Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц

Размещено на http://www.allbest.ru/

НЕИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОЧАСТИЦ

14.00.46 ? клиническая лабораторная диагностика,

14.00.36 ? аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

РАЕВ Михаил Борисович

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского Отделения Российской академии наук, г. Пермь

Научные консультанты: академик РАН, академик РАМН, д.м.н., профессор Черешнев Валерий Александрович доктор медицинских наук Шмагель Константин Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Зыбина Наталья Николаевна

доктор медицинских наук профессор Серебряная Наталья Борисовна

доктор медицинских наук профессор Климович Владимир Борисович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию МЗСР РФ

Защита состоится «24» апреля 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

Автореферат разослан «___» _____________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н. профессор Алексанин С.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной аналитической практике разработан ряд методов иммуноанализа, каждый из которых условно можно разделить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-антитело, введение в него метки и ее регистрация тем или иным способом. К таким методам можно отнести радиоиммунологический анализ [Yallow, Berson, 1959], иммуноферментный анализ [Engvall, Perlmann, 1971, 1972, Weemen, Schuurs, 1971, Rubinstein et al., 1972], био- и хемилюминесцентные иммуноанализы [Woodhead, Weeks, 1985, Ullman et al., 1996], флюориметрический анализ [Frank, 1978, Frengen et al., 1993] и его микрообъемные модификации [Swartzmann et al., 1999, Zuck et al., 1999, Martens et al., 1999], анализ проточной цитометрией [Fulwyler, 1976, Cook, Irving, 1989, Frengen et al., 1993, McHugh, 1994]. Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определять любое соединение, против которого возможно получить специфические антитела, избирательностью и специфичностью, высокой чувствительностью. Однако наряду с достоинствами, у них есть некоторые недостатки. В частности, опасность для здоровья, связанная с использованием изотопных меток в радиоиммунологических исследованиях (РИА), токсичные и канцерогенные свойства хромогенных субстратов, применяемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Кроме того, ряд методов зависит от сложной и дорогостоящей регистрирующей аппаратуры, обладает трудоемкостью и относительной длительностью исполнения (РИА, хемилюминесцентный и флуоресцентный, анализы, проточная цитометрия).

К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных по отношению к определяемому веществу (лиганду) аффинных соединений (анти-лигандов) оптически плотными частицами или цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток следует отметить латексы, в том числе цветные [Remington et al., 1983, Bangs, 1987, 1996, Lin You-chu et al., 1989, Gerber et al., 1990, Tarcha et al., 1990], эритроциты [Guesdon, Avrameas, 1980, Плаксин, 1986], неметаллические коллоиды серы, селена, теллура [Spallholz, 1982, Yost et al, 1989, Russel et al, 1989], оксиды металлов [Akzo, 1980, Zelikman, Hjerten, 1988], полимеризованные коллоидные красители, [Snowden, Hommel, 1991], гидрофобные красители [Gribnau et al., 1985, Anderson, 1988, Rounds, 1988], коллоидное золото [Moeremans et al., 1984, Egger, Bienz, 1987., Roth, Heitz, 1989, Chakraborty at al., 1990, Martin et al., 1990]. Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие лиганда как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов), так и в многочисленных гетерогенных системах. К первой группе можно отнести агглютинацию довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменение спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов. Ко второй - системы, основанные на эритроиммуноадсорбции и, более широко, на седиментационно-адсорбционном (иммуно)анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блоттинге; иммуно- и гибридофильтрации (flow-through анализах), иммунохроматографии (иммуномиграции) и ряде других процедурных аранжировках, результат которых оценивают по окрашиванию зоны специфического связывания лиганда на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых колориметров, рефлектометров, денситометров, основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение лиганда, что условно выделяет их в группу так называемых безинструментальных методов.

Основными недостатками отмеченных методов являются неудовлетворительная надежность систем анализа и плохая воспроизводимость результатов, обусловленные слабой стабильностью диагностических реагентов, а также относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью используемых в качестве меток частиц.

Решение перечисленных проблем получило свою реализацию в работах, в которых в качестве меток детектирующих реагентов применили частицы коллоидного углерода [Плаксин и др., 1991, 1994, 1997]. Основным моментом этих разработок стала двухэтапная технологическая схема синтеза углеродных конъюгатов, предусматривающая ковалентное связывание аффинных соединений с частицами углерода. Решение коснулось сразу двух аспектов проблемы. Черный цвет углеродных частиц обеспечил максимальную из существующих в природе хромофорность меток, а ковалентный характер связи аффинных соединений с ними - максимальную прочность структуры диагностикума.

Важным результатом разработанной технологии явилось получение устойчивой гетерогенной системы, обладающей одновременно свойствами истинного раствора и суспензии, названной авторами «суспензоидом». Частицы углерода размерами 162 нм, обладающие реальной поверхностью и находящиеся в водной фазе, не оседали и не всплывали под действием обычной гравитации.

Однако двухэтапный метод конъюгирования отягощен рядом технологических сложностей. В первую очередь это касается необходимости проведения двух хроматографических процедур: освобождение от избытка сорбируемого полимера и бифункционального реагента на первом этапе, и, как следствие, необходимость концентрирования, за которым вновь следует процедура хроматографического удаления несвязавшихся молекул анти-лиганда. Подобная многоэтапность не только удлиняет описанный способ, но и делает его трудоемким, мало технологичным, затратным. Кроме того, использование в качестве сорбируемого с целью пептизации поверхности углеродных частиц инертного белка - бычьего сывороточного альбумина (БСА) ограничивает количество связываемого аффинного соединения, что, в конечном итоге, накладывает ограничения на уровень чувствительности стереоспецифического анализа, проводимого с использованием таких конъюгатов.

Вместе с тем, сконструированные модели тест-систем на основе полученных реагентов в полной мере продемонстрировали перспективные возможности применения углеродных конъюгатов для создания аналитических систем, пригодных для диагностического тестирования.

Цель настоящей работы - разработка универсальной технологии одноэтапного синтеза диагностических реагентов с использованием углеродных наночастиц и конструирование на ее основе систем безинструментального иммуноанализа.

Основные задачи исследования:

1. Разработать технологию синтеза углеродных диагностикумов, предусматривающую одноэтапное конъюгирование аффинных соединений с наночастицами коллоидного углерода. Изучить стабильность полученных конъюгатов. диагностикум углеродный коллоидный иммуноаналитический

2. Обосновать универсальную систему диагностического тестирования, основанную на определении иммуноглобулинов класса G с использованием в качестве аффинного соединения белка G стрептококка и оценить ее основные аналитические параметры.

3. Обосновать системы иммуноаналитического определения различных лигандов в различных процедурных аранжировках.

4. Разработать методы аналитического тестирования на основе биотин-стрептавидинового взаимодействия.

Научная новизна и теоретическая значимость исследования. Впервые разработана одноэтапная технологическая схема ковалентного конъюгирования аффинных соединений с гидрофобными наночастицами коллоидного углерода, пригодная для промышленного внедрения, позволившая химически инертному углероду стать прочно связанным с биологическими макромолекулами. Компактность и универсальность разработанной технологии, подбор оптимальных параметров синтеза и технологических приемов позволили в условиях использования лабораторной модели технологической установки получить объем диагностических реагентов, обеспечивающий проведение до 300000 определений в год. Технологический процесс можно легко масштабировать, не опасаясь негативных последствий, которыми, как правило, сопровождаются любые действия, связанные с переносом лабораторной схемы в условия реального производства.

Впервые предложен и апробирован оригинальный и эффективный способ получения углеродных частиц с высокой степенью стандартизации по размерам.

Полученные данные дополняют современный биотехнологический арсенал методов принципиально новой технологией, позволяющей получать устойчивые водные суспензии гидрофобных наночастиц, поверхность которых может быть надежно модифицирована практически любыми соединениями, имеющими в своей структуре хотя бы одну свободную аминогруппу. Технология синтеза диагностикума и способы анализа с использованием синтезируемых углеродных реагентов защищена патентами РФ № 2089212 от 10.09.1997, № 2268471 от 20.01.2006, № 2283131 от 10.10.2006, № 2302424 от 10.07.2007. Кроме того, получены положительные решения о выдаче патентов на изобретения по заявкам № 20051128104/15(031560) от 05.02.2007, № 2007103808/15(004097) от 30.10.2007 и № 2007100406/15(000429) от 09.10.2007.

Использование разработанной технологии позволило получить устойчивые диагностические реагенты, которые характеризуются стабильностью в течение длительного времени, даже в условиях значительного отклонения от оптимальных параметров хранения. Это составило основу надежности тест-систем, конструируемых с использованием углеродных конъюгатов.

Привлекательные с позиций надежности и стабильности характеристики полученных реагентов позволили существенно упростить процедурное оформление анализов без ущерба для аналитических параметров готовых тест-систем.

Разработка технологии одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов позволила повысить чувствительность определения различных лигандов в разных форматных аранжировках анализа.

Впервые на углеродных конъюгатах продемонстрированы преимущества систем анализа, эксплуатирующих уникальные свойства биотин-стрептавидинового взаимодействия, как в аспекте универсальности детекции, так и в возможности амплифицированного усиления результата аналитического исследования, повышающего чувствительность определения.

Практическая значимость исследования.

Разработанные методические подходы в сфере конструирования неинструментальных аналитических систем могут служить основой для создания широкого спектра разнообразных наборов, пригодных для диагностического тестирования. Это могут быть системы анализа для клинико-лабораторных исследований, для экспресс диагностики в кабинете врача по принципу «один пациент - один тест», для скрининговых исследований в чрезвычайных ситуациях, для работы бригад скорой помощи, домашние тесты, полевые - в условиях экспедиционных отрядов и армейских подразделений. Быстрые и надежные, а вместе с тем, чрезвычайно простые в использовании, тесты могут найти свое применение в пищевой промышленности, в криминалистике, в ветеринарии и растениеводстве для оснащения не только контрольных лабораторий, но и фермерских хозяйств и т.д. В условиях исследовательских лабораторий наличие подобных диагностических инструментов может обеспечить возможность самостоятельного конструирования актуальных тест-систем. Например, достаточно иметь конъюгат белка G с углеродом, чтобы при необходимости сконструировать систему обнаружения и идентификации любых иммуноглобулинов. Это бывает весьма актуально там, где проводятся работы, связанные с выделением и очисткой белковых соединений из различных биологических материалов. То же касается и стрептавидинового конъюгата, как универсального детектирующего реагента, способного обнаружить любой лиганд при одном лишь условии - наличии соответствующего биотинилированного анти-лиганда.

Внедрение в практику. Результаты работы используются в практической деятельности лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН при оценке иммуноглобулиновой контаминации препаратов выделяемых белков фетоплацентарного комплекса, при оценке уровня сероконверсии в период иммунизации экспериментальных животных, в экспериментально-производственной работе филиала ФГУП НПО «Микроген» «Пермский НПО «БИОМЕД», в работе Института новых медицинских технологий (г.Краснокамск), в учебном процессе на биологическом факультете Пермского госуниверситета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная технология одноэтапного конъюгирования различных аффинных соединений с частицами коллоидного углерода позволяет получать детектирующие реагенты прочной ковалентной структуры за счет единовременного процесса пептизации, активации и связывания всех компонентов диагностикума. Получаемые конъюгаты устойчивы при хранении в течение длительного времени даже в условиях отклонения температуры окружающей среды от оптимальной.

2. Получение стабильных конъюгатов на основе углеродных наночастиц дает возможность конструировать широкий спектр систем анализа, как с высокой степенью универсальности, так и с узко направленными задачами определения конкретных лигандов, отвечающих основным требованиям, предъявляемым к диагностическим системам: высокие чувствительность и специфичность, воспроизводимость, надежность, простота, оперативность.

3. Использование в конструкции аналитических систем уникальных свойств биотин-стрептавидинового взаимодействия приводит к существенному усилению чувствительности определения при создании широкого спектра диагностических тест-систем на основе наночастиц углерода.

Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в течение 1991-2007 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации темы НИР 01.9.00.017989), а также в рамках федеральной программы «Старт 05».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на LXII сессии общего собрания Академии медицинских наук СССР, Москва, 1991, на Международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 1991, на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994, на Международном симпозиуме «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология», Москва-Пермь, 1993, на Международной конференции по иммунореабилитации, Сочи, 1994, на Международном симпозиуме ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, на Международной конференции по нейроиммунным взаимодействиям и загрязнению окружающей среды (ICONE'95), Санкт-Петербург, 1995, на XIII-м Ленсфилдском международном симпозиуме по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, на Выставке достижений Российской биотехнологии, Берлин, Германия, 1996, на 4-м Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, на Международной конференции AAAAI/AAI/CIS, Сан-Франциско, США, 1997, на Конгрессе FASEB, США, 1998, на Международной конференции по загрязнению окружающей среды (ICEP'98), Москва, 1998, на Ежегодном собрании профессиональных ученых, Экспериментальная биология 98, Сан-Франциско, Калифорния, США, 1998, на Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса», ISTC, Perm, Russia, 2001, на I-II конференциях иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001, Пермь, 2002, на Всероссийском съезде иммунологов России, Екатеринбург, Россия, 2004, на IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 2005, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет», Новосибирск, 2005, на IV, V и VI конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005, Оренбург, 2006, Ижевск, 2007, на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, Россия, 2006, на 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Сочи, 2007.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 64 печатных работах, из них: 13 статей, включая 5 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 4 патента РФ на изобретение и 3 положительных решения о выдаче патентов РФ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 217 страницах, содержит 8 таблиц и 36 рисунков, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 419 источников, в том числе: 50 на русском и 369 на английском языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. Растворы всех использованных в работе реагентов готовились на деионизированной воде с сопротивлением не менее 18 Мом. Были использованы реагенты: хлорид натрия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, бычий сывороточный альбумин, азид натрия, додецилсульфат натрия, карбонат и бикарбонат натрия, сахароза производства фирмы Sigma (США); углерод, полученный по собственной технологии; толуол, гептан, гексан, диметилформамид производства Реахим (Россия), 4-Cl-1-нафтол фирмы Sigma (США); Твин-20 производства фирмы Ferak (ФРГ); хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), моноклональные антитела AB 0422 клона 1058 против в-субъединицы ХГЧ, моноклональные антитела AB 0420 клона 1001 против б-субъединицы ХГЧ, антитела к стрептококку группы А (СГА), конъюгат козлиных антител к стрептококку гр. А с HRP производства фирмы Binax (США); антистрептококковая кроличья референс-сыворотка фирмы Wellcome (Великобритания); группоспецифическая лиофилизированная ослиная антистрептококковая сыворотка НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, кроличья антистрептококковая сыворотка, литический комплекс из Streptomyces levoris 96, культура клеток стрептококка гр. А штамма № 6/49 типа М29 Пражской коллекции культур были получены в лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М.Сеченова, группоспецифический полисахарид стрептококка группы А, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином (АПСХ-БСА) был любезно предоставлен научным сотрудником НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи к.х.н. В.А.Кульшиным, сефароза 6В-CL производства фирмы Pharmacia Fine Chemicals (Швеция); рекомбинантный белок G (Protein G from Streptococcus sp. Recombinant) фирмы Sigma (США); стандартные панели сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в низких концентрациях серий 006, 007 и 008 и стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) серии 004 производства НПО "Вектор" (Россия); антиботулинические и антистолбнячные антитела были выделены из коммерческих препаратов специфических антисывороток; ботулинический и столбнячный анатоксины получены из ГИСКа им. Л.А.Тарасевича; альфа-фетопротеин (АФП) и поликлональные антитела к АФП получены в ходе выполнения совместной работы с Институтом новых медицинских технологий, г. Краснокамск (ген. директор К.Ю. Новиков), моноклональные антитела к трофобластическому в-1-гликопротеину (ТБГ) и ТБГ получены самостоятельно; стрептавидин, стрептавидин, меченый пероксидазой хрена, N-гидроксисукцинимидный эфир аминокапроидбиотина производства ИЦПП "Пептос" (Россия); рекомбинантные полипептиды, продукты генов "envI", "envII", "gagI", "polI", контрольные сыворотки, содержащие антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, контрольная сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ производства БТК "Биосервис" (Россия), IgG человека, кролика, мыши, антитела овцы против IgG кролика, антитела кролика против IgG человека производства Sigma (США).

В качестве основы для конструирования твердофазных реагентов использовали различные полимерные материалы: непористые, изготовленные из полистирола, пористые - из нитроцеллюлозы. В частности: планшеты для серийных разведений из белого полистирола производства фирмы Linbro (США); нитроцеллюлозные мембраны 0,45 мкм BA-85, 5,0 мкм AE-98 производства фирмы Schleicher & Schuell (ФРГ), LC 5 мкм и 10 мкм производства Millipore (США), Trans-Blot Transfer Medium, Pure Nitrocellulose Membrane 0,45 мкм, Био-Рад (США); диализные мешки Visking Dialysis Tubing производства фирмы Serva (Германия).

В работе использовали следующие буферные растворы:

1. 0,15 М раствор NaCl, забуференный 0,015М Na-фосфатами, pH 7,25 (ЗФР);

2. ЗФР с 0,05% Твина 20 (ЗФРТ);

3. 0,02 М комплексирующий карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 9,6 (КББ);

4. 0,1 М карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 8,6.

5. Блокирующий раствор - ЗФРТ, содержащий 1% казеина (ЗФРТ-К)

Методы

1. Биотинилирование антител проводили по Goding J.W. [1980].

К 0,9 мл раствора антител в концентрации 1 мг/мл, предварительно отдиализованного в течение 12 часов против 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера pH 8,6, добавляли 0,1 мл ДМСО, содержащего 0,1 мг N-гидроксисукцинимидного эфира аминокапроидбиотина. После четырех часов инкубации при комнатной температуре диализовали против ЗФР, содержащего 0,1% азида натрия, с целью удаления несвязавшегося эфира биотина при +4^оС в течение 12-14 часов.

Биотинилирование БСА проводили по аналогичной схеме.

2. Проявление пероксидазы в дот-ELISA проводили с использованием субстратной смеси следующего состава:

3,5 мл 0,05 М Трис-НCl с 0,15 М NaCl pH 7,5;

1,5 мл 4-Cl-1-нафтол (10 мг/мл этилового спирта);

16 мкл 3% перекись водорода.

3. Ферментную детекцию при определении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 проводили реагентами из набора "Блот-ВИЧ" БТК "Биосервис" (Россия) по инструкции производителя.

4. Концентрирование проводили в диализных мешках в сухом Фиколле 400 производства Serva (Германия).

5. Определение белка проводили по Bradford M.M. [1976].

6. Гетерогенность реагентов оценивали электрофоретически в ПААГ [Laemmly V.K., 1970] и по результатам HPLC на хроматографе Hitachi JC 400 с колонкой TSK G2000SW (Япония) по рекомендации производителя.

7. Очистку иммуноглобулинов осуществляли гель-хроматографией на колонке 2,6 см х 80 см (LKB, Швеция). В качестве носителя использовали Сефакрил S-300 Pharmacia Fine Chemicals (Швеция).

8. Ультразвуковую дезинтеграцию частиц углерода производили на дезинтеграторе УЗДН-2М (Россия) при частоте 22 кГц.

9. АФП получали из абортной крови по оригинальной технологии. Для этого кровь центрифугировали в течение 1 часа при 6000 g и наносили на сорбент: поликлональные антитела к АФП человека/сефароза. После нанесения и отмывки сорбента белок элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером с рН 2,5 - 2,6, диализовали против физраствора и проводили негативную хроматографию на сорбенте поликлональные антитела к IgG человека/сефароза 4В с целью извлечения примесных иммуноглобулинов. Полученный препарат был электрофоретически гомогенен.

10. Поликлональные антитела получали иммунизацией коз (возраст 2-8 лет, масса 30-35 кг) препаратом АФП. Первичную иммунизацию проводили раствором АФП с полным адъювантом Фрейнда из расчета 0,3 мг/кг массы тела животного инъекцией в предлопаточный лимфатический узел и подкожно в область холки. Повторную иммунизацию проводили через три недели чистым АФП, который вводили внутривенно, подкожно и внутримышечно. Забор крови проводили через 4 недели.

Выделение антител из крови осуществляли аффинной хроматографией, которую проводили после центрифугирования и сульфатаммонийного фракционирования сыворотки крови иммунизированного животного. Фракцию, содержащую иммуноглобулины, наносили на сорбент АФП/сефароза CL-6B. После отмывки колонки антитела элюировали 0,1 М глицин-НCl буфером рН - 2,55, диализовали против забуференного физраствора и концентрировали до 10 мг/мл.

11. Моноклональные антитела к ТБГ получали из культуральной среды гибридомы BAP3 (лаборатория клеточных культур, зав. лаб. Орит Лейтер, центр биологических исследований Вейцмана, Израиль). Для этого среду, содержащую антитела, наносили на сорбент белок G/сефароза FF. После отмывки сорбента антитела элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером (рН 2,6) и диализовали против ЗФР.

12. ТБГ получали из сыворотки крови беременных женщин на сроках беременности свыше 37 недель по оригинальной технологии. Для этого сыворотку крови, предварительно фракционированную сульфатом аммония, наносили на сорбент моноклональные антитела к ТБГ/сефароза CL-4B. Элюцию проводили как описано выше. Полученный препарат после диализа доочищали на колонке с противовидовыми анти-лигандами.

13. Сорбент моноклональные антитела к ТБГ/сефароза CL-4B получали конъюгацией полученных антител с бромцианактивированной сефарозой CL-4B по методике производителя (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция).

14. Детектирующие реагенты, полученные и использованные в работе представлены в таблице 1.

Таблица 1

Общее количество проведенных одноэтапных синтезов

15. Объекты исследования и число проведенных определений представлены в таблице 2.

Таблица 2

Общее количество исследованных образцов и проведенных определений

Технологическое решение задачи разработки метода одноэтапного конъюгирования аффинных соединений с углеродной меткой.

В качестве источника частиц углерода использовали аморфный углерод, который получали в виде сажи путем конденсирования из пламени горящего толуола на стеклянной поверхности. Собранный материал подвергали тщательной отмывке комплексом органических растворителей до исчерпывающего удаления продуктов неполного окисления углеводорода. Углерод суспендировали в 10-ти кратном по весу количестве толуола и кипятили в колбе с обратным холодильником в течение 30 минут, остужали, отфильтровывали на фильтре Шотта. Далее процедуру повторяли 5 раз без нагревания до полного исчезновения окраски в растворителе, после чего отфильтрованный углерод пятикратно отмывали при комнатной температуре диметилформамидом и гексаном. Подобная процедура приводила к полному обесцвечиванию протекающего через очищаемый углерод растворителя каждого вида. Выбор используемых растворителей осуществляли на основании экспериментальных данных, сравнивая эффективность отмывки отдельных проб различными реагентами. Посредством высушивания под вакуумом конечный продукт освобождали от следов связанных органических растворителей и дополнительно прокаливали до постоянного веса в сухожаровом шкафу при 200-300^оС в течение 12-24 часов. Получаемый подобным способом чистый аморфный углерод представлял собой матово-черный лиофильный порошок, нерастворимый в доступных известных растворителях.

В процессе получения суспензии углеродных частиц к 2-х процентному раствору белка G в ЗФР добавляли аморфный углерод до конечной концентрации 5% в условиях вихревого перемешивания на магнитной мешалке. Использовали магнитный перемешивающий элемент, выполненный в виде «турбинки», что обеспечивало дополнительную гомогенизацию получаемой суспензии. Время, необходимое для полной пептизации частиц при комнатной температуре, составляло 30-36 часов. Полученную суспензию озвучивали в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия ультразвуковой обработки суспензии (частота и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирали таким образом, чтобы обрабатываемый материал при одновременном (возможном) охлаждении не разогревался до температуры свыше 40^оС. Полученный в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугировали при 6000 g в течение 5-ти минут с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. В суспензию пептизированных белком G частиц углерода на роторном встряхивателе вносили равный объем 25% глутарового альдегида. Процесс конъюгирования проводили в течение 1 часа 40 минут при комнатной температуре и интенсивном перемешивании, после чего реагент центрифугировали при 6000 g и освобождали от избытка глутарового альдегида и несвязавшегося анти-лиганда гель-фильтрацией на колонке с Сефарозой CL-6B.

Фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие конъюгат, объединяли и добавляли БСА и глицерин до конечных концентраций, соответственно 1% и 20%. В качестве консерванта во всех растворах присутствовал азид натрия в конечной концентрации 0,1%.

Конъюгаты углеродных частиц со стрептавидином получали аналогичным способом.

Синтезы углеродных конъюгатов, аффинными соединениями которых являлись антитела к ХГЧ, стрептококку группы А и АФП, включали предварительную процедуру дополнительной очистки «пришиваемых» анти-лигандов гель-хроматографией на Сефакриле S-300, после чего схема синтеза, в том числе антител к ТБГ в качестве «пришиваемого» анти-лиганда, не отличалась от описанной выше. Условная схема получаемой в результате частицы представлена на рис.1.

Таким образом, результатом разработки одноэтапной технологии синтеза углеродных конъюгатов явились, как минимум, два обстоятельства. С одной стороны, произошло существенное упрощение технологического процесса, которое привело к сокращению не менее, чем в два раза времени синтеза диагностических реагентов, существенному снижению трудоемкости и затратности их получения. С другой, - использование аффинного соединения в качестве пептизирующего полимера неизбежно приводит к увеличению удельного количества его эффекторных групп, связываемых с меткой, следствием чего можно ожидать повышение чувствительности определения лигандов в сконструированных системах аналитического тестирования. Разработанная технология была воспроизведена в 54-х синтезах различных конъюгатов. Схемы синтезов представлены на рис. 2.

Проведенные эксперименты показали, что длина волны спектрофотометра, равная 450 нм, при измерении OD углеродного суспензоида наиболее демонстративна с точки зрения удобства формализации оптической оценки реагента. Рабочая концентрация конъюгата составила 0,03%. Определяя оптическую плотность получаемого реагента, вычисляли титр (рабочее разведение), при котором использовали диагностикум в системах анализа.

Стабильность получаемых реагентов изучали на примере конъюгата стрептавидин-углерод, синтезированного по одноэтапной схеме в 1997 году. Его хранение осуществляли в бытовом холодильнике (температура от +4^оС до +8^оС) в герметично закрывающемся стеклянном флаконе. В процессе хранения часть образцов диагностикумов помещали на две недели в условия комнатной температуры (+22^оС) с усредненной периодичностью один раз в два месяца. Аналитическую эффективность детекции оценивали по определению биотинилированного БСА, нанесенного на нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм из разведений кратных десяти. Параллельно осуществляли детекцию конъюгатом, синтезированным ex tempore. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 3.

Как показывают результаты исследования, десятилетний срок хранения детектирующих реагентов при температурах бытового холодильника не оказывает заметного влияния на эффективность системы аналитического определения соответствующих лигандов даже при условиях кратковременного отклонения от оптимального режима. Чувствительность определения во всех вариантах составила 10 нг/мл.

Универсальность, как основной принцип детекции в структуре серологического анализа, сконструированного на основе углеродного конъюгата с G белком.

В первую очередь, важен тот факт, что G белок, выделенный в свое время из стрептококка G148, обладает чрезвычайно ярко выраженным сродством к Fc-фрагментам молекул IgG большинства млекопитающих, вовлеченных, так или иначе, в научно-исследовательскую сферу деятельности человека. Это послужило основанием для создания ряда аффинных сорбентов для специфического выделения и очистки иммуноглобулинов класса G, что нашло свое отражение в очистке антител, как одной из стадий реализации гибридомной технологии. Однако было бы совершенно неоправданно пройти мимо описанных свойств G белка, имея ввиду их использование в диагностике. Особенно важно подчеркнуть, что для самого G белка не играет никакой роли ни видовая принадлежность, ни способ получения, ни источник связываемых иммуноглобулинов.

Прямое определение IgG. На нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм при помощи приспособления «BIO-DOT Apparatus» (BIO-RAD, США) наносили IgG человека, из серийных двукратных разведений. После подсушивания мембраны и 30-ти минутной инкубации в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физраствор, содержащий 0,05% Твина-20 и 1% казеина (ЗФРТ-К), мембрану инкубировали в течение 15 минут в растворе описываемого конъюгата. Параллельно осуществляли детекцию аналогичным конъюгатом, но полученным в результате двухэтапного синтеза. Результаты сравнительного определения, подтвержденные в ходе исследования аналитических параметров 13-ти конъюгатов G-белка с углеродными частицами, представлены на рис.4.

Результаты определения подтверждают предположение о том, что технология одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов приводит к повышению чувствительности систем детекции. Реальным объяснением полученного эффекта может быть прогнозированное увеличение числа связывающих центров, включенных в активную поверхность углеродных частиц, составляющих диагностический реагент.

Определение антител к ВИЧ-1 и 2 в варианте сэндвич-анализа. В качестве твердофазных реагентов для определения использовали нитроцеллюлозные полоски с нанесенными в виде поперечных линий анти-лигандами - рекомбинантными вирусоспецифическими белками, продуцируемыми генами envI, gagI, polI и envII; и контрольными антигенами - внутренний отрицательный контроль - рекомбинант, не содержащий антигенных детерминант к ВИЧ-1 и 2, и внутренний положительный контроль - сыворотка против IgG человека. В качестве исследуемых образцов использовали смесь сывороток больных СПИДом с верифицированной инфекцией ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которую предварительно двукратно разводили в ЗФРТ-К, начиная с разведения 1/250. Готовые полоски (две серии по 11 полосок) помещали в исследуемые образцы и после 30-ти минутной инкубации промывали ЗФРТ трижды по 2 минуты. Детекцию проводили двумя диагностикумами: конъюгатом G белка с частицами углерода, полученным в результате одноэтапного синтеза, и ферментным конъюгатом (рис. 5).

Результаты сравнительного определения наглядно демонстрируют преимущества неферментной детекции, чувствительность которой в 4-8 раз превышает ферментную. Дело в том, что ферментная детекция предусматривает реакцию, катализируемую пероксидазой хрена, в ходе которой преципитирующий субстрат 4-Cl-1-нафтол приобретает синюю окраску. Интенсивность окрашивания (цветность) продукта реакции значительно уступает хромогенности частиц коллоидного углерода, а это неизбежно сказывается на чувствительности определения.

О высокой чувствительности и специфичности определения свидетельствует тот факт, что в ходе детекции 202-х ВИЧ-1-позитивных сывороток, 12-ти ВИЧ-2-позитивных сывороток, трех стандартных панелей сывороток содержащих антитела к ВИЧ-1 ГИСКа им. Л.А Тарасевича и 114-ти ВИЧ-негативных сывороток, полученных из банка донорской крови, тринадцатью конъюгатами G белка с частицами углерода не было получено ни одного ложноотрицательного или ложноположительного результата.

Определение антител к стрептококку группы А (СГА). В качестве иммуносорбентов использовали полоски нитроцеллюлозы с сорбированными на них в качестве анти-лиганда АПСХ-БСА из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР дотами по 3 мкл, кроличьими IgG (внутренний положительный контроль) и БСА (внутренний отрицательный контроль), нанесенными из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР. Подсушенные после нанесения анти-лигандов полоски блокировали в ЗФРТ-К в течение 30 минут при 37^оС, промывали в ЗФРТ и вновь высушивали. Полученные описанным способом твердофазные реагенты инкубировали в растворах с известной концентрацией антистрептококковых антител, разведенных с шагом 2 в ЗФРТ, начиная с 50 нг/мл, в течение 30 минут, после чего осуществляли детекцию углеродным конъюгатом с G белком. Результаты анализа представлены на рис. 6.

Чувствительность определения, как следует из результатов анализа, составила 0,38 нг/мл. О высокой специфичности системы анализа свидетельствует отсутствие как ложноотрицательных (все точки положительного контроля визуализированы в ходе определения), так и отсутствие ложноположительных (отсутствие связывания углеродного конъюгата в зонах сорбции БСА) результатов. Результаты определения воспроизведены в ходе тестирования тринадцати синтезированных конъюгатов.

Универсальный набор для определения IgG. Проведенные исследования позволили разработать универсальный набор, предназначенный для самостоятельного конструирования в условиях научно-исследовательских лабораторий необходимые тест-системы, способные определять любые IgG в зависимости от интересов и потребностей исследователей. В состав набора входят:

1. Конъюгат G белка с частицами коллоидного углерода.

2. 10-ти кратный концентрат ЗФРТ-К.

3. Полоски нитроцеллюлозы с отмеченными зонами нанесения анти-лигандов и нанесенными IgG кролика (в качестве внутреннего положительного контроля) и БСА (в качестве внутреннего отрицательного контроля).

Инструкция по применению сводится к рекомендации нанести соответствующий антиген из раствора с концентрацией 10-100 мкг/мл каплей объемом 3-5 мкл в отмеченную на полоске зону, подсушить в течение 15-20 минут и выдержать 30 минут в разведенном предварительно ЗФРТ-К. Полученные таким образом иммуносорбенты проинкубировать в течение 30 - 60 минут в исследуемой пробе и после 3-х кратной промывки в ЗФРТ осуществить детекцию, выдержав полоски в течение 15 минут в растворе конъюгата. Можно самостоятельно сконструировать практически любую тест-систему определения антител, относящихся к иммуноглобулинам класса G при условии наличия соответствующих антигенов. Но даже при отсутствии соответствующих антигенов, образцы можно напрямую сорбировать на нитроцеллюлозные полоски и осуществлять детекцию описанным способом, учитывая, что детекции будут подвергнуты все IgG, находящиеся в исследуемой пробе. Таким образом, конъюгат G белка стрептококка с наночастицами коллоидного углерода представляет собой универсальный инструмент, применение которого для прямой визуализации (детекции) специфических лигандов и взаимодействий с участием иммуноглобулинов G отвечает всем требованиям корректной диагностики, реализуя основные качественные характеристики: чувствительность, специфичность, воспроизводимость, надежность, наглядность, доступность, безопасность и др.

Иммуноаналитические системы определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ)

Иммунохроматографическое определение ХГЧ. Для конструирования систем иммунохроматографического определения ХГЧ в качестве детектирующего реагента использовали конъюгат углеродных частиц с моноклональными антителами к в-субъединице гормона. На твердой фазе, в качестве которой применяли нитроцеллюлозные пластинки размером 20х80 мм с диаметром пор 5,0 мкм, сорбировали в виде поперечных линий моноклональные антитела к б-субъединице гормона из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в концентрации 50000 МЕ/л. После полного высыхания нанесенных анти-лигандов пластинки блокировали в растворе ЗФРТ-К в течение 30 минут и подсушивали при 37^оС, промывали ЗФРТ и вновь высушивали. Подготовленные подобным образом иммуносорбенты наклеивали на прозрачный поливинилхлоридный толстый скотч. Верхнюю границу такой пластинки при помощи того же скотча плотно соединяли с впитывающим элементом (полоска толстой крупнопористой целлюлозной фильтровальной бумаги размером 40х80 мм), нижнюю - с таким же элементом, но размерами 10х80 мм, в качестве нижней контактной зоны. Полученную конструкцию нарезали на полоски шириной 4 мм.

В роли исследуемого образца использовали стандарт ХГЧ, разведенный в ЗФРТ, контролем служила моча здорового мужчины. Нижние контактные элементы хроматографических полосок опускали в подготовленные пробы, смешанные предварительно с равным объемом конъюгата, на 5-7 секунд, после чего их переносили на то же время в раствор ЗФРТ. Схема работы аналитической системы представлена на рис. 7.

За счет сил капиллярного всасывания раствор, содержащий гормон и детектирующий реагент, поднимался по полоскам со скоростью около 1,5 см/мин. Через 2-3 минуты результаты анализа определяли визуально по наличию (положительный результат) или отсутствию (отрицательный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител (черные полосы на светло-сером фоне). Свидетельством корректно проведенного анализа являлась черная полоса в зоне иммобилизации внутреннего положительного контроля (рис. 8).

Приведенные результаты иммунохроматографического определения ХГЧ демонстрируют высокий уровень чувствительности за счет использования в качестве детектирующего реагента частиц коллоидного углерода, конъюгированных с антителами к ХГЧ. Об этом свидетельствует окрашивание в зоне иммобилизации первых антител к ХГЧ при исследовании пробы, содержащей гормон в концентрации 10 МЕ/л. О высокой специфичности анализа говорит отсутствие окрашивания на поверхности иммуносорбента в условиях отрицательного контроля. Полученные результаты были воспроизведены при исследовании аналитических свойств восьми синтезированных диагностикумов.

Сам по себе результат определения 10 МЕ/л говорит о привлекательных аналитических характеристиках разработанной системы диагностики. Ни одна из представленных на нашем рынке систем определения ХГЧ, выполненных в аранжировке иммунохроматографии, не обладает чувствительностью выше 20-25 МЕ/л. Более того, качество этих систем оставляет желать лучшего, о чем свидетельствует рис. 9.

Автором не ставилась задача исследовать аналитические параметры и оценить достоинства или недостатки реализуемых на отечественном рынке систем экспрессной диагностики беременности. Выборка из аптечной сети была случайной. Анализируя полученные результаты, корректной можно считать работу только трех из восьми проверенных диагностикумов.

Иммунофильтрационное определение ХГЧ. Для осуществления иммунофильтрационного (называемого также проточно-адсорбционным) способа определения ХГЧ использовали те же иммунореагенты, что и в иммунохроматографии. Приспособлением для осуществления данного способа являлся пластиковый цилиндр с заглубленным отверстием в верхней части, заполненный крупнопористой хроматографической бумагой в качестве впитывающего элемента, с помещаемыми сверху опорным диском из крупнопористого полипропилена и иммуносорбентом (рис.10), который готовили, сорбируя на нитроцеллюлозном мембранном фильтре с диаметром пор 5 мкм связывающие моноклональные антитела к б-субъединице гормона в виде вертикальной линии из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в виде горизонтально пересекающей линии из раствора с концентрацией 50000 МЕ/л.

Высушенные после нанесения анти-лигандов мембраны блокировали, инкубируя в ЗФРТ-К 1 час при комнатной температуре, после чего отмывали ЗФРТ и вновь высушивали таким же образом.

В ходе анализа в отверстие крышки вносили 0,5 мл ЗФРТ для смачивания иммуносорбента. Затем - 0,5 мл предварительно подготовленной пробы, представляющей собой смесь равных объемов исследуемого образца (моча беременных женщин или здоровых мужчин) и конъюгата углеродных частиц с моноклональными антителами к в-субъединице гормона в двукратном от рабочего разведении. После впитывания последней вносили 1 мл ЗФРТ для промывки поверхности мембраны. Время анализа 1,5 - 2 минуты. Результаты представлены на рис. 11.

Наличие «+» на поверхности мембраны свидетельствует о присутствии в пробе ХГЧ, «-» - об отсутствии гормона и корректно проведенном анализе.

Несомненным удобством аранжированного подобным образом анализа является его простота и наглядность. По сути, в наборе для реализации такого анализа должны присутствовать только ячейки с подготовленным иммуносорбентом, флакон с конъюгатом и одноразовые пластиковые пипетки, при помощи которых последовательным набором осуществляется смешивание исследуемого образца с конъюгатом и внесение готового раствора в ячейку. Для промывки иммуносорбента используется капельница с ЗФРТ. Все восемь синтезированных конъюгатов продемонстрировали корректный результат при исследовании 58-ми образцов мочи беременных женщин. В ходе исследования 42 образцов мочи здоровых мужчин ложноположительных результатов не наблюдали.

Дот-форматная аранжировка аналитической процедуры полуколичественного определения ХГЧ. Аранжирование определения ХГЧ в формате дот-иммуноанализа позволило разработать полуколичественный метод. Использовали уже описанное приспособление для нанесения проб на пористую мембрану «BIO-DOT Apparatus» (BIO-RAD, США). Условием проведения анализа являлась необходимость серийного разведения исследуемой пробы и сравнение последней визуализируемой точки со стандартом в известной концентрации. В качестве иммуносорбента использовали нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм с нанесенными анти-лигандами: моноклональными антителами к б-субъединице гормона, сам гормон из раствора с концентрацией 50000 МЕ/л в качестве внутреннего положительного контроля и ФСГ в качестве внутреннего отрицательного контроля. После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, как описано выше, и вносили в лунки образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь иммуносорбент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата моноклональных антител против в-субъединицы ХГЧ с углеродом в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис. 12).