Поиск новых средств фармакологической регуляции болевой чувствительности среди фрагментов атипичных опиоидных пептидов

Амидирование, но не метилирование, С-концевых аминокислотных остатков увеличивает анальгетическую активность, однако выявленная закономерность не связана с увеличением сродства к м- и д-ОР. В тестах соматической и висцеральной боли наибольшей активностью обладают трипептиды Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂, Tyr-D-Pro-Ser-NH₂, Tyr-Pro-Lys-NH₂ (табл. 6).

Таблица 6. Сравнительная анальгетическая (1 мг/кг, в/б) и опиоидная активность пептидов общей формулы А-Б-Tyr-Pro(D-Pro, ДPro, D-ДPro, Hyp)-В-X и аналогов ДМ.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test). ПКМС - подвздошная кишка морской свинки (GPI), СПМ - семявыносящий проток мыши (MVD)

2. Влияние N-концевого удлинения последовательности Tyr-Pro(D-Pro, ДPro)-Х на проявление анальгетической активности и сродство к опиоидным рецепторам.

Филогенетический анализ мутаций аминокислотных остатков в белковых последовательностях позволило выделить основные группы взаимозаменяемых аминокислот: ароматические (Phe, Tyr, Trp), положительно заряженные (Lys, Arg, His), отрицательно заряженные (Glu, Asp), и остатки разной природы (неполярные с длинным радикалом (Val, Leu, Ile), слабополярные (Met, Cys), с коротким радикалом, (Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln, Pro)) (Shulz, Schirmer, 1982). Были синтезированы аналоги содержащие представителей основных групп, кроме положительно заряженных, поскольку положительный заряд лигандов ОР увеличивает избирательность по отношению к µ-ОР (Shiller et al., 1989), что повышает риск развития нежелательных побочных эффектов.

Добавление Ala (аминокислотного остатка с малой боковой цепью) с N-конца трипептида Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ увеличивает сродство к д-ОР, без изменения анальгетической активности; добавление D-Ala - не влияет на анальгетическую активность и сродство к рецепторам, а добавление Glu (отрицательно заряженного) - повышает анальгетическую активность, увеличивает сродство к д-ОР и уменьшает к м-ОР. Добавление N-концевого Met к трипептиду Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ уменьшает сродство к м- и снижает анальгетическую активность в тесте соматической боли, а к трипептиду Tyr-Pro-Ala-NH₂ увеличивает сродство к м- и д-ОР, но при этом полностью исчезает анальгетическая активность. Среди изученных тетрапептидов наибольшей анальгетической активностью обладали Ala-Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ и Glu-Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (табл. 6). Met-Tyr-Pro-Ala-NH₂ обладает высоким сродством к - и -ОР, но не оказывает анальгетического действия. Дегидрирование остатка пролина в молекуле Met-Tyr-Pro-Ala-NH₂ приводит к уменьшению сродства к д-ОР и появлению слабой активности в тесте уксусных корчей, но не отдергивания хвоста.

Таким образом, в результате проведенных исследований не было установлено взаимосвязи между уровнем анальгетической активности пептидов общей формулы А-Tyr-Pro(D-Pro, ДPro, D-ДPro, Hyp)-В-X и их связыванием с периферическими м- и д-ОР. Можно полагать, что в группе Tyr-Pro-содержащих пептидов механизм анальгетического действия не связан со взаимодействием с периферическими - и -ОР. Оптимальным соотношением уровней анальгетической активности и связыванием с периферическими - и -ОР обладают Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂, что позволило отобрать эти пептиды для дальнейших исследований в качестве потенциальных анальгетиков.

4. Изучение фармакологической активности Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂

С-концевой фрагмент атипичного ОП ДМ трипептид Tyr-Pro-Ser-NH₂ сам не взаимодействует с µ-ОР, но обеспечивает стабильность взаимодействия с ними ДМ (Saqan et al., 1989). Tyr-Pro-Ser-NH₂ может образовываться при гидролизе ДМ (Darlak et al., 1988). Ранее было показано, что при внутрижелудочковом введении трипептид не обладает анальгетической активностью (Broccardo et al., 1981). Влияние стереохимической модификации остатков пролина и серина на проявление активности амида трипептида не исследовалось.

1. Изучение анальгетической активности Tyr-Pro-[L,D]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂.

Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ проявляют анальгетическую активность в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) в широком диапазоне тестов определения болевой чувствительности. В тесте отдергивания хвоста анальгетическая активность Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б) сохраняется на протяжении 90 минут, а в дозе 0.1 мг/кг - 60 минут (табл.2). По уровню ЭД₅₀ Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ сопоставимы с ДМ. По глубине анальгетического действия пептиды уступают морфину в дозе 5.0 мг/кг. Диклофенак в дозах 10, 25 и 50 мг/кг в данном тесте не обладает обезболивающим действием. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг показывают сходную анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста при в/б и в/м введении на протяжении 90 мин и при р.о. введении на протяжении 60 мин (рис. 5). При и/н введении в дозах 0.001 и 0.01 мг/кг пептиды проявляют анальгетическую активность через 20 мин после введения (рис. 5).

Рисунок 5. Влияние Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ (А) и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (Б) при различных способах введения на болевую чувствительность в тесте отдергивания хвоста.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

В тесте горячей пластины Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ обладают анальгетическим действием в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б). Уровень активности этих трипептидов в дозе 1.0 мг/кг (в/б) сопоставим с активностью ДМ. Эффект сохраняется на протяжении 60 минут. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг подобно ДМ снижают болевую чувствительность в тесте механического раздражения хвоста крысы (табл. 3). Как и морфиноподобные соединения Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (1.0 и 10.0 мг/кг, в/б) устраняют болевые симптомы I и II фазы в тесте тонической боли, вызванной формалином (рис. 6).

Рисунок 6. Влияние Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ (А) и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (Б) на болевую чувствительность в формалиновом тесте.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

Рисунок 7. Анальгетическая активность ДМ и Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ в тесте нейрогенного болевого синдрома

В тесте уксусных корчей Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ (0.1 - 10.0 мг/кг, в/б) и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (1.0 - 10.0 мг/кг, в/б) достоверно уменьшают число корчей, вызванных уксусной кислотой. По уровню ED₅₀ пептиды активнее диклофенака, но уступают ДМ (табл. 2). Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (0.1 - 10.0 мг/кг, в/б) обладает выраженным противовоспалительным действием в тесте индуцированного конканавалином А воспаления, а Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ не проявляет активность в изученных дозах. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ в дозе 1.0 мг/кг (в/б) препятствует развитию нейрогенного болевого синдрома (рис. 7) и не влияет на развитие центрального болевого синдрома. ДМ, напротив, усиливает болевую чувствительность в тесте нейрогенного болевого синдрома.

2. Влияние стереохимических модификаций остатка серина в молекуле Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ на уровень анальгетическую активность.

В результате амидирования Tyr-Pro-L-Ser-oMe получается смесь стереоизомеров Tyr-Pro-L-Ser-NH₂ и Tyr-Pro-D-Ser-NH₂ в соотношении 1:1. Изучение анальгетической активности отдельных стереоизомеров в тесте уксусных корчей показало, что анальгетическим действием при внутрибрюшинном введении обладает только Tyr-Pro-D-Ser-NH₂ (рис. 8). Это соответствует полученным ранее данным Broccardo и коллег (1981) об отсутствии анальгетического действия у Tyr-Pro-L-Ser-NH₂ при его внутрижелудочковом введении в тесте горячей пластины.

Рисунок 8. Влияние L- и D-стереоизомеров по серину на проявление анальгетической активности Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ в тесте уксусных корчей.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

3. Изучение нежелательных эффектов Tyr-Pro-[L,D]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂, характерных для опиоидов.

Частота дыхания в контрольных группах животных соответствует 211±4 и 209.5±5.7 движений в минуту. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-D-Pro-Ser-NH2 не изменяют частоту дыхания ненаркотизированных беспородных мышей в дозах 1, 10, 100, 500 и 800 мг/кг (в/б, однократно). В группе наркотизированных кроликов частота дыхания до введения пептида соответствует 30±2.4 движения в минуту. После введения Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 в дозе 10 мг/кг (в/в, однократно) частота дыхания значимо не изменяется.

Хроническое 14 и 28-дневное введение Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в дозе 1.0 мг/кг (в/б) не приводит к развитию толерантности по анальгетическому эффекту в тесте отдергивания хвоста (рис. 9). 7-дневное введение трипептидов в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б) не вызывает развитие толерантности по анальгетическому эффекту в тесте уксусных корчей. На протяжении 28 дней введения пептидов в дозе 1.0 мг/кг и после их отмены не наблюдаются симптомы синдрома отмены, сохраняются параметры активности в открытом поле и анальгетическая активность в тесте отдергивания хвоста.

Рисунок 9. Влияние хронического введения Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ (А) и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (Б) на болевую чувствительность в тесте отдергивания хвоста.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

При провокации налоксоном синдрома отмены после введения Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в дозах 3х50, 3х75 и 3х100 мг/кг в течение 5 дней прыжки и птоз наблюдаются у меньшего числа животных по сравнению с поведением морфин-зависимых животных (рис.10).

Рисунок 10. Симптомы синдрома отмены Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂, провоцированного налоксоном.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

При однократном введении Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ показывают высокий терапевтический индекс (табл. 5). Пептиды не вызывают гибели животных в дозах до 800 мг/кг (в/б). В дозе 100 мг/кг (в/б) Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ не влияют на двигательную активность, ориентировочно-исследовательскую реакцию и не вызывают миорелаксации, нарушения координации движений, нарушений ушного и корнеального рефлексов, судорог, тремора, птоза, прыжков, встряхиваний, стука зубами, синдрома Штрауба, чесания, чихания и бокового положения.

4. Изучение нейротропной активности Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂.

Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг (в/б) не изменяют показателей двигательной активности в открытом поле. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг проявляет дозо-зависимое анксиолитическое действие в тесте ПКЛ и в дозе 10.0 мг/кг - в тесте конфликтной ситуации. Антидепрессантная активность Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ проявляется в тесте неизбегаемого плавания в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг и в тесте вращающихся колёс по Nomura в дозе 0.1 мг/кг. Пептид в дозах 1.0 и 10.0 мг/кг оказывает противосудорожное действие в тесте МЭШ и не влияет на судорожную готовность в тесте коразоловых судорог. Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ вызывает анксиолитическое действие в дозе 10.0 мг/кг только в тесте ПКЛ (рис. 11) и не проявляет противосудорожную и антидепрессантную активность.

Рисунок 11. Профиль активности Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂.

Примечание: Указаны дозы, вызывающие достоверные эффекты: 1 - доза 10 мг/кг, 2 - доза 1 мг/кг, 3 - доза 0.1 мг/кг. Дозы, угнетающие дыхание и вызывающие гибель: 1 - 300 мг/кг, 2 - 500 мг/кг, 3 - 800 мг/кг. Синдром отмены (при провокации налоксоном прыжков): 1 - 30% животных, 2 - 60%, 3 - 100%.

Изменение температуры окружающей среды приводит к изменению болевой реакции контрольной группы в тесте уксусных корчей (рис. 12). Максимальное число корчей наблюдается в термонейтральной среде. ДМ в дозе 1.0 мг/кг (в/б) уменьшает число корчей во всех температурных режимах. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 обладает анальгетическим действием только в термонейтральной среде. Наблюдаемые свойства не зависят от терморегуляторных эффектов пептидов. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 в условиях холодной и термонейтральной среды не влияет на температуру тела, а в жаркой среде вызывает гипертермию, по динамике сходную с эффектом ДМ. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 только в термонейтральной среде вызывает сужение сосудов.

Рисунок 12. Болевая чувствительность в тесте уксусных корчей при разной температуре окружающей среды зависимость контрольных величин (А); влияние ДМ и Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 (Б).

Отличия от контроля в тестируемом температурном режиме достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

5. Изучение фармакокинетических параметров Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂.

Анализ параметров кинетики - Tyr-[³H]Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-[³H]D-Pro-Ser-NH2 показал, что пептиды определяются в крови, печени и почках на протяжении 120 минут, а в мозге, сердце и легких - 40 минут. Время достижения максимальной концентрации (Tmax) Tyr-[³H]Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-[³H]D-Pro-Ser-NH2 составило 5 мин, а ее величина 0.71 и 0.67 % на мл/г, соответственно для пептидов. Пептиды с одинаковой скоростью выводятся из организма. Значения периода полувыведения (t1/2el) и MRT из крови для Tyr-[³H]Pro-[D,L]Ser-NH2 - 53.8 мин и 43.2 мин, а для Tyr-[³H]D-Pro-Ser-NH2 - 57.8 мин и 46.1 мин, соответственно.

Таблица 7. Основные фармакокинетические параметры Tyr-[³H]Pro-[D,L]Ser-NH2 (А) и Tyr-[³H]D-Pro-Ser-NH2 (Б) после его внутримышечного введения животным в дозе 1 мг/кг.

Рисунок 13. Тканевая доступность Tyr-[³H]Pro-[D,L]Ser-NH2 и Tyr-[³H]D-Pro-Ser-NH2 после внутримышечного введения животным в дозе 1 мг/кг.

5. Изучение механизма действия Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂

В механизме анальгетического действия Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ участвует опиоидергическая система. Это подтверждается способностью налоксона, налтрексона и налоксона метиодида ослаблять эффекты пептидов в тестах отдергивания хвоста и уксусных корчей (табл. 8, рис. 14).

Анальгетический эффект Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (в/б) в тесте уксусных корчей не блокируется (п/к) 3-метоксиналтрексоном (антагонист рецепторов морфин-6--глюкуронида), АМ-251 (антагонист каннабиноидных СВ₁-рецепторов), налоксоназином (антагонист ₁-ОР) или бензоилгидразоном налоксона (агонист ₃-ОР и антагонист ORL₁- и -ОР) и усиливается при блокаде д-ОР налтриндолом (табл. 8).

В исследованиях in vitro показано, что Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ не взаимодействуют с периферическими -ОР препарата СПМ (IC₅₀ 6.5*10^-4 моль и 5.3*10^-4 моль, соответственно) и проявляют слабое сродство к периферическим -ОР препарата ПКМС (IC₅₀ 3.3*10^-5 моль и 4.0*10^-5 моль, соответственно) (табл. 6).

Рисунок 14. Влияние блокаторов опиоидных рецепторов на анальгетическую активность Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в тесте отдергивания хвоста.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

Таблица 8. Влияние блокаторов опиоидных рецепторов на анальгетическую активность Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в тесте уксусных корчей.

% относительно группы активного контроля, получившего уксусную кислоту. Отличия достоверны при p<0.05 от контрольной группы (*) и от группы, которой вводили пептид (#) по критерию Вилкоксона-Мэнна-Уитни (U-test).

- блокирует; - не влияет; - потенцирует; М6Г - рецепторы морфин-6--глюкуронида.

Показано, что [³H]-ДМ имеет два участка насыщения в мембранной фракции головного мозга крысы, соответствующие 1.5-3 нМ и >5 нМ (KD₁ = 0.26 ± 0.07 нМ и концентрация рецепторов Bmax₁ = 24 ± 0.66 фмоль/мг белка, KD₂=1.7 ± 0.01 нМ и концентрация рецепторов Bmax₂ = 53 ± 4.4 фмоль/мг белка (рис. 15). Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ вытесняют [³H]-ДМ только из «высокоаффинных» мест связывания, в первую очередь оккупируемых [³H]-ДМ при использовании его в концентрации 0.5 нМ. (IC₅₀ немеченого ДМ - составила 0.5 нМ, IC₅₀ для Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ - 8±2 мкМ, IC₅₀ для Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ - 5±1 мкМ) и не влияют на связывание [³H]-ДМ с «низкоаффинными» местами связывания (рис. 15), чувствительными к немеченому ДМ и агонисту ОР DAGO (IC₅₀ составила 5 и 4.8 нМ, соответственно).

Рисунок 15. Зависимость специфического связывания от концентраций [³H]-дерморфина в присутствии 5 мкМ дерморфина (контроль), Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂, Tyr-D-Pro-Ser-NH₂. (А), в координатах Скетчарда (Б).

Исследование ноцицептивного флексорного рефлекса показало, что Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (1.0 мг/кг, в/б) вызывает достоверное повышение порога возникновения раннего и позднего ответа, а также снижает количество спайков в раннем и позднем ответе, что характеризует подавление частоты импульсации в ноцицептивных А- и С-волокнах. Сходным действием обладает морфин (Kimura et al., 2004), а ДМ снижает частоту импульсации только в С-волокнах (Sullivan, Dickenson, 1988).

Анализ электрофизиологических механизмов действия показал, что Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 (1 мг/кг, в/б) имеет отличный от морфина и ДМ профиль изменений биоэлектрической активности. В миндалине, гипоталамусе, ретикулярной формации ствола мозга и сенсомоторной коре через 10 минут после введения Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2 в дозе 1 мг/кг повышает в1 и в2 активность, а ДМ в той же дозе оказывает сноподобное действие, увеличивая активность в д-диапазоне и уменьшая в и1, и2, в1 и в2 диапазонах. Морфин в дозе 5 мг/кг повышает д-активность в перечисленных структурах. Общим в действии Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH2, ДМ и морфина является повышение в1 активности в сенсомоторной коре через 10 минут после введения и снижение в2 активности в гиппокампе через 20 минут после введения.

Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂, ДМ и морфин также различаются по влиянию на содержание и оборот моноаминов и аминокислот в мозге крыс. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ в дозе 1 мг/кг (в/б) не влияет на содержание и оборот моноаминов, снижает содержание ГАМК в спинном мозге, повышает содержание глутамата, аспартата и глицина в спинном мозге и стриатуме (рис. 16), и только глицина в гиппокампе. Морфин в дозе 5 мг/кг повышает количество глутамата в стриатуме и снижает содержание глицина в гиппокампе. ДМ в дозе 1 мг/кг повышает содержание ГАМК в стволе, глицина в стволе и стриатуме, а в спинном мозге снижает количество глицина. Общим в действии Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и ДМ является увеличение содержания глицина в стриатуме, а сходство между Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и морфином проявляется в повышении глутамата в стриатуме. На содержание глицина в гиппокампе морфин и Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ оказывают разнонаправленное действие: трипептид - повышает, а морфин - снижает. На содержание глицина в спинном мозге ДМ и Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ также оказывают разнонаправленное действие.

Рисунок 16. Влияние ДМ, Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и морфина на содержание аминокислот в стриатуме крыс.

Отличия от контроля достоверны (*) при p<0.05 по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (U-test).

Таким образом, анальгетическая активность Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ снижается налоксоном и не проникающим через ГЭБ налоксона метиодидом; пептид проявляет слабое сродство к периферическим µ-ОР и не взаимодействует с периферическими -ОР на препаратах изолированных органов ПКМС и СПМ. При блокаде д-ОР анальгетическая активность усиливается. Анальгетическое действие Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в тесте уксусных корчей не реализуется через µ₁, морфин-6--глюкуронидные, каннабиноидные СВ₁, и орфановые ORL₁- рецепторы. Электроэнцефалографические и нейрохимические исследования также выявили существенные различия в эффектах Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂, ДМ и морфина и указывают на участие иного, отличного от классического опиоидного механизма действия, в реализации эффектов Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂.

Заключение

Анализ первичных последовательностей атипичных ОП, используемый в настоящей работе, позволил выявить наиболее часто встречающуюся пептидную последовательность - дипептид Tyr-Pro у 63% пептидов. Эта последовательность Tyr-Pro принимает участие в образовании -поворота, необходимого для взаимодействия с центрами связывания (Haslach et al., 2008; Doi et al., 2002). Так ДМ (Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH₂), благодаря присутствию в молекуле D-Ala² и L-Pro⁶ в растворе может образовывать два N- и C-концевых -поворота (Renugopalakrishnan, Rapaka, 1988), что соответствует двум центрам связывания ДМ. Это послужило основанием для предположения о том, что модификация Pro в молекуле Tyr-Pro-содержащих пептидов может привести к изменению их биологической активности. Действительно, в нашем исследовании установлено, что замена пролина в молекуле ДМ на D-стереоизомер или его дегидрирование приводит к усилению и пролонгированию анальгетической активности в тесте соматической боли при термическом раздражении ноцицепторов, но не влияет на анальгетические эффекты при механическом и химическим раздражении соматических и висцеральных рецепторов, и ослабляет седативное действие. Однако, несмотря на различия в эффектах, стереохимическая модификация по пролину в молекуле ДМ не изменяет сродства к м- и д-ОР на препаратах изолированных органов.

Полученные результаты подтвердили значимость последовательности Tyr-Pro для проявления эффектов пептидов и побудили к детальному изучению собственной активности дипептида. Дипептид Tyr-Pro впервые был синтезирован и описан в работе, посвящённой количественной оценке горького вкуса пептидов этой группы, как один из фрагментов -казеина (Shinoda et al., 1986). В этом же году было установлено, что Tyr-Pro является одним из продуктов ферментативной деградации in vitro опиоидного пептида ДМ (Scalia et al., 1986). В плазме человека и крысы Tyr-Pro может образовываться при деградации пептида Tyr-MIF-1 (Kastin et al., 1994), эндоморфина-1 (Tomboly et al., 2002; Barsun et al., 2007) и эндоморфина-2 (Sakurada et al., 2003). В гидролизе принимают участие дипептилпептидазы III и IV (Chen et al., 2004). Tyr-Pro также был обнаружен в ферментативном гидролизате казеинов молока (FitzGerald, Meisel, 2000; Zhu et al., 2007) и йогурте (Yamamoto et al., 1999). Tyr-Pro может также образовываться при гидролизе дипептилпептидазой IV нейропептида Y (NPY), в результате чего образуется фрагмент NPY_3-36, с уменьшенной аффинностью к Y₁ рецепторам (Gerald et al., 1996). Установлено, что дипептид обладает антигипертензивным действием в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг у спонтанногипертензивных крыс (Yamamoto et al., 1999), и этот эффект может быть обусловлен подавлением действия ангиотензин-превращающего фермента (Zhu et al., 2007). В исследованиях Rуnai и коллег (2006) показано выраженное анальгетическое действие дипептида (100 нмоль на крысу, т.е. примерно 0.16 мг/кг) при внутрижелудочковом введении в тесте отдергивания хвоста.

Анальгетическая активность Tyr-Pro при системном введении ранее не изучалась. В нашем исследовании было установлено, что Tyr-Pro в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг обладает дозо-зависимой анальгетической активностью в тестах тонической и фазической болей, вызванных термическим, механическим и химическим раздражением соматических и висцеральных рецепторов, которая снижается неселективными блокаторами центральных и периферических ОР налоксоном и налоксона метиодидом, соответственно. В тестах in vitro Tyr-Pro обладает слабым сродством к периферическим -ОР и не взаимодействует с периферическими µ-ОР. В исследованиях Rуnai и коллег (2006) также не удалось обнаружить у Tyr-Pro опиоидной активности в тестах in vitro. Кроме того, этой же группой исследователей было показано, что в экстракте мозга крыс через 30 мин после внутрижелудочкового введения [³Н]Tyr-Pro радиоактивность обнаруживается в тетра- и трипептидах, родственных эндоморфину-2, причём основным метаболитом является дезамидированный эндоморфин-2. Однако, анальгетическое действие эндоморфина-2 чувствительно к действию антагонистов ОР налоксоназину и 3-метоксиналтрексону, что указывает на участие ₁-опиатных и морфин-6-в-глюкуронидных рецепторов (Mizoguchi et al., 2006; Sakurada et al., 2002). В наших исследованиях установлено, что анальгетическое действие Tyr-Pro не блокируется антагонистом ₁-ОР налоксоназином и антагонистом морфин-6-в-глукуронидных рецепторов 3-метоксиналтрексоном, следовательно, анальгетическое действие при периферическом введении Tyr-Pro не опосредовано эндоморфином-2.

Выполненный нами анализ первичной структуры атипичных ОП показал, что опиоидная активность не зависит от положения пары -Tyr-Pro- в последовательностях этой выборки и сохраняется, как при его перемещении в N-конец молекулы (эндоморфины, геморфины), так и внутрь цепи (глютеновые экзорфины А, геморфины, дерморфины), и в С-концевое положение (глютеновый экзорфин А, геморфин-(1-5)). Это указывает на возможность сохранения анальгетической активности при модификации -Tyr-Pro- с С- и N-концов природными аминокислотами.

На основании полученных результатов были синтезированы и изучены соединения общей формулы А-Tyr-Pro(D-Pro, ДPro, D-ДPro, Hyp)-В-X, где А, В - природные аминокислоты, а Х - метильная или амидная группа. Среди протестированных 22 оригинальных синтетических пептидов наиболее эффективными оказались Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂. Анализ литературных источников показал, что свойства пептидов Tyr-Pro-D-Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ ранее не изучались, а трипептид Tyr-Pro-L-Ser-NH₂ был изучен только при внутримозговом введении в тесте горячей пластины, где продемонстрировал отсутствие анальгетической активности (Broccardo et al., 1981). В наших исследованиях было установлено, что в изучаемой нами смеси стереоизомеров Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ (1:1) анальгетической активностью при внутрибрюшинном введении обладает именно Tyr-Pro-D-Ser-NH_2, а не Tyr-Pro-L-Ser-NH_2. Установлено, что Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в дозах 0.1-10.0 мг/кг проявляют активность в широком наборе тестов оценки болевой чувствительности и на моделях воспалительной боли. Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ подавляет частоту импульсации в А- и С-волокнах ноцицепторов. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ оказывает обезболивающее действие на модели нейропатической боли, но не при моделировании центрального болевого синдрома. Анальгетическое действие пептида зависит от температуры окружающей среды (в холодной и жаркой среде ослабляется). Анальгетический эффект Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ (в/б) блокируется неселективными антагонистами центральных и периферических ОР, однако пептиды проявляют слабое сродство к периферическим - и не связываются с -ОР на препаратах изолированных органов ПКМС и СПМ, но взаимодействуют с «высокоаффинными» местами связывания ДМ в головном мозге крыс.

Таким образом, выявлен новый класс пептидных соединений, обладающих анальгетической активностью. Отобранные для дальнейших исследований пептиды Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ проявляют анальгетическую активность и обладают рядом преимуществ по сравнению с морфином: 1) имеют большую терапевтическую широту и не оказывают влияния на частоту дыхания при превышении терапевтической дозы в 500 раз; 2) у пептидов не отмечено развития толерантности по анальгетическому действию при их хроническом введении; 3) у пептидов не выявляется проявлений синдрома отмены после прекращения их длительного введения (28 дней) и наблюдается достоверно менее выраженные проявления острой физической зависимости при провокации налоксоном. По сравнению с диклофенаком пептиды активны в более широком диапазоне тестов и в меньших дозах.

Выводы

1. При анализе биоинформационными методами первичной последовательности 60 представителей атипичных опиоидных пептидов выявлена аминокислотная последовательность -Tyr-Pro- у 63% веществ. Показано, что наличие опиоидной активности пептидов не зависит от положения -Tyr-Pro- в их молекулах.

2. Tyr-Pro в дозах 0.1 - 10.0 мг/кг (в/б) проявляет анальгетическую активность в тестах фазической и тонической боли при раздражении соматических и висцеральных ноцицепторов химическими, термическими и механическими стимулами. Анальгетическая активность Tyr-Pro чувствительна к действию центральных и периферических антагонистов опиоидных рецепторов налоксона и налоксона метиодида, однако пептид проявляет слабое сродство к -опиоидными рецепторам семявыносящего протока мыши и не взаимодействует с -опиоидным рецепторам подвздошной кишки морской свинки.

3. Стереохимическая модификация остатка пролина в молекуле Tyr-Pro-содержащего пептида дерморфина не влияет на сродство к периферическим м- и д-опиоидным рецепторам. Замена L-пролина на D-стереоизомер не изменяет анальгетическую активность дерморфина при механическом и химическом раздражении ноцицепторов, но ослабляет противовоспалительное действие. Дегидрирование пролина в молекуле дерморфина повышает сродство к опиоидным рецепторам, ослабляет противовоспалительное и анальгетическое действие при механическом раздражении ноцицепторов и приводит к появлению анксиолитической и потере противосудорожной активности.

4. Изучение зависимости между строением и анальгетической активностью в ряду новых 22 синтетических пептидов, содержащих -Tyr-Pro-, выявило, что наибольшей активностью обладают трипептиды Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ (1:1) и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂, которые в дозах 0.1 - 10 мг/кг проявляют анальгетическое действие в тестах фазической и тонической боли при раздражении соматических и висцеральных ноцицепторов химическими, термическими и механическими стимулами и в тестах воспалительной боли. Анальгетическая активность трипептидов сохраняется в течение 90 минут и наблюдается при различных способах введения (внутрибрюшинном, внутримышечном, внутрь и интраназальном). В смеси стереоизомеров Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ анальгетической активностью обладает D-стереоизомер, а L-стереоизомер - не активен.

5. При исследовании механизма действия Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ обнаружено, что анальгетическая активность пептидов чувствительна к действию центральных и периферических антагонистов опиоидных рецепторов (налоксона, налтрексона и налоксона метиодида), однако пептиды проявляют слабое сродство к -опиоидным рецепторам подвздошной кишки морской свинки и не взаимодействует с -опиоидными рецепторами семявыносящего протока мыши. Оба пептида связываются с «высокоаффинными» центрами связывания дерморфина мембранной фракции гомогената мозга крысы. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ увеличивает содержание в стриатуме и спинном мозге возбуждающих аминокислот глутамата и аспартата и тормозной аминокислоты глицина, и в гиппокампе - глицина.

6. Животные, получавшие Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂- и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в высоких возрастающих дозах, проявляют достоверно меньшие по интенсивности симптомы синдрома отмены, провоцируемого налоксоном, по сравнению с морфином и [D-Pro⁶]-дерморфином. Хроническое (28 дней) введение Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ не приводит к развитию толерантности по анальгетическому эффекту, а прекращение 28-дневного введения пептидов не вызывает проявлений синдрома отмены.

7. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ наиболее интенсивно распределяются в сильно васкуляризированных органах (печень, почки) и меньше - в слабоваскуляризированных (мозг, легкие, сердце). Соединения выводятся из организма (t_1/2el из крови = 53.8 и 57.8 мин, MRT из крови = 43.2 и 46.1 мин соответственно). Протеолиз Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ осуществляется ферментами крови, сердца, легких и мозга. В качестве основного меченного метаболита обнаруживается пролин и D-пролин, соответственно.

8. Tyr-Pro-[D,L]Ser-NH₂ и Tyr-D-Pro-Ser-NH₂ в сравнении с морфином обладают большей терапевтической широтой, достоверно менее выраженными проявлениями синдрома отмены и толерантности, не влияют на дыхательный центр (в дозах до 800 мг/кг), а в сравнении с диклофенаком - активны в меньших дозах и имеют более широкий спектр анальгетической активности. Отобранные пептиды, сочетающие анальгетическую активность и безопасность применения, можно рассматривать в качестве базисных соединений для создания потенциального анальгетика пептидной природы.

Список публикаций автора

1. Гузеватых, Л.С. Влияние дерморфина, его фрагментов и аналогов на систему терморегуляции [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.Г. Емельянова, А.Б. Усенко, Н.Н. Горячева, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Международная конференция “Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности”, 1999, Беларусь, Минск. - Минск, 2001. - С. 126.

2. Гузеватых, Л.С. Изучение анальгетической активности аналогов эндогенного пептида дерморфина [Текст] / Л.С. Гузеватых, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, А.Б. Усенко, Т.Г. Емельянова, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов // Международная научная конференция «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника». Минск, 14-16 ноября 2001. - Минск, 2001. - С.58.

3. Емельянова, Т.Г. Влияние аналогов дерморфина на терморегуляцию крыс в различных температурных режимах [Текст] / Т.Г. Емельянова, А.Б. Усенко, А.П. Бонарцев, А.А. Каменский, Л.С. Гузеватых, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Известия АН, серия биологическая. - 2002. - Т.3. - С. 348-354.

4. Гузеватых, Л.С. Влияние структурных изменений Pro⁶ в молекуле дерморфина на анальгетическую активность [Текст] / Л.С. Гузеватых, Т.Г. Емельянова, А.Б. Усенко, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Т.А. Воронина, Н.Ф. Мясоедов // Известия АН, серия биологическая. - 2002. - Т. 4. - С. 472-476.

5. Емельянова, Т.Г. Структурно-конформационные особенности дерморфинов и их роль в регуляции температурного гомеостаза [Текст] / Т.Г. Емельянова, Л.С. Гузеватых, А.Б. Усенко, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, Н.Ф. Мясоедов // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Механизмы терморегуляции и биоэнергетики: взаимодействие функциональных систем»; Иваново, 1-5 октября 2002. - Иваново, 2002. - С. 22.