Секреторная фосфолипаза А2 группы IIА в сыворотке крови больных после коронарной ангиопластики: регуляция липидами и липопротеидами

ОкЛНП в различных концентрациях (5-40 мкг белка) инкубировали с очищенной секФЛА2(IIA). Активность секФЛА2(IIA) рассчитывали как процент от базальной активности, рассчитанной в отсутствие окисленных липопротеидов. Данные представлены как М + SD, n=5 (р<0,01).

Рис. 14 Стимуляция окисленными липопротеидами активности секФлА2(IIA), содержащейся в сыворотке крови

7. Влияние ЛНП с различной степенью окисления на активацию секФлA2(IIA)

При окислении липопротеидов происходит изменение их фосфолипидного состава. Чем длительнее процесс окисления, тем больше окисленных фосфолипидов и ЛФХ образуется в липопротеидной частице. Эти продукты обладают широким спектром биологических эффектов. Например, ЛФХ активно участвует в развитии атеросклероза. ЛФХ является бифункциональной молекулой, поэтому биологические эффекты ЛФХ часто характеризуются двухфазной зависимостью от концентрации этого фосфолипида. При высокой концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования, ЛФХ может вызывать эффекты, противоположные эффектам его низких концентраций. Например, при низких концентрациях (менее 20 мкМ) ЛФХ активирует протеинкиназу С из мозга крысы, и, наоборот, подавляет её при высоких концентрациях (более 30 мкМ) [Oishi et al., 1988]. Представлялось важным изучить влияние ЛНП, имеющих разную степень окисления, а, следовательно, и различный фосфолипидый состав, на активность секФлA2(IIA). С этой целью были приготовлены ЛНП с разной степенью окисления. Степень окисления оценивали спектрофотометрически по образованию диеновых коньюгатов и количественными методами по образованию эквивалентов малонового диальдегида (TBARS) и по расщеплению ФХ и накоплению ЛФХ (табл. 3).

Табл. 3 Оценка степени окисления ЛНП в зависимости от количества образовавшегося в них ЛФХ и продуктов окисления

Результаты настоящего исследования показали, что слабо и средне окисленные ЛНП, в которых менее 40% ФХ превратилось в ЛФХ, активировали очищенную секФлA2(IIA). Активность секФЛА2(IIA) возрастала прямо пропорционально количеству добавленных в инкубационную смесь слабо и средне окисленных ЛНП (рис. 15). Сильно окисленные ЛНП, в которых более 40% ФХ превратилось в ЛФХ, наоборот, дозо-зависимым образом ингибировали секФЛА2(IIA) (рис. 16).

Рис. 15 Влияние ЛНП, имеющих среднюю степень окисления, на активацию секФлA2(IIA)

Разные количества средне окисленных ЛНП, в которых не более 40% ФХ расщепилось до ЛФХ, инкубировали с секФЛА2(IIA). Активность секФЛА2(IIA) рассчитывали как процент от количества жирных кислот, выделившихся в отсутствие окисленных липопротеидов. Данные представлены как М + SD пяти независимых экспериментов (р < 0,01).

Рис. 16 Влияние сильно окисленных ЛНП на активность секФлA2(IIA)

Описание эксперимента как в подписи к рис. 15. В сильно окисленных ЛНП более 40% входящего в их состав ФХ расщепилось до ЛФХ.

8.Влияние окисленного фосфатидилхолина на активацию секФЛА2(IIA)

При окислении липопротеидов помимо ЛФХ в них образуются окисленные фосфолипиды. Клинические исследования выявили взаимосвязь между повышенным уровнем окисленных фосфолипидов, ассоциированных с аро-В100 липопротеидными частицами, и развитием различных сердечно-сосудистых событий у пациентов и здоровых доноров [Tsimikas et al., 2008; Kiechl et al., 2007; Choi et al., 2008]. Поскольку основным фосфолипидом липопротеидов, который легко подвергается окислению, является ФХ, в данной работе было исследовано влияние окисленного ФХ (1-пальмитоил-2-арахидонил-ФХ) (окФХ) на активацию секФЛА2(IIA).

ОкФХ как в свободном виде, так и инкорпорированный в ЛНП, стимулировал активность секФЛА2(IIA)(рис. 17). 1 нмоль окФХ, как свободного, так и инкорпорированного в ЛНП (20 мкг белка), увеличивал активность секФЛА2(IIA) приблизительно в 2 раза (около 200 %).

Рис. 17 Активирующее влияние окисленного фосфатидилхолина на секФЛА2(IIA)

окФХ добавляли в инкубационную смесь либо в виде отдельных липосом (открытые символы), либо инкорпорированным в ЛНП в концентрациях, указанных на рисунке. Активность секФЛА2(IIA)оценивали по количеству отщепившейся жирной кислоты и выражали в процентах от базального уровня, рассчитанного в отсутствие окФХ и принятого за 100 %. Данные представлены как М + SD пяти экспериментов (р < 0,01).

9. Конкурентное подавление сфингомиелином активации секФЛА2(IIA), вызванной окисленным фосфатидилхолином

Молеклулы СФМ и ФХ (так же, как и окФХ) содержат в своей структуре идентичные фосфохолиновые группы. Следовательно, логично было предположить, что СФМ и окФХ могут конкурировать друг с другом при связывании с секФЛА2(IIA). Чтобы проверить это, в координатах Лайнуивера - Берка (двойные обратные величины) проанализировали активацию секФЛА2(IIA) под действием окФХ в присутствии СФМ и без СФМ. Как видно на рис. 18, оба графика пересекаются в одной точке на оси ординат, а на оси абсцисс они отсекают разные участки, свидетельствующие об изменении константы активации (Ка) реакции. При активации секФЛА2(IIA) окисленным ФХ Ка равнялась 0.55 µМ, а в присутствии 4 мкМ СФМ Ка увеличилась в 2.4 раза и составила 1.33 µМ. Эти данные являются доказательством конкурентного ингибирования сфиргомиелином активации секФЛА2(IIA), происходящей под действием окФХ.

Рис. 18 Конкурентное подавление сфингомиелином активации секФЛА2(IIA), вызванной окисленным фосфатидилхолином

Анализ в координатах Лайнуивера - Берка (двойные обратные величины)

Исходя из полученных результатов, можно предположить, что СФМ и окФХ могут взаимно устранять эффекты, оказываемые ими на активность секФЛА2(IIA). Чтобы проверить это, к ЛНП, в которые был инкорпорирован СФМ, добавили разные количества окФХ и оценили их влияние на активность секФЛА2(IIA). Как видно на рис. 19, увеличение концентрации окФХ в ЛНП приводило к устранению ингибирующего эффекта СФМ и значительно стимулировало активность секФЛА2(IIA). ОкФХ в концентрации 4 нмоль увеличил активность секФЛА2(IIA) более, чем в 2, 5 раза (270 %).

Рис. 19 Устранение окисленным фосфатидилхолином, инкорпорированным в ЛНП, ингибирующего эффекта сфингомиелина

СекФЛА2(IIA) в количестве, гидролизующем 30 пмоль ФЭ в мин, инкубировали с радиоактивно меченными липосомами ФЭ. Активность секФЛА2(IIA) рассчитывали по количеству отщепившейся арахидоновой кислоты и принимали за 100%. Затем в инкубационную смесь добавили 2 нмоль СФМ, инкорпорированного в ЛНП (20 мкг по белку), который заблокировал активность секФЛА2(IIA) на 50%. Последующее добавление окФХ (от 0,5 до 4 нмоль) приводило к устранению ингибирующего эффекта СФМ и стимуляции активности секФЛА2(IIA). Представлены данные 6 экспериментов (М + SD, р < 0,01).

Чтобы проверить, устраняет ли СФМ активирующий эффект окФХ, к 20 мкг ЛНП (по белку), содержащим 1 нмоль окФХ, добавляли разные количества СФМ и оценивали их влияние на активность секФЛА2(IIA). Как видно на рис. 20, окФХ, инкорпорированный в ЛНП в концентрации 1 нмоль, увеличил активность секФЛА2(IIA) более, чем в 2 раза. Последующее добавление к этим ЛНП различных концентраций СФМ привело к понижению активности секФЛА2(IIA) и в концентрации 8 нмоль СФМ практически полностью устранил активирующий эффект окФХ.

Рис. 20 Устранение сфингомиелином активации секФЛА2(IIA), индуцированной окисленным фосфатидилхолином

В инкубационную смесь, содержащую секФЛА2(IIA) в количестве, гидролизующем 30 пмоль ФЭ в мин (активность принимали за 100 %, добавили 1 нмоль окФХ, инкорпорированного в ЛНП(20 мкг по белку), который повышал активность секФЛА2(IIA) до 235 %. Затем в инкубационную смесь в разных количествах добавили СФМ, который устранил активирующие влияние окФХ и ингибировал активность секФЛА2(IIA).

Активность секФЛА2(IIA выражали в процентах от исходного уровня. Представлены данные 4 экспериментов (М + SD, р < 0,01).

Аналогичным образом было проверено, может ли ХС модулировать активирующий эффект окФХ на секФЛА2(IIA). Как видно на рис. 21, ХС не оказал никакого влияния на активирующее действие окФХ.

Рис. 21 Влияние холестерина на активацию секФЛА2(IIA), индуцированную окисленным фосфатидилхолином

В инкубационную смесь, активность секФЛА2(IIA) в которой была стимулирована 1 нмоль окФХ (содержащимся в ЛНП) до 230 %, добавляли разные количества ХС. Присутствие ХС в инкубационной смеси не повлияло на активность секФЛА2(IIA). Активность секФЛА2(IIA выражали в процентах от базального уровня. Данные представлены как М + SD, n=4.

Таким образом, в регуляцию активности секФЛА2(IIA) вовлечены СФМ и окФХ, содержащиеся в липопротеидных частицах. ХС и ЭХС не влияют на активность секФЛА2(IIA).

Заключение

После проведения коронарной ангиопластики в участке сосуда, который подвергся эндоваскулярному вмешательству, активизируются воспалительные процессы. У некоторых больных локальные воспалительные процессы могут приводить к рестенозу. В данном исследовании показано, что после ангиопластики у больных с развивающимся рестенозом активируется провоспалительный фермент секФЛА2(IIA). Активность фермента в сыворотке крови этих больных возрастает в несколько раз, в то время как у больных без развивающегося рестеноза (также как и у здоровых доноров) активность секФЛА2(IIA) остаётся незначительной или вообще не детектируется существующими в настоящее время методами. Стимуляции активности секФЛА2(IIA) способствуют окисленные липопротеиды. В норме активность секФЛА2(IIA) в сыворотке крови подавлена циркулирующими нативными липопротеидами ЛОНП, ЛНП и ЛВП. Компонентом липопротеидной частицы, ингибирующим активность секФЛА2(IIA), является СФМ. В окисленных липопротеидах содержится окФХ, отсутствующий в нативных липопротеидах. ОкФХ активирует секФЛА2(IIA). ОкФХ и СФМ конкурируют друг с другом за связывание с секФЛА2(IIA). В зависимости от соотношения концентраций этих веществ может происходить либо активация, либо ингибирование секФЛА2(IIA), а это значит, что изменение соотношения между концентрациями нативных и окисленных липопротеидов может регулировать активность секФЛА2(IIA) и влиять на развитие рестеноза после коронарной ангиопластики.

Выводы

Выявлена связь между секФЛА2(IIA) и вероятностью развития рестеноза коронарных артерий после проведения транслюминальной коронарной ангиопластики. Обнаружено, что в первые сутки после ангиопластики концентрация секФЛА2(IIA) значительно повышается в сыворотке крови больных с последующим рестенозом и сохраняется повышенной в течение 7 суток после вмешательства. У больных, рестеноз у которых не развивается, повышение уровня секФЛА2(IIA) после ангиопластики существенно меньше. Активность секФЛА2(IIA) после коронарной ангиопластики значительно увеличивается у больных с последующим рестенозом, в то время как у больных без развивающегося рестеноза активность фермента незначительна и не изменяется после ангиопластики;

Сыворотка крови здоровых доноров не проявляет активности секФЛА2(IIA), несмотря на присутствие в ней значительного количества фермента. Активность секФЛА2(IIA) проявляется после удаления из сыворотки всех классов липопротеидов, что свидетельствует об участии циркулирующих липопротеидов в регуляции активности секФЛА2(IIA);

Нативные липопротеиды разных классов (ЛОНП, ЛНП и ЛВП) ингибируют активность как очищенной секФЛА2(IIA), так и секФЛА2(IIA), содержащейся в сыворотке крови;

Окисленные липопротеиды (окЛОНП, окЛНП и окЛВП), стимулируют активность секФЛА2(IIA). Влияние окисленных липопротеидов на секФЛА2(IIA) зависит от степени изменения их фосфолипидного состава, происходящего при окислении;

Проведён анализ влияния липидов, входящих в структуру липопротеидной частицы, на активность секФЛА2(IIA). Холестерин и эфиры холестерина не оказывают влияния на активность секФЛА2(IIA), в то время как сфингомиелин в составе липопротеидов ингибирует, а окисленный фосфатидилхолин активирует секФЛА2(IIA);

Влияние сфингомиелина и окисленного фосфатидилхолина на активность секФЛА2(IIA) носит конкурентный характер. Изменение соотношения между концентрациями этих фосфолипидов, а также между концентрациями нативных и окисленных липопротеидов может изменять активность секФЛА2(IIA) в крови человека, приводя либо к её ингибированию, либо к стимуляции.

Практические рекомендации

Определение концентрации и активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови больных ИБС после транслюминальной коронарной ангиопластики можно рекомендовать в качестве прогностического параметра для идентификации пациентов с повышенным риском развития рестеноза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

В периодических изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Суслова ИВ, Коротаева АА, Проказова НВ. Изменение параметров равновесного связывния [3H]-хинуклидинилбензилата на мембранах предсердия кролика под действием лизофосфатидилхолина. ДАН. 1995; 343: 273-276.

2. Korotaeva A. Cheglakov I, Prokazova N. Inhibitory effect of lysophosphatidylcholine and phospholipase A2-treated low density lipoproteins on receptor-dependent regulation of [Ca2+]i in platelets. Platelets. 1997; 8: 43-51.

3. Проказова НВ, Звездина НД, Суслова ИВ, Коротаева АА, Турпаев ТМ. Влияние лизофосфатидилхолина на чувствительность сердечной мышцы к ацетилхолину и параметры связывания хинуклидинилбензилата с мембранами миокарда. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 1998; 84: 969-978.

4. Коротаева АА, Голованова НК, Власик ТН, Янушевская ЕВ, Цибульский ВП, Якушкин ВВ, Творогова МГ, Морозкин АД, Проказова НВ. Иммунореактивность апобелка В-100 и связывание с ЛНП-рецептором липопротеинов низкой плотности, обработанных фосфолипазой А2. Биохимия. 1998; 63: 1682-1690.

5. Проказова НВ, Звездина НД, Коротаева АА. Влияние лизофосфатидилхолина на передачу трансмембранного сигнала внутрь клетки. Биохимия. 1998; 63(1): 38-46.

6. Fabisiak J, Tyurin V, Tyurina Y, Borisenko G, Korotaeva A, Pitt B, Lazo J, Kagan V. Redox regulation of copper-metallothionein. Arch Biochem Biophys. 2000; 363: 171-181.

7. Коротаева АА, Проваторов СИ, Самойлова ЕВ, Каминный АИ, Сумароков АБ, Пиркова АА, Самко АН, Проказова НВ. Уровень секреторной фосфолипазы А2 в сыворотке крови как предиктор рестеноза после коронарной ангиопластики. Тер. Архив. 2002; 4: 12-15.

8. Korotaeva AA, Samoilova EV, Kaminny AI, Pirkova AA, Resing ThJ, Erne P, Prokazova NV, Tkachuk VA, Chazov EI. The catalytically active secretory phospholipase A2 type IIA is involved in restenosis development after PTCA in human coronary arteries and generation of atherogenic LDL. Mol Cell Biochem. 2005; 270:107-113.

9. Самойлова ЕВ, Пиркова АА, Проказова НВ, Коротаева АА. Влияние сыворотки крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями на каталитическую активность секреторной фосфолипазы А2 (IIA). Бюлл эксп биол мед. 2006; 142 (11): 525-527.

10. Коротаева АА, Самоходская ЛМ, Бочков ВН. Ингибирование воспалительных эффектов липополисахарида бактерий продуктами окисления липидов. Биомедицинская химия. 2007; 53(1): 65-71.

11. Пиркова АА, Самойлова ЕВ, Амелюшкина ВА, Каминный АИ, Проказова НВ, Титов ВН, Наумов ВГ, Кухарчук ВВ, Коротаева АА. Влияние терапии аторвастатином на уровень секреторной фосфолипазы А2 группы IIА и модификацию ЛНП у пациентов с ишемической болезнью сердца. Кардиология. 2007; 47(4): 37-40.

12. Проказова НВ, Самовилова НН, Голованова НК, Грачева ЕВ, Андреева ЕР, Коротаева АА. Липидные вторичные посредники и клеточная сигнализация в сосудистой стенке. Биохимия. 2007; 72(8): 981-994.

13. Торховская Т.И., Халилов Э.М., Коротаева А.А. Липидомика: новые подходы к изучению клеточной сигнализация и перспективы применения в медицине. Бюлл эксп биол мед. 2007; (прилож. 2): 33-38.

14. Коротаева АА, Самойлова ЕВ, Пиркова АА, Проказова НВ. Влияние ЛНП на активность провоспалительной секреторной фосфолипазы А2(IIA) зависит от степени их окисления. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2009; 95(5):476-483.

15. Korotaeva AA, Samoilova EV, Ameliushkina VA, Pirkova AA, Prokazova NV, Tkachuk VA, Chazov EI. Opposite effects of native and oxidized lipoproteins on proinflammatory secretory phospholipase A2 group. Prostaglandins and Other Lipid Mediators. 2009;

В научных журналах и материалах симпозиумов и конференций:

1. Коротаева АА, Чеглаков ИБ., Морозкин АД, Проказова НВ. Влияние лизофосфатидилхолина на структуру и биологические свойства липопротеинов низкой плотности. Тезисы симпозиума «Липопротеиды и атеросклероз». С-Петербург. 1995: 18.

2. Korotaeva A, Cheglakov I, Vasilevskaya V, Prokazova N. Role of membrane lipids in adhesion, activation and aggregation of platelets. 7th Erfurt Conference on platelets. Abstract. Erfurt. Germany. 1998: 24.

3. Korotaeva A, Prokazova N. Lisophosphatidylcholine is a bioactive product of phospholipase A2 reaction. International Conference on Phospholipase A2. Abstract. Berlin, Germany. 1999: P10.

4. Korotaeva A, Cheglakov I, Golovanova N, Vlasik T, Yanushevskaya E, Tsibulsky V, Yakushkin V, Prokazova N. Protective role phospholipase A2 in processes of LDL modification. XII International Symposium on Atherosclerosis. Abstract. Stockholm, Sweden. 2000: 245.

5. Проваторов СИ, Коротаева АА, Самойлова ЕВ, Самко АН. Активность секреторной фосфолипазы А2 после коронарной ангиопластики. Тезисы 5-ой ежегодной сессии НЦССХ им.АНБакулева РАМН. 2001: 42.

6. Korotaeva A, Provatorov S, Samoilova E, Samko A, Chazov E. Evidence of possible involvement of secretory phospholipase A2 in coronary restenosis. XIY International Symposium on drugs affecting lipid metabolism. Abstract. New York, USA. 2001: 472.

7. Provatorov S, Korotaeva A, Samoilova E, Samko A, Pirkova A, Sumarokov A, Chazov E. Secretory phospholipase A2 as an inflammatory predictor of coronary restenosis. XI Congress of the Mediterranean league of angiology and vascular surgery. Abstract. Chios, Greece. 2001: 216.

8. Коротаева АА, Самойлова ЕВ, Пиркова АА, Сумароков АБ, Наумов ВГ. Участие секреторной фосфолипазы А2 плазмы крови в модификации липопротеинов низкой плотности. Тезисы III Всероссийского Национального Конгресса кардиологов. Санкт-Петербург. 2002: 75.

9. Korotaeva A, Samoilova E, Pirkova A, Sumarokov A, Naumov V. Involvement of blood serum phospholipase A2 in modification of LDL. 6th International Symposium on global risk of coronary heart disease and stroke. Abstract. Fllorence, Italy.2002: 387.

10. Коротаева АА. Липиды и статины в процессах воспаления, тромбообразования и тромболизиса. Сборник трудов научной сессии «Фундаментальные исследования и прогресс кардиологии». 2002: 122-126.

11. Проваторов СИ, Самко АН, Арефьева ТИ, Красникова ТЛ, Коротаева АА. Патогенез рестенозов после коронарной ангиопластики. Сборник трудов научной сессии «Фундаментальные исследования и прогресс кардиологии». 2002: 127-132.

12. Provatorov S, Arefieva T, Krasnikova T, Kuhtina N, Korotaeva A, Samko A, Chazov E. Markers of inflammation in restenosis and in unstable plaques: indexes for anti-inflammatory treatment. US-Russia Joint Simposium on the role of infections and inflammatory responses in the heart and lung. Abstract. Orlando, USA. 2003: 267.

13. Пиркова АА, Ежов МВ, Самойлова ЕВ, Самойленко ЕЮ, Коротаева АА. Наумов ВГ. Влияние аторвастатина на С-реактивный белок и секреторную фосфолипазу А2 у больных ишемической болезнью сердца. Материалы форума «Кардиология 2006» 2006:110.

14. Титов ВН, Арапбаева АА, Пиркова АА, Коротаева АА, Амелюшкина ВА, Наумов ВГ, Кухарчук ВВ. Содержание индивидуальных жирных кислот и липидов в липопротеидах плазмы крови у больных с гиперлипидемией при приеме статинов. Кардиологический вестник. 2006; 1(2): 32-38.

15. Pirkova A.A., Ezhov MV, Samoilova EV, Samoylenko EY, Korotaeva AA, Naumov VG. The effect of atorvastatin on serum phospholipase A2 IIA type and lipids composition of LDL particles in patients with coronary heart disease. XII international symposium on atherosclerosis. Abstract. Rome, Italy. 2006: 581A.

16. Коротаева АА, Проказова НВ, Звездина НД. Фосфолипаза А2 и продукт ее реакции лизофосфатидилхолин в процессе атерогенеза. Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций. Тезисы конференции с международным участием, посвященной 90-летию академика Т.М. Турпаева. Москва, 2008: 68-69.

Список сокращений

апоВ100 - липопротеин В100

ГМК- гладкомышечные клетки

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ЛВП - липопротеиды высокой плотности

ЛНП - липопротеиды низкой плотности

ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности

ЛФХ - лизофосфатидилхолин (лизолецитин)

ОА - огибающая артерия

окЛВП - окисленные липопротеиды высокой плотности

окЛНП - окисленные липопротеиды низкой плотности

окЛОНП - окисленные липопротеиды очень низкой плотности

окФХ - окисленный 1-пальмитоил-2-арахидонил-фосфатидилхолин

ПКА - правая коронарная артерия

ПНА - передняя нисходящая артерия

секФЛА2(IIA) - секреторная фосфолипаза А2 группы IIА

СФМ - сфингомиелин

ТБКА - транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

ФАТ-ацилгидролаза - липопротеид-ассоциированная фосфолипаза А2

ФХ - фосфатидилхолин (лецитин)

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

ХС - холестерин

ЭХ - эфиры холестерина

Размещено на Allbest.ru