Иммунодиагностика и иммунотерапия туберкулезной инфекции у детей и подростков

С помощью иммунофенотипирования мы изучали процент гд - Т-лимфоцитов (CD3⁺гд⁺), а также гд - Т - ИФН-г продуцирующие клетки, индуцированные туберкулином PPD и ESAT-6 при краткосрочной инкубации образцов крови больных активным туберкулезом и пациентов, инфицированных МБТ. Установлено, что процент CD3⁺гд⁺ клеток у больных туберкулезом легких был достоверно ниже, чем у инфицированных МБТ пациентов: 2,53±0,3 и 4,93±0,8, соответственно (табл. 6).

Таблица 6. Процент CD3⁺гд⁺ клеток при индукции антигенами МБТ PPD и ESAT-6 у инфицированных МБТ и больных туберкулезом легких пациентов

В ходе исследования была изучена популяция гд - Т-лимфоцитов у больных туберкулезом легких подростков в динамике химиотерапии. Для анализа разделили полученные результаты у больных с торпидным течением туберкулезного процесса (7 чел.) и больных с положительной клинической динамикой (13 чел.) лечения. Было установлено, что при торпидном течении процент гд - Т-лимфоцитов значимо ниже среднего процентного содержания этих клеток у больных туберкулезом легких: 1,65±0,29% и 2,58±0,28%, соответственно, тогда как при благоприятной клинической динамике процесса доля гд - Т-клеток увеличивалась, т.е. относительно восстанавливалась - 3,2 ± 0,3% (рис. 3).

%

Рис. 3. Процент CD3⁺гд⁺ клеток у инфицированных МБТ пациентов и больных туберкулезом легких

1 - инфицированные МБТ;

2 - больные туберкулезом легких;

3 - больные с торпидным течением туберкулеза легких;

4 - больные с положительным течением туберкулеза легких;

ДИ - доверительный интервал для 95% уровня достоверности;

Однако при анализе индукции ИФН-г антигенами PPD и ESAT-6 субпопуляция гамма-дельта интерферон-продуцирующих Т-клеток (CD3⁺гд⁺ИФН-г⁺) была значимо выше у больных туберкулезом легких в контрольных образцах (без антигена) - 4,2±0,8%, чем у инфицированных МБТ - 1,55±0,3%. При краткосрочном инкубировании с антигенами - индукции с PPD и ESAT - 6 количество интерферон-продуцирующих гд-Т значительно увеличивалось во всех индуцированных образцах. Однако у больных мы наблюдали - 9,3±1,0% и 8.7±0.7% клеток со свойствами CD3⁺гд⁺ИФН-г⁺, что также было значимо выше, чем у инфицированных МБТ детей и подростков - 3,8±1,2% и 4,5±1,5%, соответственно (рис. 4).

%

Рис. 4. Процент интерферон-г продуцирующих гамма-дельта Т-лимфоцитов (CD3⁺гд⁺ИФН-г⁺) при индукции антигенами PPD и ESAT - 6 у пациентов инфицированных МБТ и больных туберкулезом легких

1 - инфицированные МБТ;

2 - больные туберкулезом легких;

ДИ - доверительный интервал для 95% уровня достоверности

Таким образом, установлено, что число ИФН-г продуцирующих Т-клеток при активной туберкулезной инфекции увеличивается, по сравнению с инфицированными МБТ пациентами. Субпопуляция гамма-дельта Т-клеток при активной туберкулезной инфекции уменьшается, однако доля ИФН-г продуцирующих клеток этой популяции при активной инфекции существенно выше, как и уровень индукции их числа при инкубации с антигенами МБТ. При благоприятном течении процесса число гд - Т-лимфоцитов восстанавливается. Применение метода иммунофенотипирования Т-лимфоцитов, в том числе субпопуляции гамма-дельта Т-клеток открывает дополнительные возможности оценки специфического иммунного ответа и дифференцирования активной и латентной туберкулезной инфекции.

Существенно важной задачей нашего исследования была разработка иммунологических обоснований и изучение клинической и иммунологической эффективности применения иммунотерапевтического препарата аффинолейкин при лечении больных туберкулезом легких подростков. Одним из перспективных путей иммунотерапии туберкулеза представляется использование низкомолекулярных антигенспецифичных Т клеточных пептидов (субъединицы растворимых антигенсвязывающих Т-клеточных молекул) - так называемых трансфер-факторных препаратов. При экспериментальном туберкулёзе лёгких у мышей эти препараты не только потенцировали специфическую химиотерапию, но и проявляли собственную терапевтическую активность (Fabre R.A., Pйrez T.M., Aguilar L.D. et al., 2004).

Мы провели исследование клинической и иммунологической эффективности применения иммунотерапевтического препарата аффинолейкин у детей и подростков больных, инфильтративным туберкулезом легких. С помощью рандомизированной выборки были сформированы 2 (основная и контрольная) группы пациентов по 23 человека. Распространенный туберкулезный процесс чаще наблюдался в основной группе - у 12 (52,2%) чел., в контрольной группе - у 8 (34,8%) больных. У большинства пациентов имелись деструктивные изменения легочной ткани, наблюдавшиеся в равной мере в обеих группах, в 65,0% случаев. МБТ выделялись у 12 больных в основной группе, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) в 3-х случаях и у 14 - в контрольной группе, в том числе с МЛУ - у 5 пациентов.

Больным основной группы, начиная со второго месяца интенсивной специфической антибактериальной терапии, которая проводилась в обеих группах по стандартным схемам, наряду с антибактериальным лечением, проводили иммунотерапию аффинолейкином. Аффинолейкин вводили подкожно один раз в день, по 2 ед. активности препарата в 1 мл физиологического раствора NaCl, 3 раза в неделю через день, всего 10 инъекций.

Иммунологические исследования проводили пациентам обеих групп в начале лечения и через 2 месяца комплексного лечения. В обеих группах изучали уровни продукции ИФН-г в образцах цельной крови после инкубации с антигенами PPD и ESAT-6, а также процентное содержание субпопуляции гд - Т-лимфоцитов (CD3⁺гд⁺), ИФН-г продуцирующих Т-лимфоцитов (CD3⁺ИФН-г⁺) и ИФН-г продуцирующих гамма-дельта Т-лимфоцитов (CD3⁺гд⁺ИФН-г⁺). ИФН-г- продуцирующие лимфоциты были изучены, в том числе после инкубации образцов крови с антигенами PPD и ESAT-6.

Уровни антиген-индуцированного ИФН-г в образцах плазмы крови после инкубации с антигенами PPD ESAT-6 у больных основной группы был исходно, до применения аффинолейкина (АФЛ) несколько, но не достоверно выше, чем у пациентов контрольной группы. Через два месяца лечения, при повторном исследовании уровни индуцированного ИФН-г увеличились, в среднем, в обеих группах. Однако только в основной группе уровень индуцированного ИФН-г после лечения значимо отличался от исходного по обоим антигенам: 272,7±53,2пг/мл до лечения и 106,7±25,1пг/мл после лечения (P = 0,023) для ИФН-г индуцированного туберкулином PPD (табл. 7).

Таблица 7. Антиген-индуцированная продукция ИФН-г в образцах крови при адъювантной терапии аффинолейкином (АФЛ) у больных туберкулезом легких

Для ИФН-г, индуцированного ESAT-6 эти уровни составляли 155±42,9 пг/мл и 43,9 ±10пг/мл, соответственно.

Процентный уровень Т-лимфоцитов, экспрессирующих ИФН-г после 2-х месячного лечения значимо не изменялся в обеих группах. Проценты гд - Т-лимфоцитов (CD3⁺гд+) в обеих группах до лечения были практически одинаковыми. Однако после проведения иммунотерапевтического курса АФЛ процент гд-Т-лимфоцитов восстанавливался только в основной группе: 2,56±0,37% - до лечения и 4,0±0,65% - после АФЛ, P<0,01. В то же время, процент гд - Т-клеток, продуцирующих ИФН-г (CD3⁺гд⁺ИФН-г⁺), наоборот, значимо уменьшался, составляя 5,32±1,7% до лечения и 1,23±0,4% - после применения АФЛ, P<0,05. В контрольной группе оба этих показателя не изменялись (табл. 8).

Таблица 8. Процент гамма-дельта Т-лимфоцитов (CD3+гд+) и процент ИФН-г (CD3+гд+ ИФН-г+) продуцирующих гамма-дельта Т-клеток при применении аффинолейкина (АФЛ)

* - % от числа CD3+гд+

При анализе процентных долей гд - Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-г⁺ после индукции антигенами PPD и ESAT-6, наблюдаемых до и после лечения с применением АФЛ (исследования проводили в обеих группах в те же сроки), установлено, что в обеих группах отмечалось снижение числа этих клеток, характерных для активной стадии туберкулезной инфекции.

Однако лишь в основной группе снижение процентных чисел клеток со свойствами CD3⁺гд⁺ИФН-г⁺ после индукции антигенами МБТ было достоверным. В частности, доля этих клеток, индуцированных с PPD, до лечения в опытной группе 9,5±2,0% и 4,2±1,2% , P=0,03 - после применения АФЛ. Подобным образом, при индукции антигеном ESAT-6 процент клеток CD3⁺гд⁺ ИФН-г⁺ до применения АФЛ составлял 7,8±1,2% и 4,07±1,1%, P <0,05 - после лечения.

Таким образом, иммунопотенцирующий эффект аффинолейкина демонстрировался в виде значимого повышения уровня антиген-индуцированной продукции интерферона-гамма в образцах цельной крови и увеличении доли субпопуляции гд - Т-лимфоцитов в периферической крови.

В то же время, применение аффинолейкина приводило к уменьшению числа антиген стимулированных ИФН-г экспрессирующих (продуцирующих) гд - Т-клеток в периферической крови, что подтверждает предположение об усилении их эффекторной антимикробной функции в результате миграции в очаги туберкулезной инфекции. По данным традиционного анализа гемограммы отмечалось, что в основной группе, в отличие контрольной, отмечено достоверное повышение процентного содержания лимфоцитов в периферической крови после завершения курса аффинолейкина с 32,4±1,6% до 37,6±1,4% (р<0,05). Однако абсолютное количество лимфоцитов не изменялось.

По данным клинических наблюдений, включение в комплексную противотуберкулезную терапию у подростков аффинолейкина способствовало более быстрому уменьшению симптомов интоксикации и достоверно выраженному ускоренному рассасыванию инфильтративных очагов, в среднем: 2,73±0,26 мес. против 3,98±0,33 мес. в контрольной группе; P = 0,0025. Прекращение бактериовыделения контрольной группе наблюдалось, в среднем, через 2,3±0,36 мес., в опытной группе - 1,8±0,4 мес. Статистических различий по этому критерию не установлено. В процессе лечения не зарегистрировано ни одного случая осложнений на фоне применения аффинолейкина. Хорошая переносимость лечения АФЛ наблюдалась у всех больных. Полученные результаты позволяют рекомендовать применение аффинолейкина в качестве перспективного адъювантного средства при лечении подростков с активным туберкулезом легких.

Выводы

Тест-система, разработанная на основе индукции интерферона-гамма (ИФН-г) специфичным для M.tuberculosis антигеном ESAT-6 и туберкулином PPD в образцах цельной крови позволяет с чувствительностью 96,3% и специфичностью 98,0% определять первичную туберкулезную инфекцию у детей и подростков и дифференцировать ее от поствакцинальной БЦЖ аллергии.

Уровень ESAT-6 специфической индукции ИФН-г у пациентов с «виражом» туберкулиновой пробы при размере папулы 10-16мм достоверно и значительно выше, чем у пациентов с относительно низким уровнем пробы Манту 5-9мм.

При туберкулезе легких у детей и подростков уровень антиген-индуцированного ИФН-г значительно снижается в зависимости от распространенности и тяжести туберкулезного процесса. При положительной динамике патологического процесса через 2,5 - 3месяца уровень антиген-индуцированного ИФН-г восстанавливается, тогда как при торпидном течении туберкулеза не изменяется.

Уровень фактора некроза опухоли альфа (ФНО-б) в образцах цельной крови, индуцированного туберкулином PPD и смесью антигенов ESAT-6 и CFP-10 коррелирует с активностью туберкулезной инфекции (6,2±0,6нг/мл) и значительно уменьшается у излеченных пациентов (2,2 ±0,3нг/мл).

Процент Т-лимфоцитов, экспрессирующих ИФН-г в контрольных и индуцированных антигенами PPD и ESAT-6 образцах крови значительно выше у больных туберкулезом легких детей и подростков, по сравнению с латентной инфекцией - инфицированными МБТ пациентами без признаков активности инфекции; с туберкулином PPD - 0,65±0,1% против 0,26±0,03%; с антигеном ESAT-6 - 0,66±0,1% против 0,35±0,1%.

Процентное содержание субпопуляции гамма-дельта (гд)-Т-лимфоцитов при активной туберкулезной инфекции у подростков достоверно ниже (2,58±0,28%), чем у инфицированных МБТ (4,93±0,81%) и восстанавливается при благоприятной клинической динамике -3,2±0,32%, по сравнению с торпидно текущим процессом - 1,65±0,29%.

Уровень процентного содержания гд - Т-лимфоцитов, экспрессирующих ИФН-г при активной туберкулезной инфекции значительно выше, чем при латентной инфекции как в интактных образцах крови - 4,2±0,84% против 1,5±0,26%, так и в индуцированных туберкулином PPD - 9,3±1,09% и 3,78±1,19% и антигеном ESAT-6 - 8,67±0,69% и 4,52±1,48%, соответственно.

Уровень субпопуляции CD8⁺ Т-лимфоцитов, экспрессирующих перфорин (CD8⁺Per⁺), после индукции антигенами PPD и ESAT-6 значительно выше при активной туберкулезной инфекции, чем при латентной инфекции: 4,13± ,62%. против 1,69±0,74% и 5,06±0,78% против 2,29±0,63%, соответственно.

При применении иммунопотенцирующего препарата аффинолейкина уровень антиген-индуцированного ИФН-г в образцах цельной крови у больных основной группы увеличивался значительно больше, чем у пациентов контрольной группы. В основной группе с туберкулином PPD - 106,7±25,1пг/мл и 272,7±53,2пг/мл (P<0,05), а в контрольной группе 183,7±34 пг/мл и 223,8±40,5пг/мл (P>0,05).

Уровень гд - Т-лимфоцитов, циркулирующих в крови больных, получавших аффинолейкин, восстанавливается (2,56±0,37% и 4,0±0,65%), в отличие от пациентов контрольной группы. При этом процентное содержание гд - Т-лимфоцитов, экспрессирующих ИФН-г в контрольных (5,32±1,7% и 1,23±0,4%) и антиген-индуцированных образцах крови уменьшается (9,5±2,0% и 4,2±1,2%).

Клинические наблюдения больных туберкулезом легких, получавших аффинолейкин, свидетельствуют, что он переносился без каких-либо побочных явлений, наблюдалось быстрое уменьшение интоксикации, при рентгенологическом контроле установлено, что в основной группе наблюдалось достоверно выраженное ускоренное рассасывание инфильтративных изменений: в среднем, 2,7±0,26 мес., по сравнению с 3,98±0,33 мес. в контрольной группе; P = 0,0025.

Практические рекомендации

Для эффективного и специфичного определения туберкулезного инфицирования, в том числе для дифференцирования туберкулезной инфекции от поствакцинальной БЦЖ - аллергии у детей и подростков рекомендуется применение разработанной отечественной тест-системы (набора реагентов) «Тубинферон», с использованием образцов цельной крови и специфических МБТ антигенов - ESAT-6 и CFP-10.

Тест-система «Тубинферон» может быть рекомендована для оценки специфического иммунного ответа у больных туберкулезом, позволяющей проводить соответствующее слежение в ходе специфического лечения и определить показания для возможного назначения иммунотерапевтических средств.

Метод индукции провоспалительного цитокина - фактора некроза опухоли альфа (ФНО-б) в образцах крови в присутствии туберкулина PPD и специфических МБТ антигенов ESAT-6 и CFP-10 может быть рекомендован для оценки активности туберкулезного процесса и в качестве иммунологического критерия излеченности туберкулезной инфекции у пациентов, не получавших иммунодепрессивных препаратов, в том числе ингибиторов ФНО-б.

У больных с относительным снижением уровня иммунного ответа к антигенам МБТ рекомендуется использование иммунопотенцирующего препарата аффинолейкина, оказывающего не только благоприятное влияние на параметры противотуберкулезного иммунитета, но и способствующего значительному ускорению рассасывания инфильтративных изменений легочной ткани.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Гаврильев С.С., Иванова А.П. Дифференцированный подход к профилактическому лечению детей, впервые инфицированных туберкулезом // Пробл. туберкулеза -2001.-№ 2. - С. 14-17.

2. Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Аксенова В.А., Игнашенкова Г.В., Ефремов Е.Е. Индукция ИНФ-г в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза в образцах цельной крови при туберкулезе у детей и подростков // VI съезд аллергологов и иммунологов СНГ Российский национальный конгресс аллергологов и иммунологов III Российская конференция по иммунотерапии//Аллергология и иммунология.- 2006. - том 7, №3. - С. 300.

3. Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Аксенова В.А. Индукция интерферона - гамма (ИНФ-г) в образцах цельной крови при различных формах туберкулезной инфекции у детей и подростков // XVI национальный конгресс по болезням органов дыхания : Сб. науч. трудов - Санкт-Петербург, 2006 - С. 190.

4. Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Аксенова В.А., Игнашенкова Г.В., Ефремов Е.Е. Иммунологический метод дифференцирования поствакцинальной БЦЖ - аллергии от первичной туберкулезной инфекции // XII международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореабилитации.//Аллергология и иммунология.-2007. - том 8, № 3.-С. 246.

5. Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Аксенова В.А., Игнашенкова Г.В., Ефремов Е.Е. Диагностика поствакцинальной аллергии у детей с положительной туберкулиновой пробой с помощью метода индукции интерферона - г IN VITRO / Туберкулез в России год 2007//матер. VIII Российского съезда фтизиатров - Москва, 2007 - С. 237.

6. Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Аксенова В.А., Игнашенкова Г.В., Ефремов Е.Е. Индукция интерферона - г в образцах цельной крови как метод оценки специфического противотуберкулезного иммунитета у детей и подростков с различными формами туберкулезной инфекции / Туберкулез в России год 2007//Матер. VIII Российского съезда фтизиатров - Москва, 2007 - С. 238.

7. Мадасова В.Г., Аксенова В.А., Клевно Н.И., Сенчихина О.Ю., Мордовская Л.И., Севастьянова Т.А., Сенькина Т.И., Кавтарашвили С.М. Течение лекарственно устойчивого туберкулеза у детей / Туберкулез в России год 2007//Матер. VIII Российского съезда фтизиатров - Москва, 2007 - С. 259.

8. Mordovskaya L.I., Vlasik T.N., Yanushevskaya E.I., Kashirina N.A., Efremov E.E., Ignashenkova G.V., Vladimirsky M.A. // Significance of the antigen-specific of IFN-г response in vitro for treatment monitoring of TB adolescents//Abstract book, 39th World Conference on Lung Health of the Int. Union against Tuberculosis a. Lung Dis., Paris, 16-20 october 2008. - Intern. Journal of tuberculosis a. Lung Disease. - 2008. - vol.11, sumpl. 2. - S. 231.

9. Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Аксенова В.А., Кавтарашвили С.М., Власик Т.Н., Ефремов Е.Е. Значение антигениндуцированной продукции интерферона-г in vitro при лечении туберкулеза легких у подростков//Иммунология. - 2009. - Т. 30, № 4. - С. 220-223.

10. Мордовская Л.И., Владимирский М.А., Аксенова В.А., Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.И., Власик Т.Н. Индукция интерферона-гамма в образцах цельной крови in vitro - тест для определения туберкулезного инфицирования детей и подростков//Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2009.- № 6. - С. 19-24.

11. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Владимирский М.А., Аксенова Е. А., Ефремов Е.Е., Власик Т.Н. Количественный анализ индукции интерферона - г клетками цельной крови in vitro в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза//Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. - 2009. - Т. 88, № 5. - С. 43-46.

12. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Владимирский М.А. Дифференциальная диагностика туберкулезного инфицирования и поствакцинной БЦЖ - аллергии с помощью анализа образцов крови in vitro//Якутский медицинский журнал. - 2009. - № 4. - С. 47-49.

13. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Владимирский М.А. Cовременный подход к диагностике туберкулезной инфекции у детей и подростков//Дальневосточный медицинский журнал. - № 4. - 2009. - С. 37-39.

14. Мордовская Л.И., Арефьева Т.А., Владимирский М.А, АксеноваВ.А. Иммунофено-типирование Т-лимфоцитов - дополнительные возможности дифференцирования активной и латентной туберкулезной инфекции у детей и подростков//Сборник материалов науч. - практ. конф. «Туберкулез у детей и подростков» 17-18 декабря 2009г., г. Москва. - М., 2009г. - С. 198-200.

15. Мордовская Л.И., Кавтарашвили С.М., Аксенова В.А., Арефьева Т.А., Мац А.Н., Владимирский М.А. Иммунопотенцирующий эффект применения аффинолейкина при лечении туберкулеза легких у подростков//Сборник материалов науч.-практ. конф. «Туберкулез у детей и подростков» 17-18 декабря 2009г., г. Москва. - М., 2009 г. - С. 201-203.

16. Владимирский М.А., Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Шипина Л.К., Аксенова Е. И., Сергиенко О.В., Ляшук А.М., Неретина Т.В., Карягина А.С., Лунин В. Г., Ефремов Е.Е., Игнашенкова Г.В., Власик Т.Н., Янушевская Е.В., Каширина Н.М. Разработка и применение отечественной тест-системы диагностики туберкулезного инфицирования на основе количественного анализа индукции интерферона-гамма в образцах цельной крови in vitro с использованием специфических рекомбинантных антигенов//Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 1. - C. 49-54.

17. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Арефьева Т.И., Мац А.Н., Владимирский М.А. Применение аффинолейкина в комплексном лечении туберкулеза легких у подростков//Якутский медицинский журнал. - 2010. - № 2. - С. 16-18.

18. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Шипина Л.К., Аксенова Е.И., Ефремов Е.Е., Власик Т.Н., Владимирский М.А. Антигенспецифическая индукция интерферона - г в образцах цельной крови in vitro для оценки специфического противотуберкулезного иммунитета и дифференцирования туберкулезного инфицирования и поствакцинальной аллергии//Научные труды (К 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки, профессора М.М. Авербаха). Под ред. Литвинова В.И. - М.: МНПЦБТ. - 2010. - С. 48-52.

19. Мордовская Л.И., Власик Т.Н., Ефремов Е.Е., Аксенова Е.И., Сазыкин И.М., Белоусов П.В., Недоспасов С.А., Владимирский М.А. Антиген-специфическая индукция провоспалительных цитокинов в образцах цельной крови ex vivo в диагностике и мониторинге туберкулезной инфекции//Лаборатория. - 2010. - № 2. - С. 24-25.

20. Мордовская Л.И., Аксенова В.А., Владимирский М.А., Арефьева Т.А., Мац А.Н., Кавтарашвили С.М. Аффинолейкин - иммунотерапевтический адьювант при лечении туберкулеза легких у подростков//Туберкулез и болезни легких. - 2010. - № 6. - С. 40-44.

21. Патент на полезную модель №79337 тест система для иммуноферментной диагностики «ТВ-гамма-интерферон-тест», приоритет полезной модели от 25 июня 2008.

Размещено на Allbest.ru