Роль нейтрофилов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек

Размещено на http://www.allbest.ru/

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Роль нейтрофилов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек

Шишкова Юлия Сергеевна

Челябинск 2010

Работа выполнена в научно-исследовательском институте иммунологии, на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Южно-Уральском научном центре РАМН

Научный консультант заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Долгушин Илья Ильич

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Базарный Владимир Викторович

доктор медицинских наук, профессор Смолягин Александр Иванович

доктор медицинских наук, профессор Аклеев Александр Васильевич

Ведущая организация Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург

Защита состоится на заседании диссертационного совета Д 208.117.03. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, д. 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Л.Ф. Телешева

Общая характеристика работы

слизистый оболочка резистентность женщина

Актуальность проблемы

Одним из важнейших и до сих пор мало исследованных механизмов антимикробной защиты является колонизационная резистентность кожи и слизистых оболочек, под которой понимают устойчивость эпителия к колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами (Бодяжина В.И., 1978; Долгушина В.Ф., 1991; Медведев Б.И., Казачкова Э.А. и др., 2001). Колонизационная резистентность обеспечивается совокупностью разнообразных факторов: на слизистых оболочках это, прежде всего, муцин, образующий достаточно сложноорганизованный биослой. В этот биослой встроены все защитные инструменты: резидентная микрофлора, секреторные антитела, разнообразные бактерицидные молекулы, типа лизоцима, лактоферрина, токсические метаболиты кислорода, азота и т.д. (Шендеров Б.А., Ануфриева Р.Г. и др., 1996; Рязанцев С.В., Хмельницкая Н.М. и др., 2000). До сих пор неясна роль фагоцитирующих клеток, в частности нейтрофилов (Нф), в защите слизистых оболочек. Нейтрофилы - это, прежде всего, тканевые клетки. Именно в тканях они участвуют в воспалительных и антимикробных реакциях. А вот работают ли они в слизистом биослое - не ясно.

И.И. Долгушиным было высказано предположение, что Нф, мигрирующие на поверхности слизистых оболочек, играют важную роль в их защите (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Покидая ткани и выходя в слизистый биослой, Нф секретируют биоцидные продукты, которые могут участвовать не только в антимикробной защите, но и в регуляции микробиоценозов, заселяющих соответствующие биотопы. Данное предположение и обозначило цель исследования.

Цель исследования

Определить роль нейтрофилов и их секреторных продуктов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек нижнего отдела репродуктивного тракта женщин.

Задачи исследования

1. Исследовать состояние лейкоцитарного звена цервикального и вагинального секретов здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.

2. Изучить состав растворимых антимикробных факторов цервикального и вагинального секретов здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.

3. Определить in vitro влияние S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и бактериального комплекса на жизнеспособность, функциональный статус, антимикробную активность и цитокинпродуцирующую функцию нейтрофилов.

4. Разработать способ экспресс-обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек.

5. Изучить in vitro образование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови после взаимодействия с E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или бактериальной смесью и оценить их эффективность.

6. Сравнить бактерицидный эффект секреторных продуктов интактных и активированных взвесью S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. нейтрофилов.

7. Установить in vitro влияние нейтрофилов и их секреторных продуктов на состав микрофлоры нижнего отдела генитального тракта и адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом.

Научная новизна

В работе дана комплексная оценка состояния факторов врожденного иммунитета слизистых оболочек нижнего отдела генитального тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла, впервые проведена сравнительная оценка состава растворимых антимикробных факторов, в том числе и катионных пептидов цервикального и вагинального секретов. Показано, что в цервикальном секрете здоровых женщин содержится значительно большая концентрация антимикробных факторов (оксид азота, лактоферрин, дефенсины, БПИ, миелопероксидаза), чем в вагинальном.

Впервые определено влияние S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. и бактериального комплекса на жизнеспособность, функциональный статус, антимикробную активность и цитокинпродуцирующую функцию нейтрофилов периферической крови здоровых женщин. Показано, что представители нормофлоры (лакто- и бифидобактерии) обладают выраженным апоптогенным действием, в меньшей степени стимулируют внутриклеточные киллинговые системы, не провоцируют выброс провоспалительных цитокинов (ИЛ-1б, ИЛ - 1в, ИЛ-8, ФНО-б, РАИЛ-1 и ИЛ-6), при этом усиливают секрецию бактерицидных белков (БПИ и лактоферрина).

Разработан способ экспресс-обнаружения нейтрофильных ловушек (Долгушин И.И., Андреева Ю.С. Приоритетная справка от 01.04.2008г. Заявка на изобретение № 2008112636/20 (013666)) и способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах (Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Приоритетная справка от 26.01.2009г. Заявка на изобретение № 2009102579)

Впервые показано образование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови после взаимодействия с E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или бактериальной смесью и оценена их эффективность.

Проведен сравнительный анализ бактерицидности секреторных продуктов интактных и активированных нейтрофилов на E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp.

Изучено действие супернатантов интактных и активированных нейтрофилов на состав микробиоценоза и адгезию грибов рода Candida на поверхности вагинального эпителия здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом. Впервые показано, что секреторные продукты нейтрофилов периферической крови обладают селективной бактерицидностью: они снижают в вагинальном секрете содержание условно-патогенных бактерий и не влияют на лактофлору, кроме того, супернатанты нейтрофилов здоровых женщин снижают адгезию грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов, у женщин с бактериальным вагинозом продукты секреции нейтрофилов не обладают антиадгезивной активностью.

Впервые определено, что на поверхности слизистых оболочек нейтрофилы реализуют свой антимикробный потенциал в большей степени за счет внеклеточной секреции компонентов клетки в окружающую среду.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследований позволяют расширить представление о роли нейтрофилов в защите слизистых оболочек.

Полученные данные о содержании антимикробных продуктов и цитокинов в супернатантах неактивированных и активированных нейтрофилов периферической крови, а также продукция нейтрофильных внеклеточных ловушек имеют существенное значение в понимании проблемы регулирующего влияния нейтрофильных гранулоцитов в формировании микробиоценозов слизистых оболочек. Нарушение функционирования нейтрофильного звена на поверхности слизистых оболочек может рассматриваться как один из факторов формирования патологических микробных сообществ и развития дисбактериозов.

Разработка экспресс-метода обнаружения нейтрофильных ловушек открывает возможность оценки антимикробной функции нейтрофилов даже после их гибели, а сам факт наличия внеклеточных нейтрофильных сетей является новым направлением в изучении физиологии гранулоцита.

Селективная бактерицидность и антиадгезивная активность супернатантов нейтрофилов открывают перспективу практического применения секреторных продуктов, а результаты исследований могут стать теоретическим обоснованием для проведения клинических испытаний локального использования продуктов секреции нейтрофилов с целью коррекции дисбиотических процессов нижних отделов генитального тракта женщин, повышения качества лечения больных с бактериальным вагинозом, что в конечном итоге, позволит снизить заболеваемость у женщин, частоту осложнений беременности и родов, а также перинатальную заболеваемость, смертность и будет способствовать улучшению репродуктивного здоровья и рождению здорового потомства.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В цервикальном и вагинальном секретах содержится значительное количество лейкоцитов, среди которых доминирующими являются нейтрофилы, около 50% из них - это погибшие клетки, а остальные жизнеспособные и функционально активные.

2. Контакт нейтрофилов с микроорганизмами приводит к гибели гранулоцитов, при этом лактобактерии и бифидобактерии индуцируют апоптотическую гибель нейтрофилов.

3. Инкубация нейтрофилов in vitro со взвесью бактерий (E. coli - штамм М-17, S. aureus - штамм 209, Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.) сопровождается секрецией гранулоцитами антимикробных продуктов разного состава: резидентные для слизистых микроорганизмы (лактобактерии и бифидобактерии) в сравнении с факультативными (E. coli и S. аureus) в большей степени стимулируют выброс антимикробных продуктов, обладающих селективной бактерицидностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам.

4. Продукты нейтрофилов изменяют состав микробиоценозов слизистых нижнего отдела генитального тракта женщин: они подавляют рост условно-патогенной флоры (гарднерелл, стафилококков, кишечной палочки, протея, дрожжеподобных грибов), препятствуют адгезии грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия и существенно не влияют на содержание лактобактерий.

5. Нейтрофилы могут участвовать в регуляции микробиоценозов и в формировании колонизационной устойчивости слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии, а также используются в практической деятельности лаборатории противоинфекционного иммунитета НИИ иммунологии ГОУ ВПО «Челябинской государственной медицинской академии» и проблемной лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики Южно-Уральского научного центра РАМН.

Издано учебно-методическое пособие «Методы оценки функционального статуса нейтрофилов» для системы послевузовского образования врачей (Челябинск, 2009).

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на IV, V конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005; Оренбург, 2006); IХ - XIII всероссийском форуме с международным участием “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (Санкт-Петербург 2005, 2006, 2007, 2008, 2009); республиканской научной конференции “Иммунология репродукции” (Иваново, 2005); российской научно-практической конференции “Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия” (Курск, 2006); 1 и 2 международном российско-чешском форуме (Челябинск, 2006, 2008); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII конгрессе “Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии” (Москва, 2007); на национальной конференции “Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы” (Москва, 2008); на объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008, 2009); на конференции, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008), на VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Работа была поддержана грантами Правительства Челябинской области в 2007 и 2008 гг.

Публикации

По теме диссертации опубликована 51 научная работа. Издана монография «Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов».

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 265 страницах текста, иллюстрирована 50 таблицами, 33 рисунками, 4 фотографиями, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, семи глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 303 источников, в том числе 179 отечественных и 124 зарубежных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

В качестве объекта изучения были выбраны нейтрофилы периферической крови и секреты слизистых оболочек нижнего отдела генитального тракта женщин, так как в этой анатомической области имеются два абсолютно разных по своему строению и выполняемым функциям отдела: выстланное многослойным плоским эпителием, обильно обсемененное относительно однородной флорой, влагалище и цервикальный канал, просвет которого выполнен цилиндрическим эпителием, а секрет предохраняет стерильную полость матки от проникновения микроорганизмов из влагалища. Кроме того, физиология репродуктивных органов женщины зависит от гормонального статуса и подвержена колебаниям на протяжении менструального цикла, а получение исследуемого материала является неинвазивным и простым в исполнении (Телешева Л.Ф., 2000; Гольцфарб В.М., 2005; Савочкина А.Ю., 2006).

Для решения проблемы за период с 2005 по 2008 год на базе НИИ иммунологии ЧелГМА и ЮУНЦ РАМН было проведено микробиологическое, иммунологическое и биохимическое обследование 170 женщин в возрасте 19-35 лет, из которых 128 женщины были здоровы и 42 женщины имели установленный диагноз - бактериальный вагиноз. Диагноз выставлялся на основании наличия патологических вагинальных выделений, положительного аминного теста, pH влагалищного отделяемого более 4,5 и обнаружения ``ключевых клеток'' при микроскопии отделяемого влагалища (Коршунов В.М., Володин Н.Н. и др., 1999). Исследования проводились как в первую, так и во вторую фазы менструального цикла. У всех пациенток при обследовании были исключены ВИЧ-инфекция, сифилис, трихомониаз, гонорея, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, генитальный герпес и цитомегаловирусная инфекция.

Для проведения исследований нейтрофилы выделяли из периферической венозной крови здоровых женщин репродуктивного возраста на двойном градиенте растворов фиколла-верографина, доводили до концентрации 5х10⁶кл/мл в физиологическом растворе. В качестве индукторов использовали 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных моноштаммов S. aureus («Cowan 209»), Е. coli (штамм М-17) (препарат "Колибактерин", ФГПУ "НПО "Микроген" МЗ РФ, г. Москва), Lactobacterium spp. (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "ИмБио", г. Нижний Новгород), Bifidobacterium spp. (препарат "Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Экополис", г. Ковров), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1мл (по стандарту мутности БАК - 10, ООО "Ормет", г. Екатеринбург) и разведенной в 10 раз, или смеси бактерий, состоящей из 10⁸ КОЕ/мл Lactobacterium spp.+ 10⁶ КОЕ/мл Bifidobacterium spp. + 10² КОЕ/мл S. aureus +10² КОЕ/мл Е. coli на 1 мл взвеси нейтрофилов. Для получения контрольных значений нейтрофилы оставляли без активации или стимулировали частицами латекса (диаметр частиц 1,7 мкм) из расчета 50 частиц на один нейтрофил.

Для оценки жизнеспособности нейтрофилов периферической крови и лейкоцитов секретов нижнего отдела репродуктивной системы женщин, использовали витальный краситель - трипановый синий, при этом погибшие клетки, в связи с нарушением их мембраны, окрашивались в темно-синий цвет (трипанопозитивные), а клетки, сохранившие целостность оболочки (живые и апоптозные), не пропускали краситель и оставались прозрачными (трипанонегативными).

Для количественного учета апоптозных нейтрофилов нами был использован метод флюоресценции с окраской клеточной взвеси этидиум бромидом и акридиновым оранжевым (Gasiorowski K., 2001), а также метод проточной цитофлюориметрии.

Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали по способности поглощать частицы полистирольного латекса (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990). Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов проводили с помощью НСТ-теста (Маянский А.Н., Виксман М.К., 1979). Лизосомальную активность определяли по суммарной люминесценции лизосом (Фрейдлин И.С., 1984).

Для определения уровня лизоцима в биологических жидкостях нами был использован нефелометрический метод, предложенный в 1968 г. Дорофейчук В.Г.

Определение оксида азота проводили по содержанию нитратов и нитритов (Показ. липид. обмена …, 2002). Содержание нитратов определяли в виде нитритов по реакции Грисса, после восстановления их губчатым кадмием (Емченко Н.Л., Цыганенко О.И. и др., 1994).

Количество лактоферрина, дефенсинов, бактерицидного/индуцирующего протеина и провоспалительных цитокинов в тестируемых образцах определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Для определения нейтрофильных ловушек, которые являются по своей сути волокнами ДНК, нами был опробован способ выявления нуклеиновых кислот по способу Фельгена (Меркулов Г.А., 1956). Реакцию ставили с использованием клеточной взвеси нейтрофилов периферической крови, выделенных на градиентных растворах фиколла-верографина и активированных E. coli (штамм М-17), S. aureus «Cowan 209», Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp., затем взвесь наносили на стекло, высушивали и фиксировали 96% этиловым спиртом. Однако данная реакция требовала дополнительной фиксации клеток на стекле по методу Лилли в 10% забуференном формалине. Для приготовления реактивов были задействованы агрессивные среды (соляная кислота, фуксинсернистая кислота, сернистая вода), готовые реагенты нуждались в специальных условиях хранения. Кроме того, постановка реакции проходила в 2 этапа и занимала около 2-2,5 часов. При соблюдении всех технических условий ядерное вещество окрашивалось в красно-фиолетовый цвет. Учет реакции проводили с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении 100х10х1,5. Однако даже при соблюдении всех требований выполнения данной реакции учет представлял определенные сложности: при световой микроскопии не всегда удавалось рассмотреть тонкие внеклеточно расположенные волокна ДНК активированных нейтрофилов и, кроме того, не определялись бактерии-активаторы.

Учитывая, что акридиновый оранжевый окрашивает ядра нейтрофилов в зеленый цвет, нами был использован данный краситель с целью определения внеклеточно расположенных волокон нейтрофильных ДНК. Такой способ окраски обладал следующими существенными отличительными признаками:

- для окраски использовался всего лишь один реактив (акридиновый оранжевый);

- учет проводился с помощью люминесцентной микроскопии, позволяющей четко различать окрашиваемые структуры;

- такой способ окраски позволял не только качественно, но и количественно охарактеризовать данное явление.

Определение образования нейтрофильных ловушек осуществляли следующим образом:

1) Взвесь нейтрофилов получали используя 15,0 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина фирмы “Гедеон-Рихтер”, Hungery) периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивали в стерильной пробирке при температуре + 37⁰С в течение 30 минут. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равнялся 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 оборотов в минуту на границе между градиентами появлялось кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 10 минут и доводили до концентрации 5•10⁶ клеток/мл.

2) Полученную взвесь клеток инкубировали при температуре +37⁰С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных штаммов (S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17) (препарат “Колибактерин”, ФГПУ “НПО “Микроген” МЗ РФ, г. Москва), Lactobacterium spp. (препарат “Лактобактерин сухой”, фирма “ИмБио”, г. Нижний Новгород), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1мл (по стандарту мутности БАК - 10, ООО “Ормет”, г. Екатеринбург) и разведенной в 10 раз, или смеси бактерий содержащей 10⁸ КОЕ/мл Lactobacterium spp., 10⁶ КОЕ/мл Bifidobacterium spp., 10³ КОЕ/мл S. aureus, 10³ КОЕ/мл E. coli в 1 мл на 1 мл взвеси нейтрофилов. Для контроля использовали взвесь нейтрофилов, инкубируемых в тех же условиях, но без активаторов.

3) Для окрашивания нейтрофильных ловушек использовали 200 мкл рабочего раствора акридинового оранжевого (концентрация 2мкг/мл).

4) Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа, увеличение 100х10х1,5, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм.

В результате применения данного способа сегментированные ядра нейтрофилов окрашивались в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивалась, клетки, имеющие недифференцированное ядро, были представлены структурами зеленого цвета, у которых невозможно было различить ядро и цитоплазму, нейтрофильные ловушки были представлены в виде тонких ярко-зеленых нитей, занимающими пространство в 2-3 раза превосходящее диаметр нейтрофила, а бактерии-активаторы имели ярко-оранжевый цвет.

Такой способ окраски позволил провести количественную оценку образования ловушек, так как была хорошо различима морфология нейтрофилов. Именно по этому признаку все визуализируемые структуры нами были разделены на 3 группы: 1 группа объединяла клетки с сегментированным ядром, 2 группа включала клетки с недифференцированным ядром, и к 3 группе отнесли свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки). Нами проводился подсчет 100 структур разных групп, и определялось процентное содержание каждой морфологической единицы.

Предлагаемый способ окраски позволил оценить эффективность фагоцитоза и нейтрофильной внеклеточной ловушки. Для этого рассчитывали следующие показатели:

1. Активность фагоцитоза - число нейтрофилов с сегментированным ядром, содержащих бактериальные клетки в цитоплазме, на 100 подсчитанных клеток.

2. Интенсивность фагоцитоза - число бактерий в 100 подсчитанных клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку.

3. Число нейтрофильных ловушек - количество нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки на 100 подсчитанных структур.

4. Индекс нейтрофильной ловушки - число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 клетку.

Бактерицидную активность секреторных продуктов нейтрофилов изучали по отношению к этим же штаммам микроорганизмов, используя фотонефелометрический метод О. В. Смирновой и Т. А. Кузьминой (Иммунол. методы ... , 1981).

Для оценки содержания микроорганизмов в секретах генитального тракта здоровых женщин исследуемый материал забирали из цервикального канала и заднего свода влагалища на 7-10 и 21-23 дни менструального цикла и подвергали бактериологическому исследованию.

Для определения влияния нейтрофилов и их секреторных продуктов на микробиоценоз здоровых женщин в день проведения исследований у пациентки забирали 0,1 мл вагинального содержимого в пробирку с 0,9 мл изотонического раствора хлорида натрия и 15 мл крови из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом. Выделение чистой взвеси нейтрофилов проводили на двойном градиенте растворов фиколла-верографина. Выделенные клетки доводили до концентрации 5х10⁶ кл/мл и использовали для опыта. Секреторные продукты неактивированных нейтрофилов получали после инкубации клеток (концентрация 5х10⁶ кл/мл) при температуре + 37⁰С в течение 30 минут без индукторов секреции. После этого клетки центрифугировали 20 мин при 3Ч10³ об/мин, полученный супернатант фильтровали через мембранные фильтры и сразу использовали для тестирования. Секреторные продукты активированных нейтрофилов получали после инкубации клеток (концентрации 5х10⁶ кл/мл) в тех же условиях, но в присутствии вагинального содержимого. После центрифугирования при 3Ч10³ об/мин, полученный супернатант пропускали через мембранные фильтры и сразу использовали для исследования.

Для регистрации возможного влияния нейтрофилов и их секреторных продуктов на микрофлору влагалища применяли классический метод определения бактерицидной активности (Иммунол. методы … , 1981). С этой целью 0,9 мл каждого тестируемого образца соединяли с 0,1 мл вагинального содержимого. Для контроля использовали 0,9 мл физиологического раствора. Смесь инкубировали в течение 30 мин при температуре +37⁰С. После инкубации из контрольной и опытных пробирок проводили высев количественным методом на 5% кровяной, желточно-солевой агар, на тиогликолиевую среду, среду MRS и Сабуро. Через 48 часов инкубации в эксикаторе со свечой изучали рост микроорганизмов, определяли степень обсеменения вагинальной слизи, выделяли чистые культуры и проводили их идентификацию. Бактерицидный эффект определяли по разнице числа колоний, выросших в контроле и в опыте.

Для изучения влияния секреторных продуктов нейтрофилов на адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов здоровых женщин в день исследования забирали вагинальный эпителий с боковых стенок влагалища стерильной ложкой Фолькмана и помещали в пробирку с 5 мл раствора Хенкса без фенолового красного, дважды отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2-7,4) в течение 5 минут при 1500 об/мин и готовили взвесь с концентрацией 10⁶ кл/мл (подсчёт клеток осуществляли в камере Горяева).

С. albicans штамм 601 (1х10⁷ клеток/мл) и супернатанты интактных и активированных контрольными штаммами S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. нейтрофилов смешивали в равных объемах (по 0,5 мл) и инкубировали 30 мин при температуре +37°С, встряхивая каждые 5 мин. После инкубации кандиды отмывали десятикратным объемом ЗФР и использовали для изучения адгезивных реакций на поверхности вагинальных эпителиоцитов. Контролем служил ЗФР. Результаты оценивали по трём показателям:

1. Активность адгезии (АА) - количество вагинальных эпителиоцитов с адгезированными кандидами из 100 посчитанных эпителиоцитов, %

2. Интенсивность адгезии (ИА) - количество кандид, адгезированных на 100 вагинальных эпителиоцитах, усл. ед.

3. Адгезивное число (АЧ) - количество адгезированных кандид на одной эпителиальной клетке, усл. ед.

Результаты исследования и их обсуждение

Для понимания вопросов участия нейтрофилов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек, нами решено было сначала определить состояние факторов врожденного иммунитета нижних отделов репродуктивной системы здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.

Учитывая, что основными клетками изучаемых секретов являются лейкоциты (Телешева Л.Ф., 2000), нами было подробно охарактеризовано состояние лейкоцитарного звена, изучено общее содержание, жизнеспособность, морфология и функциональная активность лейкоцитов нижних отделов репродуктивной системы здоровых женщин.

В результате проведенных исследований определили, что на поверхности слизистых оболочек нижних отделов репродуктивного тракта здоровых женщин находится большое количество лейкоцитов (рисунок 1).

Хотя, в цервикальном и вагинальном секретах встречались эозинофилы, макрофаги, базофилы и лимфоциты, доминирующими клетками как цервикального, так и вагинального секретов являлись нейтрофилы.

В цервикальном и вагинальном секретах процентное содержание трипанопозитивных (нежизнеспособных) клеток составило 25% и 31% соответственно.

Рис 1. Количество лейкоцитов в секретах нижних отделов репродуктивного тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла, n=21

На протяжении менструального цикла в цервикальном секрете содержание апоптозных клеток оставалось стабильным и составляло около 27% от общего числа нейтрофилов. В вагинальной слизи содержание апоптозных нейтрофилов в первую фазу менструального цикла было сопоставимо с аналогичным показателем цервикального секрета, во вторую фазу вагинальный секрет содержал значительно меньше нейтрофилов, подвергшихся естественной гибели (16%).

При изучении функциональной активности нейтрофилов установлено, что нейтрофилы секретов нижнего отдела генитального тракта фагоцитируют частицы латекса, обладают активным лизосомальным аппаратом и способны к кислородзависимому метаболизму, причем у нейтрофилов цервикального секрета все эти функции проявляются значительно сильнее, чем у гранулоцитов влагалища. Циклические изменения в организме здоровой женщины на оказывают значимого влияния на функциональную активность нейтрофилов цервикального и вагинального секретов.

Помимо клеток, нами были охарактеризованы гуморальные механизмы врожденного иммунитета мукозальных секретов генитального тракта здоровых женщин: определено содержание лизоцима, оксида азота, лактоферрина, дефенсинов, БПИ, активность миелопероксидазы (таблица 1).

Таблица 1. Содержание растворимых антимикробных факторов в секретах репродуктивного тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла

Антимикробный фактор	Цервикальный секрет	Вагинальная слизь
	Фаза менструального цикла	Фаза менструального цикла
	1 фаза	2 фаза	1 фаза	2 фаз
Нитраты и нитриты, мкмоль/л	96,93±10,32*	96,93±10,32*	44,94±7,31	30,40±3,11
Лизоцим, мкг/л	30,54±6,32	28,85±6,94	21,05±5,04	24,60±7,69
Активность миелопероксидазы, мкат/л	3,57±0,27*	3,96±0,27*	1,25±0,10	1,58±0,14
Дефенсины, нг/мл	194,20±26,58*	148,0±32,75*	56,27±8,87	50,7±11,15
БПИ, нг/мл	292,8±73,39*	142,30±35,64*	56,89±16,00	27,54±7,08
Лактоферрин, нг/мл	157,20±29,16*	84,51±24,16*	53,06±8,59	40,51±10,57

Примечание: - достоверное различие между показателями цервикальной и вагинальной слизи в идентичные фазы менструального цикла

У здоровых женщин репродуктивного возраста уровень лизоцима в цервикальной и в вагинальной слизи значимым образом не отличался и оставался стабильным на протяжении всего менструального цикла.

Достоверно более высокий суммарный уровень нитратов и нитритов обнаружился в цервикальном секрете и сохранялся на протяжении всего менструального цикла, превышая аналогичные показатели вагинальной слизи в 2-2,5 раза.

Результаты исследований показали, что шеечный секрет содержит значительно больше лактоферрина, дефенсинов и бактерициднного/индуцирующего протеина, чем вагинальный.

Показатели активности миелопероксидазы цервикальной слизи в 2-2,5 раза превосходили такие же показатели вагинального содержимого. На протяжении менструального цикла изучаемые параметры оставались стабильными.

Таким образом, на поверхности слизистых оболочек канала шейки матки и влагалища имеется богатый арсенал клеточных (в основном это нейтрофилы) и гуморальных микробоцидных факторов, большинство из которых может секретироваться нейтрофилами, обеспечивающих постоянную защиту репродуктивных органов женщины от проникновения чужеродных агентов. В цервикальном канале концентрация этих факторов значительно выше, что делает секрет шейки матки основным барьером на пути восходящей инфекции. Полученные нами данные не только не противоречат ранее проведенным исследованиям (Телешева Л.Ф., 2000, Гольцфарб В.М., 2005, Савочкина А.Ю., 2006), а еще раз с привлечением дополнительных методов демонстрируют важную роль врожденного иммунитета, в том числе и нейтрофилов, в защите слизистых оболочек.

Для исследования механизмов участия нейтрофилов в антимикробных реакциях в мукозальном иммунитете нами было in vitro изучено влияние отдельных представителей флоры генитального тракта женщин на функциональную, секреторную активность и жизнеспособность нейтрофилов.

Проведенные исследования позволили установить, что нейтрофилы способны активно фагоцитировать частицы латекса, кишечную палочку, золотистый стафилококк, лактобактерии и в меньшей степени бифидобактерии. E. сoli, S. aureus и бактериальная смесь значительно стимулировали кислородзависимый метаболизм и лизосомальную активность нейтрофилов. Подобный эффект отмечен и в работах Белоцкого С.М., Филюковой О.Б. (1986) и Мазурова Д.В., Дамбаевой С.В. (2000). Эти данные показали, что внутриклеточные киллинговые системы нейтрофилов в большей степени активируются E. coli и S. aureus, чем Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

Таблица 2. Показатели уровня бактерицидных факторов в супернатантах активированных и неактивированных нейтрофилов периферической крови здоровых женщин (n=20)

Показатели	Супернатант нейтрофилов
	СНН	САНlat	САНE	САНS	САНL	САНB	САсмесь бактерий
Лизоцим, мкг/мл	0,7±0,08	2,46±0,09*	0,69±0,08	0,65±0,12	0,65±0,07	0,55±0,05	0,62±0,03-
Нитраты и нитриты, мкМоль/л	19,42±1,57	17,21±0,88	19.69±1,75	19,69±1,75	19,40±1,84	18,53±1,65	20,62±1,68
Пероксидаза, мкат/л	1,08±0,14	1,29±0,15-	0,90±0,14	0,89±0,15	1,13±0,17	1,13±0,13	1,22±0,18
Дефенсины, нг/мл	3,24±0,42	-	2,55±0,53	2,29±0,43	2,15±0,33	2,46±0,58	-
БПИ, нг/мл	0,79±0,22	-	1,12±0,28	1,44±0,32	2,65±1,01	3,20±0,95*	-
Лактоферрин, нг/мл	30,23±4,97	449,5±87,99*	31,62±6,12	52,22±11,52	40,84±4,92	52,69±10,03*	116,50±14,25*

Примечание:

* - достоверность различий показателей по отношению к СНН;

СНН - супернатант неактивированных нейтрофилов;

САНlat - супернатант нейтрофилов, активированных латексом;

САНS - супернатант нейтрофилов, активированных S. aureus (штамм 209);

САНЕ - супернатант нейтрофилов, активированных E. coli (штамм М-17);

САНL - супернатант нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp.;

САНВ - супернатант нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp;

САН смесь бактерий - супернатант нейтрофилов, активированных смесью бактерий.

Учитывая, что микробоцидная функция нейтрофилов заключается не только в поглощении и внутриклеточной переработке захваченного материала, но и в секреции антимикробных факторов за пределы клетки, нами решено было изучить спектр бактерицидных факторов, таких как лизоцим, оксид азота, миелопероксидаза, лактоферрин, дефенсины, БПИ в супернатантах нейтрофилов (таблица 2).

После стимуляции гранулоцитов частицами латекса, повышался уровень лизоцима и лактоферрина. После взаимодействия нейтрофилов с E. coli (штамм М-17) и S. aureus (штамм 209) все изучаемые показатели оставались на прежних значениях. При действии лакто- и бифидобактерий повышалось содержание БПИ и лактоферрина.

Таким образом, в ответ на стимуляцию как микробными, так и немикробными агентами, нейтрофил секретирует в окружающую среду широкий спектр антимикробных факторов с разным механизмом действия. Часть этих компонентов, обладающих преимущественно прямым бактерицидным эффектом, расходуется на утилизацию бактерии-активатора, в то же время факторы непрямого (лактоферрин) и внутриклеточного (БПИ) действия определяются в больших количествах в супернатантах нейтрофилов, активированных резидентными для слизистых микроорганизмами (лакто- и бифидобактериями), но не E. сoli, S. аureus или латексом.

После оценки состава микробоцидных продуктов представляло интерес изучение содержания цитокинов в супернатантах неактивированных и активированных латексом и взвесью различных микроорганизмов нейтрофилов периферической крови. Учитывая, что нейтрофилы являются основными клетками-эффекторами воспалительной защитной реакции организма человека, нами решено было изучить цитокиновый профиль провоспалительных цитокинов (ИЛ-1б, ИЛ - 1в, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-б) и антивоспалительного медиатора (РАИЛ-1) (таблица 3).

Таблица 3. Показатели уровня цитокинов в супернатантах активированных и неактивированных нейтрофилов периферической крови здоровых женщин (n=20)

Показатели	Супернатант нейтрофилов
	СНН	САНlat	САНE	САНS	САНL	САНB	САсмесь бактерий
	1	2	3	4	5	6	7
ИЛ - 1б, пг/мл	44,17±6,73	62,27±13,60	55,49±5,26	56,82±6,55	45,79±7,22	44,24±6,97	57,64±12,18
ИЛ - 1в, пг/мл	24,07±5,41	10,83±2,27	32,0±5,46	23,56±4,66	25,00±5,99	21,01±4,15	11,83±3,88
РАИЛ - 1, пг/мл	166,50 ±32,82	25,15±3,94 *	1061,00±141,3*	344,10±145,10	124,90±29,23	182,20±43,57	17,78±2,69*
ИЛ - 6, пг/мл	1,92±0,29	1,62±0,17	2,37±0,43	2,49±0,44	2,12±0,26	1,90±0,23	1,91±0,20
ИЛ - 8, пг/мл	38,31±7,67	25,52±4,93	48,49±11,66	55,21±13,10	38,52±6,93	46,48±7,05	31,85±5,77
ФНОб, пг/мл	2,21±0,19	3,12±0,15 *	2,06±0,17	2,76±0,26	2,07±0,22	2,07±0,15	2,00±0,29

Примечание: * - достоверность различий показателей по отношению к СНН;

СНН - супернатант неактивированных нейтрофилов;

САНlat - супернатант нейтрофилов, активированных латексом;

САНS - супернатант нейтрофилов, активированных S. aureus (штамм 209);

САНЕ - супернатант нейтрофилов, активированных E. coli (штамм М-17);

САНL - супернатант нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp.;

САНВ - супернатант нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp.

САсмесь бактерий - супернатант нейтрофилов, активированных смесью бактерий

В результате проведенных исследований обнаружили, что после 30 минутной инкубации без индукторов в супернатантах находились все искомые медиаторы. Хотя их концентрация была невысокой (пг/мл), исключение составил РАИЛ-1.

В ответ на действие частиц латекса, в продуктах секреции нейтрофилов значительно уменьшалось содержание РАИЛ-1 и повышалось количество ФНОб. При действии кишечной палочки в супернатантах нейтрофилов регистрировался повышенный уровень РАИЛ-1. Лакто- и бифидобактерии не вызывали изменения содержания изучаемых цитокинов.

Для оценки влияния монокультур E. coli, S. aureus, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. и смеси перечисленных бактерий на жизнеспособность нейтрофилов периферической крови нами использовался витальный метод окраски трипановым синим.

В процессе выделения нейтрофилов из периферической крови 43% клеток теряли свою жизнеспособность, действие монокультур микробных агентов усиливало гибель клеток.

Апоптогенное действие E. coli, S. aureus, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. на нейтрофилы регистрировалось методом проточной цитометрии. После 30 минутной инкубации нейтрофилов периферической крови в присутствии кишечной палочки, золотистого стафилококка или бактериальной смеси процент апоптозных клеток не изменялся, лакто- и бифидобактерии значительно повышали уровень клеток, подвергшихся естественной гибели.

В последние годы показано, что даже после гибели нейтрофилы могут выполнять атимикробную функцию за счет образования внеклеточных ловушек (Neutrophil Extracellular Traps, NETs, НВЛ). В ответ на микробные и немикробные стимулы нейтрофилы активно формируют во внеклеточном пространстве сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов (Fuches T. A., Abed U. et al., 2007).

Используемый нами способ позволил разделить нейтрофилы в зависимости от морфологии на следующие группы: нейтрофилы с сегментированным ядром, с недифференцированным ядром и свободнолежащие нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки).

Данным способом было окрашено 70 фиксированных препаратов, из которых 10 содержали взвесь нейтрофилов без активаторов (контроль), и 6 групп по 10 мазков были приготовлены из взвеси нейтрофилов, активированных частицами латекса, E. coli, S. aureus, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или смесью бактерий соответственно.

В результате проведенных исследований обнаружили, что при действии в течение 30 минут монокультур кишечной палочки, золотистого стафилококка, лакто- и бифидобактерий содержание нейтрофилов с сегментированным ядром снижается, а количество нейтрофильных ловушек возрастает. При этом максимальные изменения этих показателей наблюдаются при действии бифидобактерий (таблица 4).

Таблица 4. Содержание различных морфологических форм нейтрофилов периферической крови здоровых женщин после взаимодействия с частицами латекса, E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. и смесью бактерий (n=10),%

Показатели	Нейтрофилы
	НН	АНlat	АНE	АНS	АНL	АНB	АН смесью бактерий
	1	2	3	4	5	6	7
Содержание нейтрофилов с неизмененным ядром, %	59,89±6,19	56,56±5,03	32,40±5,38*	40,70±2,21*	28,40±4,81*	24,00±4,94*	56,33±6,59
Содержание нейтрофилов с недифференцированным ядром, %	24,11±3,47	19,56±3,26	31,30±2,31*	32,9±4,72	37,10±3,83*	21,11±2,56	15,33±1,63
Содержание NET,%	16,0±4,22	23,69±4,15	36,30±3,89*	30,00±2,73*	34,50±4,50*	54,89±4,69 *	28,33±5,15 *

Примечание: * - достоверность различий показателей по отношению к НН;

НН -неактивированные нейтрофилы;

АНlat - нейтрофилы, активированные латексом;

АНS нейтрофилы, активированные S. aureus (штамм 209);

АНЕ - нейтрофилы, активированные E. coli (штамм М-17);

АНL - нейтрофилы, активированные Lactobacterium spp.;

АНВ - нейтрофилы, активированные Bifidobacterium spp;

АН смесью бактерий - нейтрофилы, активированные смесью бактерий.

Сравнивая фагоцитарную активность неизмененных нейтрофилов и эффективность улавливания бактерий в нейтрофильных ловушках, определили, что внеклеточно расположенные сети нейтрофила, способны задержать в 2-3 раза больше как микробных, так и немикробных агентов (таблица 5).

Таким образом, нами установлено, что после 30 минутного взаимодействия с микробными и немикробными агентами in vitro нейтрофилы образуют внеклеточные сетеподобные структуры, хорошо визуализируемые при окраске фиксированных препаратов акридиновым оранжевым. Они способны эффективнее, чем живая клетка улавливать и частицы латекса, и любые бактерии. При этом представители нормофлоры активно стимулируют производство ловушек.

Таблица 5. Количество фагоцитированных частиц латекса, E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или обнаруживаемых в нейтрофильных ловушках (n=10)

Показатели	Нейтрофилы
	Частицы латекса	E. coli	S. aureus	Lacto bacterium spp.	Bifido bacterium spp.	Cмесь бактерий
	2	3	4	5	6	7
Интенсивность фагоцитоза на 1 клетку, усл.ед	7,53±0,62	2,59±0,56*	8,49±1,08*	1,22±0,40	5,15±0,91*	0,36±0,05*
Содержание активаторов в NETах на 1 структуру, усл.ед	10,12±1,41	5,91±0,50*	11,52±1,18*	2,56±0,56	9,65±1,85*	0,93±0,21*

Примечание: * - достоверность различий интенсивности фагоцитоза микроорганизмов и содержания бактерий в нейтрофильных ловушках

Кроме того, важно отметить, что агрессивные факторы гранул нейтрофила, секретируемые во внеклеточное пространство, связаны нитями ДНК нейтрофильной ловушки (Fuches T. A., Abed U. et al., 2007). При этом они не способны вызвать развитие воспалительных изменений в тканях и оказать повреждающее действие на клетки слизистых оболочек при их колонизации представителями нормофлоры. Таким образом, нейтрофильные внеклеточные ловушки могут быть одним из основных и эффективных факторов антимикробной защиты слизистых оболочек.

После определения влияния микроорганизмов на жизнеспособность и функциональный ответ нейтрофилов, нами решено было оценить суммарный бактерицидный эффект продуктов секреции нейтрофилов периферической крови в отношении контрольных штаммов S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

Результаты исследований показали, что продукты секреции интактных нейтрофилов обладают широким спектром антимикробного действия (рисунок 2).

Рис. 2. Бактерицидный эффект секреторных продуктов неактивированных нейтрофилов на S. aureus (штамм 209), E. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

Это объясняется высоким содержанием различных биологически активных продуктов в клетке, в том числе и токсичных, которые образуются в процессе созревания нейтрофила и накапливаются в гранулах (Borregaard N., Cowland J., 1997). При дегрануляции содержимое гранул выливается в околоклеточное пространство, что и обуславливает бактерицидность супернатантов нейтрофилов (Алексеев Н.А., 2002).

После первичного взаимодействия с E. coli, S. aureus и Bifidobacterium spp., нейтрофил либо теряет, либо сохраняет на прежнем уровне бактерицидные свойства своих секреторных продуктов. Такая избирательная потеря бактерицидности, по-видимому, связана с тем, что антимикробные пептиды и ферменты лизосом обладают определенной специфичностью своего действия на различные группы микроорганизмов, и предварительная инкубация нейтрофилов с этими штаммами сопровождается расходованием (истощением) бактерицидных продуктов в супернатантах. При повторном контакте с лактобактериями происходит усиление антибактериальной активности секреторных продуктов нейтрофилов периферической крови здоровых женщин.

Для определения влияния нейтрофилов на микробиоценоз слизистых оболочек, нами решено было оценить влияние чистой взвеси нейтрофилов и супернатантов интактных и активированных вагинальным секретом нейтрофилов на состав микрофлоры и адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом.

Для решения этой задачи, прежде всего, было изучено исходное состояние флоры нижних отделов генитального тракта женщин в разные фазы менструального цикла. У здоровых женщин в первую фазу менструального цикла из цервикального канала в основном высевались лактобактерии, в 10% случаев встречались коагулазонегативные стафилококки и в единичных случаях дрожжеподобные грибы рода Candida и представители семейства Enterobacteriaceae, что совпадало и с литературными данными (Костюк О.П., Чернышова Л. И. и др., 1998; Коршунов В.М., Володин Н.Н. и др., 1999; Воробьев А.А., Лыкова Е.А., 1999; Анкирская А.С., Муравьева В.В., 2000; Кира Е.Ф., 2001; Валышев А.В., Елагина Н.Н. и др., 2001; Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002; Кудрявцева Л.В., Ильина Е.Н. и др., 2003; Sautter R. L., Brown W.J., 1980). Во вторую фазу менструального цикла в цервикальном канале чаще обнаруживались представители факультативной флоры: стафилококки, дрожжеподобные грибы, E. сoli, Enterobacter spp. и Enterococcus spp.

В секрете заднего свода влагалища основными представителями флоры также были определены лактобактерии, содержание которых значительно превосходило количество этих микроорганизмов в цервикальном канале. Состав факультативной флоры влагалища не отличался от микробного пейзажа цервикального канала. На протяжении менструального цикла микрофлора влагалища претерпевала такие же изменения, как и флора цервикального канала.

При оценке влияния нейтрофилов и их секреторных продуктов на микробиоценоз и адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов, определили, что у здоровых женщин содержание лактобактерий в пробе под действием нейтрофилов и их секреторных продуктов существенного не менялось. Нейтрофилы значимо снижали содержание коагулазонегативных стафилококков в вагинальной слизи. Секреторные продукты интактных нейтрофилов, а также нейтрофилов, активированных лактобактериями или S. aureus, при воздействии на C. albicans снижали адгезивную активность грибов, тем самым, препятствуя колонизации вагинального эпителия (таблица 6). Результаты наших исследований совпадали с результатами Свиридова М.А. (2007).

Таблица 6. Влияние супернатантов нейтрофилов на адгезивную способность Candida albicans к вагинальным эпителиоцитам здоровых женщин (M ± m)

Показатели	Кандида
	Без воздействия (контроль) n=23	Предварительно обработанные СНН n=23	Предварительно обработанные САНL n=13	Предварительно обработанные САНВ n=7	Предварительно обработанные САНS n=10	Предварительно обработанные САНЕ n=13
Активность адгезии, %	59,91±2,12	49,13±3,09*	53,54±2,04*	67,14±2,09	51,00±3,18*	59,92±2,64
Интенсивность адгезии, усл. ед.	125,57±7,53	95,57±8,26*	99,77±5,53*	205,00±23,04*	96,40±7,58*	140,08±11,59
Адгезивное число, усл. ед.	2,06±0,07	1,89±0,07*	1,86±0,06*	3,04±0,30	1,87±0,06	2,30±0,12

Примечание: * - достоверность различий показателей по отношению к контрольным значениям;

СНН - супернатант неактивированных нейтрофилов;

САНS - супернатант нейтрофилов, активированных S. aureus (штамм 209);

САНЕ - супернатант нейтрофилов, активированных E. coli (штамм М-17);

САНL - супернатант нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp.;

САНВ - супернатант нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp.

Нами была исследована бактерицидная и антиадгезивная активность нейтрофилов периферической крови и их секреторных продуктов в отношении представителей влагалищной флоры женщин с бактериальным вагинозом. Данное заболевание представляло наибольший интерес, так как при бактериальном вагинозе наблюдаются значительные нарушения микробиоценоза влагалища, характеризующиеся снижением удельного веса лактобактерий и повышением уровня условно-патогенных микроорганизмов (Муравьева В.В., Анкирская А.С., 1996; Wilks M., Thin R.N. et al., 1984; Harnmann R., Kronibus A. et al., 1987). Кроме этого, одним из проявлений такого состояния является нормальное содержание лейкоцитов в вагинальной слизи (Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002) и практически полное отсутствие классической воспалительной реакции.

Установлено, что у женщин с бактериальным вагинозом из влагалища выделяется более широкий спектр микроорганизмов, чем у здоровых женщин. Наряду с лактобактериями, которые определялись в более низких титрах, из влагалища в 78% случаев высевали гарднереллы, в 30% случаев встречались коагулазонегативные стафилококки и в единичных случаях - дрожжеподобные грибы, бифидобактерии, E. сoli и протей, что совпадало с данными литературы (Коршунов В.М., Володин Н.Н. и др., 1999; Кира Е.Ф., 2001; Кудрявцева Л.В., Ильина Е.Н. и др., 2003).