Иммуноморфологическое обоснование патогенетического применения эксимерного лазера при гнездной алопеции

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Иммуноморфологическое обоснование патогенетического применения эксимерного лазера при гнездной алопеции

Верхогляд Ирина Викторовна

14.01.10. - Кожные и венерические болезни

Москва - 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова и в клинике «Президентмед» г. Москвы.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Олисова Ольга Юрьевна.

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Суколин Геннадий Иванович

Доктор медицинских наук, профессор Перламутров Юрий Николаевич

Доктор медицинских наук, профессор Молочков Антон Владимирович

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится на заседании диссертационного Совета Д.208.040.10 при ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова Росздрава по адресу:119991, Москва, ул. М. Трубецкая, 8 стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан: 2010 год.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.10 доктор медицинских наук, профессор Эрдес Светлана Ильинична.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Гнездная алопеция (ГА) -- хроническое воспалительное заболевание, затрагивающее волосяные фолликулы и проявляется в виде круговидного, нерубцового выпадения волос на волосистой части головы, лице и других участках кожного покрова. Несмотря на то, что первые упоминания относятся к первому десятилетию нашей эры, некоторые ученые по-прежнему считают эту болезнь загадкой (Tobin D., 2003). Заболевание может начаться в любом возрасте. Встречается одинаково часто как у мужчин, так и у женщин; предпочтительного распределения по расовому признаку не наблюдается. По данным литературы частота встречаемости ГА среди дерматологических больных составляет от 1-2% до 8-12% (Кулагин В.И., 1992; Романенко Г.Ф., Рождественская О.С.,1999; McDonagh A., Messenger A., 2001). Чаще страдают лица молодого возраста: 60% всех больных отмечают манифестацию заболевания в возрасте примерно 20 лет (Price V.Н., 1991; Camacho F., 1997). Примерно у 5-10% пациентов с мелкоочаговой ГА развивается полная потеря волос на коже головы (тотальная форма), а в 1-2% случаев -- полное выпадение волос на голове и на торсе (универсальная форма) (Фомкина И.Г., 1997).

Этиология заболевания неизвестна. Большинство авторов считают природу ГА аутоиммунной. Многие критерии свидетельствуют об аутоиммунном характере ГА: случаи сочетания ГА с другими аутоиммунными болезнями (витилиго, тиреоидит Хашимото, миастения, диабет, красная волчанка, болезнь Аддисона и т.д.), увеличенное количество антител, специфических к антигенам волос, увеличение пигментированных волосяных фолликулов, высокие уровни антител ко многим структурам фолликулов стадии анагена, появление антигенпредставляющих клеток Лангерганса внутри и около луковицы, повышение отношения хелперов к супрессорам (СД4+/СД8+), активация эндотелиальных клеток, экспрессия молекул адгезии, аномальная экспрессия на мембранах эпителиоцитов волосяных фолликулов антигенов I и II класса главного комплекса гистосовместимости, отложения в нижней части волосяного фолликула иммунных комплексов IgM, IgG и С3 компонента комплемента, а также возникновение ГА у экспериментальных мышей с тяжелым иммунодефицитом при введении им Т-лимфоцитов, культивированных с фолликулярными гомогенатами, подтверждают мысль об аутоиммунной природе заболевания (Суворова К.Н. и соавт., 2004; Cerio R., 1997; Shapiro J., 2002).

Точная причина развития заболевания остается неизвестной, вместе с тем, генетические и иммунологические факторы обсуждаются как центральные в развитии ГА. Известно, что на ранней стадии развития ГА повреждение детерминируется тучными клетками и макрофагами, затем появляются лимфоциты Th-1, Th-2, а в хронической стадии преобладает реакция Th-1-лимфоцитов, которые формируют воспалительные инфильтраты вокруг волосяных фолликулов (Tobin D.J., Orentreich N., 1994). Другие авторы считают, Т-клетки инфильтрата вступают во взаимодействие с перифолликулярными или фолликулярными антигенпрезентующими клетками, в результате чего продуцируется ИФН-г, который лишает клетки кожного сосочка способности поддерживать анагенный рост волос (Colombe B.W., Lou C.D., 1999). Известно, что ИФН-г индуцирует антигены HLA-DR на кератиноцитах, экспрессия которых определяется на эпителиальных клетках фолликулов, что подтверждает участие иммунной системы в патогенезе ГА (So A., 1994).

Считают, что цитокины играют важную роль в развитии ГА, однако данные по цитокиновому профилю пациентов ГА противоречивы. Одни авторы говорят о том, что тяжелые формы ГА (тотальная и универсальная) имеют Th1 профиль (-ИНФ, ИЛ-2), а легкие и средние формы - Th2 профиль (ИЛ-4, ИЛ-10) (Hoffmann R. et al., 1996; Nelville L.F. et al., 1997). В то же время при более поздних исследованиях достоверных различий между Th1 и Th2 цитокиновым профилем у больных легкими и тяжелыми формами ГА выявлено не было (Barahmani N. et al., 2005). В другом исследовании при изучении цитокинового статуса 120 больных было выявлено достоверное повышение уровня -ИНФ, особенно в прогрессирующей стадии заболевания, и тенденцию к повышению ИЛ-4 в стационарной стадии (Диденко И.В., 2006).

Billigham R.E. высказывал предположение, что важную роль в патогенезе ГА играют трансформирующий фактор роста-бетта (ТФР-) и ИЛ-10, участвуя в поддержании иммунной привилегированности в зоне, окружающей волосяной фолликул, для изолирования от антигенов, образующихся при меланогенезе или других связанных с анагеном процессах. Вместе с тем, Arakawa S и Hatano Y. (2007) при исследовании уровня ИЛ-10 в периферической крови больных ГА не нашли различий между уровнем этого цитокина у больных и здоровых детей. Костина С.В. с соавт. (2009) также не выявили достоверных отличий от группы контроля в уровне ТФР-1 и ИЛ-10 у детей ГА, но отмечали высокое содержание в сыворотке крови ФНО-, причем уровень его прямо пропорционально зависел от тяжести процесса.

Лечение ГА также представляет большие трудности. Достаточно изученные иммуносупрессивные средства, включающие глюкокортикоиды, циклоспорин, ПУВА и контактные ирританты, большинство авторов относят в основную патогенетическую группу наиболее мощных терапевтических воздействий при ГА. Их терапевтическая эффективность отмечается как отечественными, так и иностранными учеными (Адаскевич В.П. и соавт., 2000; Короткий Н.Г. с соавт., 2001; Тихоновская И.В., Соколовский Е.В. с соавт., 2003; Тихоновская И.В., 2004; Романенко Г.Ф. с соавт., 2009; Duvic M., Welsh E.A., 1995; Gupta A. et al., 1998; Shapiro J., 2002). Однако зачастую и эти методы могут оказаться малоэффективными или иметь нестойкий результат, или вызывать серьезные побочные эффекты.

В последние годы появился принципиально новый вид светотерапии - узкополосная фототерапия с использованием эксимерного XeCl лазера с длиной волны 308 нм, которая обеспечивает возможность воздействовать на патологически измененную пролиферацию кератиноцитов сфокусировано, исключая потенциально вредное облучение здоровой кожи. В литературе встречаются единичные работы по использованию эксимерного лазера при лечении ГА. Так, Gundogan C. с соавт. (2004) и Al-Mutairi N. (2007) сообщили об эффективном лечении ГА этим методом. Успех применения эксимерного света при данном заболевании, вероятно, связан с его иммуносупрессивным действием и способностью запускать апоптоз Т-клеток. И.Я.Пинсон в своей диссертационной работе (2006) установил, что действие фототерапии эксимерным лазером не ограничивается угнетением продукции цитокинов, а оказывает также иммуномодулирующее влияние на клеточный и гуморальный иммунитет, восстанавливая их баланс.

Сообщения об успешном применении фототерапии с длиной волны 308 нм у больных хроническими воспалительными дерматозами с оценкой динамики кожного поражения и состояние клеточного и гуморального звеньев иммунитета (Василевская Е.А. и соавт., 2004; Bonis B. et al., 1997; Trehan M., Taylor C.R., 2002; Feldman SR. et al., 2002; Gerber W. et al., 2003) позволяют предположить эффективность этого метода у больных ГА.

В нашей стране отсутствуют работы по лечению ГА эксимерным лазером. Немногочисленные работы по изучению иммнного статуса при этом заболевании носят противоречивый характер. Кроме того, как в отечественной, так и в зарубежной литературе отсутствуют исследования по оценке иммунологических и иммуногистохимических изменений, а также состояния системы микроциркуляции кожи волосистой части головы в процессе фототерапии 308 нм у больных ГА. Все это обуславливает актуальность поднятой проблемы.

Цель исследования. Комплексное изучение иммунного статуса, микроциркуляторных механизмов и особенностей патоморфологических изменений в коже больных гнездной алопецией и их динамика при фототерапии эксимерным лазером.

Задачи исследования.

1. Разработать метод фототерапии УФБ лучами спектра 308 нм с использованием эксимерного лазера при гнездной алопеции.

2. Изучить терапевтическую эффективность УФБ излучения 308 нм с применением эксимерного лазера у больных гнездной алопецией и проследить за отдаленными результатами лечения.

3. Изучить иммунопатологические механизмы гнездной алопеции и проанализировать динамику показателей иммунного статуса больных при фототерапии эксимерным лазером.

4. Изучить патоморфологические и иммуногистохимические изменения в коже больных гнездной алопецией и влияние на них фототерапии эксимерным лазером.

5. Оценить состояние микрогемодинамики в очагах поражения больных гнездной алопецией до и после фототерапии УФБ лучами 308 нм с использованием эксимерного лазера.

Научная новизна.

Впервые применен метод узкополосной фототерапии УФБ лучами (308 нм) эксимерным лазером у больных ГА для нормализации патоморфологических процессов в коже и устранения дисбаланса в иммунном статусе. Впервые изучена терапевтическая эффективность и безопасность фототерапии УФБ лучами спектра 308 нм на большой выборке больных гнездной алопецией (180 человек) и прослежены отдаленные результаты лечения.

Впервые комплексно проведенными исследованиями с использованием иммунологических, гистологических и гистохимических методов было установлено, что основным патогенетическим механизмом при ГА является дисбаланс иммунорегуляции за счет повышения уровня Т-хелперно-клеточного звена иммунитета и дисбаланса цитокиновой регуляции, при этом прогрессирование ГА обусловлено девиацией цитокинового профиля по Тh1 типу в виде высокого уровня сывороточных ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-б и ИНФ-г, а хронизация процесса обусловлена повышенной секрецией сывороточного ИЛ-4, ИЛ-10, т.е. в стационарной стадии заболевания происходит переключение иммунного ответа на Th2 тип. Установлено, что уровни цитокинов прямо пропорционально отражают тяжесть заболевания: чем тяжелее процесс, тем выше показатели.

Выявлено, что наиболее характерными морфологическими признаками гнездной алопеции являются дегенеративные изменения волосяных фолликулов, дистрофические изменения матрикса и ослабление митотической активности. Соотношение фолликулов в фазах анаген/телоген меняется по мере выраженности и длительности процесса в стороу фазы телогена. Наличие воспалительного инфильтрата (патогномоничного признака) зависит от активности процесса: в прогрессирующей стадии он наиболее выражен, а в стационарной стадии при большой продолжительности заболевания инфильтрат незначительный или вовсе отсутствует.

Установлено, что в развитии патологического процесса в коже при ГА принимает участие Т-клеточный компонент иммунитета, т.к. лимфоциты в перибульбарном инфильтрате имеют преимущественно фенотип CD3+CD4+CD45RO+ (фенотип Т-хелперов), а активация большинства Т-клеток подтверждается экспрессией активационного маркера НLA-DR и увеличением количества антиген-представляющих клеток Лангерганса.

Выявлена в очагах поражения высокая экспрессия трансформирующего фактора роста-альфа (TGF-б), которая указывает на важную роль этого медиатора в патогенезе ГА, принимающего участие в поддержании иммунной привилегированности в перифолликулярной зоне.

Установлено, что восстановление волос после фототерапии эксимерным лазером сопровождается нормализацией иммунорегуляторного звена иммунитета и снижением уровней сывороточных цитокинов, т.е. фототерапия эксимерным лазером обладает иммуносупрессивным действием и является патогенетически обоснованным методом лечения ГА.

Установлено, что фототерапия эксимерным лазером при клиническом восстановлении волос в очагах поражения приводит к утолщению межфолликулярного эпидермиса, увеличению количества капилляров с расширенными просветами, усилению митотической активности, увеличению количества фолликулов до нормы, подавляет клеточные иммунные реакции в виде уменьшения или отсутствия клеточных инфильтратов, что при иммуногистохимическом исследовании выявляется в виде расбросанных единичных CD4+ и CD8+ лимфоцитов и CD68+клеток (макрофагов), отсутствия клеток Лангерганса (CD1) и отсутствия экспрессии HLA-DR и TGFб

Впервые использован метод лазерной допплеровской флоуметрии для оценки состояния кожной микроциркуляции при гнездной алопеции и выялены расстройства микроциркуляции, характеризующиеся снижением уровня перфузии кожи. По результатам амплитудно-частотного анализа лазерной доплеровской флуометрии констатировано снижение эффективности микроциркуляци за счет уменьшения доли активных вазомоций микрососудистого русла на фоне сохранения активности пассивных компонентов, что подтверждает расстройства регуляторных процессов в системе микроциркуляции не только в очагах поражения, но и в здоровой коже. Фототерапия эксимерным лазером приводит к нормализации микроциркуляции кожи головы, что позволяет ее рекомендовать в качестве патогенетического метода.

Практическая значимость.

Разработан метод узкополосной фототерапии УФБ лучами спектра 308 нм эксимерным лазером больных ГА, позволивший получить клиническую ремиссию у 134 (74,4%) больных. С помощью клинических и лабораторных исследований установлена высокая эффективность и безопасность данного метода, в связи с чем фототерапия эксимерным лазером больных ГА внедрена в практическое здравоохранение. Предложен и внедрен метод лазерной допплеровской флуометрии для определения микроциркуляции при гнездной алопеции и для оценки эффективности фототерапии эксимерным лазером. Важным в практическом отношении является патогенетическое обоснование узкополосной фототерапии больных ГА. При ее применении происходит коррекция основных показателей иммунного статуса и патоморфологических изменений в коже этих больных. Полученные результаты могут быть использованы в обучении студентов, ординаторов и врачей-дерматологов и косметологов.

Внедрение результатов работы в практическое здравоохранение.

Работа выполнена на кафедре кожных и венерических болезней лечебного факультета Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова и в клинике «Президентмед» г. Москвы. Работа является фрагментом комплексной темы кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета ММА им. И. М. Сеченова: «Разработка и тяжело протекающих кожных заболеваний». Номер госрегистрации темы 01.200.110441.

Полученные результаты фототерапии УФБ лучами спектра 308 нм эксимерным лазером больных ГА внедрены в практику в клинике «Президентмед», Лаборатории репаративных процессов в коже Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова, а также в учебный процесс кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета ММА им. И. М. Сеченова.

Положения, выносимые на защиту.

1. В патогенезе ГА важную роль играет дисбаланс иммунорегуляции за счет повышения уровня Т-хелперно-клеточного звена иммунитета и дисбаланса цитокиновой регуляции, при этом прогрессирование ГА обусловлено девиацией цитокинового профиля по Тh1 типу в виде высокого уровня сывороточных ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-б и ИНФ-г, а хронизация процесса обусловлена повышенной секрецией сывороточных ИЛ-4 и ИЛ-10.

2. Наиболее характерными морфологическими признаками гнездной алопеции являются дегенеративные изменения волосяных фолликулов, дистрофические изменения матрикса и ослабление митотической активности. Наличие воспалительного инфильтрата зависит от активности процесса. В очагах поражения. Лимфоциты в очагах поражения имеют фенотип Т-хелперов (CD3+CD4+CD45RO+), а активация большинства Т-клеток подтверждается экспрессией активационного маркера НLA-DR и увеличением количества антиген-представляющих клеток Лангерганса. В развитии ГА активное участие принимает трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-б), о чем свидетельствует высокая экспрессия этого медиатора в очагах выпадения волос.

3. Определение микрогемодинамики кожи волосистой части головы у больных гнездной алопецией с помощью метода лазерной допплеровской флоуметрии позволяет выявить нарушение микроциркуляции, характеризующееся снижением уровня перфузии кожи и уменьшением доли активных вазомоций микрососудистого русла, и его устранение при проведении фототерапии эксимерным лазером.

4. Клиническое и катамнестическое наблюдение больных после фототерапии эксимерным лазером показывает высокую эффективность и безопасность метода в лечении ГА, приводящего к полному восстановлению волос у 74,4 % больных.

5. Фототерапия эксимерным лазером является патогенетически обоснованным методом лечения ГА. Под воздействием фототерапии эксимерным лазером происходит нормализация иммунорегуляторного звена иммунитета и снижаются уровни провоспалительных цитокинов сывороточных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-, ИНФ-. В очагах поражения фототерапия подавляет клеточные иммунные реакции, что сопровождается уменьшением или отсутствием клеточных инфильтратов, отсутствием клеток Лангерганса (CD1) и отсутствием экспрессии HLA-DR и TGFб.

Апробация работы.

-V съезде врачей-дерматовенерологов Белоруссии «Актуальные вопросы дерматологии, венерологии и дерматокосметологии». 20-22 сентября 2006 года г. Минск, Беларусь,

-VI Международном конгрессе «Kosmetik international» им. Е. Лапутина, г. Москва, февраль 2007;

-II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов, г.Санкт Петербург, 25 сентября 2007;

-I Международном форуме медицины и красоты, г. Москва, 18ноября 2008;

-Научно-практической конференции дерматовенерологов
Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф.Владимирского (МОНИКИ), г. Москва, 27 мая 2009;

-Научно-практической конференции «Инновации в дерматологии, косметологии и эстетической медицине», г. Уфа, 17 июня 2009;

-Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматологии и урогенитальной патологии», г. Москва, 5-6 ноября 2009;

-Научно-практической конференции 2-го Форума медицины и красоты, г. Москва, 24 ноября 2009;

-XV Междисциплинарный научный симпозиум «Новое в дерматовенерологии, андрологии, акушерстве и гинекологии: наука и практика»
04 декабря 2009 г. Москва в Центральном Доме Ученых

-Совместной научно-практической конференции кафедры и клиники кожных и венерических болезней ММА им. И.М.Сеченова и клиники «Президентмед» , г. Москва, март 2010 г.

Публикации. Результаты работы изложены в 20 публикациях и 3 методических рекомендациях для врачей.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 202 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, 4 глав собственных результатов исследования, заключения, практических рекомендаций, выводов и списка литературы.

Библиографический указатель включает 66 отечественных и 159 иностранных источников. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 36 рисунками.

Содержание работы

Характеристика группы наблюдаемых больных.

Среди обследованных было 81 (45 %) мужчин и 99 (55 %) женщин. Половое соотношение мужчины: женщины составляло 1: 1,22. Среди наблюдаемых нами мужчин с ГА преобладали пациенты в возрастных группах 20 - 29, 32, 35 и 37 лет. На возрастной интервал 19 - 25 лет у женщин приходилось 35,3 % обратившихся, на интервал 33 - 42 - 41,4 %.

Длительность ГА составила от 4 месяцев до 10 лет. Продолжительность заболевания до 3 лет отмечалась у 132 ( 75 муж., 57 жен.), или 73,3 %, более 3 лет - у 48 (19 муж., 29 жен.), или 26,7 % больных. В интервале дебюта заболевания до 3 лет преобладали мужчины, среди больных ГА с давностью заболевания более 3 лет - женщины.

Согласно классификации тяжести ГА, которая предусматривает 4 степени тяжести процесса (Шуцкий И. В., 1988), у 98 (50 муж., 48 жен.) пациентов диагностирована I степень тяжести ГА, проявлявшаяся единичными очагами поражения размером 3 - 5 см в диаметре; у 53 больных (21 муж., 32 жен.) - II степень тяжести ГА, проявлявшаяся единичными очагами поражения размером 5 - 10 см в диаметре; у 29 (10 муж., 19 жен.) больных отмечалась субтотальная алопеция, что соответствовало III степени тяжести ГА.

Клиническая картина у всех больных была представлена гнездной алопецией (ГА), при этом у 98 (54,4 %) больных отмечалась I cтепень тяжести процесса, т.е. имелись единичные, четко очерченные, изолированные очаги выпадения волос на голове размером не более 5 см в диаметре округлых очертаний. У 53 (29,4 %) больным была диагностирована II степень тяжести процесса, когда в клинической картине преобладали такие же округлые очаги, но крупных размеров. При субтотальной алопеции, или III степени, у 29 (16,1%) больных очаги поражения сливались между собой, и очертания приобретали неправильные и причудливые очертания, занимая большую часть поверхности головы. Только на отдельных участках сохранялись островки волос, а также единичные тонкие обесцвеченные волосы и пушковые волосы. Очаги выпадения волос располагались повсеместно на голове, однако чаще при I и II степени тяжести излюбленной локализацией был затылок и теменная область, а при III cтепени тяжести (субтотальной) ГА, помимо головы, очаги локализовались также на бровях и бороде. Иногда брови и ресницы выпадали полностью или значительно разрежались. Кожа в очагах поражения имела нормальный цвет или цвет слоновой кости. Фолликулярный рисунок в очагах у всех больных был сохранен. У некоторых пациентов в очагах выпадения волос встречались короткие обломанные волосы с расширением на конце (симптом «восклицательного знака»), что свидетельствовало о стационарной стадии и прекращении активного выпадения волос. Однако у 112 больных выявлялась зона «расшатанных» волос по периферии очагов поражения, в связи с чем этим больным была диагностирована прогрессирующая стадия. Таким образом, у 112 (62,2 %) больных отмечалась прогрессирующая стадия процесса, а у 68 (37,8 %) больных - стационарная.

При сборе анамнестических данных по выявлению триггерных факторов нами было установлено, что почти у половины больных (47,2 %) дебюту заболевания предшествовала стрессовая ситуация, причем сильные эмоциональные переживания происходили часто за несколько месяцев до первых признаков ГА. В 6 (3,3%) наблюдениях больные имели травму головы с сотрясением мозга средней тяжести. 10 (5,5%) пациентов отметили выпадение волос после перенесенного гриппа и тяжелой ангины. Некоторые больные (13,8%) все-таки связывали начало ГА с имеющимися у них сопутствующими болезнями. У 54 (30,5%) больных установить провоцирующий фактор нам не удалось.

Методы исследования.

Для решения поставленных задач использовали комплекс исследований, включающий клинические, гематологические, биохимические, иммунологические, иммуногистохимические методы, а также метод оценки состояние микрогемодинамики в очагах поражения.

Клиническое обследование пациентов ГА включало углубленное изучение анамнеза, жалоб и дерматологического статуса.

Степень тяжести ГА оценивалась в соответствии с классификацией тяжести заболевания по 4 степеням, разработанной И. В. Шуцким (1988). Согласно этой градации выделяют:

I степень тяжести ГА - проявлявшаяся единичными очагами поражения размером 3 - 5 см в диаметре; II степень тяжести ГА, проявлявшаяся единичными очагами поражения размером 5 - 10 см в диаметре; III степень - субтотальная ГА при сохранении на волосистой часи головы небольших участков роста пигментированных волос или пушковых волос; IV степень - тотальная ГА с сохранением пушковых волос.

Критерием клинической эффективности назначенного лечения являлось уменьшение очагов ГА: 1) на 75 % и более от исходного показателя - выраженное улучшение клинической картины (этот показатель соответствует регрессивной стадии); 2) на 74 - 50 % - удовлетворительное улучшение (соответствует стационарной стадии); 3) на 49 - 25 % - незначительное улучшение; 4) менее 25 % - без видимого улучшения.

В нашем исследовании как критерий оценки тяжести состояния больного и как критерий эффективности проводимого лечения изучался дерматологический индекс качества жизни (ДИКЖ) - руссифицированный профессором Н.Г.Кочергиным (2001) вариант индекса Finlay. ДИКЖ оценивает негативное влияние дерматологического заболевания на качество жизни больного и состоит из 10 вопросов, характеризующих разные аспекты жизни больного: профессиональные, бытовые, сексуальные, социальные. Оценочные показатели ДИКЖ выражаются в баллах от 0 до 3, максимальная сумма баллов - 30, при этом качество жизни пациента обратно пропорционально сумме баллов).

Для определения общего статуса больных ГА изучали гематологические и биохимические анализы крови.

Исследование показателей гемограммы выполнялось на автоанализаторе System KX-21 (Швейцария) в клинической лаборатории Медицинского центра УД Президента РФ. Определялись следующие показатели: гемоглобин, количество эритроцитов, гематокрит, средняя концентрация гемоглобина, количество лейкоцитов, количество тромбоцитов, скорость оседания эритроцитов.

Биохимические исследования выполнялись на калиброванном автоанализаторе «Konelab 30i» (фирмы Thermoelectron, Швейцария) и включали изучение следующих показателей: общего белка, глюкозы, креатинина, общего билирубина, холестерина, мочевой кислоты, трансаминаз (АЛТ и АСТ), гамма-глутамилтрансферазы (г-ГТ), общей лактатдегидрогиназы.

Для иммунологического исследования использовалась сыворотка крови больных ГА. Забор крови производился двукратно по стандартным методикам пациентам ГА до и после курса лечения. Иммунологическое исследование осуществлялось в лаборатории НИИ Иммунопатологии РАЕН.

Определение субпопуляций лимфоцитов осуществляли методом проточной цитофлуорометрии с использованием моноклональных антител (МКАТ) к различным маркерам лимфоцитов. Фенотипирование иммунокомпетентных клеток включало: 1) определение Т-лимфоцитов в периферической крови (CD3+ клетки); 2) подсчет и мониторинг популяций Т-хелперов/индукторов; 3) подсчет популяций Т-лимфоцитов цитотоксических. 4) определение В-лимфоцитов в периферической крови (CD20+клетки). Количественная оценка зрелых Т-лимфоцитов двух основных популяций CD4+ и CD8+ основывалась на определении баланса иммунорегуляции - соотношения СD4+/CD8+.

Уровень общих сывороточных иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) определяли по стандартной технологи иммунодиффузии в геле по Манчини.

Для определения сывороточных уровней цитокинов использовали твердофазный иммуноферментный анализ. Изучали количественное определение провоспалительных и противовоспалительных цитокинов - ИЛ 1 в, ИЛ 2, ИЛ 4, ИЛ 10, ИФН-г, ФНОб с помощью системы «Суtotech» (Бельгия) (табл. 1).

Реакция признавалась положительной при наличии мембранного и/или цитоплазматического коричневого окрашивания клеток. Результаты оценивались полуколичественным методом. Содержание HLA-DR+клеток выражали в баллах: отсутствие экспрессии - 0 баллов, слабая экспрессия - 1 балл, интенсивная экспрессия - 2 балла. Для исследования содержания CD3, CD4, CD8, СD68 и CD1a в перибульбарных инфильтратах в 10 произвольных полях зрения при увеличении объектива х40 подсчитывалось количество окрашенных клеток из 20 расположенных рядом лимфоцитов, исследовалось 5 инфильтратов в каждом биоптате, после чего для каждого препарата рассчитывалось среднее значение показателя.

Таблица 1. Панель используемых моноклональных антител

Гистологический метод. Для морфологической оценки изменений в коже под местной анестезией 0,5% р-ра новокаина брались биопсии из края очагов поражения до и после лечения. Всего взято 38 биоптатов (28 - до лечения и 10 - после).

При изучении экспрессии рецептора трансформирующего фактора роста-альфа (ТФР-б) криостатные срезы фиксировали в ацетоне с последующим высушиванием в течение 10 минут. Для подавления эндогенной пероксидазной активности клеток срезы 20 минут обрабатывали 0,6% раствором перекиси водорода в метаноле, после чего промывали в дистиллированной воде и ТРИС-буфере. Для блокирования неспецифического свечения 20 минут инкубировали в нормальной сыворотке свиньи, разведенной ТРИС-буфером (1:5), а затем на срезы наносили моноклональные антитела к ТФР-, с которыми они инкубировались 30 минут, после чего помещали на 5 минут в ванночку с TBS и опять инкубировали 30 минут со свиной противокроличьей биотиновой сывороткой, разведенной в TBS (1:300 - 1:500). Выявление пероксидазной активности осуществляли с помощью DAB+ (Dako). Экспрессию ТФР-б оценивали путем определения в дерме при увеличении х40 в 1 поле зрения количества окрашенных клеток. Подсчет количества окрашенных клеток осуществляли в 5 произвольно выбранных полях зрения и определяли среднее значение.

Метод «фототрихограмма» представляет собой визуальный подсчет стержневых и пушковых волос на площади 1 см², провдимый по цифровому фотоснимку очага поражения, выполненному фотокамерой Canon PS 5 с разрешением 8 Mps в режиме макросъемки. Фототрихограмма проводилась до и по окончании курса терапии.

Метод оценки нарушения микроциркуляции кожи волосистой части головы у больных ГА.

Для определения микроциркуляции в коже больных ГА и оценки эффективности лечения проводилось изучение микрогемодинамики в очагах поражения до и после лечения.

Для решения поставленной задачи был использован метод лазерной допплеровской флоуметрии, который основывается на зондировании ткани лазерным излучением и последующей регистрации излучения, отраженного от подвижных и неподвижных компонентов ткани. Отраженное от статических (неподвижных) компонентов ткани лазерное излучение не изменяет своей частоты, а отраженное от подвижных частиц (эритроцитов) -- имеет доплеровское смещение частоты относительно зондирующего сигнала. Переменная составляющая отраженного сигнала, пропорциональная мощности спектра допплеровского смещения, определяется концентрацией эритроцитов в зондируемом объеме и их скоростью. Регистрируемый при лазерной допплеровской флоуметрии сигнал характеризует кровоток в микрососудах в объеме 1 - 1,5 мм³ ткани, что дает интегральную информацию по очень большому количеству эритроцитов, около 3,4х10⁴, одновременно находящихся в зондируемом объеме крови.

Для проведения лазерной допплеровской флоуметрией использовался лазерный анализатор микроциркуляции крови компьютеризованный «ЛАКК-02». Расчеты производились на компьютере по «Программе записи и обработки параметров микроциркуляции крови. В ходе исследования регистрировали и рассчитывали следующие показатели ЛДФ сигнала: среднее значение показателя микроциркуляции (ПМ) и его среднеквадратическое отклонение (у).

Диагностика перфузии кожи волосистой части головы.

Расчет параметров базального кровотока проводится в два этапа. На первом этапе рассчитываются средние значения изменения перфузии: М, у и K_v. На втором этапе анализируются осцилляции кровотока. Поскольку, общепринятых нормативных показателей микроциркуляции в современной медицине не существует, для сравнения нами использованы результаты ЛДФ у здоровых людей (n=20). Мониторинг записи и обработка допплерограмм осуществляются с помощью прилагающегося пакета программ на компьютере Intel Pentium IV.

Диагностика ритмов колебаний кровотока в микроциркуляторном русле.

Наше дальнейшее исследование заключалось в изолированной оценке влияния активных и пассивных факторов контроля микродинамики. Активные факторы контроля микроциркуляции (факторы, непосредственно воздействующие на систему микроциркуляции) - это эндотелиальный, миогенный и нейрогенный механизмы регуляции просвета сосудов, тонуса сосудов. Эти факторы контроля регуляции модулируют поток крови со стороны сосудистой стенки и реализуются через ее мышечный компонент.

Алгоритм вычисления этих показателей проводился с помощью Вейвлет-преобразования, который наилучшим образом выявляет периодичность коротких и длительных процессов, представленных в одной реализации (Stefanovska A., 1999).

В основе программной реализации Вейвлет-преобразования лежит почленное перемножение массива данных ЛДФ-граммы на массив, содержащий вейвлеты для разных частот: миогенных (МТ), нейрогенных (НТ) и эндотелиальных (ЭЗКТ) компонентов тонуса микрососудов. Расчеты производятся на компьютере по «Программе записи и обработки параметров микроциркуляции крови версия 2.2.0.506. (11.07.03)».

Природа нейрогенного тонуса (НТ) связана с активностью -адренореценторов (в основном ₁) мембраны ключевых и отчасти сопряженных гладкомышечных клеток. Поэтому НТ может увеличиваться как при возрастании активности симпатических нервов-вазоконстрикторов, так и на фоне денервационной гиперчувствительности сосудистой стенки.

Миогенные колебания (активный фактор). Диагностическое значение миогенных колебаний (диапазон 0,07-0,15 Гц) заключается в оценке состояния мышечного тонуса прекапилляров, регулирующего приток крови в нутритивное русло.

Колебания в нейрогенном диапазоне (активный фактор). Диагностическое значение нейрогенных колебаний (диапазон 0,02-0,052 Гц) заключается в возможности оценивать периферическое сопротивление артериол (вход микроциркуляторного русла); увеличение амплитуд нейрогенных колебаний является индикатором снижения сопротивления и возможного усиления кровотока по артериоло-венулярному шунту при повышении миогенного тонуса.

Эндотелиальные колебания (активный фактор). Диагностическое значение эндотелиальных колебаний (диапазон 0,0095-0,02 Гц) заключается в оценке эндотелиальной дисфункции по относительному изменению амплитуд колебаний вблизи 0,01 Гц.

Пассивные факторы.

Пульсовая волна (пассивный фактор). Амплитуда пульсовой волны, приносящейся в микроциркуляторное русло со стороны артерий, является параметром, который изменяется в зависимости от состояния тонуса резистивных сосудов. При снижении указанного сосудистого тонуса, увеличивается объем притока артериальной крови в микроциркуляторное русло, модулированной пульсовой волной.

Дыхательная волна (пассивный фактор). Дыхательная волна в микроциркуляторном русле обусловлена динамикой венозного давления при легочной механической активности, присасывающим действием «дыхательного насоса». Местом локализации дыхательных ритмов в системе микроциркуляции являются венулы. Диагностическое значение дыхательной волны (диапазон 0,15-0,4Гц) заключается в ее связи с венулярным звеном. Увеличение амплитуды дыхательной волны указывает на снижение микроциркуляторного давления. Ухудшение оттока крови из микроциркуляторного русла может сопровождаться увеличением объема крови в венулярном звене. Это обстоятельство приводит к росту амплитуды дыхательной волны в ЛДФ-грамме. Поэтому возрастание амплитуды дыхательной волны одновременно с увеличением показателя микроциркуляции (более высокое среднее арифметическое значение М) указывает на проявление застойных явлений в микроциркуляторном русле.

Проводился амплитудно-частотный анализ ЛДФ-граммы и определялись следующие параметры: ALF/3 x 100% - отношение амплитуды низкочастотных или высокочастотных колебаний к утроенному показателю среднего квадратичного отклонения, свидетельствующее о состоянии активных вазомоциях; AHF/3 x 100% и ACF/3 x 100% - отношение высокочастотных и пульсовых колебаний к утроенному показателю среднеквадратичного отклонения, свидетельствующее о пассивной активации микроциркуляции; ACF/ПМ x 100% - отношение амплитуды вазомоций в диапазоне пульсовых колебаний к показателю микроциркуляции, свидетельствующее о внутрисосудистом сопротивлении и ИЭМ (индекс эффективности микроциркуляции) - отношение амплитуды активных факторов микроциркуляторного русла к сумме амплитуд высокочастотных и пульсовых колебаний кровотока (пассивных факторов микроциркуляции).

Определение состояния микроциркуляции кожи волосистой части головы у больных ГА с помощью метода лазерной допплеровской флоуметрии проводили до и после лечения.

Для статистической обработки данных использовались стандартные методы описательной и вариационной статистики, с использованием простого и множественного линейного регрессионного анализа. Значения рассчитывались и представлялись в виде М m_M , M , Pm_P и rm_R , где М - среднее арифметическое, Р - относительные величины, выраженные в процентах (%), r - коэффициент корреляции, m () - ошибка репрезентативности (среднее квадратичное отклонение). Равенство генеральных дисперсий в сравниваемых группах оценивалось по коэффициенту ранговой корреляции Спирмена. Достоверность различий между данными рассчитывалась с помощью t-теста Стьюдента для параметрических величин.

В качестве достоверного критерия различий рассматривался p0,05. Характер корреляционных связей представляли по рассчитываемому коэффициенту корреляции (направление связи + прямая - обратная), сила связи (от 0 до 1): 0 - связь отсутствует; 0 - 0,3 - связь слабая; 0,3 - 0,7 - связь средняя; 0,7 - 1,0 - связь сильная.

Статистическая обработка материалов проводилась на PC Intel Pentium 4 2,4 Ghz, в среде Windows XP, с использованием программы MS Exel 2000.

Статистическую обработку полученных данных иммуногистохимических исследований проводили с использованием пакета статистических программ Statistitica 6.1 (StatSoft, Inc., США). Сравнение групп осуществляли с помощью теста Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р0,05.

Метод лечения больных гнездной алопецией.

Техническая характеристика эксимерного лазера.

Все больные получали лечение методом фототерапии УФБ-лучами с использованием ксенон-хлоридного эксимерного лазера («XTRAC», США) с длиной волны 308 нм. Главное преимущество этого аппарата в том, что лазер монохроматичен, действует одной длиной волны 308 нм в цель на 1 выбранный хромофор. Лазер генерирует высокоинтенсивное излучение до 2500 мДж/см², что является необходимым условием для эффекта гибели патологических клеток, но не их стимуляции.

Длина импульса составляет 30 наносекунд, что способствует процессу вапоризации и отсутствию термических эффектов. Частота импульсов достигает 143 Гц. Система доставки излучения представлена оптоволоконным кабелем длиной 2 м и насадкой со сменными наконечниками. Площадь светового пятна - 5,3 см². Лазер генерирует высокоинтенсивное излучение до 2500 мДж/смІ, что является необходимым условием для эффекта гибели патологических клеток в перибульбарном инфильтрате.

В лазере «XTRAC » имеется четкая термическая дозировка 3 мДж/см² за 1 импульс, учет количества импульсов, суммарное количество энергии за 1 сеанс и за весь курс лечения, что обеспечивает безопасность и контроль.

«XTAC» имеет программное обеспечение, позволяющее производить облучение как единичных очагов поражения, так и больших поверхностей. Аппарат снабжен компьютерными программами, которые разрешают работать в трех режимах, разных скоростях и гарантируют равномерность распределения энергии без перекрытий и пропусков, четко дозируя суммарную энергию на каждом участке.

Лечение проводили в виде монотерапии по методике 2-х и 3-хразового облучения в неделю. Выбор методики основывался на распространенности и площади очагов ГА. При I и II степени тяжести больные получали лечение дважды в неделю, а при III степени для ускорения регрессирования процесса мы предпочитали методику 3-х разового облучения в неделю, однако всегда главным ориентиром был индивидуальный ответ облучаемой кожи.

Лечение начинали после определения минимальной фотоэритемной дозы (МЭД) на коже вне очагов поражения. Облучали 6 областей с помощью насадки 3х3 см², после чего через 48 часов оценивали результат. МЭД определяли по области, в которой была первой обнаружена различимая эритема от МЭД-теста, после чего мы выбирали один из шести множителей. В связи с высокой чувствительностью кожи головы лечение начинали с дозы УФ, превышающей МЕД на Ѕ или 1 МЕД. Для лечения использовали аппликатор, который покрывал площадь 23 мм х 23 мм (5,3 см²). При более крупных очагах облысения аппликатор постепенно перемещали по пораженному участку.

В зависимости от типа кожи для достижения терапевтического эффекта мы брали дозы с разной плотностью мощности; в основном это были низкие (0,5 и 1 МЭД) и средние (2, 3, 4 и 6 МЭД) дозы. В последующие процедуры для подбора дозы мы ориентировались только на эритему: если после процедуры появлялось покраснение в очагах поражения, то дозу оставляли прежней. Если реакция на облучение отсутствовала, то дозу увеличивали на Ѕ или 1 МЭД, но не более чем вдвое. Наблюдая за больными, мы заметили, что при одинаковой экспозиции у больных с высокой фоточувствительностью очаги ГА подвергались регрессу при более низкой интенсивности облучения. В случаях применения средних доз облучения больным требовалось меньше процедур для восстановления волос в очагах облысения. Однако в некоторых наблюдениях у больных от применения таких доз появлялись пузыри как проявление фотодерматита в местах облучения, в связи с чем дозу УФ мы оставляли прежней, а лечение прекращали на 1-2 процедуры.

Лечение проводили до полного восстановления волос в очагах поражения и такой результат мы расценивали как клиническую ремиссию. В процессе лечения мы фиксировали следующие параметры: рост единичных депигментированных волос, рост пушковых волос, рост стержневых волос, увеличение плотности волос и исчезновение зоны «расшатанных» волос, выраженная визуализация фолликулярного рисунка. Но если рост волос приостанавливался, несмотря на увеличение дозы УФ, т.е. очаги облысения реагировали слабо на облучение при правильно подобранной очередной дозе УФ-лучей и дальнейшей положительной динамики не отмечалось после трех процедур, лечение прекращали и, в зависимости от процента восстановления зоны роста волос, достигнутый результат расценивали как значительное улучшение или улучшение.

Результаты собственных исследований.

Результаты фототерапии эксимерным лазером больных ГА.

В процессе лечения у 98 больных (50 муж., 48 жен.) ГА I ст. тяжести восстановление роста волос наступало от 3 до 6 недель. За это время пациенты получили от 8 до 17 процедур с суммарной дозой УФБ от 50 мДж/см² до 800 мДж/см². У 53 больных (21 муж. 32 жен.) ГА II ст. тяжести восстановление роста волос наступало от 4 до 8 недель. За это время пациенты получили от 14 до 20 процедур с суммарной дозой УФБ от 150 мДж/см² до 1000 мДж/см². При указанной продолжительности лечения и лучевой нагрузке клиническая ремиссия отмечалась у 39 больных. Состояние значительного улучшения было зафиксировано у 13 больных, получивших от 5 до 18 процедур на протяжении 4 - 7 недель с суммарной дозой УФБ от 200 - 850 мДж/см². Из 29 больных (10 муж., 19 жен.) ГА III ст. тяжести восстановление роста волос наступало от 6 до 8 недель. За это время пациенты получили от 16 до 24 процедур с суммарной дозой УФБ от 350 мДж/см² до 1100 мДж/см². При указанной продолжительности лечения и лучевой нагрузке клиническая ремиссия отмечалась у 15 больных. Состояние значительного улучшения было зафиксировано у 12 больных, получивших от 8 до 12 процедур на протяжении 3 - 4 недель с суммарной дозой УФБ 300 - 450 мДж/см². У 2 пациентов к концу 4 недели была выявлена незначительная положительная динамика в виде роста единичных стержневых волос.

Прямой зависимости суммарной дозы облучения от длительности лечения нет, так как можно проводить лечение, сохраняя одну и ту же дозу несколько процедур. Это позволяет иметь невысокие суммарные дозы облучения, что, безусловно, имеет значение для отдаленных побочных эффектов. Анализируя основные показатели лечения всех клинических проявлений ГА, можно сказать, что суммарная доза прямо коррелировала с тяжести ГА и наибольшая суммарная доза при достижении терапевтического эффекта требовалась при фототерапии ГА III степени тяжести (табл. 2).

Таблица 2. Суммарные дозы УФ и длительность лечения в зависимости от тяжести ГА

Таким образом, в результате лечения у всех больных отмечался выраженный клинический эффект: клиническая ремиссия среди всех 120 больных ГА была достигнута у 134 (74,4 %) больных, значительное улучшение - у 43 (23,9 %), и только у трех (1,7 %) больных с II и III ст. тяжести процесса результат был расценен как улучшение (табл. 3).

Таблица 3. Результаты фототерапии эксимерным лазером больных ГА

Переносимость фототерапии была хорошей; среди побочных эффектов можно отметить только появления пузырей у 7,7 % больных в местах облучения, которые быстро разрешались и не мешали продолжению лечения. Что касается эритемы, возникающей после фототерапии, мы не расценивали ее как фототоксическую реакцию. При облучении волосистой части головы эритема была ориентиром для подбора индивидуальной дозы облучения для больного.

Результаты оценки фототрихограммы у больных ГА до и после фототерапии.

Среди 180 больных ГА у 112 (62,2 %) больных отмечалась прогрессирующая стадия, о чем свидетельствовало наличие зоны «расшатанных» волос. Прогрессирующая стадия диагностировалась у 78 больных I степени тяжести и у 34 больных II степени тяжести. У остальных пациентов наблюдалась стационарная стадия. В результате проведенного лечения у 69 (88,4 %) больных ГА I ст. тяжести c прогрессрующей стадией в течение первых двух недель фототерапии отмечалось сокращение зоны «расшатанных» волос, что свидетельствовало об остановке прогрессирования заболевания. У 13 (11,6 %) пациентов с прогрессирующей стадией этот процесс растянулся на 3 недели. Рост волос у больных с I степенью тяжести ГА отмечался через 2 недели терапии у 76 (77,6 %) пациентов, у 17 (17,3 %) пациентов рост волос отмечался на третьей неделе терапии, лишь у 5 (5,1 %) больных отмечалось появление активного роста волос на четвертой неделе. При оценке фототрихограммы больных ГА I ст. тяжести средняя плотность волос до лечения составляла 175,63±32,3/см². Причем доля пушковых волос в среднем составляла 65 %, стержневых - 35 %. После 4 недель фототерапии эксимерным лазером плотность волос составляла 344,57±58,22/см², в среднем с долей пушковых волос - 7 %, стержневых - 93 %. Следует заключить, что фототерапия эксимерным лазером в течение 1-1,5 месяцев у больных ГА I ст. тяжести способствовала увеличению общей плотности волос в 1,96 раз, снижению количества пушковых волос в 4,75 раз и увеличению стержневых волос в 4,97 раз. При этом коэффициент пушковые/стержневые волосы уменьшался с 1,78 до 0,075, т.е. в 23,73 раза.

В процессе лечения у 28 (82,4 %) из 34 больных ГА II ст. тяжести с прогрессирующей стадией в течение первых двух недель терапии отмечалось сокращение зоны «расшатанных» волос. У 6 (17,6 %) пациентов с прогрессирующей стадией этот процесс растянулся на 3 недели. Рост волос отмечался через 3 недели терапии у 40 (75,5 %) пациентов, у 9 (17 %) пациентов рост волос отмечался на четвертой неделе терапии, у 3 (5,7%) пациентов активный рост волос появился на пятой неделе, у 1 (1,9 %) пациента роста значительного количества волос не было (отмечался рост единичных депигментированных и стержневых волос). При оценке фототрихограммы больных ГА II ст. тяжести средняя плотность волос до лечения составляла 166,31±29,3/см². Причем доля пушковых волос в среднем составляла 68 %, стержневых - 32 %. После 4 недель фототерапии эксимерным лазером плотность волос составляла 363,62±54,6/см², в среднем с долей пушковых волос - 9 %, стержневых - 91 %. Фототерапия эксимерным лазером в течение двух месяцев у больных ГА II ст. тяжести способствовала увеличению общей плотности волос в 2,18 раз, снижению количества пушковых волос в 3,45 раз и увеличению стержневых волос в 6,22 раз. При этом коэффициент пушковые/стержневые волосы уменьшается с 2,12 до 0,099, т.е. в 21,41 раза.