Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц

Результаты анализа, представленные на рис. 12, демонстрируют чувствительность определения 5 МЕ/л. Визуализируемой на этом уровне точке референса соответствует точка разведения исследуемого образца 1:10⁴, из чего следует, что исходное содержание гормона было равно 50000 МЕ/л. Аналогичные результаты были продемонстрированы всеми восемью синтезированными конъюгатами. Таким образом, разработанная схема дот-иммуноанализа, вполне пригодна для полуколичественного определения любых лигандов при условии наличия референсных образцов. Возможность количественной формализации результатов анализа в существенной степени приближает удобную в процедурном отношении, чувствительную и надежную в плане аналитических возможностей диагностическую сферу медико-биологических исследований к пользователям, удаленным от крупных центров, оснащенных современным оборудованием.

Описанные для определения ХГЧ форматные аранжировки: иммунохроматография, иммунофильтрация и дот-иммуноанализ могут быть реализованы в конструировании любых систем, имеющих такое же форматное оформление. Речь идет о подготовке твердофазного реагента (иммуносорбента) описанным способом, контакте его с исследуемым объектом (кровь, сыворотка, моча, экстракт, слюна, слеза и т.д.) и детекции соответствующим специфическим диагностикумом. Определяющими оценочными факторами с позиции целесообразности того или иного процедурного оформления являются порог диагностически значимого результата и индивидуальные свойства компонентов диагностической системы, способные или неспособные реализовывать требуемые аналитические характеристики, в первую очередь, аффинность антител, структурная организация молекул, характер возможной контаминации. Что же касается самой углеродной метки, то и ее физико-химические параметры, и технология синтеза конъюгатов надежно гарантируют воспроизводимые качественные характеристики диагностикумов, обеспечивающие возможность их применения в любых процедурных аранжировках.

Прямое дот-иммуноаналитическое определение стрептококка группы А. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат кроличьих антистрептококковых антител с частицами коллоидного углерода. Системой сравнения служила детекция ферментным конъюгатом кроличьих антител к стрептококку гр. А с пероксидазой хрена и проявлением результатов анализа с 4-хлор-1-нафтолом в стандартных условиях. На полоски нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм наносили АПСХ-БСА из серийных разведений в ЗФР дотами по 3 мкл и БСА в качестве отрицательного контроля. После высушивания нанесенных лигандов и блокирования поверхности полосок растворе ЗФРТ-К их обрабатывали сравниваемыми системами детекции (рис. 13).

Преимущество неферментной детекции подтверждается, прежде всего, в два раза более высокими показателями чувствительности. Отсутствие стадии субстратного проявления делает процедуру анализа более оперативной, упрощает ее, исключает вредность контакта с токсичным субстратом ферментной реакции. Подобного рода система анализа, позволяющая в течение часа в кабинете врача или в условиях обычной клинической лаборатории определить наличие СГА в мазке больного с чувствительностью 40-80 нг/мл, могла бы стать действенным инструментом в первичной диагностике инфекции. Представленная модель аналитической системы демонстрирует преимущества и принципиальную возможность определения СГА углеродным конъюгатом, воспроизведенную в трех синтезах. В реальной аналитической практике возникает методическая проблема, связанная с подготовкой исследуемой пробы (лизис клеточной стенки бактерии), которая могла бы служить серьезным препятствием на пути внедрения описываемой диагностической системы в качестве оперативного инструмента. Существующее решение этой проблемы было апробировано в ходе разработки сэндвич-варианта дот-иммуноаналитической системы определения СГА.

Дот-иммуноаналитическое определение стрептококка гр. А в варианте сэндвич-анализа. Сравниваемые системы детекции были те же, что и при прямом сравнении определения АПСХ. На нитроцеллюлозные полоски сорбировали антитела к стрептококку гр. А дотами по 3 мкл из раствора с концентрацией 1 мг/мл ЗФР и АПСХ-БСА в качестве внутреннего положительного контроля (К+) в той же концентрации. Полоски обрабатывали в блокирующем растворе по описанной выше схеме. Исследуемыми образцами служили клеточные лизаты с известным содержанием клеток в исходных пробах. Лизаты получали методом, разработанным в лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М. Сеченова [Шмакова и др., 1991]. Подготовленные иммуносорбенты инкубировали с анализируемыми образцами в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего отмытые в ЗФРТ полоски детектировали ферментным и углеродным конъюгатами. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 14.

В представленном варианте анализа чувствительность неферментного определения стрептококка группы А составила 10⁴ клеток/мл, что существенно превышает чувствительность ферментного определения и соответствует рекомендациям ВОЗ, согласно которым данный показатель является необходимым порогом диагностически значимой чувствительности методов, особенно экспрессных, и позволяет проводить идентификацию СГА непосредственно в мазке из зева.

Дот-иммуноаналитическое определение АФП и ТБГ в сыворотке крови беременных женщин. Форматная аранжировка определения АФП и ТБГ фактически повторяет таковую, разработанную для полуколичественного определения ХГЧ, описанную выше. В процедуре подготовки твердофазного реагента, как и в ходе анализа, также использовали приспособление для нанесения проб на пористую мембрану. Анализировали образцы, полученные в результате серийного разведения исследуемой пробы (сыворотка крови беременной женщины в сроке 16 недель) в прямом сравнении с последней визуализируемой точкой раститрованного с шагом 2 референс-стандарта АФП. На нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм наносили аффинноочищенные козьи поликлональные антитела к АФП из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл в ЗФР объемом 20 мкл, сам белок в качестве внутреннего положительного контроля (К+) и БСА в качестве отрицательного контроля (К-). После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, и в лунки вносили образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь твердофазный реагент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата поликлональных антител против АФП с углеродом в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис.15).

Чувствительность определения АФП в представленном варианте анализа составила 10 нг/мл. Из этого следует, что концентрация АФП с учетом разведения в исследуемом образце составляла около 40 нг/мл. Полученный результат согласуется с имеющимися данными, свидетельствующими о том, что медиана концентрации АФП в материнской сыворотке при сроке беременности 16 недель составляет 41 нг/мл (33 МЕ/мл) [Решетников, 2004, Tabor et al., 1987].

Для определения ТБГ в сыворотке крови (беременность 16 недель) на мембрану наносили моноклональные антитела к ТБГ в той же концентрации и таким же образом, что и в описанном определении АФП. В качестве контролей использовали сам белок - «К+» и АФП - «К-». В ходе анализа в лунки вносили образцы референсного белка, раститрованного с шагом 10 параллельно с исследуемыми образцами в аналогичном разведении. Детекцию осуществляли конъюгатом моноклональных антител к ТБГ с частицами углерода (рис.16).

Чувствительность определения ТБГ в системе дот-иммуноаналитического исследования составила 1,0 нг/мл. Следовательно, с учетом разведения концентрация определяемого белка в исследуемой пробе находилась в диапазоне от 10 до 100 мкг/мл. Согласно литературным данным, среднее значение нормы ТБГ в материнской сыворотке при сроке беременности 16 недель составляет 48 мкг/мл [Богданович и др., 2004].

Безусловно, с позиций количественной формализации результатов, полученную точность определения трудно назвать удовлетворительной, отсюда и квалификация разработанного метода как полуколичественного. Однако следует отметить, что для увеличения точности оценки результатов достаточно использовать более дробное разведение референсного и исследуемого материала.

Возможность количественной формализации получаемых результатов (даже с точки зрения оценки динамического «больше-меньше») может иметь особое значение при анализе парных проб, когда исследования одного и того же параметра осуществляются через определенные временные промежутки (1-2 недели). Разработанная система анализа может служить надежным инструментом, позволяющим динамически следить за концентрацией ТБГ, отсутствие прироста которого при еженедельном определении позволяет диагностировать наличие плацентарной недостаточности.

Полуколичественная оценка процесса сероконверсии в ходе получения специфических антител. Известна важность контроля за процессом выработки антител при иммунизации лабораторных животных. Наиболее широко используемым методом в современной лабораторной практике, является метод двойной радиальной иммунодиффузии в геле [Оухтерлони, 1949]. Метод достаточно демонстративный, но занимает слишком много времени, малочувствителен и страдает определенным субъективизмом в оценке результатов. Этих недостатков лишена дот-иммуноаналитическая система определения антител с использованием уже описанного углеродного конъюгата с G белком.

На нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм при помощи устройства «Био-Дот» наносили АФП из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР объемом 20 мкл, в качестве внутреннего положительного контроля - IgG козы, в качестве внутреннего отрицательного контроля - БСА. После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, как описано выше, и вносили в лунки образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. Референсные пробы - разведения козьих анти-АФП антител с известной концентрацией в ЗФР, исследуемые - разведения сыворотки крови иммунизированной козы. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь иммуносорбент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата G белка с частицами углерода в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис.17).

Время проведения анализа, если не считать время подготовки иммуносорбента, - 25 минут, чувствительность определения - 10 пг/мл. Анализируя полученные результаты, можно рассчитать примерную концентрацию антител в исследуемой сыворотке. Последняя визуализируемая точка, равная 10 пг/мл, в ряду разведений сывороток соответствует разведению 1:10⁷. Из этого следует, что концентрация антител в исследуемой сыворотке составляет 0,1 мг/мл.

Описанную систему анализа легко адаптировать для определения практически любых антител в любом биологическом материале. Отсюда возможность разработки систем простого и надежного контроля за эффективностью процессов вакцинации человека и животных. Это могло бы найти свое применение в ветеринарии, особенно в условиях угрозы эпидемического кризиса.

Биотин-стрептавидиновые взаимодействия в иммунодиагностике.

Универсальность уже описанных систем детекции стереоспецифических взаимодействий, основанных на использовании в качестве аффинного соединения конъюгата G белка бесполезна, когда единственным способом связывания определяемого лиганда с твердой фазой является использование специфических антител. Решение проблемы в виде синтеза конъюгата с использованием вторых антител, конъюгированных с частицами углерода при этом не всегда возможно по ряду вполне определенных причин, чаще всего - экономических. На наш взгляд, уместно использование уникальных способностей биотина и стрептавидина. Стрептавидин - белок, вырабатываемый Streptomyces avidinii, обладающий очень высоким сродством к биотину, благодаря наличию в структуре его молекулы четырех центров связывания. Наиболее стандартное применения этого белка - выявление биотинилированной ДНК в методе нерадиоактивной гибридизации in situ, где обычно он используется в комплексе с флуоресцентной или ферментной меткой. Однако биотинилировать можно не только ДНК. Используя N-гидроксисукцинимидный эфир аминокапроидбиотина, можно легко биотинилировать практически любые белки, в том числе и антитела. Именно такие биотинилированные зонды мы использовали в системах диагностики, где в качестве универсального детектирующего реагента применяли уже упомянутый конъюгат стрептавидина с углеродными частицами, синтезированный по описанной для G белка одноэтапной схеме.

Определение столбнячного и ботулинического анатоксинов на непористой твердой фазе. В качестве основы твердофазного реагента использовали плоское дно лунок планшета, предназначенного для серийных разведений, изготовленного из белого полистирола фирмы Linbro (США). На дно лунок сорбировали антитела к столбнячному и ботулиническому анатоксинам дотами из капель по 5 мкл в концентрации 0,1 мг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ). После инкубации во влажной камере при температуре +37^оС капли удаляли, а поверхность иммуносорбента промывали ЗФРТ. В качестве внутреннего положительного контроля в каждой лунке сорбировали биотинилированный БСА, в качестве отрицательного - IgG человека. В лунки вносили исследуемые образцы соответствующих анатоксинов в ЗФРТ в разведении, кратном двум и после 30-ти минутной инкубации и двукратной промывки - соответствующие биотинилированные антитела: в одном случае - к столбнячному, в другом - к ботулиническому анатоксинам. Время инкубации составляло 30 минут, после чего лунки промывали ЗФРТ и осуществляли детекцию конъюгатом стрептавидина с углеродом в течение 15 минут (рис.18).

Чувствительность анализируемой системы 10 и 100 нг/мл не может считаться достаточной для целей реальной диагностики. Однако следует учитывать тот факт, что емкость сорбции на непористой твердой фазе существенно ниже, чем на пористых мембранах, что в конечном итоге и ограничивает диагностические возможности систем анализа, сконструированных на основе непористых материалов. В то же время описываемый материал имеет несомненное достоинство в том, что абсолютно не требует процедуры блокирования своей поверхности после комплексирования с анти-лигандами. Многочисленными экспериментами доказано отсутствие какого бы то ни было неспецифического взаимодействия углеродных конъюгатов с поверхностью полистирольного планшета. Что касается исследования аналитических параметров определения, то они были воспроизведены в ходе тестирования 24-х стрептавидиновых конъюгатов. Демонстрируемая система тестирования при помощи стрептавидинового конъюгата позволяет прогнозировать реальную возможность конструирования такого же универсального инструмента, как и в случае с конъюгатом G белка с углеродными частицами. В системе аналитической процедуры достаточно сменить только твердофазный реагент и биотинилированные зонды, чтобы получить систему, способную определять практически любой лиганд, к которому возможно получение специфических антител. Что же касается возможностей повышения чувствительности определения, то можно выделить, как минимум, два направления. Первое предусматривает использование в качестве иммуносорбента пористых материалов с сорбированными на них анти-лигандами, второе - усиление результирующего сигнала, введением в систему детекции конъюгат биотина с углеродом.

В качестве примера универсальных возможностей разработанного метода можно представить экспресс-применение биотин-стрептавидинового конъюгата для дифференциальной детекции IgG.

В ходе выделения и очистки одного из белков фетоплацентарного комплекса человека с использованием двух аффинных сорбентов: козьи антитела против АФП и кроличьи антитела против IgG человека, конъюгированных с сефарозой, в получаемом препарате появилась контаминация, верифицированная как IgG. Для идентификации видопринадлежности иммуноглобулинов использовали две полоски нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, на которые сорбировали контаминированные пробы и биотинилированный БСА (Bi-БСА) в качестве положительного контроля. После блокирования в стандартных для этой процедуры условиях, полоски инкубировали, в одном случае, с биотинилированными анти-кроличьими антителами, в другом - с биотинилированными анти-козьими антителами. После промывки иммуносорбентов осуществляли детекцию конъюгатом стрептавидин-углерод. Результаты анализа представлены на рис. 19.

Из результатов анализа следует, что получаемый препарат был контаминирован кроличьими антителами, что свидетельствует об утечке лиганда с применяемой на стадии доочистки аффинной колонки. Положительный и отрицательный контроли убедительно продемонстрировали высокий уровень специфичности системы анализа. Подобный пример может служить демонстрацией универсальных способностей сконструированной системы детекции и прогнозировать возможность формирования универсального набора для конструирования систем анализа в условиях любой исследовательской лаборатории в зависимости от актуальных потребностей.

Привлекательной стороной использования особенностей биотин-стрептавидинового взаимодействия явилась возможности усиления чувствительности детекции. Идея использования амплификации результирующего сигнала потребовала синтеза углеродного конъюгата с биотином в качестве аффинного соединения. Для этого в качестве исходного реагента использовали биотинилированный БСА. Схема одноэтапного синтеза ничем не отличалась от описанной технологии получения диагностикумов с G белком, стрептавидином, очищенными поли- и моноклональными антителами.

Для реализации идеи усиления результирующего сигнала на дно лунок полистирольного планшета сорбировали описанным способом биотинилированный БСА дотами из капель по 5 мкл из разведений кратных двум в КББ, начиная с 5 мкг/мл. После комплексирования в лунки вносили в одном случае конъюгат стрептавидин-углерод, в другом - смесь равных объемов конъюгатов стрептавидин-углерод и биотин-углерод (рис. 20).

Представленные результаты подтверждают возможность повышения чувствительности определения с использованием приема усиления результирующего сигнала введением в систему детекции биотинилированного углерода. Чувствительность определения в стандартных условиях составила 20 нг/мл, с усилением - 5 нг/мл. Механизм наблюдаемого усиления можно представить следующим образом. Частицы углерода связываются со специфическим иммунным комплексом на поверхности твердой фазы посредством взаимодействия стрептавидина на их поверхности с биотинилированным лигандом. В свою очередь, частицы углерода, поверхность которых модифицирована биотином, связываются с уже иммобилизованными частицами стрептавидинового диагностикума.

И те и другие частицы доступны для продолжения взаимных «контактов», осуществление которых приводит к амплифицированному увеличению числа связанных углеродных частиц в зоне сорбции специфических комплексов или молекул, что и способствует усилению результирующего сигнала. Кроме того, пространственная структура конъюгатов позволяет связываться с сорбированным на твердой фазе лигандом преформированного комплекса, образующегося в жидкой фазе реакционного объема. В сочетании с использованием пористого материала для сорбции анти-лигандов описанный прием может существенно повысить чувствительность детекции. Данное предположение было наглядно подтверждено в варианте определения анти-человеческих антител при анализе кроличьей иммунной сыворотки с целью оценки эффективности сероконверсии. Для проведения анализа поверхность нитроцеллюлозных полосок сенсибилизировали иммуноглобулинами G человека. Использовали уже описанное приспособление «Био-Дот». В прибор устанавливали мембрану с диаметром пор 0,45 мкм и в 6 рядов лунок вносили анти-лиганды по 20 мкл из раствора с концентрацией 1 мг/мл ЗФР. В качестве внутреннего положительного контроля использовали биотинилированный БСА, в качестве отрицательного - интактный БСА. После полного высушивания анти-лигандов полоски блокировали описанным способом и вновь высушивали. Подготовленный подобным образом иммуносорбент вновь помещали в прибор и вносили в нечетные ряды лунок по 0,2 мл растворов кроличьих антител против IgG человека с известной концентрацией от 50 мкг/мл до 5 пг/мл. В лунки четных рядов - образцы сыворотки иммунизированного кролика по 0,2 мл, разведенной в ЗФРТ с шагом 10. После полного прохождения образцов сквозь мембрану лунки промывали ЗФРТ 3-х кратно по 0,2 мл, после чего вносили в каждую лунку по 20 мкл биотинилированных анти-кроличьих антител в концентрации 1,0 мг/мл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После двукратной промывки лунок ЗФРТ мембрану извлекали из прибора, вновь промывали и осуществляли детекцию в стандартной системе стрептавидиновым конъюгатом, описанной выше смесью конъюгатов стрептавидин-углерод и биотин-углерод и ферментным конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена (рис.21).

Из результатов проведенных сравнительных анализов следует, что вариант совместного использования углеродных конъюгатов на основе стрептавидина и биотина позволяет существенно (в данном случае в 100 раз) повысить чувствительность определения.

Ферментная детекция, чувствительность которой равна чувствительности определения стрептавидиновым конъюгатом в стандартных условиях (без усиления), тем не менее, проигрывает по другим важным характеристикам. Прежде всего, обращает на себя внимание наличие слабого сигнала (фона) в зоне отрицательного контроля. Факт вполне объяснимый тем обстоятельством, что ферментная метка, особенно пероксидазная, обладает способностью к неспецифическому связыванию, как с белками, так и с пористыми материалами на основе нитроцеллюлозы. Дело в том, что общепринятая технология получения пероксидазных конъюгатов [Tijssen, 1985] предусматривает периодатное окисление фермента с последующим после конъюгирования восстановлением боргидридом натрия. Даже при самом незначительном от исчерпывающего отклонении в восстановлении окисленных форм фермента, что часто бывает в условиях масштабированного производства, появляются проблемы с фоном в ходе аналитических исследований.

Все описанные выше системы аналитического определения были либо направлены на детекцию иммунореактивных соединений, либо использовали иммунореактивные соединения в структуре аналитической аранжировки. Однако, если иметь ввиду более широкое понятие «стереоспецифический анализ», можно легко прогнозировать возможность разработки систем, основанных на принципах генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного взаимодействий, в которых также есть место реализации достоинств углеродных конъюгатов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования наглядно продемонстрировали возможность получения надежных диагностикумов, эксплуатирующих уникальные природные свойства углеродных частиц. Химически индифферентный материал может быть вовлечен в физико-химическую перестройку, результатом которой является получение принципиально нового продукта - конъюгата инертных в отношении образования прочных химических связей углеродных частиц с различными биологически активными молекулами. Высокий уровень оптической контрастности (хромогенности) обеспечивает углеродной метке приоритетное положение в ряду любых цветных материалов, применяемых в диагностических системах.

Разработанная одноэтапная технологическая схема синтеза углеродных конъюгатов, по существу, представляет собой простой и надежный способ масштабного производства диагностикумов разной направленности. При этом, она объективно не зависит ни от условий производства, ни от уникального оборудования, требующего, как правило, дополнительных затрат на обслуживание и эксплуатацию. Смена производимого продукта не влечет за собой никаких технологических изменений и связанных с этим материальных затрат, а вопросы масштабирования решаются простым изменением объема сорбента, участвующего в процессе хроматографии.

Представленные результаты аналитического тестирования в полной мере демонстрируют основные привлекательные характеристики тест-систем, конструируемых с использованием углеродных конъюгатов. Высокая чувствительность за счет исключительной хромофорности углеродных частиц и максимального размещения активных групп на их поверхности обеспечивают получение диагностически значимого результата. Высокая специфичность, подтвержденная отсутствием примеров неспецифического связывания, в основе которой лежат технологические решения, предусматривающие минимизацию неспецифических взаимодействий, отвергает возможность получения ложноположительного результата, который может стать причиной негативных последствий некорректного тестирования. Стабильность реагентов, обусловленная прочностью химических связей, что являющается следствием надежного конъюгирования аффинных соединений с частицами коллоидного углерода, обеспечивает не только хорошую воспроизводимость результатов, но и возможность длительного и нетребовательного хранения. Это в равной степени касается и перспектив неограниченно долгого хранения результатов анализа, что бывает чрезвычайно важно в ситуациях, когда необходимо сравнение результатов исследований, разнесенных во времени.

Не меньшее значение имеет ряд процедурных удобств, свойственных сконструированным системам аналитического тестирования. Особенно это касается возможности создания экспрессных тест-систем. Такое качество, как простота исполнения анализа, освобождает от необходимости подготовки квалифицированных специалистов, что часто бывает серьезной проблемой в условиях небольших отдаленных от крупных центров медицинских пунктов и лабораторий. Наглядность и очевидность полученных результатов анализов предохраняют от неоднозначности и субъективизма в их трактовке, а оперативность исполнения позволяет сократить до минимума время адекватной реакции, особенно в случаях необходимости экстренного принятия мер интенсивной терапии. Все это может и должно стать основой для скорейшего доведения описанных и перспективных моделей аналитических систем до готового к использованию состояния и перехода к масштабному выпуску диагностических тест-систем углеродного происхождения.

Описанные конкретные системы аналитического определения различных лигандов никоим образом не исчерпывают возможности применения, как разработанной технологии, так и спектра конструируемых на ее основе систем детекции. Все описанные аналитические модели и различным образом аранжированные форматные процедуры определения принципиально отличающихся лигандов служат лишь демонстрацией некоторых возможностей применения детектирующих реагентов, синтезированных на основе частиц углерода. Более того, представленные примеры и те, которые представляют собой лабораторные модели, и те, которые используются в реальной лабораторной аналитической практике (идентификация IgG, оценка уровня сероконверсии), могут быть отнесены к группе, так называемых, неинструментальных методов исследования. Но неинструментальность не является основной целью представляемого направления научных исследований, а потому, не ставится автором в ряд необходимых процедурных характеристик, оценивающих основные параметры сконструированных тест-систем с позиции их привлекательности. Есть все основания, в том числе и экспериментальные, полагать, что описанные диагностические реагенты могут быть с успехом использованы в разработке инструментально аранжированных методов, в частности, турбидиметрического анализа с использованием спектрофотометрии для формализации получаемых результатов и плашечного варианта твердофазного анализа с детекцией результатов в планшетном фотометре. Очевидно, что это позволит существенно модифицировать целый ряд диагностических методов исследования, находящихся в арсенале клинических лабораторий, но это уже цель будущих исследований.

Необходимо отметить, что не все представленные аранжировки аналитических систем являются совершенными и технологичными. Нельзя, например, надеяться на то, что в любой лаборатории найдется прибор «Био-Дот» для нанесения образцов на мембрану и осуществления анализа. Отсюда - необходимость в дальнейшей разработке различных форматных аранжировок и процедурных приемов, основанных на использовании описанных свойств углеродных конъюгатов.

Таким образом, разработанная технология синтеза конъюгатов углеродных наночастиц может стать основой для конструирования широкого спектра эффективных систем для упрощенного диагностического тестирования, способных существенно расширить диапазон и повысить уровень информативной ценности и надежности фундаментальных и прикладных аналитических исследований в биологии, медицине, криминологии, сельском хозяйстве и т.д. Привлекательные характеристики таких тест-систем с успехом могут быть реализованы в разнообразных "один пациент-один тест" наборах для амбулаторных, пребольничных и больничных анализов, включая срочные клинические и эпидемические ситуации, в массовых "домашних" системах, пригодных для индивидуального использования, в полевых условиях работы экспедиционных групп и службы воинских подразделений, в экстренных ситуациях работы бригад скорой помощи и отрядов МЧС. Ими могут быть укомплектованы все ветеринарные службы: от клинических ветлабораторий до сельских ветпунктов, мобильные аптечки, необходимые в повседневной практике сельскохозяйственного производства. Главное преимущество разработанной технологии, заключается в ковалентном механизме конъюгирования биореагентов и углеродных частиц, что способно обеспечить перспективу разработки и широкое внедрение диагностикумов, сконструированных на ее основе.

ВЫВОДЫ

1. Разработана одноэтапная технология синтеза белково-углеродных конъюгатов, предусматривающая гидрофилизирующую пептизацию углеродных наночастиц аффинным соединением, активацию гомобифункциональным реагентом и конъюгирование, осуществляемые единовременно. Эффективность разработанной технологии воспроизведена в 54-х синтезах.

2. Получаемые конъюгаты могут сохранять свои аналитические и эксплуатационные свойства в условиях хранения при +4^оС - +8^оС в течение 10-ти лет. Кратковременные (2 недели) отклонения в сторону повышения температуры хранения до +22^оС не вызывают негативного влияния на свойства диагностикумов.

3. Обоснована универсальная система определения иммуноглобулинов класса G человека и животных, позволяющая с высокой чувствительностью и специфичностью определять любые лиганды, обладающие сродством к G белку стрептококка, использованного в качестве аффинного соединения диагностикума.

4. Обоснованы системы иммуноаналитического определения ХГЧ, стрептококков группы А, альфа-фетопротеина и трофобластического в-1-гликопротеина человека на основе антител. Охарактеризованы их аналитические параметры. Показана возможность качественного и полуколичественного определения лигандов в различных аранжировках: дот-анализ, иммунохроматография и иммунофильтрация.

5. Разработаны и апробированы универсальные методы определения различных лигандов (столбнячного и ботулинического анатоксинов, антител), основанные на свойствах и возможностях биотин-стрептавидинового взаимодействия, позволяющие различным образом аранжировать формат анализа. Показана возможность усиления результирующего сигнала, приводящая к увеличению чувствительности определения в 4 - 100 раз.

Практические рекомендации

1. Рекомендовать научно-производственным подразделениям, работы которых связаны с выделением и очисткой биологических макромолекул из биоматериалов, использовать углеродные тест-системы для определения IgG. Это позволит иметь постоянную оперативную информацию о контаминированности материала. Кроме того, станет возможным простой и достоверный контроль состояния сорбентов в случаях применения аффинной хроматографии.

2. Рекомендовать специалистам в области экспериментальной иммунологии и ветеринарии использовать системы определения IgG для наблюдения за степенью сероконверсии при иммунизации животных в процессах получения антител, а также для оценки эффективности вакцинации.

3. Рекомендовать специалистам Роспотребнадзора использовать системы экспрессного определения для оценки качества воды и пищевых продуктов.

4. Рекомендовать научно-исследовательским лабораториям использование углеродных конъюгатов при конструировании систем анализа, основанных на принципах иммунного блоттинга, как более стабильных реагентов по сравнению с ферментными диагностикумами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ.

1. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Шмагель К., Демаков В., Тузанкина И., Осипенко А., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е., Ширшева И. Физиология иммунной системы и экология // «Иммунология». 2001. №3. С. 12-16.

2. Раев М.Б., Орлова Е.Г., Горбунова О.Л., Красных М.С. Конструирование и применение универсальной тест-системы с использованием неферментных диагностикумов для безинструментального оценки уровня специфических антител // Биотехнология. 2006. №1. С. 84-88.

3. Раев М.Б. Частицы коллоидного углерода в качестве меток диагностических реагентов // Вестник уральской медицинской академической науки. 2006. №3(1). С. 202 - 205.

4. Королевская Л.Б., Шмагель К.В., Раев М.Б., Николаева А.М. Определение размера и концентрации циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по изотипам иммуноглобулинов // Вестник уральской медицинской академической науки. 2006. №3(1). С. 107-109.

5. Раев М.Б. Частицы коллоидного углерода в системах неинструментальной диагностики // Клиническая и лабораторная диагностика. 2008. №2. С. 44-49.

Статьи в журналах, сборниках, методические рекомендации для врачей.

6. Rayev М., Ambrosov I, Briko N. A novel method for the serodiagnosis of group A streptococcal antibodies. // Streptococci and the Host. Ad. Thea Horaud at al. Advances in Experimental medicine and biology. Plenum Press, New York and London. 1997. V.418. Р. 327-329.

7. Ambrosov I, Rayev М., Briko N. A novel method for the primary diagnosis of group A streptococci from clinical specimens. // Streptococci and the Host. Ad. Thea Horaud at al. Advances in Experimental medicine and biology. Plenum Press, New York and London. 1997. V.418. Р. 323-325,

8. Бахметьев Б., Шилов Ю., Ширшев С., Кеворков Н., Черешнев В., Раев М. Особенности функционирования иммунной системы у работников нефтяной отрасли в регионах проведения технологических подземных ядерных взрывов // Сб. научных работ «Проблемы экспериментальной физиологии». Москва-Екатеринбург. 1997. С. 169-179.

9. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Шмагель К., Демаков В., Тузанкина И., Осипенко А., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е., Ширшева И. Физиология иммунной системы и экология // ВИНИТИ Новости науки и техники, Серия: Медицина. Аллергология, астма и клиническая иммунология. 2000. №8. С. 21-27.

10. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Шмагель К., Демаков В., Королевская Л., Старкова Е., Ширшева И. Промышленное загрязнение окружающей среды и иммунная система // «Клиническая и прикладная иммунология». 2001. №1. С. 147-152.

11. Раев М., Плаксин Д., Кеворков Н., Черешнев В. Разработка новых тест-систем для неинструментального определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. (Новый биотехнологический подход к диагностике) // Сборник «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса». ISTC. 2001. С. 333-337.

12. Бахметьев Б.А., Кеворков Н.Н., Королевская Л.Б., Лихачева Н.С., Лопатина В.А., Молчанова Н.Н., Раев М.Б., Старкова Е.А., Шилов Ю.И., Ширшев С.В., Ширшева И.В., Харитонова А.В., Перевозчикова Н.Н., Езова Е.А., Токмакова О.Г. Основные показатели иммунограммы детей и взрослых Пермской области // Справочно-методический материал для врачей, Пермь. 2002.

13. Раев М.Б., Шмагель К.В., Черешнев В.А. Использование наночастиц углерода в иммунодиагностике // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2007. №3(17). С. 59-62.

Патенты

14. Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Метод стереоспецифического анализа и метод получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Патент РФ № 2089212 от 10.09.1997.

15. Раев М.Б., Плаксин Д.Ю. Способ определения иммунореактивных соединений. Патент РФ № 2268471от 20.01.2006.

16. Родионов С.Ю., Раев М.Б., Орлова Е.Г. Способ получения препарата альфа-фетопротеин сухой. Патент РФ № 2283131 от 10.09.2006.

17. Раев М.Б. Способ выделения и очистки альфа-фетопротеина. Патент РФ № 2302424 от 10.07.2007.

18. Раев М.Б. Способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Положительное решение от 05.02.2007 о выдаче патента на изобретение по заявке № 20051128104/15(031560).

19. Раев М.Б., Шмагель К.В., Раев А.Б., Черешнев В.А., Демаков В.А., Бахметьев Б.А. Способ выделения и очистки трофобластического в-1-гликопротеина. Положительное решение от 09.11.2007 о выдаче патента на изобретение по заявке № 2007100406/15(000429).

20. Раев М.Б. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов иммуноаналитических систем. Положительное решение от 30.10.2007 о выдаче патента на изобретение по заявке № 2007103808/15(004097).

Тезисы докладов и статей.

21. Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Новые системы детекции стереоспецифических взаимодействий с использованием водонерастворимых красителей // Тез. докл. на международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 16-26 июля, 1991, стр. 246-247.

22. Плаксин Д., Громаковская Е., Раев М., Якунина Н., Коваленко В., Товер А., Трифонов В., Павлова И. Новые подходы к неинструментальной экспресс диагностике // LXII Сессия общего собрания Академии мед. наук СССР, Москва, 19-23 марта, 1991.

23. Бахметьев Б.А Шилов Ю.И., Ширшев С.В., Евдокимова И.В., Леденцов В.В., Раев М.Б., Кокшаров С.И. Иммунологическая оценка критерий экологических групп риска детей // Тез. докл. международного симпозиума «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология». Москва-Пермь, 11-19 мая, 1993, стр. 126-127.

24. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Вторичный иммунодефицит, индуцированный неблагоприятными условиями окружающей среды // Тез. докл. ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, стр. 1281.

25. Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Новые реагенты для неинструментального стереоспецифического анализа на основе суспензоидных углеродных частиц // Тез. докл. конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994.

26. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Ширшева И., Леденцов В. Иммунные изменения у работников нефтяной отрасли в регионах проведения подземных ядерных взрывов // Intern. J. Immunorehabilitation, 1994, № 1.

27. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Ширшева И. Иммунологические последствия подземных ядерных взрывов. Урал атомный: наука, промышленность, жизнь // Тез. докл. II Международного симпозиума, Екатеринбург, Ин-т промышленной экологии Уральского отделения РАН, 1994, С. 53-54.

28. Раев М. Тест-система для определения антител к ВИЧ-1,2 // Тез. докл. конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994.

29. Chereshnev V., Kevorkov N., Bachmetyev B., Rayev M.B., Shilov Ju., Shirshev S. Secondary immunodeficiency induced by unfavourable environmental conditions. // Allergy & Clinical Immunology News, Suppl. № 2, 1994, P. 195.

30. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Иммунореабилитация экологических вторичных иммунодефицитных состояний // Intern. J. Immunorehab, 1995, № 1.

31. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Ширшева И., Леденцов В. Иммунные и гематологические изменения у работников нефтяной отрасли в регионах проведения подземных ядерных взрывов // Тез. докл. XII Российской научной конференции, Челябинск, 1995, С. 115.

32. В.Черешнев, Н.Кеворков, Б.Бахметьев, М.Раев, Ю.Шилов, С.Ширшев.

Иммунореабилитация экологических вторичных иммунодефицитных состояний. Intern. J. Immunorehab, 1995, № 1.

33. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Шилов Ю., Ширшев С., Раев М. Экологически стимулированный вторичные иммунодефицитные состояния // Международная конференция по нейроиммунным взаимодействиям и окружающая среда (ICONE”95), 17-24 июля, Санкт-Петербург, 1995, стр. 102.

34. Раев М., Амбросов И., Брико Н. Новый метод прямой диагностики стрептококка гр.А. // Тез. докл. XIII Лэнсфилдского международного симпозиума по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, С. 258.

35. Амбросов И., Раев М., Брико Н. Новый метод для серодиагностики стрептококка гр. А // Тез. докл. XIII Лэнгсфилдского международного симпозиума по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, С. 259.

36. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Токмакова О. Влияние неблагоприятных условий окружающей среды на взаимоотношения возраста и иммунной системы детей // Тез. докл. 5 EFIT'96. Иерусалим, Израйль, 1996.

37. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Иммунологические критерии для оценки состояния здоровья населения при выраженной антропогенной нагрузке // Тез. докл. 2 конф. “Sustainable development: System analysis in Ecology”. Севастополь, Украина, 1996.

38. Раев М., Плаксин Д., Громаковская Е., Амбросов И. Тест-система для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 // Тез. докл. AAAAI/AAI/CIS Joint Meeting. San Francisco, USA, 21-26 февраля, 1997.

39. Раев М., Плаксин Д., Громаковская Е., Амбросов И. Метод неинструментального стереоспецифического анализа на основе водонерастворимых цветных красителей // Доклад на 4^м Национальном конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, С. 286-287.

40. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Исследование иммунной системы в сочетании с оценкой экологического влияния на человека // Доклад на 1^м Национальном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов, Москва, 1997, С. 345.

41. Черешнев В., Бахметьев Б., Кеворков Н., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Значение мониторинга иммунной системы для предупреждения ее функциональных нарушений в регионах промышленных // XIII^я Российская научная конференция, Челябинск, 1997, С. 182-183.

42. Черешнев В., Кеворков Н., Бахметьев Б., Шилов Ю., Ширшев С., Раев М., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е. Вторичные экологически обусловленные иммунодефициты. // Фридмановские чтения. Тез. докл. Всероссийской научной конференции, Пермь, 1988, С. 142-143.

43. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е. Принципы иммунокоррекции вторичных иммунодефицитов // 2^я Национальная конференция российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов, Москва, 1998.

44. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е. Влияние выраженной антропогенной нагрузки на функционирование иммунной системы населения // Тез. докл. 2^й Международной конференции к 100-летию НПО «Биомед», Пермь, 1998.

45. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Королевская Л., Дианова Д., Черешнева М., Старкова Е. Иммунотерапия и иммунореабилитация при вторичных иммунодефицитах // Тез. докл. Международной конференции «Загрязнение окружающей среды», Москва, 1998.

46. Бахметьев Б., Раев М., Старкова Е., Кеворков Н. Новый метод идентификации CD-положительных клеток // The FASEB Journal, 1998, т.12, № 4, часть 1, стр. A 617.

47. Раев М., Плаксин Д., Громаковская Е. Многоцелевой стереоспецифический анализ на основе водонерастворимых цветных красителей // The FASEB Journal, 1998, т.12, № 4, часть 1, стр. A915.

48. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С., Королевская Л., Старкова Е., Черешнева М., Тендрякова С. Экологически индуцированные иммунные нарушения // Тез. докл. III^й Междунар. конгресс по патофизиологии. Лахти, Финляндия, 1998.

49. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Раев М., Шилов Ю., Ширшев С. Экология и иммунитет - патофизиологические аспекты // II^й Российский конгресс по патофизиологии, Москва, 2000, С.158.

50. Кеворков Н., Черешнев В., Бахметьев Б., Шилов Ю., Ширшев С., Раев М. Экология и иммунитет. // Аллергология и иммунология. 2000, Т.2, №3, С.11.

51. Раев М., Плаксин Д., Кеворков Н. Неферментная система визуализации в неинструментальной диагностике // Доклад на I^й конференции иммунологов Урала. Екатеринбург, Россия, 2001.

52. Раев М.Б., Плаксин Д.Ю., Громаковская Е.Т.. Безинструментальные методы неферментного стереоспецифического анализа // Тез. докл. на II конференции иммунологов Урала. Пермь, Россия, 2002.

53. Гупалова Т.В.,.Палагнюк В.Г, Раев М.Б., Тотолян А.А. Быстрый метод оценки микроальбуминурии // Тез. 15 IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 22 National Congress of the Spanish Society of Clinical Biochemistry and Molecular Pathology, Euromedlab Barcelona, Испания, 2003, С. 156.

54. Раев М.Б., Орлова Е.Г.,.Красных М.С, Горбунова О.Л., Родионов С.Ю. Сравнительная оценка методов определения специфических антител к альфа-фетопротеину в сыворотке иммунизированных коз // «Медицинская иммунология», С. Петербург, 2005, т.7, №2-3, С. 279.

55. Раев М.Б., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г., Родионов С.Ю. Сравнительный анализ использования линейного и градиентного ПААГ на примере исследования электрфоретической чистоты альфа-фетопротеина // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С. 76-77.

56. Крапивина О.А., Родионов С.Ю., Ханжин С.К., Раев М.Б., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г. Особенности иммунизации коз для получения антител против альфа-фетопротеина человека в процессе серийного производства препарата «Профеталь» // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С. 119.

57. Раев М.Б., Зайцева А.В., Хорошева Л.Р., Суховая Д.А., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г., Родионов С.Ю. Проблемы иммуноаффинной очистки альфа-фетопротеина и методы негативной иммуносорбции как способ их решения // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С. 122.

58. Раев М.Б., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г., Родионов С.Ю. Оценка чувствительности различных методов определения специфических антител к альфа-фетопротеину в сыворотке иммунизированных коз // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С. 122-123.

59. Раев М.Б., Суховая Д.А., Хорошева Л.Р., Зайцева А.В., Родионов С.Ю. К вопросу о способах синтеза иммуносорбентов для аффинной хроматографии белков фетоплацентарного комплекса // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С. 123.

60. Раев М.Б., Горбунова О.Л., Красных М.С., Орлова Е.Г., Родионов С.Ю. Использование безинструментальных тест-систем для определения уровня специфических антител // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С. 123.

61. Шур Н.Н., Тараненко Л.А., Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Орлова Е.Г., Раев М.Б., Сибиряк С.В. Динамика иммунологических показателей у больных злокачественными опухолями при комбинированной и монотерапии препаратом «Профеталь» // Предварительные результаты. «Иммунология Урала», Уфа, 2005, № 1(4), С. 159-161.

62. Раев М.Б., Орлова Е.Г., Горбунова О.Л., Красных М.С. Разработка универсальной тест-системы с использованием неферментного диагностикума для безинструментального определения уровня специфических антител // «Иммунология Урала», Уфа, 2005, № 1(4), С. 192-194.

63. Раев М.Б. Универсальный подход к конструированию систем безинструментальной диагностики // Материалы Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Russian Journal of Immunology, Курск, 2006, V.9, №3, С. 171.

64. Раев М.Б. Качественное и полуколичественное определение белков репродукции методами неинструментальной диагностики // Russian Journal of Immunology, Сочи, 2007, V.9, supl. 4, Р. 136-137.

Размещено на Allbest.ru