Секреторная фосфолипаза А2 группы IIА в сыворотке крови больных после коронарной ангиопластики: регуляция липидами и липопротеидами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Секреторная фосфолипаза А2 группы IIА в сыворотке крови больных после коронарной ангиопластики: регуляция липидами и липопротеидами

03.00.04 - Биохимия

14.00.06 - Кардиология

Коротаева Александра Алексеевна

Москва 2009 год

Работа выполнена в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ и СР РФ»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

академик РАН, академик РАМН Чазов Евгений Иванович

доктор биологических наук,

академик РАН, академик РАМН Ткачук Всеволод Арсеньевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

академик РАМН, профессор Насонов Евгений Львович

доктор биологических наук,

заслуженный деятель науки РФ, профессор Алесенко Алиса Владимировна

доктор биологических наук, профессор Ланкин Вадим Зиновьевич

Ведущая организация:

ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН

Защита диссертации состоится 16 декабря 2009 г. в 13.30 часов на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению учёной степени доктора наук в ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ по адресу: 121467 г. Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ

Автореферат разослан « » сентября 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук В.Е.Синицын

каталитический кровь ишемический

Актуальность проблемы. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является одной из наиболее частых причин смерти и инвалидизации населения [Чазов, 2008]. Это заболевание в большинстве случаев обусловлено стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий. Для лечения больных с ИБС в настоящее время широко используется транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика. Этот рентгеноваскулярный метод малотравматичен, не требует вскрытия грудной клетки, остановки сердца, общего наркоза и характеризуется хорошей переносимостью. Однако у ряда пациентов через несколько месяцев после проведения ангиопластики развивается повторное гемодинамически значимое сужение коронарной артерии, рестеноз, приводящий к возобновлению клиники стенокардии. Совершенствование эндоваскулярной технологии и применение стентов с различными лекарственными покрытиями позволило повысить эффективность коронарной ангиопластики и уменьшить число рецидивов, однако это не привело к окончательному решению проблемы рестенозов. К сожалению, в настоящее время невозможно не только предотвратить рестеноз, но и предсказать его развитие у конкретного больного. Существующие предикторы рестеноза, такие как диаметр артерии, протяженность стеноза и др., позволяют лишь отнести пациента к группе повышенного риска в отношении развития рестеноза. Для выявления вероятности развития рестеноза у пациентов после коронарной ангиопластики нужно учитывать специфические факторы, отражающие механизмы рестенозирования [Чазов, 2001; Ткачук, 2003].

Рестеноз - многофакторный процесс, важную роль в котором играет воспаление. Одним из ферментов, принимающим активное участие в развитии воспаления, является секреторная фосфолипаза А2 группы IIА (секФЛА2(IIA)). Этот фермент участвует в образовании медиаторов воспаления - лейкотриенов, простагландинов, фактора активации тромбоцитов, биоактивных лизофосфолипидов. В настоящее время к секФЛА2(IIA) привлечено пристальное внимание врачей и исследователей. Фермент обнаружен в стенке сосуда на всех стадиях развития атеросклеротического поражения [Elinder et al, 1997; Menschikowski et al., 1995; Piek et al., 2002]. СекФЛА2(IIA) присутствует в интиме, медии и адвентиции сосудистой стенки, в пенистых клетках, в очагах кальцификации, участках клеточного некроза и экстрацеллюлярном матриксе [Hurt-Camejo et al., 1997; Schiering et al., 1999]. У пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями повышенный уровень секФЛА2(IIA) в плазме крови является предиктором развития таких неблагоприятных сердечно-сосудистых событий, как нестабильная стенокардия, инфаркт миокарда, смерть [Kugiyama et al., 2000; Mallat et al., 2005; Boekholdt et al., 2005; Mallat et al., 2007]. Выявление возможной взаимосвязи между рестенозом и содержанием или активностью провоспалительной секФЛА2(IIA) в сыворотке крови пациентов после коронарной ангиопластики может привести к созданию удобного и информативного метода прогноза развития рестеноза.

Механизмы, регулирующие активность секФЛА2(IIA) в крови, мало изучены. СекФЛА2(IIA), содержащаяся в плазме крови, не всегда проявляет свою каталитическую активность. Это может свидетельствовать о наличии в плазме крови компонентов как ингибирующих, так и активирующих секФЛА2(IIA), соотношение которых может изменяться при определенных физиологических условиях. Многочисленные попытки исследователей обнаружить в крови человека белок, селективно ингибирующий секФЛА2(IIA), оказались безуспешными. В плазме крови помимо белков содержатся различные липиды, многие из которых являются биоактивными молекулами, проявляющими различные физиологические эффекты. Очень хорошо такие эффекты описаны для лизофосфолипидов, окисленных фосфолипидов и сфинголипидов [Проказова и соавт. 2007; Торховская и соавт., 2007; Алесенко 1998; Kougias et al., 2006; Berliner et al., 2008]. Липиды нерастворимы в воде, и в плазме крови они находятся в составе циркулирующих липопротеидов (ЛОНП, ЛНП и ЛВП). При воспалении фосфолипиды, содержащиеся в липопротеидах, могут окисляться, в результате чего образуются окисленные липопротеиды, фосфолипидный состав которых отличается от фосфолипидного состава нативных липопротеидов. Окисленные ЛНП, в отличие от нативных ЛНП, вовлечены в развитие атеросклеротических поражений сосудов. Клинические исследования выявили строгую корреляцию между уровнями окисленных ЛНП и провоспалительной секФЛА2(IIA) [Paradis et al., 2006]. Поэтому исследование влияния нативных и окисленных липопротеидов, а также входящих в их состав фосфолипидов на активность секФЛА2(IIA) может дать представление о возможных механизмах регуляции секФЛА2(IIA) в плазме крови человека и указать на новые мишени для терапевтического вмешательства при ИБС и развитии рестеноза сосудов после коронарной ангиопластики.

Целью данного исследования было выяснить связь между провоспалительной секФЛА2(IIA) и вероятностью развития рестеноза после коронарной ангиопластики у больных ИБС, а также идентифицировать липидные регуляторы активности секФЛА2(IIA), находящиеся в сыворотке крови человека.

Задачи исследования:

Определить уровень и каталитическую активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови больных ИБС до коронарной ангиопластики, в течение 7 дней и через 6 месяцев после реваскуляризации и сравнить эти показатели у больных с развившимся рестенозом и без рестеноза;

Определить влияние циркулирующих нативных липопротеидов на каталитическую активность секФЛА2(IIA);

Определить влияние окисленных липопротеидов и степень их окисления на активность секФЛА2(IIA);

Провести анализ влияния липидов, содержащихся в структуре нативных и окисленных липопротеидов, на активность секФЛА2(IIA);

Определить липидные компоненты липопротеидной частицы, влияющие на активность секФЛА2(IIA).

Изучить влияние различных комбинаций липидов, входящих в структуру липопротеидов, на активность секФЛА2(IIA).

Научная новизна: В данной работе впервые установлена взаимосвязь между провоспалительной секФЛА2(IIA) и развитием рестеноза. Показано, что после транслюминальной коронарной ангиопластики у больных с последующим рестенозом концентрация и активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови значительно повышены по сравнению со значениями до проведения процедуры. При этом наблюдается непропорционально большее повышение активности этого фермента, чем его концентрации. У больных без развивающегося рестеноза активность секФЛА2(IIA) сохраняется низкой до и после проведения коронарной ангиопластики, в то время как у больных с последующим рестенозом активность секФЛА2(IIA) резко и значительно возрастает после процедуры.

Впервые показано, что циркулирующие в плазме крови липопротеиды (ЛОНП, ЛНП и ЛВП) регулируют активность секФЛА2(IIA). Активность секФЛА2(IIA) ингибируется нативными ЛОНП, ЛНП и ЛВП.

При воспалении циркулирующие липопротеиды могут подвергаться окислению, превращаясь в окислено-модифицированные частицы с измененным фосфолипидным составом. Впервые показано, что окисленные липопротеиды (окЛОНП, окЛНП и окЛВП) стимулируют активность секФЛА2(IIA), устраняя ингибирующий эффект нативных липопротеидов. Влияние окисленных липопротеидов на активность секФЛА2(IIA) зависит от степени изменения их фосфолипидного состава, вызванного окислением.

Впервые показано, что сфингомиелин, содержащийся во всех классах липопротеидов, ингибирует секФЛА2(IIA). При окислении в липопротеидах может образовываться окисленный фосфатидилхолин, который, в отличие от сфингомиелина, активирует секФЛА2(IIA). Сфингомиелин конкурирует с окисленным фосфатидилхолином за связывание с секФЛА2(IIA), и изменение соотношения между концентрациями этих фосфолипидов в составе нативных и окисленных липопротеидов может влиять на регуляцию секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека, приводя либо к ингибированию, либо к стимуляции её активности.

Холестерин и эфиры холестерина, входящие в состав липопротеидов, не оказывают влияния на активность секФЛА2(IIA).

Сделано предположение, что изменение активности секФЛА2(IIA) под действием нативных и окисленных липопротеидов может влиять на развитие рестеноза коронарных сосудов.

Практическая значимость: Полученные данные расширяют представления о молекулярных механизмах развития рестеноза, в основе которых лежат воспалительные процессы. Так как воспаление приводит к усилению секреции секФлA2(IIA) и окислению циркулирующих липопротеидов, изменение соотношения между концентрациями нативных и окисленных липопротеидов, а также сфингомиелина и окисленного фосфатидилхолина может влиять на развитие рестеноза коронарных артерий за счет изменения активности секФлA2(IIA). Полученные результаты могут быть использованы для поиска новых подходов в диагностике и лечении воспалительных процессов и сосудистых осложнений после транслюминальной коронарной ангиопластики у больных ИБС. Повышенные значения уровня и активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови больных после коронарной ангиопластики (по сравнению с этими значениями до проведения процедуры) могут быть использованы как прогностические параметры для выявления больных с повышенным риском развития рестеноза.

Внедрение в практику: Определение концентрации и активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови больных ИБС внедрено в практическую и научную деятельность Института клинической кардиологии имени А.Л.Мясникова РКНПК МЗ и СР РФ.

Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ и СЗ ЗФ» 25 июня 2009 г. Результаты работы доложены и обсуждены на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: Симпозиум «Липопротеиды и атеросклероз» (С-Петербург, 21-23 ноября 1995 г); 7th Erfurt Conference on platelet (Германия, 28 июня-1 июля 1998); International Conference on Phospholipase A2 (Берлин, Германия, 26-29 мая 1999 г); XII International Symposium on Atherosсlerosis (Стокгольм, Швеция, 25-29 июня 2000 г); 5-я ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева (Москва, 13-15 мая 2001); XIY International Symposium on drugs affecting lipid metabolism (Нью-Йорк, США, 9-12 сентября 2001 г); XI Congress of the Mediterranean league of angiology and vascular surgery (Чиос, Греция, 30 мая -2 июня 2001 г); III Всероссийский Национальный Конгресс кардиологов (Санкт-Петербург, 8-11 октября 2002); 6th International Symposium on global risk of coronary heart disease and stroke (Флоренция, Италия, 12-15 июня 2002 г); US-Russia Joint Simposium on the role of infections and inflammatory responses in the heart and lung (Орландо, Флорида, США, 6-8 ноября 2003 г); XII international symposium on atherosclerosis (Рим, Италия, 18-22 июня 2006 г); Форум «Кардиология 2006» (Москва, 2006 г); Конференция с международным участием, посвященная 90-летию академика Т.М. Турпаева (Москва, 24-26 ноября 2008 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа: 18 в отечественных и 13 в международных изданиях.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 9-ти глав, посвящённых собственным результатам и их обсуждению, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 210 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 8 таблиц. Список литературы включает 377 источников.

Материалы и методы исследования

Клиническая характеристика больных

В исследование были включены мужчины в возрасте от 38 до 69 лет (средний возраст 54,7 + 12,8) со стабильной стенокардией II-III функционального класса. Все пациенты имели ангиографически документированный стеноз как минимум одной магистральной коронарной артерии выраженностью > 70 %.

Всем пациентам была проведена транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика с имплантацией стента 316 L Bx Sonic, Cordis Corp., США (без лекарственного покрытия).

Все больные были сравнимы по возрасту, наследственно отягощённой гипертонии, перенесённому инфаркту миокарда, курению и основным биохимическим показателям крови и ангиографическим характеристикам поражения коронарного русла.

Из исследования исключались пациенты с острым инфарктом миокарда или перенесшие хирургические вмешательства в течение предшествующих 6 месяцев, больные с сахарным диабетом, острыми или хроническими воспалительными заболеваниями, онкологическими заболеваниями, гипергликимией, требующей медикаметозной коррекции, а также пациенты, у которых ангиопластика сопровождалась введением блокаторов IIb/IIIa рецепторов тромбоцитов.

При проведении коронарной ангиопластики каждому пациенту вводили 250 мкг нитроглицерина и 10 000 Ед гепарина внутриартериально с последующей внутривенной инфузией 1000 Ед/ч гепарина в течение 12 часов. После проведения процедуры пациенты получали тиклопидин 250 мг два раза в день в течение 1 месяца. В течение всего срока исследования пациенты принимали аспирин 100 мг в день. Всем больным после выписки из стационара были назначены статины. При наличии показаний пациентам назначали также нитраты, антогонисты кальция, ингибиторы АПФ.

Для выявления рестеноза через 6 месяцев после коронарной ангиопластики каждому пациенту была выполнена контрольная коронароангиография.

Клинико-инструментальные методы исследования

Транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика (ТБКА) проводилась по стандартной методике. В устье пораженного сосуда селективно устанавливали катетер, к которому присоединялась закрытая система для контрастирования, промывания, инвазивной регистрации давления и инфузии лекарственных препаратов. В дистальный сегмент пораженного сосуда вводили коронарный проводник. Затем по проводнику к месту поражения проводили баллонный катетер, диаметр которого соответствовал должному диаметру стенозированного участка артерии. Центр баллона устанавливали в место максимального сужения артерии и выполняли предилятацию. Количество дилятаций стеноза составляло от 1 до 5. Каждая дилятация длилась от 30 до 90 сек, давление в баллонном катетере составляло от 2 до 16 атм. Затем баллонный катетер удаляли и по проводнику к поражённому сегменту проводили стент. Номинальный диаметр стента соответствовал должному диаметру артерии в стенозированном участке. Позиционирование стента производилось с котрольными снимками не менее чем в двух ортогональных проекциях. В последующем, при проведении коронарной ангиографии, съемка выполнялась в тех же проекциях. После установки стента производили ангиографический контроль не менее чем в двух ортогональных проекциях. Ангиографическим успехом считали результат, при котором остаточный стеноз после стентирования не превышал 10 %, отсутствовали признаки диссекции и тромбоза сосуда.

Коронарная ангиография проводилась на аппарате Coroscop-33 (Siemens, Германия) по стандартной методике. Съемка каждого стеноза производилась как минимум в 2-х ортогональных проекциях для его лучшей визуализации. Последующий анализ полученных ангиограмм проводилась с помощью системы компьютерного анализа Hicor (Siemens, Германия). Рестеноз диагностировался в случае сужения просвета сосуда в зоне проведенной ангиопластики > 50 %.

Биохимические методы исследования

Коллекция образцов крови. Образцы венозной крови отбирали из локтевой вены непосредственно перед коронарной ангиопласттикой (0 день), в течение первой недели и через 180 дней после процедуры. Для получения плазмы в пробирки для отбора крови добавляли антикоагулянт - 0,25М ЭДТА, рН 7,2 (2,5 мл на 100 мл крови), для получения сыворотки в пробирки ничего не добавляли. Отобранные образцы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин при 40C и хранили при -70 0С до проведения анализа.

Получение цельной и делипидированной сывороток. Цельную сыворотку отделяли от венозной крови центрифугированием при 3000 rpm в течение 20 мин при 40C. Делипидированную сыворотку получали путем удаления из полученной цельной сыворотки всех классов липопротеидов методом последовательно ультрацентрифугирования. Перед экспериментом делипидированную сыворотку диализовали против 0.01 М PBS, рН 7.4 для удаления из нее NaBr. Для создания сравнимых условий цельную сыворотку также диализовали при идентичных условиях.

Методом электрофореза на ацетате целлюлозы на системе Scanion (Hospitex diagnostics S.A.) проверяли отсутствие липопротеидов и чистоту делипидированной сыворотки.

СекФлА2(IIA) из опухоли сердца человека (миксомы) была любезно предоставлена доктором Бибилашвили Р.Ш. и доктором Хаспековым Г.Л., (лаборатория генной инженерии Российского кардиологического научно-производственного комплекса). Удельная активность фермента составляла 36 мкмоль гидролизованного фосфатидилэтаноламина/мин/мг.

Липопротеиды выделяли из плазмы крови здоровых доноров путем последовательного градиентного ультрацентрифугирования по методу Havel [Havel et al., 1955].

Определении белка проводили по медоду, описанному Lowry [Lowry et al,. 1951]. Чувствительность метода была от 5 мкг до 35 мкг белка

Приготовление ЛНП, обогащённых СФМ, ФХ, ХС, ЭХС и окФХ. В отдельные пробирки добавляли различные количества СФМ, ФХ, ХС, ЭХС или окФХ, растворённых в хлороформе. Затем пробирки высушивали под струёй азота, добавили по 50 мкл 0,1 М PBS, рН 7.4 и озвучивали в течение 3-мин. К полученным суспензиям добавили свежевыделенные ЛНП (по 20 мкг белка в каждую пробирку) и инкубировали при 370С в течение 40 мин при постоянном перемешивании. Липопротеиды отделяли от неинкорпорировавшихся липидов центрифугированием смеси в плотности 1.006 г/мл в течение 8 час при 35000 оборотов/мин в роторе Type 65 фирмы «Бекман». Перед анализом липопротеиды диализовали против PBS, pH 7.4 и концентрацию белка в них определяли методом Лоури.

Приготовление окисленных липопротеидов. Свежевыделенные ЛОНП, ЛНП и ЛВП диализовали против PBS и хранили при 370С в течение 2-24 часов, либо через свежевыделенные липопротеиды пропускали струю кислорода в течение 40-90 мин. Окисление липопротеидов оценивали спектрофотометрически по образованию коньюгированных диенов при оптической длине волны 234 нм, как описано ранее [Esterbauer et al., 1989].

Тиобарбитуровый метод для определения липидных перекисей. 50 мкл образца смешивали со 150 мкл 20 % трихлоруксусной кислоты и со 150 мкл 0,67 % тиобарбитуровой кислоты. Инкубировали в течение 1 часа при 80 0С. После охлаждения при комнатной температуре смесь центрифугировали при 22000 g в течение 10 мин для осаждения денатурированного белка. Содержание продуктов окисления (TBARS - thiobarbituric acid reactive substances), выраженных как эквиваленты малонового диальдегида, определяли спектрофотометрически при 532 нм, используя в качестве стандаота 1,1,3,3-тетраэтоксипропан (или 1,1,3,3-тетраметоксипропан) (малондиальдегид бис-диметил ацетат).

Приготовление [14C]-меченных липопротеидов. 0.336 мкКю L-3-фосфатидилэтаноламин,1-ацил-2-(1-14C)арахидонил ([14C]ФЭ) (59 мКю/ммоль, Амершам) растворяли в хлороформе, высушивали под струёй азота, добавили 50 мкл PBS и озвучивали (50 sec pulses) в соникаторе (модель 450, Branson Ultrasonic corp.). К полученной суспензии добавляли свежевыделенные ЛОНП (0,2 мг белка), ЛНП (0,5 мг белка) или ЛВП (0,5 мг белка) и инкубировали при 370С в течение 3 часов при постоянном перемешивании. Липопротеиды отделяли от неинкорпорировавшегося [14C]РЭ центрифугированием смеси в плотности 1.006 г/мл в течение 8 час при 35000 rpm в роторе Type 65 (Beckman Instruments, Mountain View, CA, USA). Супернатант, содержащий свободный радиомеченный ФЭ, удалили, а липопротеиды, находящиеся на дне пробирки, собрали. Количество инкорпорировавшегося [14C]ФЭ составило около 90%. Перед анализом липопротеиды диализовали против PBS, pH 7.4 и концентрацию белка в них определяли методом Лоури.

Приготовление [14C]-меченных липосом. Липосомы были приготовлены с использованием L-3-фосфатидилхолин,1-стеароил-2-(1-14C)арахидонил ([14C]ФХ) (56 мКю/ммоль; Амершам) или L-3-фосфатидилэтаноламин,1-ацил-2-(1-14C)арахидонил ([14C]ФЭ) (59 мКю/ммоль, Амершам). Для приготовления липисом, содержащих радиоактивно меченный ФХ, [14C]ФХ (5 нмоль на каждую пробу) смешивали в хлороформе с холодным ФХ (12.5 нмоль на каждую пробу). Для приготовления липосом, содержащих радиоактивно меченный ФЭ, [14C]ФЭ (5 нмоль на пробу) смешивали в хлороформе с холодным ФХ (7.5 нмоль на пробу). Полученные смеси высушивали под струёй азота, затем растворяли в 1 мл диэтилового эфира и опять высушивали под струёй азота. Высушенные липиды ресуспендировали в соответствующем объеме Tris-HCl буфера pH 8.0, содержащего 100 мM Tris, 2 mM CaCl2, 0.15M NaCl, охлаждали в жидком азоте и озвучивали при 40С в соникаторе (модель 450, Branson Ultrasonic corp.) до получения четкой дисперсии. Для контрольных экспериментах готовили липосомы, содержащие только холодный ФХ (12,5 нмоль).

Определение концентрации секФлА2(IIA) в сыворотках крови проводили с помощью моноклональных антител, используя набор реактивов (sPLA2(IIA) (human synovial) enzyme immunoassay kit), полученный из Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). Эти антитела специфичны для секФлА2(IIA) и не имеют перекрёста с типом I, типом IV, типом V, типом VI и типом Х секФлА2. Минимальная определяемая концентрация фермента составляла 15.6 пг/мл.

Определение активности секФлА2(IIA) в сыворотках крови больных после коронарной ангиопластики проводили с помощью [14C]ФХ, который содержался в липосомах и использовался в качестве субстрата. Инкубационная смесь содержала 20 мкл сыворотки, 5 нмоль радиоактивно меченного субстрата, 100 мМ Tris -HCl буфера pH 8.0, 2 мM CaCl2. Конечный объём реакционной смеси составлял 250 мкл. Реакции проводили в течение 30 мин при 37 0С при постоянном перемешивании и останавливали добавлением 1.5 мл хлороформ:метанола (2:1, объём\объём). Верхний водно-метанольный слой удаляли. Липиды, экстрагированные в нижний хлороформный слой, высушивали под струёй азота, растворяли в 80 мкл хлороформа и разделяли методом тонкослойной хроматографии на силикагельных пластинках (DC, Merk, Germany), используя сольвентную систему хлороформ : метанол : 28% NH4OH (60:30:8 об/об/об). Очищенный ЛФХ использовали в качестве стандарта в каждой хроматограмме. Липидные пятна визуализировали парами йода и фракции, соответствующие ЛФХ, выскребали во флаконы, содержащие 7 мл сцинтилляционной жидкости. Радиоактивность определяли жидкостным сцинтилляционным счетчиком. Каталитическую активность определяли по количеству образовавшегося ЛФХ и выражали как нмоль/мин/мл.

Определение активности секФлА2(IIA) в цельной и делипидированной сыворотках здоровых доноров. Аликвоту сыворотки крови (либо цельной, либо делипидированной) с различным количеством секФлА2(IIA) добавляли к 10 мкл [14C]ФЭ-липосом, 100 mM Tris-HCl буфера pH 8.0, 2 мM CaCl2, 0.15M NaCl в конечный объём 500 мкл. В контрольном эксперименте в реакционную смесь, содержащую делипидированную сыворотку, добавляли только [14C]ФЭ-меченные липопротеиды без внесения [14C]ФЭ-липосом. Липиды разделяли методом тонкослойной хроматографии, используя сольвентную систему гексан : диэтиловый эфир : уксусная кислота (85:15:1 об/об/об). Очищенную арахидоновую кислоту применяли в качестве стандарта в каждой хроматограмме. Радиоактивность определяли жидкостным сцинтилляционным счетчиком. Каталитическую активность оценивали по количеству гидролизованного ФЭ и выражали как пмоль/мин.

Ингибирование маноалидом и моноклональными антителами к секФЛА2(IIA) активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови пациентов. Образцы сыворотки крови пациентов, содержащие 2,75 нг/мл секФЛА2(IIA) и проявляющие секФЛА2-активность, инкубировали с различными количествами специфического ингибитора секФЛА2(IIA) маноалидом (0,1-0,5 мкМ) в течение 30 мин при 37 0С или с 0,1 и 0,2 мкг специфических моноклональных антител к секФЛА2(IIA) в течение 2-х часов при 37 0С, а затем определяли в них активность секФЛА2(IIA).

Влияние нативных и окисленных ЛОНП, ЛНП и ЛВП на активность секФлА2(IIA). Различные количества нативных или окисленных ЛОНП, ЛНП или ЛВП (10 - 80 мкг белка) инкубировали с очищенной секФлА2(IIA) или с секФлА2(IIA), содержащейся в делипидированной сыворотке. Для возможности сравнивать эффекты липопротеидов на активности обеих секФлА2 (IIA), ферменты брали в количествах, которые имели одинаковую активность и гидролизовали 30 пмоль ФЭ мин-1. Реакционная смесь содержала 10 мкл [14C]ФЭ-липосом, 100 mM Tris-HCl буфера pH 8.0, 2 мM CaCl2, 0.15M NaCl в конечном объеме 500 мкл. В контрольных экспериментах для определения возможности разбавления радиоактивно меченных [14C]ФЭ-липосом фосфатидилхолином, содержащимся в липопротеидах, в инкубационную смесь вместо липопротеидов добавляли липосомы, содержащие только ФХ. Экстракцию фосфолипидов и определение активность секФлА2(IIA) проводили, как описано в пункте «Определение активности секФлА2(IIA) в цельной и делипидированной сыворотках здоровых доноров». Активность выражали как процент гидролизованного ФЭ относительно контрольной пробы, которая инкубировалась в отсутствие липопротеидов.

Статистическую обработку результатов производили с применением прикладных программ “STATISTICA for WINDOWS 6.0” StatSoft Inc., США. Результаты представлены как средние значения (M) + стандартная ошибка среднего значения или стандартное отклонение среднего значения (SD). Пациенты без рестеноза выступали как «контроль» для группы пациентов с развившимся рестенозом. Достоверность изменения средних величин рассчитывали по t-критерию Стьюдента (после проведения анализа нормальности распределения статистических величин). При проведении корреляционного анализа между концентрацией и активностью секФлА2(IIA) вычисляли коэффициент линейной корреляции Пирсона. Для всех видов анализа статистически достоверным считали значения р < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Клинико-ангиографические показатели больных

Контрольная коронарная ангиография, выполненная у 49 больных через 6 месяцев после проведения коронарной ангиопластики, выявила рестеноз у 19 больных.

Больные с развившимся рестенозом и без рестеноза были сопоставимы по основным клинико-лабораторным и ангиографическим показателям. Характеристика 19 пациентов с развившимся в ходе исследования рестенозом и 30 пациентов без рестеноза приведена в табл. 1 и табл. 2.

Табл. 1 Клиническая характеристика больных с развившимся рестенозом и без рестеноза

Показатели	С рестенозом	Без рестеноза
Количество пациентов Возраст, годы Гипертония Курение Перенесенный инфаркт миокарда Лейкоциты крови, тыс/мкл Тромбоциты крови, тыс/мкл СОЭ, мм/ч Уровень холестерина в крови, моль/л Уровень триглицеридов в крови, моль/л Уровень глюкозы в крови, ммоль/л Уровень креатинина в крови, мкмоль/л	19 54,6 + 12,3 8 (42 %) 12 (63 %) 10 (53 %) 6,6 + 1,6 215 + 58,3 4,5 + 2,8 5,4 + 0,61 1,8 + 0,7 5,6 + 0,6 99,3 + 34,5	30 55,2 + 9,2 10 (33 %) 8 (27 %) 14 (47 %) 6,8 + 1,4 221 + 64,1 4,8 + 2,6 5,2 + 0,9 1,6 + 0,8 5,2 + 1,3 108,3 + 21,6

Участие секФЛА2(IIA) в развитии рестеноза

Концентрацию и активность секФЛА2(IIA) определили в сыворотке крови 49 больных непосредственно перед коронарной ангиопластикой, в течение первых 7 дней и через 6 месяцев после процедуры. Концентрация секФЛА2(IIA) до начала коронарной ангиопластики (0 день, базальный уровень) была практически одинаковой у всех обследованных пациентов (1,51 + 0,2 нг/мл) и не отличалась у пациентов без рестеноза и пациентов с развившимся впоследствии рестенозом (рис. 1).

Через 1 сутки после коронарной ангиопластики у пациентов с развившимся впоследствии рестенозом наблюдалось резкое и значительное увеличение концентрации секФЛА2(IIA) (в 2.4 раза по сравнению с базальным уровнем, т.е. с уровнем до начала ангиопластики (3,8 + 0,6 нг/мл, р < 0,05)).

Повышенный уровень фермента у этих пациентов сохранялся в течение последующих 7 суток.

Хотя в течение данного периода времени наблюдалось постепенное снижение концентрации секФЛА2(IIA), к 7-м суткам после ангиопластики уровень фермента оставался в 2 раза выше по сравнению с базальным уровнем (3,2 + 0,5 нг/мл).

Табл. 2 Ангиографическая характеристика больных с развившимся рестенозом и без рестеноза

Показатели	С рестенозом n = 19	Без рестеноза n = 30
Исходный стеноз, % Протяженность стеноза, мм Диаметр артерии, мм Количество поражений артерий 1 2 3 Локализация ПНА ОА ПКА Сегмент артерии Проксимальный Средний Дистальный Устье	77,0 + 9,8 13,1 + 4,1 2,94 + 0,45 4 (21 %) 8 (42 %) 7 (37 %) 12 (63 %) 2 (11 %) 5 (26 %) 5 (26 %) 9 (48 %) 4 (21 %) 1 (5 %)	79,1 + 11,2 12,9 + 3,8 3,01 + 0,38 8 (27 %) 12 (40 %) 10 (33 %) 14 (47 %) 5 (17 %) 11 (36 %) 9 (30 %) 14 (47 %) 7 (23 %) 0 (0 %)

У пациентов, рестеноз у которых не возник, концентрация секФЛА2(IIA) через 1 сутки после ангиопластики увеличилась незначительно по сравнению с базальным уровнем (2,3 + 0,4 нг/мл) и постепенно снизилась, достигнув к 7-ым суткам значения, близкого к исходному (1,7 + 0,3 нг/мл). Через 6 месяцев после ангиопластики уровень секФЛА2(IIA) у всех обследованных пациентов соответствовал базальному уровню.



n=19 n = 30

Рис. 1 Концентрация секФЛА2(IIA) в сыворотке крови пациентов до и после коронарной ангиопластики

Концентрацию секФЛА2(IIA) измеряли в сыворотке крови пациентов до ангиопластики (0 день), в течение 1-7 дней и через 180 дней после коронарной ангиопласти при помощи моноклональных антител к секФЛА2(IIA). Представлены данные (M+ стандартная ошибка среднего) группы пациентов, у которых в дальнейшем развился рестеноз (n=19, закрытые символы), и пациентов, рестеноз у которых не развился (n=30, открытые символы). У пациентов с развившимся впоследствии рестенозом концентрация секФЛА2(IIA) на 1-7 сутки после ангиопластики значительно повысилась по сравнению с 0 днем (до ангиопластики) (р<0,05).

Каталитическая активность секФЛА2(IIA) в сыворотках крови пациентов с развившимся впоследствии рестенозом и у пациентов, рестеноз у которых не возник, до начала коронарной ангиопластики (0 сутки) и в течение первых 2-х суток после процедуры была незначительной, на грани чувствительности метода (рис. 2). У пациентов с развившимся впоследствии рестенозом активность секФЛА2(IIA) стала увеличиваться на 3-е сутки. На 4-е сутки активность фермента резко возросла, увеличившись в 5,8 раз по сравнению с 0 сутками (3,5 нмоль/мин/мл и 0,6 нмоль/мин/мл соответственно) и к 6-м сутки после ангиопластики достигла максимального значения (5,02 + 0,4 нмоль/мин/мл, р < 0,001 по сравнению с 0 сутками), увеличившись в 6,6 раз (3,95 нмоль/мин/мл).

Наоборот, у всех пациентов, рестеноз у которых не возник, изменения активности фермента не наблюдалось в течение всего периода наблюдения. У этих пациентов активность секФЛА2(IIA) оставалась на грани чувствительности метода (0,4 нмоль/мин/мл).

n = 19 n = 30

Рис. 2 Активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови пациентов до и после коронарной ангиопластики

Активность секФЛА2(IIA) измеряли в сыворотке крови пациентов до ангиопластики (0 день), в течение 1-7 дней и через 180 дней после коронарной ангоипластики при помощи липосом, содержащих радиоактивно меченный ФХ в качестве субстрата. Представлены данные (M+стандартная ошибка среднего) группы пациентов, у которых в дальнейшем развился рестеноз (n=19, закрытые символы), и группы пациентов, рестеноз у которых не развился (n=30, открытые символы). У пациентов с развившимся впоследствии рестенозом активность секФЛА2(IIA) на 4-7 сутки после ангиопластики была значительно выше по сравнению с её активностью до начала ангиопластики (0 день) (*р<0,001) и по сравнению с активностью секФЛА2(IIA) в группе пациентов без рестеноза (р<0,001).

Чтобы определить форму фосфолоипазы А2, которая проявляет активность в сыворотке крови пациентов, мы проводили ингибиторный анализ. Специфический необратимый ингибитор секФЛА2(IIA) маноалид и моноклональные антитела к секФЛА2(IIA) инкубировали с сывороткой крови больных с развивающимся рестенозом, отобранную на 6-е сутки после ангиопластики (проявляющую максимальную секФЛА2-активность). Маноалид дозо-зависимым образом ингибировал секФЛА2-активность и в концентрации 0,2 мкМ полностью устранял активность фермента рис. 3(а). Специфические моноклональные антитела к секФЛА2 типа IIA также полностью ингибировали секФлА2-активность (рис. 3(б)).

Таким образом, полученные данные показывают, что в сыворотке крови пациентов после коронарной ангиопластики проявляется активность секФЛА2(IIA), а другие представители семейства фосфолипазы А2 не вносят вклад в измеряемую активность. Литературные данные также свидетельствуют, что в плазме крови пациентов с ишемической болезнью сердца и инфекционными заболеваниями из секреторных фосфолипаз А2 обнаруживается только секФЛА2(IIA) [de Beer FC at al. 2006; Aarsman et al, 2000].

Корреляционный анализ не выявили пропорциональной зависимости между концентрацией и активностью секФЛА2(IIA). Активность секФЛА2(IIA) начинает возрастать у пациентов с развивающимся рестенозом только на 3 сутки после ангиопластики, хотя концентрация фермента у этих больных резко возрастает уже на 1-е сутки после процедуры. Максимального значения активность секФЛА2(IIA) достигает к 6-м суткам после ангиопластики, в то время как концентрация фермента к этому моменту уже снижается. Эти данные свидетельствуют о наличии в сыворотке крови компонентов, регулирующих активность секФЛА2(IIA) (ингибитора или активатора), соотношение между которыми может изменяться на 3-е сутки после ангиопластики у пациентов с развивающимся рестенозом. Кроме того, значительная разница в активности секФЛА2(IIA) между пациентами с развившимся рестенозом и пациентами, рестеноз у которых не развился, подтверждает данное предположение.

3. Активность секФЛА2(IIA) в цельной сыворотке крови и сыворотке, лишенной липопротеидов

Поскольку ингибиторный белок в сыворотке крови человека до сих пор не обнаружен, мы предположили, что ингибиторами секФЛА2(IIA) могут быть липиды. Липиды не растворяются в воде, и в плазме крови они находятся в составе циркулирующих липопротеидов - ЛОНП, ЛНП и ЛВП.

Чтобы проверить могут ли липопротеиды влиять на активность секФЛА2(IIA), мы определили активность секФЛА2(IIA) в цельной сыворотке здоровых доноров и после удаления из неё всех классов липопротеидов (делипидированной сыворотке). Предварительно в цельной и делипидированных сыворотках определили с помощью моноклональных антител к человеческой секФЛА2(IIA) уровень секФЛА2(IIA), как описано в разделе «Материалы и методы».

Цельная сыворотка крови, независимо от количества содержащейся в ней секФЛА2(IIA), не проявляла никакой активности фосфолипазы А2. Однако после удаления из неё всех классов липопротеидов (делипидирования) сыворотка стала проявлять секФЛА2-активность, которая была прямо пропорциональна количеству содержащейся в сыворотке секФЛА2(IIA) (рис.4).

Таким образом, полученные результаты показывают, что циркулирующие липопротеиды (ЛОНП, ЛНП и ЛВП) могут подавлять каталитическую активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека.

Рис. 4 Активность секФЛА2(IIA) в цельной и делипидированной сыворотке крови

Аликвоты цельной сыворотки крови здоровых доноров (закрытые символы) и после удаления из неё липопротеидов (открытые символы), содержащие одинаковые количеством секФЛА2(IIA) (25-100 пг) инкубировали при 37 0С в течение 30 мин с радиоактивно меченными ФЭ липосомами в качестве субстрата. Активность секФЛА2(IIA) оценивали по количеству выделившейся арахидоновой кислоты. Данные представлены как М + SD восьми независимых экспериментов (р < 0,01).

4. Влияние ЛОНП, ЛНП и ЛВП на активность секФЛА2(IIA)

Для установления ингибирующего влияния липопротеидов свежевыделенные ЛНП, ЛВП и ЛОНП инкубировали с секФЛА2(IIA) из опухоли сердца человека (миксомы). Этот фермент идентичен секФЛА2(IIA), находящейся в сыворотке крови человека [Skamrov et al., 2004]. ЛНП при концентрации 60 мкг белка в пробе полностью ингибировали активность секФЛА2(IIA). Аналогичное ингибирующее действие на активность секФЛА2(IIA) оказывали ЛВП и ЛОНП. Полное ингибирование активности секФЛА2(IIA) под действием ЛВП и ЛОНП наблюдалось при их соответствующих концентрациях 80 и 40 мкг по белку в инкубационной пробе (рис 5.).

Как известно, ФЭ, содержащийся в липосомах, является преимущественным субстратом для секФЛА2(IIA) и предпочтительнее гидролизуется ферментом, чем ФХ, содержащийся в липопротеидах. Однако между липосомами и липопротеидами в инкубационной смеси может происходить обмен фосфолипидами. Увеличение количества ЛНП, содержащих большое количество ФХ, может приводить к вытеснению фосфатидилхолином ФЭ, содержащегося в липосомах, в результате чего количество гидролизуемого ФЭ может снижаться. Чтобы проверить, не связано ли наблюдаемое уменьшение высвобождения меченной жирной кислоты с «разбавлением субстрата», в инкубационную смесь вместо ЛНП были добавлены липосомы, концентрация ФХ в которых сохранялась в пределах физиологической концентрации ФХ в ЛНП [Skipski, 1967]. Как видно на рис. 5, увеличение концентрации ФХ не влияло на гидролиз ФЭ секФЛА2(IIA) и количество меченой арахидоновой кислоты, отщепляемой от ФЭ, не изменялось при увеличении количества ФХ в липосомах.

Таким образом, полученные результаты показывают, что наблюдаемое дозо-зависимое уменьшение активности секФЛА2(IIA) происходит за счёт ингибирования нативными ЛНП, ЛВП и ЛОНП гидролиза субстрата, а не за счет его разбавления.



Рис. 5 Влияние нативных ЛНП, ЛВП и ЛОНП на активность очищенной секФЛА2(IIA)

Различные количества свежевыделенных ЛВП (закрытые квадраты), ЛНП (закрытые треугольники), и ЛОНП (закрытые кружки) инкубировали при 370С в течение 30 мин с очищенной секФЛА2(IIA), которая гидролизовала 30 пмоль ФЭ в мин. Ингибирующий эффект липопротеидов на активности фермента оценивали по снижению количества радиоактивно меченной арахидоновой кислоты, выделившейся из ФЭ липосом. Чтобы выяснить, происходит ли разбавление радиоактивного субстрата ФХ, содержащимся в липопротеидах, в инкубационную смесь вместо ЛНП добавили различные количества ФХ в составе липосом (открытые кружки). Ингибирующего эффекта в этом случае не наблюдалось. Активность секФЛА2(IIA) выражали в процентах от количества жирных кислот, выделившихся в отсутствие либо липопротеидов, либо ФХ липосом (данные представлены как М + SD, n=5, р < 0,01).

Чтобы проверить, оказывают ли липопротеиды ингибирующее влияние на секФЛА2(IIA), находящуюся в сыворотке крови, различные количества свежевыделенных ЛНП, ЛВП и ЛОНП добавили к делипидированной сыворотке, секФЛА2(IIA)-активность которой соответствовала активности очищенной секФЛА2(IIA). Как видно на рис. 6. нативные ЛНП, ЛВП и ЛОНП сохраняли своё ингибиторное действие и подавляли активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови.

Рис. 6 Подавление нативными ЛНП, ЛВП и ЛОНП активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови

Различные количества ЛВП (закрытые квадраты), ЛНП (закрытые треугольники), и ЛОНП (закрытые кружки) инкубировали с секФЛА2(IIA), содержащейся в делипидированной сыворотке (активность фермена в реакционной смеси в отсутствие липопротеидов составляла 30 пмоль ФЭ в мин). Условия эксперимента как в подписи к рис. 5. Данные представлены как М + SD, n=5 (р < 0,01).

Известно, что мембраны интактных клеток и нативные липопротеиды не подвержены фосфолипидному гидролизу со стороны секФЛА2(IIA) [Murakami et al., 1995; Singer et al., 2002; Schaloske et al. 2006; Boyanovsky et al., 2009]. Однако Прузански и соавт. показали, что инкубация секФЛА2(IIA) с нативными липопротеидами в течение не менее, чем 4-х часов при 370С может приводить к незначительному гидролизу фосфолипидов в составе липопротиедов [Pruzanski et al., 1998].

В данной работе было проверено, расщепляется ли ФЭ, находящийся в составе ЛНП, секФЛА2(IIA). Для этого радиоактивно меченый ФЭ инкорпорировали в частицы ЛНП, как описано в разделе «Материалы и Методы», и проинкубировали их с делипидированной сывороткой без добавления липосом. В данном случае субстратом для секФЛА2(IIA) служили сами радиоактивно меченные ЛНП. Кроме того, инкубацию проводили в течение 30 мин. Выделения [14C]арахидоновой кислоты из радиоактивно меченных ЛНП не наблюдалось. Эти контрольные эксперименты подтверждают полученные нами данные о том, что нативные ЛНП ингибируют активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови.

5. Влияние липидов, входящих в структуру липопротеидов, на активность секФЛА2(IIA)

Все классы липопротеидов содержат в своём составе фосфатидилхолин (ФХ), сфингомиелин (СФМ), холестерин (ХС) и эфиры холестерина (ЭХС). Все эти липиды могут влиять на активность секФЛА2(IIA). Ранее было показано, что СФМ может ингибировать рекомбинантную секФЛА2(IIA), а также рекомбинантную секФЛА2 группы V [Koumanov et al, 1997; Singh et al., 2007]. Сообщалось также, что ХС препятствует ингибирующему эффекту СФМ, а в концентрации, равной концентрации СФМ, полностью отменяет ингибирующий эффект СФМ [Koumanov at al, 1998 ]. Известно, что в ЛНП содержание ХС приблизительно в 2 раза больше, чем содержание СФМ, поэтому неясным остаётся вопрос, сохраняет ли СФМ свою ингибиторную способность, находясь в структуре ЛНП. Чтобы проверить это, различные количества СФМ инкорпорировали в ЛНП и изучили влияние полученных ЛНП на активность секФЛА2(IIA) в сравнении с эффектом свободного СФМ.

СФМ как в свободном виде, так и инкорпорированный в ЛНП, ингибировал выделение свободных жирных кислот из радиоактивно меченного субстрата, происходящего под действием секФЛА2(IIA) (рис. 7). Максимальное ингибирование активности секФЛА2(IIA) как свободным СФМ, так и инкорпорированным в ЛНП, составляло приблизительно 65%. Увеличение концентрации СФМ в инкубационной смеси не приводило к дальнейшему снижению активности фермента. Субстратом для секФЛА2(IIA) являются фосфолипиды. К этому классу веществ относится и СФМ. Наблюдаемое неполное ингибирование активности секФЛА2(IIA) сфингомиелином может быть связано с конкуренцией СФМ с субстратом за активный центр фермента.

Рис. 7 Ингибирование активности секФЛА2(IIA) сфингомиелином

Различные количества СФМ либо в свободном виде (открытые символы), либо инкорпорированного в ЛНП (20 мкг по белку) (закрытые символы) инкубировали с секФЛА2(IIA) (активность секФЛА2(IIA) в инкубационной смеси составляла 30 пмоль ФЭ в мин) в течение 30 мин при 37 0С. Активность выражали в процентах от активности в отсутствие добавленных СФМ или ЛНП. Данные представлены как М + SD, n=5, р < 0,01.

В липопротеидной частице из всех фосфолипидов наибольшее содержание принадлежит ФХ. Известно, что ФХ является очень плохим субстратом для секФЛА2(IIA) [Singer et al., 2002; Schaloske et al. 2006; Boyanovsky et al., 2009]. Находясь в составе липопротеидной частицы ФХ не расщепляется секФЛА2(IIA) и, следовательно, наряду с другими липидами может оказывать влияние на активность секФЛА2(IIA). Чтобы проверить это, различные количества ФХ инкорпорировали в свежевыделенные ЛНП и оценили их влияние на расщепление радиоактивно меченного субстрата под действием секФЛА2(IIA).

ФХ ни в свободном виде, ни в составе ЛНП не влиял на гидролиз [14C]ФЭ в липосомах под действием секФЛА2(IIA) (рис. 8). Следовательно, ФХ, находящийся в структуре циркулирующих липопротеидов, не оказывает влияния на активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови.

Рис. 8 Влияние фосфатидилхолина на активность секФЛА2(IIA)

Различные количества ФХ, находящегося либо в свободном виде (открытые символы), либо инкорпорированного в ЛНП (20 мкг белка) (закрытые символы) инкубировали с секФЛА2(IIA). Условия эксперимента как в подписи к рис. 7. Активность рассчитывали как процент от активности в отсутствие ФХ или ЛНП с инкорпорированным в них ФХ. Данные представлены как М + SD пяти независимых экспериментов.

Как было сказано выше, в липопротеидах, помимо СФМ и ФХ, содержится ХС. Свободный ХС не оказывал никакого влияния на активность секФЛА2(IIA) (рис.9). Однако, будучи инкорпорированным в ЛНП, ХС вызывал небольшое (на 10%) уменьшение активности секФЛА2(IIA), причем это уменьшение было постоянным и не зависело от количества инкорпорированного ХС. Логично предположить, что наблюдаемый эффект связан с распределением ХС в липидном монослое липопротеидной частицы.

Рис. 9 Влияние холестерина на активность секФЛА2(IIA)

ХС в свободном виде (открытые символы), либо инкорпорированный в ЛНП (закрытые символы), инкубировали с секФЛА2(IIA). Активность фермента рассчитывали, как описано в рис. 8. Данные представлены как М + SD пяти экспериментов.

ЭХС как в свободном виде, так и инкорпорированные в ЛНП, в широком диапозоне концентраций, не влияли на активность секФЛА2(IIA) (рис.10).

Рис. 10 Влияние эфиров холестерина на активность секФЛА2(IIA)

Как известно, липиды расположены в липидной глобуле в строго определенном порядке. Стационарное соотношение СФМ и ХС является одним из условий стабильности глобулы. Изменения концентрационных соотношений этих липидов могут модулировать свойства липопротеидной частицы. В результате влияние СФМ на активность секФЛА2(IIA) может измениться. Чтобы проверить данное предположение, в ЛНП, содержащие постоянное количество СФМ (2 нмоль), инкорпорировали разные количества ХС, а затем инкубировали эти ЛНП с секФЛА2(IIA).

Как видно на рис. 11, ЛНП с инкорпорированным в них СФМ подавляли активность секФЛА2(IIA) на 50%. Добавление ХС к ЛНП уменьшало приблизительно на 15 % это ингибирование, увеличив активность секФЛА2(IIA) до 72%. Надо отметить, что увеличение активности секФЛА2(IIA) не зависело от концентрации ХС и сохранялось практически постоянным. Эти результаты отличаются от полученных выше результатов, в которых ХС, инкорпорированный в нативные ЛНП, наоборот, слегка подавлял (на 10 %) активность секФЛА2(IIA). Известно, что в биологических мембранах ХС тесно ассоциирован со СФМ [Shinitzky, 1974; Slotte, 1999; Barenholz, 2004]. Вероятно, полученные противоречия связаны с разной степенью влияния одного ХС и смеси ХС и СФМ на жидкостность липидного монослоя ЛНП, что отражается на активности секФЛА2(IIA).

Аналогичным образом мы проверили, оказывают ли ЭХС модулирующее влияние на ингибирование активности секФЛА2(IIA) сфингомиелином. С этой целью различные количества ЭХС инкорпорировали в 20 мкг ЛНП (по белку), которые содержали 2 нмоль СФМ. Как видно на рис. 12, инкорпорирование ЭХС не повлияло на ингибирование активности секФЛА2(IIA) сфингомиелином ЛНП.

Таким образом, на ингибирование секФЛА2(IIA) сфингомиелином, содержащимся в ЛНП, слабый восстанавливающий эффект оказывает ХС, причем этот эффект не зависит от концентрации ХС. ЭХС не влияют на ингибирование секФЛА2(IIA) СФМ ЛНП.



Рис. 11 Влияние холестерина на ингибирование секФЛА2(IIA) сфингомиелином, содержащимся в частице ЛНП

К 20 мкг ЛНП (по белку), в которые было инкорпорировано 2 нмоль СФМ, добавили различные количества ХС. Полученные ЛНП инкубировали с секФЛА2(IIA), а затем в инкубационной смеси определяли активность секФЛА2(IIA), приняв за 100 % активность секФЛА2(IIA) в отсутствие СФМ и ХС. Данные представлены как М + SD пяти экспериментов.



Рис. 12 Влияние эфиров холестерина на ингибирование активности секФЛА2(IIA) сфингомиелином ЛНП

ЭХС инкорпорировали в ЛНП как описано в подписи рис. 11. Представлены данные 5 экспериментов (М + SD).

6. Влияние окЛОНП, окЛНП и окЛВП на активность секФЛА2(IIA)

Окислительные процессы, происходящие в организме при воспалении, могут приводить к образованию окисленных форм липопротеидов. Как известно, окисленные липопротеиды, в отличие от нативных, проявляют различные биологические эффекты, способствующие атерогенезу [Tsimikas et al., 2008; Nakajima et al., 2006; Matsuura et al., 2006]. Логично было предположить, что влияние окисленных липопротеидов на активность секФЛА2(IIA) может отличаться от влияния нативных липопротеидов. Для проверки данного предположения были приготовили аутоокисленные окЛОНП, окЛНП и окЛВП, как описано в разделе «Материалы и Методы». Как показано на рис. 13, окЛНП значительно стимулировали активность очищенной секФЛА2(IIA). Увеличение количества окЛНП в инкубационной среде приводило к увеличению количества свободной [14C]-меченной жирной кислоты, отщепившейся от радиоактивно меченного субстрата. Приблизительно 3-х кратное повышение активности секФЛА2(IIA) (по сравнению с базальным уровнем) наблюдалось при добавлении окЛНП в концентрации 40 мкг (p<0.01). Подобное стимулирующее влияние на активность очищенной секФЛА2(IIA) оказывали окЛВП и окЛОНП.

Влияние окисленных липопротеидов на очищенную секФЛА2(IIA) могло отличаться от эффектов на секФЛА2(IIA), содержащуюся в сыворотке крови, т.к. компоненты сыворотки крови (различные метаболиты, белки, протеазы, антиоксиданты и т.д.) могут воздействовать на окисленные липопротеиды и препятствовать их эффектам. Чтобы проверить, сохраняют ли окисленные липопротеиды активирующий эффект на секФЛА2(IIA), находящуюся в сыворотке крови, различные количества окисленных липопротеидов (окЛНП, окЛВП и окЛОНП) проинкубировали с цельной и делипидированной сыворотками, аликвоты которых содержали 50 пг секФЛА2(IIA). Такое количество секФЛА2(IIA) в делипидированной сыворотке проявляло активность, равную активности очищенной секФЛА2(IIA) в инкубационной смеси выше представленных экспериментов (30 пмоль гидролизованного ФЭ в мин). Как видно на рис. 14, окЛНП, окЛОНП и окЛВП стимулировали активность секФЛА2(IIA) в делипидированной сыворотке, подобно их действию на очищенный фермент.



Рис. 13 Влияние окЛНП на активность очищенной секФЛА2(IIA)