Интероцептивные эффекты психотропных препаратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Интероцептивные эффекты психотропных препаратов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Одним из актуальных направлений современной экспериментальной и клинической фармакологии является изучение интероцептивных (субъективных) эффектов психотропных препаратов, которые, как полагают, являются важным фактором, повышающим риск развития лекарственной зависимости (Rush, 2004; Vansickel, 2006). Способность фармакологических агентов проявлять интероцептивные свойства лежит в основе фундаментального феномена «обучения, зависимого от состояния», состоящего в том, что ранее выработанный у человека или животного условный рефлекс воспроизводится в наиболее полной форме только в том состоянии, в котором происходит его выработка (Overton, 1984, Khavandgar, 2003). Моделируемое введением веществ «обучение, зависимое от состояния» обнаруживается в явлениях, которые можно подразделить на две основные группы: диссоциированное обучение (state dependent learning) и лекарственную дифференцировку (ЛкД) (drug discrimination).

В эксперименте при обучении животных ЛкД интероцептивные эффекты фармакологических агентов выполняют функцию дифференцировочных стимулов, указывая на высокую вероятность предъявления физиологически значимого для организма безусловного раздражителя (вознаграждения) при совершении определенной иструментальной реакции. В процессе такого условнорефлекторного обучения у животного формируется стабильная интероцептивная дифференцировка по степени, воспроизведения которой у обученных животных судят об изменении интероцептивных эффектов тренировочных веществ после самых разнообразных фармакологических манипуляции (Colpaert, 1999; Jarbe, 2008).

Являясь самостоятельным физиологическим феноменом, ЛкД составляет основу методологического подхода к экспериментальному изучению целого ряда проблем биологии и медицины. Современные классификационные схемы подтипов рецепторов нервной системы основываются на результатах исследований лигандного связывания и других методов анализа «ин витро», при использовании в качестве моделей патологии трансгенных и нокаутированных инбредных линий животных (Storustovu, 2006; Crestani, 2001; Morris, 2005). При этом остается актуальной проблема сопоставления этих данных с анализом действия психотропных препаратов и функционирования рецепторных систем в условиях «ин виво» и в исходных популяциях (wild) лабораторных животных (Rowlett, 2004; Atack, 2007). Высокая корреляция данных, полученных при изучении рецепторных механизмов действия веществ на основе анализа их интероцептивных эффектов, позволяет рассматривать ЛкД в качестве уникальной экспериментальной парадигмы, обеспечивающей высокий уровень адекватности информации о нейрохимических и молекулярных механизмах действия лекарственных препаратов «ин виво» (Lelas, 2001; Lelas, 2002).

Важной практической точкой приложения методологии, основанной на интероцептивных эффектах фармакологических агентов, является доклиническая оценка наркогенного потенциала новых психотропных лекарственных препаратов в сравнении с их известными аналогами и химически родственными соединениями (Wu, 2003; Barrett, 2005).

При изучении интероцептивных эффектов психотропных препаратов выделяют несколько основных актуальных направлений. Первый комплекс задач составляют исследования способности новых веществ проявлять субъективные эффекты и изучение механизмов их психотропной активности на основе методологии ЛкД (Recker, 2004). Разработка психотропных препаратов на основе новых фармакологических концепций часто имеет своим результатом создание новых психоактивных веществ оригинального, часто сложного, спектра действия, сочетающих анксиолитическое действие с ноотропным и / или нейропротективным, нейролептический эффект с ноотропными свойствами, опиат-зависимые аналгетические эффекты, сочетающиеся со слабой выраженностью подкрепляющих свойств. Это обусловливает необходимость сравнительного анализа интероцептивных свойств этих новых веществ и классических препаратов с целью определения перспективы изучения рецепторных механизмов их действия в условиях «ин виво» на основе методологии ЛкД, рисков развития у пациентов психологической лекарственной зависимости, возможных негативных влияний на процессы памяти и обучения. Вышеизложенное объясняет актуальность анализа особенностей динамики формирования ЛкД при изучении интероцептивных эффектов новых лекарственных препаратов как одного из фундаментальных компонентов спектра психотропной активности.

Вторым важным направлением является разработка, оптимизация и стандартизация экспериментальных методов для изучения интероцептивных эффектов веществ. При колоссальном методическом разнообразии, наблюдаемом в области изучения интероцептивных эффектов веществ, единично представлены экспериментальные работы, предметом которых является сравнительный анализ и обобщение различных подходов изучения ЛкД, в частности использования разных типов безусловного подкрепления при формировании дифференцировочного рефлекса, разных режимов оперантного обучения, вариаций тестовых процедур (Zarcone, 2000). Наиболее эффективным методом исследования ЛкД в настоящее время признаны оперантные модели поведения, представленные различными модификациями и используемые у разных видов лабораторных животных (Barrett, 2005; Platt, 2005; Carter, 2005). Однако единственная на сегодняшний день классификация дифференцируемости психотропных препаратов основана на динамике и специфичности интероцептивных свойств веществ при формировании ЛкД в условиях Т-образного лабиринта при электроболевом подкреплении (Overton, 1982). Вместе с тем, противоречивость данных, получаемых в разных экспериментальных работах при изучении специфичности и механизмов интероцептивных эффектов психотропных препаратов, часто объясняют особенностями методических модификаций формирования ЛкД и оценки «стимульного контроля» веществ (Zarcone, 2000).

В ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН наряду с бензодиазепиновыми (БД) анксиолитиками феназепамом и гидазепамом, в последние годы были созданы и внедряются в лечебную практику оригинальные вещества, сочетающие анксиолитический эффект с ноотропным и / или нейропротективным действием. Селективный анксиолитик с нейропротективным действием афобазол обладает принципиально новым для противотревожного средства механизмом действия, оказывая влияние на внутриклеточные процессы в результате избирательного взаимодействия с у-рецепторами (Середенин, 2006). В лечебной практике в качестве анксиолитического, ноотропного и нейропротективного средства применяется препарат мексидол (Воронина, 2001, 2004). На основе дизайна коротких пептидов создан препарат ноопепт, анксиолитическую и ноотропную активность которого связывают с его метаболитом циклопролил-глицином (ЦПГ), также определяемым в ЦНС млекопитающих в качестве эндогенного вещества (Гудашева, 1999, 2001). На стадии углубленного изучения в качестве новых аналгетиков находятся производные пептида дерморфина (Гузеватых, 2003). Вопрос о наличии дифференцировочных интероцептивных эффектов у ноотропных и / или нейропротективных препаратов, равно как и сравнительные аспекты интероцептивных эффектов нового селективного анксиолитика афобазола и классических БД препаратов, остается неясным. Выше изложенное обусловило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования состояла в сравнительном изучении особенностей интероцептивных эффектов психотропных препаратов основных фармакологических классов и новых веществ из разных фармакологических групп (анксиолитиков, атипичных нейролептиков, ноотропов, аналгетика) и разработке оптимальной стратегии изучения интероцептивных свойств новых психотропных препаратов в условиях оперантной модели лекарственной дифференцировки. Для решения выше означенной цели были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить сравнительный анализ динамики формирования ЛкД известных и новых психотропных препаратов при использовании разных режимов оперантного обучения (FR1 и FR10).

2. На основе дифференцированного анализа особенностей текущего процесса формирования ЛкД и ее воспроизведения определить параметры дифференцируемости веществ в условиях оперантной модели поведения.

3. Осуществить сравнительный анализ специфичности интероцептивных эффектов исследуемых препаратов и механизмов реализации их дифференцировочных стимульных свойств в условиях разных режимов оперантной модели лекарственной дифференцировки.

4. Определить роль отдельных модуляторных сайтов ГАМК_А-рецепторов в реализации интероцептивных эффектов веществ с анксиолитическим действием.

5. Провести анализ соотношения степени дифференцируемости препаратов из разных фармакологических классов и их специфических психотропных свойств.

6. На основе полученных данных определить общие принципы оптимизации методической схемы экспериментального изучения интероцептивных эффектов новых веществ из разных фармакологических классов в условиях оперантной модели ЛкД у крыс.

Научная новизна исследования. Выявлены различия в характеристиках интероцептивных стимульных свойств и особенности формирования ЛкД анксиолитиков бензодиазепиновой (БД) структуры и анксиолитиков с ноотропным и / или нейропротективным компонентами действия. Показано, что феназепам является высокодифференцируемым препаратом и характеризуется наибольшей специфичностью интероцептивных дифференцировочных стимульных свойств в ряду классических БД анксиолитиков, что проявляется в отсутствии генерализации интероцептивных эффектов феназепама при использовании в условиях заместительного тестирования положительных модуляторов ГАМКА-рецепторов барбитуратной и нейростероидной структуры. Полная генерализация интероцептивных эффектов феназепама наблюдается только при использовании лоразепама, что свидетельствует о наличии существенных отличительных особенностей в рецепторном механизме реализации психотропной активности феназепама и лоразепама по сравнению с другими БД. Вместе с тем, установлено, что специфичность интероцептивных свойств феназепама несколько выше, чем у лоразепама. Показана способность БД анксиолитика гидазепама частично воспроизводить стимульные свойства лоразепама в условиях оперантной модели ЛкД. Вместе с тем, гидазепам менее эффективен при воспроизведении интероцептивных стимульных свойств феназепама.

Впервые выявлены общие звенья в механизме реализации интероцептивных эффектов феназепама и лоразепама и изучены механизмы реализации интероцептивных эффектов гидазепама. Установлено, что в реализации стимульных свойств феназепама и гидазепама определяющую роль играет функциональное состояние БД модулирующего участка хлорного канала, что является общим звеном в механизме интероцептивных эффектов веществ БД структуры. Вместе с тем, интероцетивные свойства феназепама и лоразепама в значительной степени зависят от состояния ГАМК_А-рецепторов, что отличает их от гидазепама. Стимульные свойства феназепама и лоразепама не зависят от функциональной активности пикротоксинового и нейростероидного модулирующих сайтов, что отличает феназепам и лоразепам от других БД анксиолитиков. Впервые проведено изучение дифференцировочных стимульных свойств анксиолитиков с ноотропным и / или нейропротективным компонентами действия мексидола, афобазола и ЦПГ, атипичных нейролептиков сульпирида и дилепта, пептидного аналгетика дерморфина. Показано, что афобазол и дилепт относятся к группе недифференцируемых препаратов. Установлена средняя степень дифференцируемости мексидола при использовании разных режимов оперантного поведения (FR1 и FR10), ЦПГ в режиме непрерывного подкрепления, сульпирида в разных режимах оперантного обучения (FR1 и FR10) и дерморфина (FR10).

Показано, что ЛкД, вырабатываемая при использовании анксиолитиков с ноотропными и / или нейропротективными свойствами, характеризуется более длительными сроками обучения, более низким уровнем воспроизведения адекватных оперантных реакций, менее стабильным воспроизведением ЛкД.

Научно-практическая значимость работы. Данные о низкой дифференцируемости афобазола позволяют полагать полное отсутствие риска развития лекарственной зависимости и синдрома отмены при прекращении длительных приемов препарата.

Наличие средней степени дифференцируемости мексидола, ЦПГ и дерморфина свидетельствует о риске возникновения лекарственной зависимости при длительном применении веществ лишь у отдельных пациентов.

Данные о высокой специфичности стимульных свойств БД анксиолитиков (феназепама и лоразепама), низкой и средней дифференцируемости анксиолитиков с ноотропными и / или нейропротективными свойствами позволяют расширить международную классификацию психотропных препаратов, основанную на их дифференцируемости.

Определены подходы к оптимизации методики исследования интероцептивных эффектов психотропных препаратов. Показана эквипотенциальная эффективность использования в качестве базовых оперантных режимов FR1 и FR10 при выработке ЛкД и анализе механизмов интероцептивных эффектов, высоко дифференцируемых фармакологических агентов, что позволяет ускорить процедуру формирования ЛкД и изучение механизмов их действия при использовании оперантного рефлекса FR1.

Установленные в работе особенности формирования и воспроизведения ЛкД в условиях оперантной модели поведения у крыс позволяет определить общие подходы при изучении интероцептивных эффектов новых препаратов из разных фармакологических классов. При изучении стимульных свойств новых психотропных препаратов со сложным спектром поведенческих эффектов, сочетающих анксиолитические свойства с ноотропным и / или нейропротективным действием, предпочтение следует отдавать оперантному режиму FR10, поскольку динамика текущего процесса формирования ЛкД не совпадает с динамикой воспроизведения ЛкД и зависит от сложности базового условного рефлекса.

Связь с планами НИР. диссертация выполнена в рамках фундаментальной тематики НИР ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН - темы «Изучение механизмов эндо - и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» и гранта РФФИ 99-04-49-625 «Изучение механизмов интероцептивных стимульных свойств бензодиазепиновых анксиолитиков».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в докладах на всероссийских и международных конференциях: Международная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика С.В. Аничкова «Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий», Санкт-Петербург, 1992; VI и VII Российский Национальный Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 1999, 2000; «Нейрофармакология двадцать первого века», Санкт-Петербург, сентябрь 2002, 2-й Съезд Российского Научного Общества фармакологов, Москва, 2003 г.; 3-й Съезд Российского Научного Общества фармакологов «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007; 3-rd International Symposium «Pharmacology of Transmitter Interaction», Sofia, Bulgaria, 1990; 2-nd International Conference «Biological Basis of Individual Sensitivity to Psychotropic Drugs», Moscow, 1993; 5th Meeting of the European Behavioural Pharmacology Society (EBPS), Berline Germany, 1994; 1th European Congress of Pharmacology, Milan, Italy, 1995; 6th Meeting of the EBPS Cagliary, Italy, 1996; 7th Meeting International EBPS, Brno, Czech Republic and 5th International Meeting on Drug Discrimination of the Society for Stimulus properties of Drugs, Antwerp, Belgium, 1998; European Research conference «Neuronal mechanisms of learning and memory», Obernai, France, 2000; 8th TCNP Regional Meeting, Moscow, Russia, 2005; 11th Biennial Meeting EBPS, Barselona, Spaine, 2005.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы исследования», 9-ти экспериментальных глав, обсуждения результатов, выводов, библиографического указателя, включающего 50 источников на русском и 345 источников на иностранном языках. Диссертация изложена на 360 страницах машинописного текста, содержит таблицы и рисунков.

Содержание работы

феназепам интероцептивный лекарственный

Материалы и методы исследования

Опыты проведены на самцах белых нелинейных крыс массой 220-250 г. и 350-400 г. соответственно в начале и конце хронического эксперимента (питомник «Столбовая» РАМН). Животных содержали в стандартных клетках в условиях естественного светового режима при свободном доступе к воде и стандартному гранулированному корму (фирмы «МЭСТ», РФ) с добавлением овощей и кефира. Вода была доступна животным в течение 33 ч в неделю. Поведенческие эксперименты проводились с 13 до 17 ч.

Исследованы интероцептивные дифференцировочные стимульные свойства анксиолитиков производных 1,4 - бензодиазепина феназепама (ФХИ имени А.В. Богатского УАН), лоразепама («Polfa», Польша); диазепама («Sigma»), гидазепама (ФХИ имени А.В. Богатского УАН), селективного анксиолитика производного меркаптобензимидазола афобазола (ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН), производного пиримидинил-пиперазиновой структуры буспирона (ФХИ имени А.В. Богатского УАН), ноотропных препаратов с выраженным противотревожным компонентом действиях производного 3-оксипиридина мексидола (ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН), фенильного производного ГАМК фенибута, эндогенного дипептида ЦПГ (ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН), атипичного нейролептика сульпирида («Sanofi-Synthelabo»), нового пептидного нейролептика дилепта (ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, Москва), аналгетика пептидной природы дерморфина (ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН), антагониста ГАМК коразола (pentylenetetrazol, «Sigma»). Препараты были исследованы в дозах, в которых они обнаруживают специфическую психотропную активность.

При анализе специфичности интероцептивных эффектов веществ использовали: феназепам, лоразепам, гидазепам, буспирон, фенобарбитал, пентобарбитал натрия, пирацетам, мексидол, афобазол, ГАМКА-позитивный нейростероид прегнанолон, ингибитор ГАМК - трансаминазы вальпроат кальция (Ca), дилепт, d-амфетамин, комбинацию вальпроата кальция и мексидола, избирательный агонист ГАМКА-рецепторов мусцимол, антагонист дофаминовых рецепторов D₃-рецепторов нейролептик карбидин, блокатор кальциевых каналов флунаризин.

В качестве фармакологических анализаторов использовали: избирательный блокатор ГАМКА-рецепторов бикукуллин («Sigma»), ингибитор хлорного канала пикротоксин («Sigma»), инверсный агонист БД сайта ГАМК_А-рецепторов флумазенил («Serva»).

Все исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно за исключением бикукуллина, пикротоксина и коразола, применявшихся при подкожном введении.

Методика оперантного поведения. Оперантные рефлексы вырабатывали в 6-ти секционной установке оперантного поведения (фирма - «Lafayette Instrument Со, США) в условиях автоматизации эксперимента при использовании персонального компьютера Apple-2e (США) по специально разработанной оригинальной программе (Гарибова, 1990). Камера Скиннера в настоящей модификации представляла собой звукоизолированный бокс размером 21,5х21,5х28,5 см. На передней стенке камеры расположены два рычага на высоте 7,5 см над электродным полом и на расстоянии 7,5 см друг от друга, поилка (кормушка), жидкостной и пеллетный распределители, электрическая лампочка для подачи светового сигнала. Каждый из 6-ти оперантных боксов соединялся через интерфейс «Lafayette Instrument Со» с компьютером Apple-2e и принтером Epson FX-80. Рефлексы у животных вырабатывали после 24-48-часовой водной депривации, в качестве безусловного раздражителя использовали питьевое подкрепление: 1 капля воды объемом 0,125 мл при осуществлении адекватной оперантной реакции. В дальнейшем крысы получали воду только в течение экспериментов в качестве вознаграждения и в течение 20 мин после сеансов обучения (в разные интервалы времени после окончания сеанса обучения).

ЛкД веществ осуществляли при использовании оперантных режимов фиксированного отношения (fixed ratio) - FRN, где N (число последовательных нажатий на рычаг, вознаграждаемое 1 единицей подкрепления) составляло 1, 4 или 10 (FR1, FR4, или FR10). При выработке ЛкД в оперантом режиме FR10 предварительный этап обучения состоял в поэтапном формировании у животных базового оперантного рефлекса FR10. С этой целью крыс последовательно обучали в режимах FR1, FR2, FR4, FR6, FR8, FR10, при этом подкрепляли выполнение оперантного рефлекса в отношении любого из 2-х рычагов. После упрочения базового рефлекса переходили к этапу собственно дифференцировочного обучения, суть которого состояла в выработке у крысы реакции альтернативного выбора правого или левого рычага в зависимости от введенных веществ.

При использовании режима непрерывного подкрепления, или FR1, предварительный этап обучения отсутствовал. По достижении критерия обученности и стабильном воспроизведении ЛкД тестирование чередовали с тренировочными сеансами (Рис. 1).

При формировании ЛкД в качестве дифференцируемых стимулов использовали феназепам (2 мг/кг, FR1 или FR10), лоразепам (2 мг/кг, FR10), гидазепам (10 мг/кг, FR1 или FR10), буспирон (5 мг/кг, FR1 или FR10), пентобарбитал натрия (10 мг/кг, FR1 или FR10), фенибут (100 мг/кг, FR1), пирацетам (500 мг/кг, FR1), мексидол (50, 100 мг/кг, FR1 или FR10), афобазол (20 мг/кг, FR10), циклопролил-глицин (ЦПГ) (0,1 мг/кг, FR1 или FR10), сульпирид (25, 33, 40, 60 мг/кг, FR1 или FR10), дилепт (2, 6 мг/кг, FR1 или FR10), дерморфин (0,5 и 1 мг/кг, FR10), коразол (20 мг/кг, FR10). Каждую группу лабораторных животных, состоящую из 6-27 крыс, обучали отличать одно из выше перечисленных веществ от контрольного раствора. Диазепам в качестве дифференцируемых стимулов использовали в двух дозах - 0,5 мг/кг и 5 мг/кг, обучая крыс различать их в режиме FR10. При выработке ЛкД введения веществ или контрольного раствора, а при использовании диазепама - двух разных доз препарата, чередовали в равно вероятностной последовательности. Интервал времени между инъекцией вещества и началом сеанса обучения ЛкД соответствовал периоду развития специфической психотропной активности дифференцируемого препарата.

Оценку специфичности интероцептивных эффектов исследуемых препаратов и тесты на антагонизм с их стимульными свойствами осуществляли только у крыс, демонстрирующих стабильное воспроизведение ЛкД. Тестирование осуществляли 1-2 раза в неделю, при этом тесты чередовали с тренировочными сеансами с целью сохранности ЛкД. Длительность каждого тестового сеанса составляла 2-3 мин, в течение которых подкрепление отсутствовало независимо от поведения животных (Рис. 1). Каждый тест повторяли 2-3 раза.

Параметрами оценки воспроизведения интероцептивных эффектов тренировочных и тестовых препаратов при заместительном тестировании и в тестах на антагонизм являлись: 1) средний по группе% выборов рычага, соотнесенного в процессе обучения с инъекцией «тренировочного» препарата; 2)% крыс, осуществляющих выбор рычагов, ассоциируемых с каждым из дифференцируемых стимулов; 3) частоту оперантных реакций тестируемых животных. При определении среднего% адекватных реакций альтернативного выбора у крыс, обучаемых в оперантном режиме FR1, регистрировали долю правильных реакций, осуществляемых в течение всего времени тестирования. При использовании рефлекса FR10% правильных реакций определяли по отношению (10/N) х100%, где N - общее число нажатий на оба рычага до получения первого подкрепления.

Анксиолитические свойства веществ исследовали в условиях конфликтной ситуации (Молодавкин, 1992). Эффекты препаратов на ориентировочно-исследовательскую реакцию животных оценивали в «открытом поле». Влияние веществ на координацию движения и мышечный тонус определяли в тестах вращающегося стержня и горизонтальной перекладины.

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли по точному критерию Фишера для выборочных долей вариант (данные, выраженные в%), парному и непарному t-критериям Стьюдента, непараметрическому критерию Манна-Уитни (Урбах, 1964; Боровиков, 2001).

Результаты исследования

Изучение динамики формирования ЛкД

Оценка особенностей динамики формирования ЛкД состояла из двух этапов: 1) анализа текущего процесса выработки условнорефлекторного навыка различения веществ (при подкреплении адекватных реакций альтернативного выбора рычагов), отражающего, помимо интероцептивных эффектов тренировочного препарата, его влияние на процесс оперантного обучения и 2) оценки параметров воспроизведения ЛкД (в отсутствие подкрепления адекватных оперантных реакций), собственно отражающих «силу стимульного контроля» тренировочного вещества.

При использовании большинства изученных веществ в качестве дифференцируемых стимулов, альтернативных «состоянию нормы» (без вещества), первый критерий обученности фиксировали в течение 1-8 сеансов обучения независимо от базового оперантного режима (FR1 или FR10). Незначительное исключение составили мексидол (режим FR10) и афобазол (режим FR4), при хронических инъекциях, которых для достижения первого критерия обученности было необходимо до 12-13 сеансов обучения. Более выраженное замедление достижения первого критерия обученности регистрировали при формировании ЛкД при введении нейролептиков сульпирида и дилепта (Табл.1). Увеличение числа фиксированного отношения до 10 сопровождалось увеличением периода, необходимого для стабильного выполнения ЛкД, при использовании буспирона, мексидола и сульпирида. При применении в качестве дифференцируемого стимула ЦПГ в условиях оперантного режима FR 10 стабильного выполнения условнорефлекторного навыка различения веществ не обнаруживали и после 42 сеансов обучения. Вместе с тем, асимптотический уровень точности выполнения ЛкД при инъекции этих веществ не изменялся по сравнению с тренировкой животных на основе более простого оперантного рефлекса FR1. При использовании в качестве дифференцируемого стимула фенибута стабильного выполнения ЛкД не регистрировали после 24 сеансов обучения в условиях простого режима FR1 (Табл.1). Прогрессирующее уменьшение частоты оперантных реакций при инъекции этого препарата не позволило продолжить дальнейшее формирование ЛкД.

Отсутствие подкрепления адекватного оперантного поведения не оказывало негативного влияния на асимптотический уровень воспроизведения условного рефлекса альтернативного выбора у крыс, обучаемых при хроническом введении БД, буспирона, барбитурата или коразола. При использовании этих веществ адекватную реакцию альтернативного выбора рычагов регистрировали у значимо большей части тестируемых крыс (80 и более%). В противоположность этому, в тестовых условиях применение тренировочных доз остальных исследуемых веществ сопровождалось уменьшением уровня адекватного реагирования ниже 80%, установленных в качестве критерия воспроизведения ЛкД (Табл.2). Тем не менее, при анализе индивидуальных реакций установлено, что при обучении ЛкД при инъекции мексидола, сульпирида, ЦПГ или дерморфина определенная часть обучаемых животных обнаруживала высокий уровень воспроизведения ЛкД в соответствии с критериями, принятыми для высоко дифференцируемых фармакологических веществ. В случае применения мексидола или сульпирида доля животных, различающих инъекции препаратов и контрольного раствора, не изменялась от сложности базового оперантного поведения. При обучении ЛкД фенибута, афобазола или дилепта ни одно из тестируемых животных не воспроизводило интероцептивных эффектов.

Совокупность экспериментальных данных, полученных при оценке динамики текущего процесса обучения и воспроизведения ЛкД, позволяет разделить изученные вещества на несколько основных групп - высоко-, средне - и недифференцируемые препараты.

В условиях оперантной модели ЛкД у крыс высокодифференцируемые вещества характеризуются сочетанием следующих параметров: период достижения первого критерия обучения (на фоне каждого из дифференцируемых состояний) составляет не более 7-ми сеансов обучения, уровни точности выполнения дифференцировки в течение сеанса обучения и воспроизведения дифференцировки составляют 80 и более%, что характерно для 80-100% тестируемых животных. Принципиальной характеристикой интероцептивных эффектов веществ данной группы является независимость динамики формирования ЛкД от сложности оперантного режима фиксированного отношения и сходство динамики обучения и динамики воспроизведения условного рефлекса различения веществ.

Для среднедифференцируемых веществ характерно увеличение периода тренировки, необходимого для стабильного выполнения ЛкД. При применении веществ данной группы период достижения первого критерия обучения может увеличиваться до 30 дней, максимальный уровень точности выполнения дифференцировочного рефлекса в течение сеанса обучения может достигать до 75-90%, период, необходимый для демонстрации стабильного выполнения рефлекса - от 14 дней (возможно только при обучении в простом оперантном режиме) до нескольких месяцев, средний по группе уровень воспроизведения дифференцировки - 50-80%, доля тестируемых животных, способных к воспроизведению - 8-80%. Следует отметить, что наблюдаемые случаи воспроизведения ЛкД при инъекциях выше упомянутых веществ соответствуют достаточно жестким критериям, принятым для описания интероцептивных свойств высоко дифференцируемых препаратов. По-видимому, наиболее адекватным подходом, характеризующим дифференцируемость этих веществ в условиях оперантной модели поведения с питьевым подкреплением, является установление принципиальной возможности воспроизведения ЛкД при их использовании в качестве условных стимулов.

Для недифференцируемых веществ характерно следующее: первое достижение критерия обучения возможно в любой период обучения, но вместе с тем носит эпизодический характер, уровень точности выполнения реакции альтернативного выбора в течение сеанса обучения составляет 40-60%, период, необходимый для демонстрации стабильного выполнения рефлекса - от 50 дней, средний по группе уровень воспроизведения дифференцировки - 40-60%, доля тестируемых животных, способных к ее воспроизведению - 0%.

Табл. 1. Параметры текущего процесса формирования лекарственных дифференцировок в условиях оперантного обучения (при подкреплении реакций альтернативного выбора)

Поскольку одной из основных характеристик оперантного рефлекса является частота оперантных реакций, был проведен сравнительный анализ влияния изучаемых веществ на этот параметр на ранних этапах формирования ЛкД (в течение первых 14 сеансов) (Рис. 2). Высокодифференцируемые вещества (гидазепам, пентобарбитал натрия, буспирон (5 мг/кг)) или вызывали увеличение частоты оперантных реакций по сравнению с сеансами, проводимыми на фоне контрольного раствора, или не изменяли это соотношение (феназепам, лоразепам, диазепам). Недифференцируемые препараты афобазол и фенибут, а так же буспирон в недифференцируемой дозе 10 мг/кг, вызывали снижение частоты оперантных реакций по сравнению с контрольным раствором. Дилепт, не эффективный в качестве дифференцировочного стимула, и вещества, отнесенные к группе среднедифференцируемых фармакологических агентов (мексидол, циклопролил-глицин, дерморфин, сульпирид) не влияли на соотношение частоты оперантных реакций при инъекциях веществ и контрольного раствора (Рис. 3). Полученные результаты свидетельствуют, что превышающая или сопоставимая с состоянием «нормы» частота оперантных реакций на фоне действия дифференцируемого фармакологического агента, является необходимым, но недостаточным условием успешной выработки ЛкД. Уменьшение частоты оперантных реакций под действием психотропного вещества более чем на 50% по сравнению с введением контрольного раствора, в течение первых 14 сеансов обучения ЛкД может прогнозировать неэффективность этого вещества при дальнейшей тренировке.

Табл. 2. Параметры воспроизведения лекарственных дифференцировок в условиях оперантной модели поведения (в отсутствие подкрепления адекватных реакций альтернативно выбора)

2. Изучение специфичности интероцептивных эффектов анксиолитиков

При исследовании специфичности интероцептивных эффектов веществ использовали заместительное тестирование, состоящее в замене тренировочного препарата на другие вещества или другие дозы тренировочного препарата у крыс, стабильно воспроизводящих ЛкД.

2.1 Изучение специфичности интероцептивных эффектов феназепама

Полную генерализацию дифференцировочных стимульных эффектов феназепама (2 мг/кг) регистрировали только при замене его на лоразепам (2 мг/кг), о чем свидетельствовал не только высокий уровень воспроизведения адекватного тренировочному БД оперантного рефлекса, но и сохранение сопоставимой с тренировочными условиями частоты оперантных реакций (Рис. 3; Табл.3). Выбор рычага, ассоциируемого с инъекциями феназепама (2 мг/кг), осуществляли достоверное большинство тестируемых животных не зависимо от оперантного рефлекса, на основе которого вырабатывали ЛкД феназепама (Табл.3). Замена феназепама на диазепам (30 мг/кг) в среднем по группе вызывала сопоставимый с тренировочными условиями уровень воспроизведения интероцептивных эффектов феназепама (Рис. 3А). Однако выбор в пользу феназепама регистрировали лишь у 40% тестируемых животных и при значимом снижении частоты оперантных реакций (Табл.3). Гидазепам в дозе в 25 раз превышающей дозу феназепама вызывал лишь интермедиальный уровень генерализации ЛкД последнего, что сочеталось с тенденцией к снижению частоты нажатий на рычаги. В условиях оперантной модели FR1, интермедиальный уровень генерализации интероцептивных эффектов феназепама (2 мг/кг) наблюдали при замене его на барбитураты и вальпроат Ca. В условиях оперантного обучения FR10, вальпроат Са вызывал поведение, адекватное состоянию нормы, у 40% тестируемых крыс, в то время как при использовании режима FR1 для 100% испытуемых животных были характерны промежуточные реакции (Табл.3). Препараты, сочетающие анксиолитические свойства с ноотропным / нейропротекторным действием, вызвали у крыс, обученных различать феназепам и контрольный раствор, реакции, соответствующие инъекциям контрольного раствора (Рис. 3А, Б; Табл.3). При совместном введении мексидола и вальпроата Ca в дозах, в которых эти вещества по отдельности вызывали рефлекс, адекватный применению контрольного раствора, регистрировали интермедиальный уровень генерализации интероцептивных эффектов феназепама, что свидетельствует о выраженном модулирующем эффекте данной фармакологической комбинации в отношении БД сайта ГАМК_А-рецепторов «ин виво».

Табл. 3. Специфичность интероцептивных эффектов феназепама (2 мг/кг)

При сравнительном изучении специфичности интероцептивных эффектов феназепама при формировании ЛкД в разных режимах FR установлено, что независимо от выбранного режима стимульные свойства феназепама полностью воспроизводятся только при замене его на лоразепам в эквивалентной дозе.

2.2 Изучение специфичности интероцептивных эффектов лоразепама

У крыс, дифференцирующих инъекции лоразепама (2 м/кг) и контрольного раствора, применение феназепама (2 мг/кг) вызывало полную генерализацию интероцептивных эффектов первого. Регистрируемое при этом увеличении частоты оперантых реакций может свидетельствовать об облегчающем влиянии феназепама на дифференцировочный рефлекс, детерминируемый введением лоразепама.

Табл. 4. Специфичность интероцептивных эффектов лоразепама (2 мг/кг)

Замещение лоразепама на гидазепам (20, 50 мг/кг) в среднем по группе вызывало поведение, адекватное применению тренировочного БД. Однако достижение или превышение 80%-ного уровня адекватных инъекциям феназепама реакций регистрировали у 67% тестируемых животных (Табл.4). Аналогично интероцептивным свойствам феназепама, дифференцировочные свойства лоразепама не воспроизводились при замене БД на пентобарбитал натрия (10 мг/кг), инъекция которого вызывала снижение частоты оперантных реакций по сравнению с тренировочными условиями (Табл.5).

2.3 Изучение специфичности интероцептивных эффектов гидазепама и диазепама

Специфичность интероцептивных эффектов гидазепама (10 мг/кг, в/б) и диазепама (5 мг/кг, в/б) была исследована при обучении крыс ЛкД в условиях оперантного режима FR1. При использовании при заместительном тестировании положительных модуляторов ГАМК_А-рецепторов наблюдалась полная генерализация интероцептивных эффектов диазепама (5 мг/кг) (Рис. 5). При этом выбор в пользу рычагов, ассоциированных с введением диазепама, осуществляли все тестируемые крысы с частотой оперантных реакций, сопоставимой с частотой нажатий на рычаги, регистрируемой при введении тренировочного БД (Табл. 5). Интероцептивные эффекты гидазепама полностью воспроизводились при использовании в заместительном тесте БД. Однако при использовании барбитурата, интероцептивные эффекты гидазепама воспроизводились лишь частично, что свидетельствует о более высокой специфичности эффектов гидазепама по сравнению с диазепамом.

Табл. 5. Сравнение специфичности интероцептивных эффектов гидазепама (10 мг/кг, в/б) и диазепама (5 мг/кг, в/б) в условиях заместительного теста в оперантном режиме FR1

2.1 Сравнительное изучение генерализационных профилей анксиолитиков в оперантном режиме FR10

В условиях заместительного тестирования феназепам (0,5-2 мг/кг, в/б), гидазепам (0,5-10 мг/кг, в/б), пентобарбитал натрия (0,5-15 мг/кг, в/б) и буспирон (1-5 мг/кг, в/б) вызывали дозозависимую полную генерализацию интероцептивных свойств своих тренировочных доз (Рис. 6). Полная генерализация интероцептивных эффектов феназепама (2 мг/кг) имела место лишь при использовании в тесте феназепама (2 мг/кг) и диазепама (30 мг/кг). Однако в последнем случае высокий уровень генерализации дифференцировочных свойств феназепама регистрировали лишь у 40% тестируемых крыс, что позволяет рассматривать генерализацию ЛкД феназепама при замене его на диазепам лишь как частичную. В эффективной дозе диазепам значимо снижал частоту оперантных реакций на 40% по сравнению с частотой оперантных реакций, наблюдаемых в тестовых сессиях при введении контрольного раствора. Фенобарбитал вызывал дозозависимую частичную генерализацию стимульных эффектов феназепама, в то время как буспирон не обладал дозозависимым действием и вызывал у обученных различать инъекции феназепама и контрольного раствора крыс реакции, адекватные состоянию нормы (Рис. 6А).

Диазепам полностью воспроизводил стимульные свойства гидазепама, как и феназепам (Рис. 6Б). Диазепам (10 мг/кг) и феназепам (1 мг/кг) в условиях заместительного тестирования вызывали 100% уровень генерализации ЛкД гидазепама, не вызывая при этом значимого снижения частоты оперантных реакций. Значительное снижение частоты нажатий на рычаги регистрировали при увеличении дозы БД (диазепама до 20 мг/кг, феназепама - до 2 мг/кг). Фенобарбитал (40-80 мг/кг) вызывал интермедиальный уровень генерализации ЛкД (35-55% адекватных инъекциям гидазепама реакций), снижая при этом частоту оперантных реакций. Вместе с тем, следует отметить в данном случае наличие положительной дозовой зависимости. Принципиально иные результаты получены при введении крысам, обученным условному рефлексу различения гидазепама и контрольного раствора, буспирона. Во-первых, при замене гидазепама на буспирон у животных регистрировали условные реакции, или адекватные применению контрольного раствора (выбор ассоциируемого с гидазепамом в среднем не превышает 20%), или соответствующие интермедиальному уровню (30%). Во-вторых, генерализационная кривая характеризуется полным отсутствием линейной зависимости от дозы. При этом частота оперантных реакций существенно снижалась по сравнению с частотой нажатий на рычаги в условиях нормы и при использовании в качестве тестируемых агентов позитивных модуляторов ГАМК_А-рецепторов. Таким образом, результаты заместительного тестирования свидетельствуют о сходстве интероцептивных свойств гидазепама, феназепама и диазепама. Однако, эффекты, сопоставимые по уровню генерализации интероцептивных свойств гидазепама (10 мг/кг), диазепам и феназепам вызывали в разных дозовых диапазонах, различающихся в 10 раз.

При инъекции крысам, обученным условнорефлекторному навыку различения пентобарбитала натрия и контрольного раствора (Рис. 6В), феназепам (0,5 - 2 мг/кг) или гидазепама (1-10 мг/кг) вызывали дозозависимую и полную генерализацию дифференцировочных свойств барбитурата, подтверждая полученные в условиях других методик ЛкД данные о способности БД препаратов замещать производные барбитуровой кислоты (Lelas, 2000).

В условиях заместительного тестирования позитивные модуляторы ГАМК_А-рецепторов у крыс, обученных дифференцировке буспирона (5 мг/кг), вызывали в лучшем случае интермедиальный уровень воспроизведения интероцептивных эффектов производного пиримидинил-пиперазина и не обнаруживали прямой линейной зависимости степени генерализации эффекта от тестируемой дозы (Рис. 6Г).

Таким образом, экспериментальные результаты, полученные при обучении крыс ЛкД в условиях оперантного режима FR10, свидетельствуют о наличии определенной степени качественного сходства интероцептивных эффектов изученных позитивных модуляторов ГАМК_А-рецепторов и их принципиальном отличии от противотревожных веществ не БД структуры (буспирона).

3. Изучение механизмов интероцептивных эффектов положительных модуляторов ГАКМ_А-рецепторов

3.1 Роль различных компонентов ГАМК_А-рецепторов в механизме реализации стимульных свойств БД и барбитуратов

При совместном применении флумазенила (5-15 мг/кг) с феназепамом или гидазепамом интероцептивные эффекты тренировочных БД ингибировались дозозависимым образом, что согласуется с данными литературы о способности инверсного агониста БД рецепторов нарушать стимульный контроль, индуцируемый БД, в том числе и лоразепамом (Ator, 1983; Lelas, 2000). В дозе 15 мг/кг флумазенил вызывал специфический «сдвиг» условнорефлекторного поведения крыс в сторону состояния нормы. Так, при совместном применении каждого из исследуемых БД с флумазенилом (15 мг/кг) крысы отказывались от выборов рычагов, соответствующих инъекции феназепама или гидазепама, и предпочитали рычаги, адекватные введению контрольного раствора (Рис. 7А, В; Табл. 6).

Блокада активности ГАМК_А-рецепторов при введении субсудорожной дозы бикукуллина нарушала воспроизведение интероцептивных эффектов феназепама (45,8±14,0%; P<0,01; точный критерий Фишера). Большинство тестируемых крыс (80%) демонстрировали интермедиальные реакции, а 20% - выбирали рычаги, ассоциируемые с инъекциями контрольного раствора. В противоположность феназепаму, дифференцировочные стимульные свойства гидазепама не зависели от функционального состояния ГАМК_А-рецепторов, поскольку селективный антагонист бикукуллин не изменял условнорефлекторной реакции у 100% животных (Рис. 7А, В).

Комплексное введение блокатора хлорного канала пикротоксина с феназепамом приводило к незначительному снижению доли реакций, адекватных БД (с 87,2±4,3% до 75,7± 10%; P>0,05; точный критерий Фишера). Одновременно отмечали незначительное уменьшение% крыс, предпочитавших в данной ситуации соответствующий феназепаму рычаг. При совместном применении гидазепама и пикротоксина регистрировали также незначительное (P>0,05) снижение доли выборов ассоциируемых с БД рычагов. Вместе с тем, наблюдали более существенное уменьшение доли крыс (на 23%), осуществляющих выборы в пользу гидазепама (Табл.5).

Избирательный агонист ГАМК_А-рецепторов мусцимол (1 мг/кг) в условиях заместительного тестирования индуцировал интермедиальный уровень воспроизведения интероцептивных свойств феназепама (Рис. 7Б).

Установлено, стимульные свойства феназепама (2 мг/кг) не воспроизводятся при замене его на прегнанолон (5, 10 мг/кг, в/б). Вместе с тем, степень генерализации дифференцировочных свойств феназепама при замещении его на прегнанолон носит дозозависимый характер, как по количественным, так и по качественным характеристикам ЛкД, что может свидетельствовать о способности нейростероидного компонента ГАМК_А-рецептора оказывать модулирующее действие на БД рецепторы, активность которых преимущественно лежит в основе интероцептивных эффектов БД анксиолитков (Рис. 7Б; Табл.5).

Агонист ГАМК вальпроат Ca, повышающий уровень эндогенной ГАМК в головном мозге, в условиях заместительного тестирования демонстрировал низкий «заместительный потенциал» в отношении феназепама: крысы выбирали рычаги, соотнесенные с применением тренировочного БД, всего лишь в 25,6±8,0% всех случаев. Большая часть тестированных крыс выбирали рычаги, ассоциируемые с состоянием нормы. При введении вальпроата у крыс, дифференцирующих гидазепам и контрольный раствор, также не наблюдали генерализации интероцептивных эффектов тренировочного БД. Однако в этом случае отмечался интермедиальный уровень генерализации интероцептивных эффектов препарата (60,7 ± 5,2%; P<0,05; точный критерий Фишера), что было характерно для всех испытуемых животных (Табл.5).

В противоположность БД препаратам, селективное воздействие на БД рецепторы ГАМК_А-рецепторного комплекса не оказывало существенного влияния на воспроизведение интероцептивных эффектов пентобарбитала натрия, что согласуется с данными литературы (Ator, 1983). Совместное введение пентобарбитала и бикукуллина не вызывало у крыс нарушения оперантного рефлекса, сформированного при хроническом использовании барбитурата. Животные, как и в тестовых условиях на фоне одного пентобарбитала, в большинстве случаев выбирали рычаги, ассоциируемые с введением препарата, а не физиологического раствора (Рис. 7Г). Однако следует отметить снижение доли крыс, выбирающих адекватные барбитурату рычаги, до 60% (Табл. 5). Более существенное изменение уровня воспроизведения интероцептивных эффектов пентобарбитала наблюдали при совместном применении барбитурата и пикротоксина (Рис. 7Г; Табл.5). При замене барбитурата на мусцимол (1 мг/кг) у 80% животных регистрировали поведение, адекватное инъекциям физиологического раствора, а доля выборов рычагов, соответствующих инъекциям препарата составляла в среднем по группе всего лишь 10,5±7,0% (P<0,01; точный критерий Фишера).

Табл. 6. Зависимость реакции альтернативного выбора рычагов, адекватных инъекциям позитивных модуляторов ГАМК_А-рецепторов, от функциональной активности различных модуляторных сайтов ГАМК_А-рецепторов у крыс условиях оперантного режима FR10