.

Учет и интерпретация результатов анализа. Учет реакции проводили количественно с помощью многоканального сканирующего иммуно-ферментного анализатора - «БиоРад» (США). Результаты иммуноферментного анализа обрабатывали, используя программу Zemfira для обсчета количественного ИФА. По средним значениям дубликатов сигналов в лунках калибровочных проб результата титрования рекомбинантного ИФН-г в качестве стандарта строилась полиномиальная калибровочная кривая, устанавливалась линия тренда, и по ней определялась концентрация ИФН-г в анализируемых образцах в пг/мл. У каждого пациента определяли 3 показателя: спонтанную продукцию в лунках без добавления стимулятора и индуцированную антигенами PPD и ESAT-6. Рассчитывали разность между индуцированной и спонтанной продукцией ИФН-г. Чувствительность указанного метода составляет 10 пг/мл.

Определение антиген-индуцированной продукции ФНО-б. Использовали планшеты для иммуноферментного анализа с сорбированными кроличьими поликлональными антителами к ФНО-б. Калибровочная кривая строилась путем последовательных двукратных разведений с использованием концентраций стандартного ФНО-б от 5,9 нг/мл до 0,18 нг/мл. Дальнейшая процедура анализа и учет результатов были стандартными, аналогично выше изложенному.

Фенотипические методы исследования Т-лимфоцитов

Иммунологическое исследование включало в себя определение популяционного состава лимфоцитов периферической крови, продукции мононуклеарами периферической крови интерферона - г. Определение популяционного состава лимфоцитов периферической крови (CD3⁺, CD3⁺ИФН-г⁺, CD3⁺гд⁺, CD3⁺гд⁺ИФН-г⁺, CD3⁺перфорин⁺, CD3⁺СD8⁺, CD8⁺перфорин⁺) проводили с использованием моноклональных антител фирмы "Becton Dickinson" методом прямой иммунофлюоресценции.

Образцы периферической венозной крови получали из локтевой вены утром натощак, в качестве антикоагулянта использовали гепарин (10 ед. на 1 мл крови). Кровь разводили 1:1 в среде RPMI-1640 (Sigma). К 1 мл разведенной крови добавляли по 10 мкл раствора антигена (туберкулин PPD, ESAT-6 и CFP-I0) или стерильного физиологического раствора. В отдельных пробах лейкоциты активировали в присутствии 10 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА, Sigma) и 1 мкг иономицина (Sigma). Для предупреждения секреции цитокинов использовали ингибитор аппарата Гольджи брефельдин А (BD GolgiPlug) 10 мгк/мл. Пробы инкубировали 5 ч при 37^оС. Эритроциты лизировали в растворе BD PharmLyse (Becton Dickinson). Лимфоциты для определения внутриклеточного ИФН-г окрашивали антителами производства Becton Dickinson к поверхностным маркерам CD3 (PerCP-конъюгат) и TCRг/д (FITC-конъюгат) и внутриклеточному ИФН-г (РЕ-конъюгат) согласно инструкции производителя.

Для определения перфорин продуцирующих Т-лимфоцитов (CD3⁺ перфорин⁺), содержания CD3⁺ СD8⁺ и перфорин продуцирующих (CD8⁺ перфорин⁺) Т-лимфоцитов у инфицированных микобактериями туберкулеза и у больных туберкулезом легких детей и подростков лимфоциты окрашивали антителами производства Becton Dickinson к поверхностным маркерам CD3 (PerCP-конъюгат) и CD8 (FITC-конъюгат) и внутриклеточному перфорину (R-РЕ-конъюгат) согласно инструкции производителя. Для фиксации и пермеабилизации клеток использовали набор BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (Becton Dickinson). Анализ связывания антител с клетками проводили на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems), используя программное обеспечение CELL QUEST.

Методика использования иммунотерапевтического препарата «Аффинолейкин» в комплексном лечении туберкулеза легких у подростков

С целью изучения клинико-иммунологической эффективности аффинолейкина при лечении больных туберкулезом легких подростков были сформированы рандомизированно (четная-нечетная) две группы пациентов: основная (23 пациента) и контрольная (23 пациента). В обеих группах возраст больных колебался от 14-17 лет; юноши составили 41,0 % (19 чел.), девушки - 59,0 % (27 чел.). Пациентам основной группы наряду с антибактериальным лечением проводили иммунотерапию аффинолейкином. У подростков основной группы было получено информированное согласие. Исследование было одобрено Межвузовским комитетом по этике при ассоциации медицинских и фармацевтических вузов.

Больные контрольной группы получали только специфическую противотуберкулезную химиотерапию. Всем больным проводили противотуберкулезную терапию по стандартным схемам, установленным приказом №109 Минздрава России от 21 марта 2003г. до определения лекарственной чувствительности МБТ, далее лечение продолжали в соответствии с полученными результатами.

Аффинолейкин (Регистрационный N 98/366/1) - комплекс низкомолекулярных белков, выделенных из мембран лейкоцитов человека и лиофилизированных с глицином (5,4 мг в ампуле), представляет аморфную массу белого цвета. Количество препарата, приготовленного из 500 млн лейкоцитов донорской крови, обладает 1 ед. активности. Препарат изогенен и вирусологически безопасен. Разработчики: НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова РАМН, Пермское НПО "Биомед" и Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Изготовитель: Пермское НПО "Биомед".

Иммунологические свойства аффинолейкина заключаются в содержании антигенспецифических цитокинов Т-клеточного происхождения. При недостаточности клеточного иммунитета его введение восстанавливает утраченную и усиливает угнетённую клеточноопосредованную иммунореактивность на антигены повсеместно распространённых инфекционных возбудителей, таких как вирусы простого герпеса и гепатита В, стафилококки, стрептококки, микобактерии туберкулёза, коринебактерии, дрожжеподобные грибы и т.п.

Аффинолейкин вводили подкожно один раз в день 3 раза в неделю через день, при первой инъекции - 0,5 ед и при отсутствии побочных реакций увеличивали вводимую дозу по 0,5 ед. до 2 ед., на курс 10 инъекций.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы SAS и SPSS с помощью параметрических и непараметрических методов анализа. Определяли среднюю величину, стандартное отклонение (дисперсию), медиану и межквартильный (25% - 75%) уровень результатов. Достоверность различий в изучаемых группах анализировали по критерию Вилкоксона. Проверку на нормальность распределения проводили по Холмогорову-Смирнову.

Вероятность (р) определялось по таблице Стьюдента-Фишера. Существенными считались различия между средними при величине р < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Одной из поставленных задач настоящей работы явилась разработка новой отечественной тест-системы для определения туберкулезной инфекции у детей и подростков на основе антиген - индуцированной продукции ИФН-г в образцах цельной крови ex vivo; изучение диагностической эффективности этого метода при первичной туберкулезной инфекции у детей и подростков, в том числе возможности дифференцирования туберкулезной инфекции от поствакцинальной аллергии. В соответствии с этой задачей мы разработали, совместно с коллегами из отечественной фирмы ООО «Мона» иммуноферментную тест-систему количественного определения ИФН-г. Чувствительность этой системы составила 10 пг/мл. При этом была показана высокая воспроизводимость результатов анализа; отклонения в анализируемых концентрациях ИФН-г не превышали 10%.

Разрабатываемый отечественный метод определения туберкулезного инфицирования, (на основе международно признанной тест-системы Quaantiferon-TB-Gold), имеет важное отличие, заключающееся в том, что наряду с пробой крови, инкубируемой с комплексом антигенов специфичных для M.tuberculosis ESAT-6 и CFP-10, нами была использована и проба крови, инкубируемая с туберкулином PPD. Это позволило в дальнейшем более определенно дифференцировать инфекционную аллергию от поствакцинальной БЦЖ аллергии. Методика постановки исследования образцов крови была усовершенствована в процессе исследования. Если в начале исследований образцы крови по 1 мл культивировали в лунках специального планшета для культуры клеток, который помещался во влажную камеру, то затем культивирование образцов проводили с использованием стерильных криопробирок объемом 5мл с завинчивающимися крышками. Это существенно упрощало выполнение анализа и сбор образцов надосадочной плазмы после культивирования. Таким образом разработанная тест-система для определения туберкулезного инфицирования при исследовании образцов цельной крови, названная в дальнейшем производителем «Тубинферон», состоит из набора для иммуноферментного анализа для количественного определения ИФН-г, включающая калибровочную пробу ИФН-г, а также двух антигенных реагентов - туберкулина PPD, смесь антигенов ESAT-6 и CFP-10, набора специальных пробирок для культивирования образцов крови. Поскольку в каждом исследовании проводится контрольная проба крови, культивируемая без антигенов, проба с туберкулином и проба с рекомбинантными антигенами, то при использовании одного набора тест-системы «Тубинферон» можно исследовать 13 пациентов для определения туберкулезного инфицирования.

Для разработки этого метода и соответствующей тест-системы необходимо было разработать пороговый критерий концентрации ИФН-г, при наличии или выше которой в образце крови, культивируемой с рекомбинантным антигеном ESAT-6 или смесью антигенов ESAT-6 и CFP-10, можно считать наличие туберкулезного инфицирования у исследуемого пациента.

Для этого было проведено обследование 421 пациента с установленными диагнозами в следующих группах: «вираж» туберкулиновой пробы (период первичной туберкулезной инфекции) - 82 пациента; поствакцинальная аллергия - 66 пациентов; инфицированные микобактериями туберкулеза не более 2 лет - 56 пациентов; дети и подростки с первичным туберкулезным комплексом (ПТК) - 4, с туберкулезом внутригрудных лимфатических узлов (ТВГЛУ) - 45, с экссудативным плевритом туберкулезной этиологии - 15 человек, с впервые выявленным туберкулезом легких - 122 детей и подростков и обследовали также 31 здорового ребенка с отрицательной или сомнительной реакцией пробы Манту. Результаты представлены в следующей таблице 3.

В присутствии специфического для МБТ антигена ESAT-6 уровни индукции ИФН-г у детей с отрицательной реакцией Манту с 2Т.Е., а также детей с поствакцинальной аллергией были нулевыми или в нескольких случаях очень низкими. Концентрации ИФН-г в этих образцах у детей с «виражом» туберкулиновой пробы составили по медиане и 25-75% межквартильным различиям 351 (152-537) пг/мл, тогда как у детей с поствакцинальной аллергией - 0 (0 - 0) пг/мл, P<0,001. В дальнейшем в ряде опытов при сравнении культивирования исследуемых проб крови с антигеном ESAT-6 или смесью антигенов ESAT-6 и CFP-10, значимых различий в результатах концентраций ИФН-г мы не получали. Mazurek G. и соавт., 2003 также не получали значимых различий по этому признаку.

Таблица 3. Результаты обследования детей и подростков при дифференцировании поствакцинальной БЦЖ-аллергии от туберкулезного инфицирования при индукции ИФН-г с антигенами микобактерий туберкулеза

Н.д. - недостоверно. P-по критерию Вилкоксона.

При использовании порогового критерия концентрации индуцированного ИФН-г равного или более 70 пг/мл лишь в 2-х случаях у детей с туберкулиновой пробой до 5мм индукция ИФН-г превышала этот уровень, а из 66 детей с клинически установленной поствакцинальной аллергией все результаты индукции ИФН-г были ниже 70пг/мл. При «вираже» туберкулиновой пробы из 82 обследованных детей лишь в 3-х случаях уровень индукции был ниже порогового критерия. Таким образом, было установлено, что при получении порогового критерия концентрации индуцированного рекомбинантным антигеном ИФН-г равного или более 70пг/мл плазмы культивированного образца крови можно было сделать заключение о наличии туберкулезного инфицирования. В случае относительно низкого уровня индукции ИФН-г в пробирке с рекомбинантными антигенами, но значимой индукции в пробирке с туберкулином PPD, речь идет о поствакцинальной аллергии. При использовании этого критерия специфичность дифференцирования поствакцинальной аллергии и отрицательного заключения об отсутствии туберкулезного инфицирования составляет 98,0%, а чувствительность его определения - 96,3%. Уровень ESAT-6 специфической индукции ИФН-г у пациентов с «виражом» туберкулиновой пробы при размере папулы 10-16мм достоверно и значительно выше, чем у пациентов с относительно низким уровнем пробы Манту - 5-9мм. Это косвенно подтверждает достоверность получаемых результатов.

Следующей задачей работы было изучение возможностей этого метода для анализа уровня иммунного ответа при локальных формах туберкулеза легких и изучение его результатов в зависимости от эффективности химиотерапии туберкулеза. Для этой цели изучали уровни иммунного ответа при использовании обоих антигенов - туберкулина PPD и ESAT-6. Как видно из данных вышеприведенной таблицы, средний уровень (медиана) индукции ИФН-г при туберкулезе легких у подростков с туберкулином PPD составил 212 (91-374) пг/мл, а в присутствии специфического антигена ESAT-6 - 47 (19-161) пг/мл, что существенно ниже, чем при первичной туберкулезной инфекции - первичное туберкулезное инфицирование МБТ («вираж» туберкулиновой пробы), туберкулез внутригрудных лимфатических узлов и экссудативный плеврит туберкулезной этиологии; P<0,001. Мы изучили уровни антиген-индуцированного ИФН-г у подростков - больных с ограниченными и распространенными формами туберкулезом легких. Уровень индукции при инкубации с PPD у 59 подростков с распространенным туберкулезом легких составил 135,0±24,0 пг/мл, тогда как при ограниченной форме туберкулеза легких (63 подростка) индукция ИФН-г была существенно выше и составила в среднем 338,0±40,6 пг/мл, (р<0,001). При инкубации образцов крови с рекомбинантным антигеном ESAT-6 мы наблюдали аналогичную закономерность. Уровни индукции у больных распространенным и ограниченной формами туберкулеза легких составляли 44,0±14,0 пг/мл и 106,0±28,0 пг/мл, соответственно, P = 0,03.

В группе из 28 больных с распространенным туберкулезом легких подростков индукция ИФН-г антигенами PPD и ESAT-6 была изучена повторно через 2,5-3 мес. на фоне их специфического лечения противотуберкулезными препаратами. Анализ получаемых результатов об антиген-индуцированной продукции ИФН-г проводили в зависимости от эффективности проведенного лечения. В группе из 17 пациентов с положительной клинической динамикой уровни индукции ИФН-г, составлявшие в начале лечения 93,0±25,0 пг/мл с туберкулином PPD и 43,0±19,0 пг/мл c антигеном ESAT-6 достоверно увеличивались через 2,5-3 мес лечения, составляя 256,0±53,0 пг/мл и 135,0±37,0 пг/мл, соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Индукция ИФН-г у пациентов с положительной динамикой течения туберкулезного процесса

1 - в начале лечения;

2 - через 2,5-3 месяца;

ДИ - доверительный интервал для 95% уровня достоверности

В группе из 11 больных с торпидным (без улучшения) течением процесса или с отрицательной (4 пациента) клинической динамикой течения заболевания уровни антиген-индуцированной продукции ИФН-г через 2,5-3 мес. лечения, по сравнению с началом лечения, практически не изменялись.

Таким образом, мы могли сделать следующие выводы: 1) уровень индукции ИФН-г в образцах цельной крови больных туберкулезом в присутствии антигенов МБТ находится в обратной зависимости от распространенности и тяжести туберкулезного процесса; и 2) восстановление уровня индукции ИФН-г у больных в процессе лечения коррелирует с положительной клинической динамикой.

Возможность дифференцирования активной туберкулезной инфекции от латентной с помощью иммунологических методов исследования является одной из весьма трудных и мало разработанных проблем. С целью изучения этих возможностей мы использовали нашу систему анализа антиген-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов в образцах крови ex vivo и изучили уровни индукции фактора некроза опухоли (ФНО-б) в тех же условиях, что и вышеприведенные условия индукции ИФН-г.

Проводили анализ концентрации ФНО-б в образцах плазмы крови после инкубации с антигенами: туберкулином PPD и смеси антигенов ESAT-6 и CFP-10. Концентрацию ФНО-б измеряли с помощью разработанной нами количественной иммуноферментной тест-системы. Были изучены следующие группы пациентов подросткового возраста:

1) впервые инфицированные МБТ («вираж» туберкулиновой пробы) - 8 человек;

2) ранее инфицированные МБТ - подростки с положительной пробой Манту - 10 чел; 3) больные активным туберкулезом легких - 20 пациентов; и 4) пациенты с ограниченными формами туберкулеза в фазе уплотнения и кальцинации - 8 чел.

Было установлено, что у пациентов, впервые инфицированных МБТ, уровень ФНО-б индуцированного туберкулином PPD был достоверно выше, чем при латентной инфекции или эффективно пролеченных пациентов с относительно небольшими формами туберкулеза (первичный туберкулезный комплекс, ограниченный в пределах одного сегмента инфильтративный туберкулез легких в фазе уплотнения). В то же время при активном туберкулезе легких уровень ФНО-б был значимо выше, чем при излеченных небольших процессах. При индукции ФНО-б смесью антигенов ESAT6 и CFP-10 было установлено, что в этих опытах уровень индукции ФНО-б у пациентов с впервые выявленным туберкулезным инфицированием (3,0±0,3 нг/мл) также значимо выше, чем у ранее инфицированных МБТ (1,4±0,2 нг/мл), а у больных активным туберкулезом легких (6,2±0,6 нг/мл) не только существенно превышает уровень индуцированного ФНО-б в группе пациентов с затихшим процессом (2,2±0,2 нг/мл), но и значительно выше, чем в группе впервые инфицированных МБТ (3,0±0,3 нг/мл) (табл. 4).

Таблица 4. Индукция ФНО-б в образцах цельной крови инкубированных с туберкулином PPD и ESAT - 6

Это свидетельствовало, что уровень антиген-индуцированной продукции ФНО-б отражает степень активности туберкулезной инфекции. Очень высокий уровень индуцированного ФНО-б наблюдали при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких - 14,1 нг/мл, а также при инфильтративном туберкулезе в сочетании с экссудативным плевритом - 9,13 нг/мл.

В рамках изучения возможностей дифференцирования активной туберкулезной инфекции от латентной была также изучена антиген-индуцированная продукция перфорина в популяции цитотоксических (CD8) Т-лимфоцитов. Для этого, как и в последующих исследованиях мы использовали метод индукции факторов антиген-специфического иммунного ответа в образцах крови ex vivo, при котором эти образцы краткосрочно инкубировались с антигенами МБТ с последующим иммунофенотипированием внутриклеточного синтеза этих факторов, в частности, перфорина. Мы сравнили уровни антиген-индуцированного перфорина CD3⁺ (Т-лимфоциты) и CD8⁺ (цитотоксические Т-хелперы 1) клеток у 11 инфицированных МБТ и 10 больных с активным туберкулезом легких. Для анализа количества перфорин продуцирующих Т-лимфоцитов CD3⁺Per⁺ и CD8⁺Per⁺, индуцированных антигенами PPD и ESAT-6, мы уровня из процентного числа CD3⁺Per⁺ и CD8⁺Per⁺ клеток в индуцированных образцах вычитали число клеток в контроле (без антигена).

Таблица 5. Сравнение % субпопуляции CD8 Т-клеток, продуцирующих перфорин (CD8+Per+) в антиген-индуцированных образцах крови у детей, инфицированных МБТ, и больных туберкулезом легких

Было показано, что если в контроле (без антигена) у больных туберкулезом легких отмечено лишь незначительное увеличение процентного содержания перфорин-продуцирующих субпопуляции CD8⁺ Т-лимфоцитов, по сравнению с инфицированными МБТ пациентами, при индукции антигенами - туберкулином PPD и ESAT-6 у больных туберкулезом уровни клеток CD8⁺Per⁺ были значительно выше, чем у инфицированных МБТ: 4,13±0,62% против 1,69±0,74 при индукции PPD и 2,29±0,63% (P<0,01) против 5,06±0,78% (P<0,01) при индукции ESAT-6, соответственно (табл.5). При анализе индукции перфорина в общей популяции Т-лимфоцитов (CD3⁺) различий между инфицированными МБТ и больными туберкулезом пациентами не было обнаружено. Таким образом, с помощью метода антиген-специфической индукции образцов крови анализ активирования цитотоксической субпопуляции Т-лимфоцитов выявляет прямую корреляцию с активностью туберкулезной инфекции.

Аналогичный подход с антиген-специфической индукцией и последующим иммунофенотипированием ИФН-г продуцирующих Т-лимфоцитов, гамма-дельта (гд) Т-клеток и субпопуляции ИФН-г продуцирующих гд-Т-лимфоцитов был использован как для изучения активности туберкулезной инфекции, так и для динамического наблюдения за характером иммунного ответа в процессе химиотерапии туберкулеза легких у подростков.

Мы изучали число Т-лимфоцитов (CD3⁺), продуцирующих ИФН-г без индукции антигенами (контроль), а также после краткосрочной индукции антигенами. Сравнение получаемых результатов, показало, что проценты ИФН-г-продуцирующих (ИФН-г⁺) лимфоцитов у больных туберкулезом легких по всем критериям: в контроле, с антигенами PPD и ESAT-6 (0,34±0,1, 0,65±0,1, 0,66±0,1, соответственно) был достоверно выше (р<0.05), чем у инфицированных МБТ детей и подростков (0,12±0,02, 0,26±0,03 и 0,35±0,1, соответственно (рис. 2).

%

Рис. 2. Проценты ИФН-г продуцирующих CD3⁺ ИФН-г⁺ лимфоцитов при индукции антигенами МБТ PPD и ESAT-6 у пациентов инфицированных МБТ и больных туберкулезом легких

1 - инфицированные МБТ;

2 - больные туберкулезом легких;

ДИ - доверительный интервал для 95% уровня достоверности

В этом случае мы должны отметить определенное противоречие между нашими данными о снижении уровня антиген-индуцированного ИФН-г в образцах плазмы у больных активным туберкулезом, по сравнению с инфицированными МБТ пациентами, в то время как число Т-лимфоцитов, содержащих внутриклеточный ИФН-г (ИФН-г- продуцирующие) у больных активным туберкулезом увеличивается без индукции антигенами и еще больше возрастает в результате индукции. Эти данные частично подтверждаются в работах Ferrand R.A. et al. 2005 и Hughes et al..2005. Эта дихотомия рассмотрена также в обзоре И.В. Лядовой и В.Я. Гергерта, 2009.

Особое внимание в нашей работе уделено субпопуляции гд - Т-лимфоцитов, играющих очень важную роль в процессе туберкулезной патологии. Данные клетки способны очень быстро распознавать антигены микобактерий и реагировать, обладая этой, как бы врожденной способностью к распознаванию не только белковых, но и липидных антигенов. Они продуцируют ИФН-г и ФНО-б и оказываются в относительно большом количестве в зоне туберкулезного поражения - легких и регионарных лимфатических узлах.