Поиск новых средств фармакологической регуляции болевой чувствительности среди фрагментов атипичных опиоидных пептидов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН)

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Поиск новых средств фармакологической регуляции болевой чувствительности среди фрагментов атипичных опиоидных пептидов

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Гузеватых Людмила Сергеевна

Москва - 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН)

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Воронина Татьяна Александровна

академик РАН, доктор химических наук, профессор Мясоедов Николай Федорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наукКоваленко Лариса Петровна

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Решетняк Виталий Кузьмич

член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова.

Защита диссертации состоится 2010 года, на заседании диссертационного совета Д.001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор мед. наук Е.А. Вальдман.

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Поиск новых высокоэффективных анальгетиков является актуальной проблемой современной фармакологии, поскольку применяемые в клинической практике обезболивающие препараты не удовлетворяют требованиям эффективности и безопасности (М.Л. Кукушкин, В.К. Решетняк, 1999; С.С. Павленко, 1999; Г.Н. Крыжановский, 1999; В.В. Чурюканов, М.В. Чурюканов, 2002; М.Л. Кукушкин, Н.К. Хитров, 2004; Trescot et al., 2008). Так, наркотические анальгетики характеризуются сильным обезболивающим действием, что обеспечивает возможность их использования при травмах и заболеваниях, сопровождающихся выраженным болевым синдромом (злокачественные новообразования, инфаркт миокарда и другие). Однако, наряду с анальгетическим эффектом, они оказывают влияние на центральную нервную систему человека, проявляющееся в развитии эйфории, а при их повторном применении возникает привыкание, наблюдаются синдромы психической и физической зависимости. Кроме того, увеличение дозы препарата сопровождается риском угнетения дыхательного центра (Э.Э. Звартау и др, 2007; Wintle, 2008).

Ненаркотические анальгетики не оказывают влияния на дыхательный центр, не вызывают эйфории и явлений физической и психической зависимости. Однако их анальгетическая активность проявляется, главным образом, при невралгических, мышечных, суставных болях, головной и зубной боли, а при сильной боли, связанной с травмами, полостными оперативными вмешательствами, злокачественными новообразованиями и т.п., они практически не эффективны; некоторые ненаркотические анальгетики характеризуются хорошими жаропонижающим и противовоспалительным эффектами. Нежелательным побочным действием этих препаратов является негативное влияние на желудочно-кишечный тракт, систему кроветворения, выводящую систему (Е.Л. Насонов, 1999; А.Ю. Беспалов, Э.Э. Звартау, 2000; В.С. Шухов, 2001; Ю.Б. Белоусов, А.Н. Грацианская, 2008; Krenzischek et al., 2008).

В настоящее время общепризнанна ведущая роль эндогенных пептидов в регулировании различных систем организма (И.П. Ашмарин и др., 1988). В нашей стране успешно развивается направление создания лекарственных средств на основе регуляторных пептидов. Внедрены в клиническую практику ноотроп и нейропротектор семакс (ИМГ РАН (Н.Ф. Мясоедов, И.П. Ашмарин, А.А. Каменский, В.Н. Незавибатько и др. 1982)), ноотроп ноопепт (НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (С.Б. Середенин, Т.А. Воронина, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская и др. 1995), противоязвенный препарат даларгин (ИЭК РКНПК МЗ РФ (М.И. Титов, Ж.Д. Беспалова и др. 1983)), иммуномодулятор тимоген (ИБХ имени М.М. Шемякина РАН и Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова (В.И. Дейгин, В.Х. Хавинсон, и др. 1989)).

Существует несколько стратегий поиска веществ пептидной структуры с заданной фармакологической активностью. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН успешно применяется подход конструирования новых пептидных лекарственных средств как трехмерных топологических аналогов известных непептидных лекарственных соединений (Т.А. Гудашева, 1985-2008). Часто используют множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белковых структур, которое позволяет определить общность происхождения, функцию отдельных аминокислотных остатков, консервативность определенных участков и совпадение пространственных структур (multiple alignments) (Minkiewicz et al., 2008). Другой подход связан с поиском закономерностей в последовательностях аминокислот, способствующих эффективно и специфично взаимодействовать с рецепторами (Bakalkin et al., 1992).

В нашем исследовании был выбран подход, связанный с поиском минимальной аминокислотной последовательности, отвечающей за проявление анальгетического эффекта, среди эндогенных опиоидных пептидов (ОП), и разработка на ее основе новых соединений.

Атипичные ОП образуются из разных предшественников, и не содержат консервативной последовательности Tyr[Phe]-Gly-Gly-Phe-Met[Leu], ответственной за связывание с опиоидными рецепторами (ОР) (Corbett et al., 2006). Особый интерес представляют эндоморфины (Tyr-Pro-Trp[Phe]-Phe-NH₂), дерморфины (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂), и пептиды группы Tyr-МИФ-1 (Tyr-Pro-Leu[Trp]-Gly-NH₂), которые преимущественно связываются с µ-ОР (Broccardo et al., 1981; Zadina et al., 1996; Tseng et al., 2000). Попыток выявить общую последовательность среди атипичных ОП ранее не проводилось. Эндоморфины синтезируются в мозге млекопитающих, в том числе человека, и проявляют активность при центральном введении (Sakurada et al., 2008). Высокая анальгетическая активность этих пептидов сопровождается побочными эффектами, характерными для морфина (Czapla et al., 2000; Soignier et al., 2004; Chen et al., 2003). Дерморфины проявляют анальгетическое действие при центральном и периферическом введении (Broccardo et al., 1981; Negri et al., 2000), при этом не влияют на частоту дыхания даже в кататонических дозах (Paakkari et al., 1990), вызывают более медленное развитие толерантности по анальгетическому действию и менее выраженный синдром отмены по сравнению с морфином (Broccardo et al., 1985; Negri et al., 1995; Riba et al., 2002). Tyr-МИФ-1 оказывает антиопиоидное действие, уменьшая анальгетическую активность и препятствуя развитию толерантности при использовании морфина (Erchegyi et al., 1993; Pan, Kastin, 2007), при этом в более высоких дозах обладает собственным анальгетическим действием (Zamfirova et al., 2003). Таким образом, поиск новых потенциальных анальгетиков на основе общей структуры атипичных ОП представляется достаточно перспективным, поскольку пептиды должны обладать менее выраженными побочными эффектами, характерными для классических опиоидов.

Целью настоящего исследования явился поиск новых средств фармакологической регуляции болевой чувствительности на основе функционально-значимой минимальной аминокислотной последовательности атипичных опиоидных пептидов.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Выявить наиболее часто встречающийся минимальный аминокислотный фрагмент в первичных последовательностях 60 атипичных ОП и исследовать его (Tyr-Pro) анальгетический эффект, психотропную активность, механизм действия и побочное действие при системном введении.

2. Исследовать влияние модификации остатка пролина в молекуле Tyr-Pro-содержащего атипичного ОП дерморфина на проявления анальгетической, психотропной активности и побочных эффектов.

3. Исследовать структурно-функциональные взаимоотношения в ряду удлиненных и модифицированных по остатку пролина аналогов Tyr-Pro на проявление анальгетической и опиоидной активности, и отобрать наиболее перспективные для дальнейшего углубленного изучения соединения.

4. Определить спектр анальгетической активности, эффективность и продолжительность действия при разных путях введения и исследовать нейропсихотропную активность отобранных соединений.

5. Изучить механизм действия отобранных соединений.

6. Изучить побочные эффекты отобранных соединений, в том числе влияние на дыхание, оценить синдром отмены, развитие толерантности и терапевтическую широту.

7. Изучить распределение по органам и тканям отобранных соединений.

8. Провести сравнительные исследования отобранных соединений с эталонными препаратами.

Научная новизна. Выявлена последовательность Tyr-Pro, встречающаяся у большинства (63%) атипичных ОП и продемонстрировано, что именно она является минимально необходимой для проявления анальгетической активности. Впервые показано, что дипептид Tyr-Pro в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг при системном введении проявляет анальгетическую активность в тестах соматической и висцеральной боли при активации ноцицепторов химическим, термическим и механическим стимулами, и обладает противовоспалительным действием. Анальгетическое действие дипептида реализуется через налоксон-чувствительные механизмы; Tyr-Pro имеет низкое сродство к периферическим -ОР, и не взаимодействует с периферическими µ-ОР. Tyr-Pro в дозах 1 - 800 мг/кг не влияет на частоту дыхания и не вызывает гибели мышей в течение последующих 24 часов. Установлено, что фармакологическая активность атипичных ОП не зависит от положения последовательности Tyr-Pro в молекуле и модификация C- и N-конца последовательности -Tyr-Pro- природными аминокислотами сохраняет анальгетическую активность полученных пептидов, что открывает возможности конструирования новых пептидов, стойких к протеолизу и обладающих анальгетическим действием.

Показано, что стереохимическая модификация или дегидрирование остатка пролина в молекуле атипичного ОП дерморфина (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂) не изменяет анальгетическую активность при химическом и механическом раздражении и уменьшает противовоспалительное действие. Наряду с этим, дегидрирование остатка пролина в молекуле дерморфина приводит к ослаблению противовоспалительного и анальгетического действия при механическом раздражении ноцицепторов, но вызывает появление анксиолитической и потерю противосудорожной активности.

При изучении 22 оригинальных пептидов выявлена новая группа соединений, обладающих анальгетическим действием, общей формулы А-Tyr-Pro(D-Pro, ДPro, D-ДPro, Hyp)-В-X, где А, В - природные аминокислоты, а Х - метильная или амидная группировка. Установлено, что анальгетическая активность этих пептидов не зависит от взаимодействия с периферическими - и -ОР подвздошной кишки морской свинки (ПКМС) и семявыносящего протока мыши (СПМ), что предполагает низкий риск развития лекарственной зависимости. Среди пептидов этой группы отобраны Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂, которые обладают наиболее высокой анальгетической активностью. Установлено, что в смеси стереоизомеров Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ (1:1), получаемой в результате амидирования Tyr-Pro-L-Ser-OMe, анальгетической активностью обладает только D-стереоизомер (Tyr-Pro-D-Ser-NH₂).

Впервые показано, что Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг при системном введении проявляют анальгетическое действие в тестах по оценке болевой чувствительности, основанных на активации ноцицепторов термическими, химическими или механическим стимулами. Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ активен на модели нейропатической боли; Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ оказывает прямое действие на первичные афференты ноцицептивного флексорного рефлекса. Анальгетическое действие Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ уменьшается при холодной (4С) и жаркой (31-32С) температуре окружающей среды.

Показано участие опиоидергической системы в анальгетическом действии Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂: анальгетическая активность ослабляется неселективным антагонистом центральных ОР налоксоном и периферических ОР - налоксоном метиодидом. Установлено, что Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ взаимодействуют с «высокоаффинными» центрами связывания (1.5 - 3 нМ) дерморфина и не взаимодействуют с «низкоафинными» (> 5 нМ). Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂, в отличие от дерморфина и морфина, проявляют слабое сродство (IC₅₀ 3.3*10^-5 моль и 4.5*10^-5 моль, соответственно) к периферическим -ОР ПКМС и не обладают сродством (IC₅₀ 6.5*10^-4 моль и 5.3*10^-4 моль, соответственно) к периферическим -ОР СПМ.

Установлено, что Tyr-[³H]Pro-[D,L]-Ser-NH₂ и Tyr-[³H]D-Pro-Ser-NH₂ наиболее интенсивно распределяются в сильно васкуляризированных органах выделения (печень, почки) и меньше - в слабоваскуляризированных (мозг, легкие, сердце). Оба соединения выводятся из организма (t_1/2el из крови = 53.6 и 57.8 мин, MRT из крови = 43.2 и 46.1 мин, соответственно), а их протеолиз осуществляется ферментами крови, сердца, легких и мозга. В качестве основного меченного метаболита обнаруживаются пролин и D-пролин, соответственно.

Научно-практическое значение. Выявлена новая группа оригинальных веществ регуляции болевой чувствительности общей формулы А-Tyr-Pro(D-Pro, ДPro, D-ДPro, Hyp)-В-X, где А, В - природные аминокислоты, а Х - метильная или амидная группа, с отличным от классических ОП механизмом действия (зарегистрирован патент РФ №2286169 (приоритет от 18.04.2005), подана заявка на международный патент WO 2008/020778 A1 (от 21.02.2008)). Преимущества наиболее активных соединений этой группы перед морфином заключаются в отсутствии угнетающего влияния на дыхательный центр, более медленном развитии толерантности по анальгетическому действию и достоверно меньшей выраженностью синдрома отмены, в связи с чем, новые соединения имеют большую, чем морфин, безопасность и терапевтическую широту. При сравнении с диклофенаком пептиды активны в меньших дозах и обладают более широким спектром анальгетических эффектов. Отобранные пептиды Tyr-Pro-[D,L]-Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ сочетающие анальгетическую активность и безопасность применения, можно рассматривать в качестве базисных соединений для создания потенциального анальгетика пептидной природы.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной конференции “Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности” (Минск, 1999), Международной научной конференции «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника» (Минск, 2001), Всероссийском симпозиуме «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем» (Иваново, 2002), III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), 10^th German-Russian Peptide Symposium (Turingia, 2003), 8^th ECNP Regional Meeting (Moscow, 2005), I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), IV международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006), 15^th World Congress of Pharmacology (Beijing, 2006), II международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2006), XVIII симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2006), Российских научно-практических конференциях с международным участием «Актуальные вопросы острой и хронической боли» (Самара, 2005) и «Хронические болевые синдромы» (Новосибирск, 2007), II и III съездах фармакологов России (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2007), I, II, III и IV Российских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005; Пущино, 2007; Казань, 2009).

Объем и структура диссертации. Представленная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 687 отечественных и зарубежных источников, приложения. Диссертация изложена на 297 страницах машинописного текста, содержит 54 таблицы и 74 рисунка.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатные работы, среди них 16 в рекомендованных ВАК журналах.

Содержание работы

Методы исследований

Эксперименты проводили на самцах нелинейных белых крыс массой 180-250 г, самцах нелинейных белых мышей и мышей линии СВА и С57/bl6 массой 20-25 г, самцах морских свинок массой 500 г, самцах кроликов массой 3-4 кг, полученных из Центрального питомника лабораторных животных «Столбовая», Московской области. Животных содержали на постоянном доступе к корму и воде. Содержание и уход за животными, проведение экспериментов и эвтаназия осуществлялись в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (86/609 EEC). Всего было проведено 1965 экспериментов.

В работе использовано 26 пептидов, из которых 22 оригинальных, в том числе меченные тритием Tyr-[3,4-³HPro]-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-[3,4-³H D-Pro]-Ser-NH₂, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН (под. рук. акад. РАН Н.Ф. Мясоедова) и реактивы фирмы «Sigma»: налоксон, налоксон метиодид, налтрексон, налоксон бензоилгидразон, налтриндол, АМ-251, 3-метоксиналтрексон, конканавалин А.

Пептиды вводили внутрибрюшинно (в/б), внутримышечно (в/м), внутривенно (в/в), внутрь (р.о.), интраназально (и/н) в виде водного раствора, в диапазоне доз 0.01-10.0 мг/кг веса животного (объем вводимого раствора составлял 1 мл/кг массы крыс и 10 мл/кг массы мышей, при и/н введении вводили 20 мкл на крысу). Блокаторы вводили подкожно. Контрольные животные получали эквивалентный объем дистиллированной воды. Животных использовали однократно. Каждая экспериментальная группа состояла из 815 животных.

Исследования проводили в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», (ред. - Р.У. Хабриев, 2005), где дано подробное описание используемых в работе методов. Анальгетическая активность изучалась в тестах: отдергивания хвоста при действии горячей воды (54С) и луча света (установка 602000-TF-AD-MR-01 фирмы TSE-system, Германия) (D`Amor et al., 1941), горячей пластины (52С) (Woolfe, Macdonald, 1944), уксусных корчей при действии 0.6% раствора уксусной кислоты (Chernov et al., 1967), формалиновых болей при действии 5% раствора формалина (Bannon et al., 1998), механической боли (Haffner, 1929), на моделях нейрогенного (М.Л. Кукушкин и др. 1993) и центрального (М.Л. Кукушкин и др. 1999) болевого синдрома, флексорного рефлекса (М.Л. Кукушкин и др. 2003). Противовоспалительное действие изучали в тесте псевдоаллергической реакции, вызванной конканавалином А (Б.И. Любимов, Л.П. Коваленко и др. 2005).

Нейропсихотропное действие пептидов оценивали в тестах: открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт (Lister, 1987), конфликтная ситуация (Vogel et al., 1983), неизбегаемое плавание (Porsolt, 1979), поведенческое отчаяние в тесте вращающихся колес (Nomura et al., 1982), судорог, вызванных коразолом (Swinyard, 1969) и максимальным электрошоком (White, 1992). Влияние на суммарную биологическую активность мозга оценивали по ЭЭГ крыс (Т.А. Воронина, Л.Н. Неробкова 2000). Электроды вживляли по координатам атласа Буреша (1991) в миндалину, гипоталамус, гиппокамп, сенсомоторную кору, ретикулярную формацию ствола мозга. Влияние на систему терморегуляции оценивали по ректальной температуре и температуре кожи хвоста животного (являющегося специфическим органом теплообмена у крыс), помещенного в холодную (4-6C), термонейтральную (27-28C) и жаркую среду (31-32C) (Hart, 1971, Т.Г. Емельянова и др. 2008).

Для оценки побочных эффектов и терапевтической широты соединения измеряли частоту дыхания в минуту бодрствующих мышей и наркотизированных хлоралгидратом кроликов. ЛД₅₀ рассчитывали по показателю гибели мышей через 24 часа после введения (Е.В. Арзамасцев и др. 2005). Развитие толерантности исследовали с использованием тестов отдергивания хвоста, уксусных корчей, открытого поля, вращающихся колес и конфликтной ситуации через 7, 14 и 28 дней после введения пептидов. Интенсивность синдрома отмены изучали по специфическим признакам при провокации налоксоном в дозе 10 мг/кг массы тела (Fernandes et al., 1977) и без провокации налоксоном после прекращения 28 дневного введения пептидов в тестах отдергивания хвоста и открытого поля.

Таблица 1. Свойства различных семейств опиоидных пептидов.

Связывание с периферическими ОР оценивали с использованием препаратов изолированных органов ПКМС (-ОР) и СПМ (-ОР) (Broccardo et al., 1981). Связывание с центральными рецепторами оценивали по вытеснению [³H]-дерморфина из мест его специфического связывания с мембранной фракцией головного мозга крыс (Н.А. Беляев и др. 1990). Для изучения динамики распределения и накопления пептида в тканях и органах крыс использовали меченные тритием пептиды (В.П. Шевченко и др. 2006). Изучали влияние соединений на содержание и оборот моноаминов и аминокислот в мозге крыс при использовании ВЭЖХ/ЭД и ВЭЖХ/ФД соответственно (В.С. Кудрин и др. 2005, П.М. Клодт и др. 2005).

Статистическую обработку данных проводили при использовании стандартных пакетов статистических программ Statistica 6.0, Microsoft Excel 2000 с приложением Attestat 10.6.1,STATGRAF (Stat. & Graph. Corp., USA), При сравнении характеристик массивов использовались параметрический t-Student тест, непараметрический Вилкоксона-Мэнна-Уитни и альтернативный метод Фишера (F-test). ЛД₅₀, ТД₅₀ и ЭД₅₀ рассчитывали по методу Litchfield, Wilcoxon (1949). пролин анальгетический опиоидный

Результаты исследований

1. Выявление функционально значимого фрагмента в аминокислотных последовательностях атипичных опиоидных пептидов, изучение его анальгетической и другой физиологической активности

Проведенный нами анализ литературных источников показал, что в настоящее время насчитывается более 140 ОП природного происхождения. По происхождению, структурным особенностям, спектру физиологической активности и специфичности к известным опиоидным рецепторам ОП были разделены в нашей работе на 26 семейств (табл. 1). Согласно классификации Teschemacher (1993) представители ОПобразуют два подкласса: типичные и атипичные ОП. Типичные ОП образуются из предшественников проопиомеланокортина, проэнкефалина, продинорфина и проорфанина-FQ/ноцицептина (Corbett et al., 2006). Посттрансляционные изменения предшественников приводят к образованию активных пептидов, имеющих общую N-концевую последовательность Tyr[Phe]-Gly-Gly-Phe-Met[Leu], ответственную за связывание с опиоидными и орфановыми ORL₁-рецепторами (Raynor et al., 1994). Типичные ОП характеризуются высоким сродством к ОР и выраженной анальгетической активностью. Атипичные ОП более разнородны по происхождению и специфичности к известным ОР. Анальгетическая активность некоторых атипичных ОП сопровождается низким сродством к ОР, что указывает на существование иных отличных от классических опиоидных механизмов снижения болевой чувствительности. Исходя из вышеизложенного, поиск минимальной структуры, необходимой для проявления анальгетической активности, был осуществлен в подклассе атипичных ОП.

Анализ наиболее часто встречающегося аминокислотного фрагмента в этом подклассе выявил, что мини-консенсусом, объединяющим большую часть (63%) рассматриваемой группы является дипептидный фрагмент -Tyr-Pro- (рис. 1).

Рисунок 1. Распространённость дипептидных фрагментов у атипичных ОП.

Примечание: по оси абсцисс - первый аминокислотный остаток дипептида, по оси ординат - второй аминокислотный остаток дипептида. A - Ala, D - Asp, E - Glu, F - Phe, G - Gly, H - His, I - Ile, K - Lys, L - Leu, M - Met, N - Asn, P - Pro, Q - Gln, R - Arg, S - Ser, T - Thr, V - Val, W - Trp, Y - Tyr

Выявленная нами уникальная распространенность дипептидного фрагмента Tyr-Pro среди представителей атипичных ОП указывает на его участие в формировании фармакофора, а дипептид Tyr-Pro сам по себе может обладать функциональной активностью, в том числе анальгетическим действием.

В связи с этим в настоящем исследовании был изучен широкий спектр анальгетических эффектов дипептида Tyr-Pro при его системном введении. Установлено, что дипептид Tyr-Pro в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) обладает дозо-зависимым анальгетическим действием в тесте отдергивания хвоста (тест соматической боли) (рис. 2), по уровню ЭД₅₀ (1.2 (2.0ч0.7) мг/кг) дипептид активнее ДМ в 4.25 раз, не уступает морфину, диклофенак в данном тесте не эффективен (табл. 2). В тесте формалиновых болей Tyr-Pro в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг вызывает дозо-зависимое уменьшение болевых реакций в I и II фазе, подобно наркотическим анальгетикам, тогда как НПВС, габапентин и антагонисты NMDA рецепторов активны только во II фазе (Le Bars et al., 2001). Дипептид в дозе 0.1 мг/кг (но не 1.0 и 10.0 мг/кг) подавляет реакцию воспаления, вызванную конканавалином А, а в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг уменьшает число корчей, вызванных уксусной кислотой (тест висцеральной боли). По уровню ЭД₅₀ (0.5 (8.3ч0.03) мг/кг) в тесте уксусных корчей Tyr-Pro на два порядка менее активен, чем ДМ, уступает морфину, но активнее диклофенака (табл. 2). Tyr-Pro в дозе 10.0 мг/кг проявляет анальгетическое действие в тесте механического зажима основания хвоста (тест соматической боли) (табл. 4).

Таблица 2. Анальгетическая активность Tyr-Pro, Tyr-Pro-содержащих пептидов и известных анальгетиков в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей.

Введение (в/б) отдельных аминокислот Tyr или Pro или их эквимолярной смеси не вызывает анальгезии в тесте отдергивания хвоста, следовательно, обезболивающим эффектом обладает именно дипептид (рис. 2).

Метилирование (Tyr-Pro-oMe) или амидирование (Tyr-Pro-NH₂) С-концевого пролина дипептида Tyr-Pro снижает длительность анальгетического действия в тесте отдергивания хвоста и увеличивает величину анальгетического эффекта дипептида в тесте уксусных корчей (табл. 6). Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле Tyr-Pro не изменяет анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста и увеличивает в тесте уксусные корчи (табл. 6). Полученные данные позволяют предполагать разные механизмы проявления обезболивающего действия пептида в тестах соматической и висцеральной боли.

Рисунок 2. Влияние на болевую чувствительность пролина, тирозина, их смеси и Tyr-Pro, в тесте отдергивания хвоста крыс.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

Рисунок 3. Влияние блокаторов опиоидных рецепторов на анальгетическую активность Tyr-Pro в тесте отдергивания хвоста.

Отличия достоверны при p<0.05 от контрольной группы (*) и от группы, которой вводили Tyr-Pro (#) по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test). Все соединения вводили в дозе 1 мг/кг в/б.

Анализ механизма анальгетического действия Tyr-Pro с использованием фармакологических анализаторов показал, что выраженность эффекта снижается под действием антагонистов центральных и периферических опиоидных рецепторов налоксона и налоксона метиодида в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей (рис. 3, табл. 3), что свидетельствует о вовлечённости периферической опиоидергической системы в анальгетический эффект Tyr-Pro в тестах соматической и висцеральной боли.

Таблица 3. Влияние блокаторов опиоидных рецепторов на анальгетическую активность Tyr-Pro в тесте уксусных корчей.

% относительно группы активного контроля, получившего уксусную кислоту. Отличия достоверны при p<0.05 от контрольной группы (*) и от группы, которой вводили Tyr-Pro (#) по критерию Вилкоксона-Мэнна-Уитни (U-test). М6Г - рецепторы морфин-6--глюкуронида

- блокирует; - не влияет; - потенцирует.

Установлено, что анальгетический эффект Tyr-Pro в тесте уксусных корчей не реализуется через рецепторы, связывающие морфин-6--глюкуронид, каннабиноидные СВ₁-рецепторы и ₁-ОР, так как какая-либо реакция на введение специфических антагонистов этих рецепторов (3-метоксиналтрексона, АМ-251 или налоксоназина, соответственно) отсутствовала. В то же время анальгезия, вызванная дипептидом, усиливается при блокаде д-ОР налтриндолом, а также под действием бензоилгидразона налоксона, который стимулирует ₃- и подавляет ORL₁- и -ОР (табл. 3).

Tyr-Pro проявляет слабое сродство к периферическим -ОР (IC₅₀ 9.1*10^-5 моль) и не обладает сродством к периферическим -ОР (IC₅₀ 7.6*10^-4 моль) на препаратах изолированных органов СПМ и ПКМС, соответственно (табл. 4), в отличие от ДМ и морфина, которые оказывают эффект в наномолярной области концентраций. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле Tyr-Pro приводит к потере способности связываться с периферическими -ОР (табл. 6).

Таблица 4. Влияние модификаций по пролину на анальгетическую, нейропсихотропную активность и дополнительные эффекты ДМ, его фрагментов и аналогов (в таблице указаны дозы в мг/кг при внутрибрюшинном введении, вызывающие достоверные отличия от контрольной группы).

В контрольной группе беспородных мышей частота дыхания соответствует 210.5±4.5 движений в минуту. Дипептид Tyr-Pro в дозах 1, 10, 100, 500 и 800 мг/кг (в/б) не влияет на частоту дыхания и не приводит к гибели мышей через 24 часа после введения. Синдром отмены Tyr-Pro при провокации налоксоном достоверно меньше выражен, по сравнению с отменой морфина. Дипептид в дозах 1-10 мг/кг (в/б) не изменяет температуру тела и кожи хвоста крыс при холодной (4-6C), комфортной (27-28C) и жаркой (31-32C) температуре окружающей среды. В этих же дозах (в/б) Tyr-Pro оказывает анксиолитическое действие в тесте ПКЛ и противосудорожное (только 10 мг/кг) в тесте МЭШ, но не в тесте коразоловых судорог, не изменяет двигательную активность и ориентировочно-исследовательскую реакцию в тесте открытое поле, не обладает антидепрессантной активностью в тесте неизбегаемого плавания (табл. 4).

2. Влияние модификаций остатка пролина в молекуле дерморфина на проявление анальгетической активности и сопутствующих эффектов

Атипичный ОП дерморфин (ДМ) - Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂ в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б) проявляет дозо-зависимую анальгетическую активность в тестах соматической боли при действии термических (тест отдергивания хвоста и горячей пластины) и механических стимулов (тест механического зажима основания хвоста) и в тесте тонической боли, вызванной формалином. Пептид оказывает анальгетическое действие в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) в тесте висцеральной боли, вызванной уксусной кислотой и противовоспалительное действие при стимуляции конканавалином А (табл. 2, 4, 6).

Замена остатка пролина в шестом положении в молекуле ДМ на D-стереоизомер или его дегидрирование (ДPro⁶) увеличивает латентный период болевой реакции и удлиняет анальгетическое действие в тесте отдергивания хвоста при в/б введении (табл. 2, 4, 6). Замещение остатка пролина на D-ДPro⁶ приводит к исчезновению эффекта. Уровень активности [D-Pro⁶]-ДМ и [ДPro⁶]-ДМ в дозе 1.0 мг/кг (в/б) выше активности морфина в той же дозе, а в дозе 10.0 мг/кг [D-Pro⁶]-ДМ сопоставим с морфином в дозе 5.0 мг/кг (табл. 2). В тесте горячей пластины замена остатка пролина на D-Pro⁶, ДPro⁶ или D-ДPro⁶ уменьшает выраженность анальгетического эффекта. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле ДМ не изменяет анальгетическую реакцию в тесте механического зажима основания хвоста крыс. Дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ приводит к увеличению эффективных доз (табл. 4). Замена остатка пролина на D-Pro в молекуле ДМ не изменяет диапазон действующих доз в тесте уксусных корчей и формалиновых болей (табл. 2, 4, 6). Дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ приводит к смещению диапазона действующих доз в сторону его увеличения в тесте уксусных корчей. Стереохимическая модификация или дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ вызывает уменьшение противовоспалительного действия при стимуляции конканавалином А (табл. 4).

ДМ в дозах 1-600 мг/кг (в/б) не влияет на частоту дыхания и не вызывает гибели мышей. Дегидрирование остатка пролина не приводит к изменению доз, влияющих на дыхание, не изменяет токсичность и в дозах 1-800 мг/кг (в/б) пептид не вызывает гибели мышей. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле ДМ снижает уровень доз, угнетающих дыхание (ТД₅₀ = 322 (466221) мг/кг) и повышает токсичность (ЛД₅₀ = 568 (618522) мг/кг) (табл. 5).

Таблица 5. Терапевтический индекс пептидов при внутрибрюшинном введении.

ДМ (0.1 - 10.0 мг/кг, в/б) вызывает у мышей дозо-зависимое седативное действие в тесте открытое поле, не влияет на время пребывания крыс в открытых рукавах ПКЛ и не изменяет время иммобилизации мышей в тесте неизбегаемого плавания (табл. 4). В дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) пептид проявляет противосудорожное действие в тесте МЭШ, но не в тесте коразоловых судорог. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле ДМ приводит к увеличению уровня доз, оказывающих седативное действие в тесте открытое поле и противосудорожное действие в тесте МЭШ, и появлению противосудорожного действия в тесте коразоловых судорог (табл. 4) Дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ вызывает появление анксиолитического и исчезновение противосудорожного действия.

ДМ (0.5 мг/кг, в/б) изменяет температуру тела в зависимости от температуры окружающей среды. В холодной среде (4-6С) и термонейтральной (27-28С) вызывает гипотермию, а в жаркой (31-32С) - гипертермию. При замене остатка L-пролина в молекуле ДМ на D-стереоизомер или его дегидрировании гипотермическое действие в холодной среде сохраняется. В термонейтральной среде при действии ДМ наблюдается двухфазная сосудистая реакция. Дегидрирование остатка пролина приводит к исчезновению сосудосуживающего компонента действия, а стереохимическая модификация по пролину вызывает потерю гипотермического действия и сосудистой реакции. В условиях жаркой среды дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ приводит к инверсии температурной реакции на гипотермическую и появлению сосудосуживающего действия. Замена остатка L-пролина в молекуле ДМ на D-стереоизомер вызывает появление сосудосуживающего действия.

При субхроническом 7-дневном введении [D-Pro⁶]-ДМ (10 мг/кг, в/б) развивается толерантность по анальгетическому действию в тесте уксусных корчей и по седативному действию в тесте открытое поле. Перекрестная толерантность к морфину не проявляется. При провокации налоксоном синдрома отмены у морфин-зависимых животных регистрировались прыжки (у 94%) и изменение веса (на 23%). У [D-Pro⁶]ДМ-зависимых животных наблюдалось достоверно меньшее по сравнению с морфином число прыжков (у 18 %). Вес пептид-зависимых животных не изменялся после введения пептида и провокации налоксоном. Следовательно, [D-Pro⁶]-ДМ-зависимые животные легче переносят синдром отмены.

ДМ с высокой аффинностью связывается с периферическими м- и д-ОР ПКМС и СПМ (2,6*10^-8 моль и 9,0*10^-8 моль, соответственно) (табл. 6). Стереохимическая модификация по остатку пролина в молекуле ДМ не изменяет сродства к периферическим м- и д-ОР ПКМС и СПМ (табл. 6).

Рисунок 4. Профиль активностей ДМ (А) и [D-Pro⁶]-ДМ (Б).

Примечание: Указаны дозы, вызывающие достоверные эффекты: 1 - доза 10 мг/кг, 2 - доза 1 мг/кг, 3 - доза 0.1 мг/кг. Изменение температуры тела в дозе 0.5 мг/кг: 1 - в холодной; 2 - в термонейтральной; 3 - в жаркой средах. Дозы, угнетающие дыхание и вызывающие гибель: 3 - 300 мг/кг, 2 - 500 мг/кг, 1 - 800 мг/кг. Синдром отмены (при провокации налоксоном прыжков): 1 - 30% животных, 2 - 60%, 3 - 100%.

Таким образом, Tyr-Pro-содержащий пептид ДМ обладает анальгетическим, седативным, противосудорожным и терморегуляторным действием. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле ДМ усиливает анальгетическое действие в тесте отдергивания хвоста и уменьшает противовоспалительное и противосудорожное действие (рис. 4). При субхроническом 7-дневном введении [D-Pro⁶]-ДМ по анальгетическому и седативному действию развивается толерантность. При провокации налоксоном симптомы синдрома отмены [D-Pro⁶]-ДМ менее выражены по сравнению с морфином. Дегидрирование остатка пролина в молекуле ДМ сдвигает диапазон действующих доз в сторону увеличения в тестах механического раздражения основания хвоста и уксусных корчей.

3. Исследование влияния удлинения дипептидной последовательности Tyr-Pro(D-Pro, ДPro, Hyp) на проявление анальгетической и опиоидной активности

Анализ зависимости структуры-активности в ряду атипичных ОП выявил свободу позиционирования пары -Tyr-Pro- в последовательностях пептидов. Действительно, функциональная опиоидная активность пептидов принципиальным образом не зависит от положения фрагмента Tyr-Pro в пептидной цепи и сохраняется при его перемещении как в N-конец молекулы (эндоморфины, геморфины), так и внутрь цепи (глютеновые экзорфины А, геморфины, дерморфины), так и в С-конец (глютеновый экзорфин А, геморфин-(1-5)). С другой стороны, при рассмотрении серии гомологов геморфина выявлено, что аминокислотные остатки слева от тирозина и справа от пролина не имеют критического значения для проявления функциональной активности и могут быть удалены. На основании проведенного анализа было высказано предположение о том, что удлинение дипептида Tyr-Pro природными аминокислотами может приводить к новым пептидам, сохраняющим анальгетическую активность.

1. Влияние С-концевого удлинения последовательности Tyr-Pro(D-Pro, ДPro, Hyp) на проявление анальгетической активности и сродство к опиоидным рецепторам.

Изученные пептиды Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂, Tyr-Pro-Ser-oMe, Tyr-D-Pro-Ser-NH₂, Tyr-D-Pro-Ser-oMe, Tyr-Pro-Ser-NH₂, Tyr-[D,L]Pro-Ser-oMe, Tyr-Pro-Lys-NH₂, Tyr-Pro-Ala-NH₂ обладают анальгетическим действием в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей, а Tyr-Hyp-Ser-NH₂, Tyr-Hyp-Ser-oMe - только в тесте уксусных корчей. Удлинение последовательности Tyr-Pro положительно заряженным Lys увеличивает сродство к д-ОР, нейтрально заряженным Ala - к м-ОР, а полярным Ser - незначительно увеличивает к м- и уменьшает к д-ОР, при этом усиливается анальгетическая активность в тесте уксусных корчей (табл. 6).

При удлинении дипептида Tyr-Pro последовательностью Gly-Pro анальгетический эффект сохраняется, хотя сродство к м- и д-ОР практически не изменяется. При удлинении Tyr-D-Pro-Ser последовательностью Pro-Gly-Pro значимо не изменяется сродство к м- и д-ОР, но сокращается продолжительность обезболивающего действия в тесте отдергивания хвоста (табл. 6).