Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспекты

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспекты

03.00.04. - биохимия

доктора биологических наук

Гарипова Маргарита Ивановна

Уфа - 2008

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии

ГОУ ВПО Башкирский государственный университет

Научный консультантдоктор биологических наук, профессор Киреева Наиля Ахняфовна

Официальные оппоненты:доктор биологических наук, профессор Лопина Ольга Дмитриевна Московский государственный университет

доктор биологических наук, профессор Мединцев Александр Григорьевич Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

доктор биологических наук, профессор Мустафина Ольга ЕвгеньевнаИнститут биохимии и генетики УНЦ РАН

Ведущая организация Казанский государственный университет

Защита состоится «___» __________200__г. в _______ часов

на заседании Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01

при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

Адрес: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. Институт биохимии и генетики УНЦ РАН,

www.anrb.ru/molgen/dissov.html.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан “__ “ ______________ 200_ г.

Ученый секретарь

диссертационного совета - Бикбулатова С. М.

транспорт инсулин гормон хроматография

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Инсулин - первый белок с доказанной гормональной активностью (Abel, 1926), однако механизм его транспорта в крови во многом остается неясным до настоящего времени. Из данных литературы следует, что в транспорте инсулина принимают участие два механизма. Первый механизм заключается в доставке инсулина к периферическим тканям плазмой крови, в которой инсулин транспортируется в составе двух фракций: “связанного” и “свободного” инсулина (Касаткина, 1996). Состав и свойства белков, формирующих фракцию связанного инсулина, изучены недостаточно; по мнению Н.К. Грачевой и соавторов (1972), эта фракция формируется за счет взаимодействия гормона с трансферином. Однако, ввиду использования авторами физико-химических методов выделения содержащих инсулин фракций, возникает сомнение в том, что были выделены все из них. Что касается свободного инсулина, то до настоящего времени не ясно, находится ли он в истинно свободном состоянии или формирует лабильный комплекс с белками крови (Старосельцева и др., 1983, Марри и др., 1993, Касаткина, 1996, Покровский, 2007).

Второй механизм транспорта инсулина заключается в доставке гормона к периферическим тканям в комплексе со специфическими рецепторами плазматической мембраны эритроцитов (Govin et. al., 1972; Сандуляк, 1972). В работах ряда авторов показано, что эритроциты крови человека и животных участвуют в транспорте инсулина наряду с плазмой и формируют его депо, из которого инсулин поступает в плазму крови и ткани в ответ на повышение уровня глюкозы, молочной кислоты и под влиянием физико-химических факторов (Доломатов, 1999; Картун и др., 2000; Запорожан и др., 2001).

Соотношение между двумя системами транспорта инсулина в норме и при сахарном диабете до настоящего времени не получило своей оценки.

В то же время, несмотря на успехи в изучении этиологии сахарного диабета и создание новых препаративных форм инсулина, сахарный диабет продолжает занимать третье место среди причин смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и рака (Старосельцева и др., 1983; Касаткина, 1996; Покровский, 2007; Chan, 2007; Neumiller et. al, 2008). Это свидетельствует о необходимости углубления знаний о механизмах синтеза, транспорта и биологического действия инсулина.

Доказано, что диабет первого типа имеет аутоиммунную природу. Разрушение продуцирующих инсулин -клеток осуществляют собственные лимфоциты организма (Atkinson, 1990; Bach, 1994; Hom et. al., 1998; Espe et. al., 2007; Stefan et. al., 2007). По данным литературы, аутоиммунная реакция специфична ко многим антигенам -клеток, в том числе к инсулину (Atkinson, 1990). Однако, механизм формирования аутоиммунных реакций к антигенам -клеток, не выявлен. Известно, что развитие иммунного ответа к антигенным детерминантам зависит от свойств носителя, распознаваемого лимфоцитами (Галактионов, 2004). Роль носителя при антигенном распознавании инсулина могут играть молекулы, транспортирующие его к клеткам-мишеням. Из этого вытекает важность идентификации и изучения свойств компонентов крови, принимающих участие в транспорте инсулина к периферическим тканям в норме и при сахарном диабете.

Цель работы - изучение инсулин-транспортирующих систем крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа с использованием аффинных методов.

Задачи исследования:

1. Оценить соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина в сопоставлении с аналогичными соотношениями ряда гидрофильных и гидрофобных гормонов.

2. Разработать новый носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахаридными носителями.

3. Изучить свойства полученных на основе нового носителя аффинных сорбентов при использовании в условиях лаборатории, биотехнологического производства и в аффинных диагностических системах.

4. Создать диагностическую систему для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

5. Разработать метод количественного определения связывающих инсулин белков сыворотки крови человека и провести сравнение их концентрации в норме и при сахарном диабете первого типа.

6. Синтезировать аффинный сорбент с иммобилизованным инсулином на основе предложенного носителя и провести аффинное выделение связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа.

7. Определить роль ионов цинка и других двухвалентных катионов во взаимодействии инсулина и транспортных белков сыворотки крови.

8. Оценить гетерогенность инсулинсвязывающих белков крови и провести идентификацию в их составе известных транспортных соединений методами электрофореза, гельхроматографии, иммунохимии и классической биохимии в норме и при сахарном диабете первого типа.

9. Количественно оценить содержание липидов и гормонов первой и второй групп в составе связывающего инсулин комплекса.

10. Изучить иммуномодулирующие свойства инсулин-связывающих белков сыворотки крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом.

Научная новизна

Впервые установлено, что особенность транспорта инсулина, по сравнению с транспортом других белковых гормонов, заключается в равноценном использовании сывороточного и эритроцитарного механизмов. При сахарном диабете происходит достоверное снижение вклада сывороточной системы в транспорт инсулина, соответственно, возрастает вклад эритроцитарного транспорта.

Разработан и запатентован новый метод синтеза матрицы для аффинной хроматографии, позволяющий получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные связывающие инсулин белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы и иммобилизованного лиганда. На основе предложенной матрицы синтезирован и запатентован сорбент с иммобилизованной аминофенилбороновой кислотой, использованный при создании диагностической системы для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

Впервые показано, что в плазме крови человека инсулин взаимодействует со сложным комплексом белков, формирующих при физиологических значениях рН ядро транспортирующего гормоны комплекса. Для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка. Показано, что в крови здоровых доноров в состав связывающего инсулин комплекса входят белки с доказанной транспортной функцией: альбумин, -фетопротеин и трансферин.

Установлено, что при сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса достоверно изменяется: альбумин и -фетопротеин, входящие в ядро комплекса в норме, замещаются в нём белком острой фазы воспалительной реакции - ₁-кислым гликопротеином.

Доказано, что транспортирующий гормоны комплекс плазмы крови человека является общим для гормонов различной природы: наряду с инсулином, он содержит как гидрофобные (тироксин, трийодтиронин, тестостерон), так и гидрофильные гормоны (лютеинизирующий гормон, тиреотропный гормон, пролактин).

Показано, что гликопротеиды, формирующие комплекс с инсулином в крови здоровых доноров, обладают способностью снижать иммунный ответ при добавлении к антигенам при иммунизации.

Практическая значимость работы

Разработан и запатентован метод получения носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта. Новый носитель (Поливиналь) не уступает по плотности активных групп бромциан-Сефарозе 4В, обладает лучшими, по сравнению с полисахаридными матрицами, колоночными свойствами и превосходит их по химической стабильности (Гарипова М.И. и др. Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений. Авторское свидетельство № 1789532, 22.09.1992).

Иммуноаффинный сорбент, синтезированный на основе предложенного носителя, испытан в условиях производства человеческого лейкоцитарного интерферона в Отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи на стадии удаления антигенных примесей из полуфабрикатов интерферона. По результатам производственных испытаний, принято Дополнение к регламенту «Лейкинферон для инъекций. Стадия ВР-5.4. Иммобилизация иммуноглобулинов». Сорбент для очистки лейкоцитарного интерферона человека, синтезированный на основе запатентованного носителя, с ноября 1991 года до настоящего времени используется на производстве инъекционного препарата лейкоцитарного интерферона в отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи согласно утвержденному производственному регламенту (Акт об использовании предложения от 23 января 1992 года).

Создана диагностическая система для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека, включающая микроколонки с иммобилизованной на предложенном носителе мета-аминофенилбороновой кислотой (Гарипова и др. Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина. Патент на изобретение № 20935525.2002). Диагностическая система разрешена к применению для диагностики сахарного диабета в лечебно-профилактических учреждениях Республики Башкортостан решением Научно-технического Совета Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан от 28 июля 1992 года.

На основе нового носителя получен сорбент с иммобилизованным инсулином и впервые проведено аффинное выделение связывающих инсулин белков сыворотки крови (транспортирующего гормоны комплекса) здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. Выделенный аффинно транспортирующий гормоны комплекс крови может быть использован в качестве препарата, корректирующего гормональные нарушения, а также при создании новых препаративных форм инсулина с повышенной эффективностью доставки гормона к периферическим тканям.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Особенность транспорта инсулина к периферическим тканям в сравнении с транспортом большинства других белковых гормонов, заключается в равноценном вкладе в доставку гормона двух транспортных систем крови: системы сывороточных транспортных белков и эритроцитарной системы транспорта.

2. При сахарном диабете первого типа снижается роль сывороточного и повышается роль эритроцитарного транспорта в доставку инсулина к периферическим тканям.

3. Предложена новая матрица для аффинной хроматографии, позволяющая получить сорбент с иммобилизованным инсулином, не загрязняющий выделенные инсулин-связывающие белки продуктами расщепления полисахаридной матрицы и иммобилизованного лиганда. На основе новой матрицы синтезирован сорбент с иммобилизованной аминофенилбороновой кислотой, использованный при создании диагностической системы для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека.

4. В плазме крови человека инсулин включается в общий для гидрофильных и гидрофобных гормонов транспортный комплекс, ядро которого формируют альбумин, -фетопротеин, ₂-глобулины и - глобулины (в том числе трансферин), для включения инсулина в транспортный комплекс необходимо присутствие ионов цинка.

5. При сахарном диабете первого типа состав белков транспортного комплекса изменяется: из него исчезают альбумин и -фетопротеин, снижается содержание ₂ -глобулинов, появляется фракция ₁-глобулинов (в том числе кислый ₁- гликопротеин).

6. Белки транспортирующего гормоны комплекса крови в норме обладают иммуносупрессивным действием.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на I Всесоюзной конференции «Аффинная хроматография антител - теоретические и прикладные аспекты» (Москва, 1983), на V Всесоюзной конференции «Новые направления в биотехнологии» (Пущино, 1984), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на V конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино,1988), на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на 33 Международном съезде физиологов (Санкт-Петербург, 1997), на III съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), на Всероссийской конференции «Морфологические основы гистогенеза и регенерации тканей» (Санкт-Петербург, 2001), на конференции «Экологические, морфологические особенности и современные методы исследования живых систем» (Казань, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием «Достижения биологической функционологии и их место в практике образования» (Самара, 2003), на региональной конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), на конференции «Проблемы биоэкологи и пути их решения» (Саранск, 2008).

Публикации. Основные материалы диссертации обобщены в монографии и изложены в 49 печатных работах, в том числе в 10-ти статьях в журналах, рекомендованных ВАК, а также защищены 2 патентами и 2 авторскими свидетельствами.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 336 страницах, содержит 20 рисунков, 24 таблицы и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 536 работ.

Благодарности. Выражаю глубокую признательность научному консультанту - профессору, д.б.н. Наиле Ахняфовне Киреевой за плодотворное сотрудничество, консультации и ценные советы, способствовавшие совершенствованию работы; за подробный анализ работы и доброжелательное отношение к.б.н. Ольге Борисовне Кузовлевой и к.м.н. Маю Яковлевичу Корну, за ценные консультации профессору, д.б.н. Станиславу Юрьевичу Веселову, профессору, д.б.н. Сергею Владимировичу Сибиряку и всем моим коллегам, оказавшим неоценимую помощь в работе.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Формирование группы здоровых доноров, из крови которых аффинно выделяли связывающие инсулин белки, проводили на основании заключения эндокринолога об отсутствии отклонений от нормы в регуляции углеводного обмена. В качестве второго критерия отбора использовано процентное содержание гликозилированного гемоглобина (% Ггб) в капиллярной крови обследуемых, отражающее средний уровень гликемии за 2 месяца, предшествующие взятию пробы (Brownlee et.al., 1980; Garlick et. al., 1983; Hubbuch, 1983). Для количественного определения белков, связывающих инсулин, в плазме крови и их аффинного выделения были отобраны пробы крови 800 здоровых добровольцев 20-25 лет с содержанием Ггб от 4 до 7,5%, что соответствует нормальному уровню гликемии.

Определение коэффициентов распределения гормонов проведено в пробах крови 100 здоровых доноров 25-35 лет со средним содержанием гликогемоглобина в капиллярной крови 5,2±0,41%.

Для количественного определения белков, связывающих инсулин, в плазме крови и их аффинного выделения были отобраны пробы крови 800 больных сахарным диабетом первого типа (8 серий по 100 пациентов), находившихся на стационарном лечении в эндокринологических отделениях больниц г. Уфы. Процентное содержание гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови обследованных колебалось от 10,3 % до 18,6 %, что соответствует стадии заболевания с неудовлетворительной компенсацией нарушений углеводного обмена. Эта стадия заболевания была выбрана в связи с тем, что именно в стадии декомпенсации следовало ожидать проявления наиболее выраженных изменений транспорта инсулина.

В работе использованы следующие методы. Аффинное выделение связывающих инсулин белков крови проводили на сорбентах, синтезированных на основе предложенного носителя. Иммуноферментное определение альбумина крови человека, -фетопротеина, овальбумина, и антител к овальбумину проводили по стандартному методу (Engval et. al., 1971) с использованием наборов для иммуноферментного анализа производства Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИ им. Н.Ф. Гамалеи. Иммуноферментное определение гормонов, альбумина и -фетопротеина проводили с использованием диагностических наборов фирмы НВО Иммунотех (Россия). Иммунолюминесцентное определение гормонов на автоматическом анализаторе Amerham (Англия), проводили при помощи наборов Amerlite. Иммунонефелометрическое определение ₁-кислого гликопротеина и трансферина проведено при помощи диагностических наборов фирмы НВО Иммунотех (Россия). Электрофорез белков на ацетатцеллюлозных пленках проводился c использованием системы Microtech 648 PC фирмы Interlab, предназначенной для полностью автоматизированного проведения электрофореза. Иммуномодулирующие свойства инсулин-связывающих белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом изучены в эксперименте по иммунизации белых лабораторных мышей дифтерийным анатоксином. Для определения концентрации противодифтерийных антител и связывающих инсулин белков крови использовали реакцию пассивной гемагглютинации с диагностикумом, приготовленным по ранее описанному методу (Гарипова и др., 2005). Изоэлектрическое фокусирование связывающих инсулин фракций крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом проводили по ранее описанному методу (Гарипова и др., 1984) с использованием амфолинов фирмы Pharmacia (Швеция). Спектры поглощения выделенных фракций в ультрафиолетовой области получены при помощи Спектрофотометра СФ-123 (Россия). Расчет статистических ошибок, применение критериев сравнения и корреляционный анализ проводили с использованием статистического пакета Statistica for Windows версии 5,5

Результаты исследований и их обсуждение

Соотношение вкладов эритроцитарной и сывороточной систем в транспорт инсулина и ряда гормонов первой и второй групп. Проведено экспериментальное определение коэффициентов распределения между поверхностью эритроцитов и плазмой крови здоровых доноров инсулина и ряда гормонов первой и второй групп. Величина коэффициента распределения определялась двумя методами. В крови здоровых доноров коэффициент распределения рассчитывался как отношение концентрации гормона, элюированного с поверхности эритроцитов к его концентрации в плазме крови. Определение концентрации гормона проводили иммунолюминесцентным методом. Коэффициент распределения инсулина в крови больных сахарным диабетом и здоровых доноров определяли по соотношению активности пероксидазы, конъюгированной с инсулином, связанной с поверхностью эритроцитов, к её активности в плазме крови (*). Коэффициент распределения инсулина в крови здоровых доноров определен при использовании каждого из указанных методов. Сопоставление значений коэффициента распределения инсулина в норме, полученных двумя методами, показало, что использованные методы дают статистически тождественные результаты (0,49±0,0132 и 0,47±0.0159^*, табл. 1). Обследовано 100 здоровых доноров 20-35 лет.

Из данных таблицы 1, следует, что для всех исследованных гормонов второй группы (как простых белков, так и гликопротеидов), характерно резкое преобладание связанной с эритроцитами фракции гормона по сравнению с гормоном, присутствующим в плазме крови. Величина определенных в эксперименте коэффициентов распределения гормонов второй группы, за исключением инсулина, превышает 100. Очевидно, это свидетельствует, о наличии на поверхности эритроцитов специфических рецепторов к этим гормонам и о чрезвычайно низкой концентрации в плазме крови связывающих эти гормоны белков.

Установлено, что коэффициенты распределения гормонов первой группы (прогестерона, кортизола, трийодтиронина, тироксина) близки к 0 (таблица 1). Следовательно, гидрофобные гормоны транспортируются в основном плазмой крови, что согласуется с данными литературы о присутствии в плазме транспортирующих эти гормоны гликопротеидов (Godovac-Zimmermann ; 1988; Марри,1993; Kengni et.al., 2007).

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что в норме коэффициент распределения инсулина составляет 0,49±0,0053. Очевидно, это свидетельствует о том, что в отличие от других гормонов второй группы, инсулин доставляется к периферическим тканям при равноценном участии двух механизмов, характерных как для гормонов второй, так и первой групп.

Таблица 1. Распределение гормонов между поверхностью эритроцитов и плазмой крови здоровых доноров

Таким образом, согласно полученным данным, своеобразие транспорта инсулина, в сравнении с транспортом других белковых гормонов, заключается в том, что в него вносит значительный вклад система транспорта, типичная для гидрофобных гормонов - система транспортных белков плазмы крови.

Для выявления изменений в транспорте инсулина, происходящих при сахарном диабете, обследована группа 100 больных сахарным диабетом первого типа с неудовлетворительной компенсацией заболевания (процентное содержание фракции гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови обследованных в среднем составило 9,36±0,52%). Среднее значение коэффициента распределения инсулина между эритроном и плазмой в пробах крови больных диабетом составило 0,73±0,0065, то есть было достоверно выше аналогичного показателя, определенного в пробах крови здоровых доноров (таблица 1, t=2,176, p=0,036). На основании результатов сравнения коэффициентов распределения инсулина в норме и при сахарном диабете первого типа, был сделан вывод о том, что при диабете наблюдается достоверное увеличение вклада эритроцитарной системы в доставку инсулина к периферическим тканям. Увеличение эритроцитарного транспорта инсулина при сахарном диабете, вероятно, носит компенсаторный характер и обусловлено снижением его взаимодействия с транспортными белками крови. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами титрования активности связывающих инсулин сывороточных белков в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом, из которых следует, что связывание инсулина белками плазмы крови снижается при сахарном диабете первого типа (Гарипова и др., 2005).

Снижение роли сывороточного транспорта инсулина при сахарном диабете первого типа свидетельствует о необходимости изучения состава и свойств инсулин-транспортирующих белков. Наиболее полное выделение всего спектра взаимодействующих с инсулином белков крови возможно при использовании аффинной хроматографии. В предварительных экспериментах установлено, что аффинные сорбенты с инсулином, иммобилизованным на основе активированной бромцианом Сефарозы-4В, не позволяют выделить связывающие инсулин белки крови, свободные от примесей продуктов разложения полисахаридной матрицы. В связи с этим, на первом этапе исследований была поставлена задача разработать носитель для аффинной хроматографии, отличающийся повышенной стабильностью по сравнению с традиционно используемыми полисахаридными носителями.

Разработка носителя для аффинной хроматографии на основе поливинилового спирта. Выделение специфически взаимодействующих с инсулином белков крови с последующим определением их состава и структуры предъявляет повышенные требования к матрице аффинного сорбента, использованной для синтеза сорбента с иммобилизованным инсулином.

В 80-х годах 20 века коммерческие носители повышенной стабильности на основе поливинилового спирта были получены фирмой Toyo Soda и использованы для синтеза широкого спектра аффинных сорбентов и ионообменников (Matsumoto et al., 1982). Метод получения гелей поливинилового спирта с ковалентно сшитыми цепями, использованный фирмой Toyo Soda, в литературе не описан. В связи с этим, метод формирования геля поливинилового спирта и способ его активации разработаны в отдельной серии экспериментов (Гарипова и др., 1989, 1993, Гарипова 1998).

Формирование геля поливинилового спирта, устойчивого в широком диапазоне температур и рН, проводили за счет реакции внутримолекулярного ацеталирования гидроксильных групп полимера карбонильными группами, образовавшимися при окислении раствора поливинилового спирта натриевой солью перийодной кислоты. Ранее этот метод получения стабильного геля поливинилового спирта использовался в текстильной промышленности и для синтеза сорбентов не применялся (Ушаков, 1960). В качестве катализатора при проведении реакции ацеталирования применяли соляную кислоту и соли трехвалентного железа (Гарипова и др., 1993). Качество полученных гелей оценивали по гидродинамическим свойствам и проницаемости для белковых маркеров фирмы Serva.

Известно, что гель, полученный за счет реакции ацеталирования гидроксилов поливинилового спирта образовавшимися в результате окисления альдегидными группами, не является достаточно стабильным из-за обратимого перехода гель-золь (Matsumoto et al., 1982). Из этого вытекает необходимость дополнительной стабилизации геля, полученного этим методом, перед использованием его в аффинной хроматографии. В связи с этим, были испытаны два метода стабилизации гелей поливинилового спирта: за счет создания поперечных сшивок в реакции с эпихлоргидрином и глутаровым альдегидом. Условия стабилизации, необходимые для получения стабильного геля поливинилового спирта, выдерживающего кипячение при контрастных значениях рН, были подобраны экспериментально (табл. 2).

Таблица 2. Оптимизация стабилизации геля поливинилового спирта эпихлоргидрином и глутаровым альдегидом

*Эффективность стабилизации определяли в баллах (++++ - полученные гели выдерживают кипячение при крайних значениях рН; +++ - гели стабильны во всем диапазоне рН при нормальных условиях; ++ - гели нестабильны при крайних значениях рН, +- гели нестабильны во всем диапазоне рН).

Как следует из данных, приведенных в таблице 2, достаточная стабилизация геля происходит при использовании как глутарового альдегида, так и эпихлоргидрина. Полученные гели превосходят по стабильности широко используемые в аффинной хроматографии полисахаридные носители, так как выдерживают кипячение при крайних значениях рН. Однако, наиболее удобной оказалась стабилизация глутаровым альдегидом, так как в этом случае одновременно со стабилизацией происходит достаточная активация геля: в расчете на 1 мл геля в ходе реакции вводится 100 и более микромолей активных альдегидных групп, в то время как при использовании эпихлоргидрина в гель вводится не более 20 микромолей эпоксидных групп на 1 мл геля. Таким образом, использование метода формирования геля поливинилового спирта после его частичного окисления периодатом натрия в сочетании со стабилизацией полученного геля глутаровым альдегидом позволяет получить носитель для аффинной хроматографии, имеющий крупнопористую структуру, обладающий хорошими гидродинамическими свойствами, содержащий не менее 100 мкМ/мл активных альдегидных групп. Предложенный метод синтеза носителя для аффинной хроматографии защищен авторским свидетельством (Гарипова и др., Авторское свидетельство № 1789532 22.09.1992).

Для лабораторных исследований свойств полученного носителя получены аффинные сорбенты с иммобилизованным протеином А. Staphylococcus aureus, овальбумином и глобулиновой фракцией кроличьей антисыворотки к овальбумину (анти-ОВА). Проводили параллельное сравнение свойств сорбентов, полученных на основе предложенного носителя (Поливиналя) и бромциан-Сефарозы 4В фирмы Pharmacia fine chemicals (Швеция). Как следует из данных, приведенных в таблице 3, аффинные сорбенты на основе нового носителя обладают специфической емкостью, сравнимой с емкостью сорбентов на основе Сефарозы 4В, низким неспецифическим связыванием и лучшими, по сравнению с сорбентами на основе Сефарозы, гидродинамическими свойствами (Гарипова, 1998; Хайбуллина и др., 2003).

В условиях производства инъекционных препаратов интерферона проведено испытание иммуноаффинного сорбента на основе нового носителя с иммобилизованными антителами к примесям, подлежащим удалению из полуфабрикатов препарата. По результатам производственных испытаний, проведенных в Отделении интерферона Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, принято Дополнение к производственному регламенту “Лейкинферон для инъекций. Стадия ВР-5.4. Иммобилизация иммуноглобулинов” и получен Акт об использовании предложения.

Предложенный носитель был использован для иммобилизации инсулина в эксперименте по выделению связывающих инсулин белков крови человека. Для иммобилизации использован инсулин Хумулин Р фирмы Lilly из расчета 10 единиц гормона на 1 мл сорбента.

Таблица 3. Сравнение удельной емкости аффинных сорбентов на основе бромциан-Сефарозы 4В и Поливиналя

*- мг белка, элюированного с 1 мл сорбента;

**- бычий сывороточный альбумин (БСА);

***- процент от нанесенного количества БСА

Создание диагностической системы для определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека. Гликозилированная фракция гемоглобина является своеобразной “памятью” о среднем уровне гликемии за время жизни эритроцита, составляющем 2-3 месяца. Образование этой фракции обусловлено неферментативным связыванием глюкозы молекулами исходно негликозилированного гемоглобина за счет реакции между альдегидной группой глюкозы и аминогруппой гемоглобина (Guthrow et. al., 1979, Day et. al., 1980, Higgins et.al., 1982, Hubbuch, 1985, Morris et. al., 1985, Мазовецкий, 1991). Существует ряд методов определения процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина. Наиболее популярными из них являются ионообменная хроматография (Hubbuch, 1985), аффинное определение на сорбенте с иммобилизованной фенилбороновой кислотой (Dean et. al., 1980) и колориметрическое определение с тиобарбитуровой кислотой (Guthrow et. al., 1979). В 80-х годах двадцатого века фирма Pierce Chemical Company начала выпуск диагностического набора, содержащего микроколонки с аффинным сорбентом, представляющим собой мета-аминофенилбороновую кислоту (м-АФБК), иммобилизованную на 6% агарозе. Принцип аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина основывается на свойстве фенилбороновой кислоты избирательно связывать молекулы, содержащие цис-диольную группировку, в том числе, гликозилированный гемоглобин (Weith et. al.,1970, Okayama et. al., 1978, Reed et. al., 1986). Набор содержит 25 колонок, каждая из которых рассчитана на 3-6 определений. Небольшое количество достоверных определений, которое можно провести на одной колонке фирмы Pierce Chemical Company объясняется недостаточной стабильностью использованного при синтезе аффинного сорбента носителя. Для повышения количества достоверных определений гликозилированной формы гемоглобина на одной микроколонке с аффинным сорбентом, проведена иммобилизация м-АФБК на носителе Поливиналь. Полученный сорбент с иммобилизованной аминофенилбороновой кислотой использован в диагностической системе для аффинного определения гликозилированной формы гемоглобина в капиллярной крови человека (Гарипова, 1996). Предложенная диагностическая система является аналогом диагностической системы фирмы Pierce Chemical Company. Для количественного определения гликозилированной формы гемоглобина использована методика определения, рекомендованная фирмой Pierce Chemical Company с некоторыми изменениями. Клинические испытания предложенной диагностической системы, проведенные в клинико-диагностических лабораториях больниц г. Уфы, показали, что при ее использовании ошибка определения не превышает 5% (табл. 4). За счет повышенной стабильности аффинного сорбента, использование новой диагностической системы позволило увеличить количество определений процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина в пробе с 3-6 (при использовании набора фирмы Pierce Chemical Company) до 20.

Таблица 4. Вариабельность определения гликозилированного гемоглобина на протяжении 20 циклов использования сорбента Поливиналь-мета-АФБК

В лаборатории клинической биохимии Эндокринологического научного Центра РАМН проведено параллельное определение процентного содержания гликогемоглобина с использованием предложенного аффинного сорбента и определение основной фракции гликозилированного гемоглобина Нв А _1с методом высокоэффективной ионообменной хроматографии при помощи хроматографа AUTO A1CTMHA (фирма Kyoto Kagaku Co, LTD, Япония). Коэффициент корреляции между полученными значениями показателей составил +0,95, р=0,0136.

Обследовано 380 больных сахарным диабетом и 125 больных с другими диагнозам. Установлена положительная корреляция среднего значения гликемии натощак при взятии крови 2 раза в неделю в течение месяца со значением процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина (% Ггб), определенным в конце этого периода. Коэффициент корреляции между средними значениями гликемии натощак за один месяц наблюдения и %Ггб, определенным в конце периода наблюдения, составил +0,945,p=0,0001 (рис. 1) .

Рис. 1. Взаимосвязь среднего за период наблюдения значения гликемии и процентного содержания гликозилированной формы гемоглобина, определенного в конце периода наблюдения (r=+0,945, p=0,0001).

Таким образом, в ходе клинических испытаний диагностической системы на основе предложенного аффинного сорбента, показано, что полученные значения % Ггб соответствуют клинической картине течения заболевания и динамике гликемии. Установлено, что при оценке полученных результатов следует использовать критерии, предложенные А. Habbuch и соавторами (Habbuch, 1985).

Использование предложенной диагностической системы позволило провести объективную оценку состояния углеводного обмена обследуемых при формировании групп здоровых доноров и больных сахарным диабетом в стадии декомпенсации заболевания при изучении инсулин-транспортирующих систем крови человека.

Сравнение инсулинсвязывающей активности плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. На первом этапе изучения транспорта инсулина в плазме крови проведено сравнение количества связывающих инсулин белков плазмы крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом первого типа. Количественное определение белков сыворотки, специфически связывающих инсулин, проводили методом титрования в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитами барана, сенсибилизированными инсулином. Эритроциты сенсибилизировали инсулином из расчета 0,4мг гормона на 1 мл 50% стабилизированных формалином эритроцитов по методике, описанной ранее (Гарипова и др., 2005; 2007).

Показано, что в сыворотках крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом присутствуют компоненты, агглютинирующие эритроциты барана, сенсибилизированные инсулином. Агглютинация происходила только при введении в реакционную среду ионов цинка и специфически подавлялась при добавлении в реакционную среду свободного инсулина. Внесение в рабочий буферный раствор эквимолярных количеств солей кальция и магния не замещало действия ионов цинка. Агглютинация несенсибилизированных эритроцитов не выявлена.

Как следует из данных, приведенных в таблице 5, средний логарифм титра (log₂) связывающих инсулин белков в плазме крови здоровых доноров составляет 6,980,61, по сравнению 3,860,47 в крови больных сахарным диабетом. Следовательно, концентрация связывающих инсулин белков плазмы крови здоровых доноров достоверно выше, чем в крови больных сахарным диабетом первого типа (t=5,76; p=0,0023, n=64).

Таблица 5. Результат титрования инсулинсвязывающей активности сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом

Хроматографическое выделение и анализ гетерогенности связывающих инсулин компонентов сыворотки человека. На основании результатов сравнения концентраций специфичных к инсулину белков в крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом, высказано предположение о том, что аффинные к инсулину белки плазмы крови играют важную роль в доставке инсулина к тканям и снижение их титра в крови больных диабетом связано с формированием заболевания. На втором этапе исследований проведено выделение специфичных к инсулину белков из сывороток крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом на сорбенте с иммобилизованным инсулином, синтезированным на основе Поливиналя. Для изучения роли ионов цинка в формировании комплекса инсулина с белками плазмы, аффинную хроматографию проводили в присутствии (опыт) и в отсутствии (контроль) ионов цинка в буфере связывания. В опытной серии в состав 0,01М фосфатного буфера рН 7,2, содержащего 0,14 М хлорида натрия вводили 0,007 мМ хлорида цинка. Как следует из хроматограмм, приведенных на рисунке 2, связывание сывороточных транспортных белков с иммобилизованным инсулином происходит только в том случае, если в состав буфера связывания входят ионы цинка. При добавлении эквимолярных количеств хлорида кальция и магния связывания сывороточных белков с сорбентом не происходило.

ОП₂₈₀

v (мл)

Рис. 2. Влияние ионов цинка на эффективность взаимодействия транспортных белков крови с инсулином. Хроматограммы выделения инсулинсвязывающих компонентов сывороток здоровых доноров на сорбенте с иммобилизованным инсулином а) в присутствии ионов цинка в буфере связывания; б) в отсутствии ионов цинка в буферном растворе. I - сорбат; II - элюат.

В выделенных аффинно фракциях связывающих инсулин белков, полученных из 1 мл сывороток здоровых доноров, содержание белка составило 0,062±0,003 мг/мл. В аналогичных фракциях, выделенных из сывороток крови больных сахарным диабетом, концентрация связывающих инсулин белков была достоверно ниже - 0,042±0,0025 мг/мл (t=4,35; p=0,008). Таким образом, в пробах, выделенных аффинно на иммобилизованном инсулине из сывороток здоровых доноров, количество связывающих инсулин белков достоверно выше, чем в пробах больных сахарным диабетом. Полученные данные согласуются с результатами титрования инсулинсвязывающей активности исследованных сывороток (табл. 5).

Сравнительный анализ состава связывающих инсулин фракций сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом. При сравнении спектров поглощения в ультрафиолетовой области выделенных аффинно связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом установлено, что пробы, выделенные из крови больных сахарным диабетом, имеют более выраженное поглощение в области 260 нм (рис. 3).

ОП

Рис. 3. Спектры поглощения в ультрафиолетовой области связывающих инсулин фракций 1-здоровых доноров, 2- больных сахарным диабетом.

Соотношение оптических плотностей в области 260 и 280 нм (ОП₂₆₀/ОП₂₈₀ ) в пробах больных сахарным диабетом составило 1,209±0,042 по сравнению с 1,095±0,034 в норме. Проведение качественных реакций, выявляющих нуклеиновые кислоты и их компоненты, показало, что в связывающих инсулин фракциях плазмы крови эти соединения отсутствуют. В связи с этим было высказано предположение о том, что для инсулинсвязывающих белков больных сахарным диабетом характерно более высокое содержание углеводов.

Для оценки молекулярного веса и степени гетерогенности веществ, формирующих комплекс с инсулином, полученные пробы были разделены гельхроматографией на колонке с Сефадексом G-75, откалиброванной при помощи маркеров молекулярного веса фирмы Serva (Швеция). Гельхроматографию проводили при рН 2,8 (элюаты без нейтрализации) и при физиологическом значении рН. Как следует из хроматограммы, приведенной на рисунке 4 (I) , при рН 2,8 связывающие инсулин компоненты разделились по молекулярному весу на два пика. Первый пик имеет объем выхода, соответствующий молекулярному весу около 100 тысяч дальтон, и, вероятно, представлен сывороточными глобулинами. Соотношение ОП₂₆₀/ ОП₂₈₀ этой фракции в норме составило 1,109, что свидетельствует о высоком содержании углеводов в веществах, формирующих эту фракцию. Второй пик представлен соединениями, молекулярный вес которых близок к 50 тысячам дальтон. Соотношение ОП₂₆₀/ ОП₂₈₀ , равное 0,98 свидетельствует о меньшем содержании углеводов в этой фракции. Таким образом, данные гельхроматографии на Сефадексе-G-75 свидетельствуют о гетерогенности сывороточных компонентов, формирующих специфические комплексы с инсулином.

При хроматографии на той же колонке проб, полученных методом аффинной хроматографии после плавного доведения рН до 7,2, получен один пик, имеющий молекулярный вес более 100 тысяч Д. Вероятно, это свидетельствует о том, что при физиологических значениях рН связывающие инсулин белки ассоциируют, формируя единый комплекс (рисунок 4 II).

Для оценки степени гетерогенности и идентификации в пробах известных транспортных веществ сыворотки крови по их электрофоретической подвижности, проведено электрофоретическое разделение полученных аффинно проб при рН 8,6 на ацетатцеллюлозных пленках. В таблице 6 приведен фракционный состав связывающих инсулин белков крови здоровых доноров и больных сахарным диабетом.

III

Рис. 4. Оценка гетерогенности связывающих инсулин белков крови методом гельхроматографии. Хроматограммы разделения инсулинсвязывающих белков, выделенных из сыворотки здорового донора ( ) и больного диабетом - ( ), на сефадексе G-75. I - при рН 2,8; II - при рН 7,2.

Как следует из данных, приведенных в таблице 6, в связывающих инсулин белках сывороток больных сахарным диабетом в 2 раза больше -глобулинов (411,83%) по сравнению с их количеством в связывающих инсулин белках здоровых доноров (210,95%). Возможно, это обусловлено повышенным содержанием специфичных к инсулину антител в крови больных сахарным диабетом. Полученные результаты согласуются с данными литературы о появлении в крови больных сахарным диабетом антител к инсулину (Atkinson et al., 1990). Присутствие в составе связывающих инсулин белков значительного количества -глобулинов может свидетельствовать о том, что выделенная инсулин - связывающая фракция представлена иммунными комплексами. Для проверки этого предположения, провели рехроматографию выделенных фракции на сорбенте с иммобилизованным протеином А золотистого стафилококка, специфически связывающим иммуноглобулины. Как следует из хроматограмм, приведенных на рисунке 5, связывающие инсулин белки крови содержат две фракции: взаимодействующую (2) и не взаимодействующую (1) с протеином А.

Таблица 6. Относительное содержание (%) белковых фракций связывающих инсулин белков крови, полученное методом электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках

Содержание фракций в инсулинсвязывающих белках крови (%) I - здоровых доноров; II - больных сахарным диабетом;

Взаимодействующая с протеином А фракция инсулинсвязывающих белков здоровых доноров составляет не более 20% от их общего содержания, в то время как в пробах инсулинсвязывающих белков больных сахарным диабетом она достигает 50% (различие доказано с использованием критерия Стьюдента, t=3,43; p=0,028). Вероятно, эта фракция представлена иммунными комплексами. Фракция невзаимодействующих с протеином А белков, вероятно, представляет собой белки крови, осуществляющие транспорт инсулина.

Обращает на себя внимание тот факт, что в норме значительная часть связанного с инсулином белка сыворотки (25,91,75%, табл. 6) представлена альбумином, или белком, имеющим ту же электрофоретическую подвижность.

Рис. 5. Выделение иммунных комплексов из связывающих инсулин белков здоровых доноров на протеине А Staphylococcus аureus. I - первый цикл выделения взаимодействующей с протеином А фракции; II - рехроматография сорбата, полученного в первом цикле. 1 -сорбат, 2- элюат, содержащий иммунные комплексы.

При сахарном диабете первого типа этот транспортный белок в связывании с инсулином участия не принимает: в комплексе связывающих инсулин веществ, выделенном из сывороток больных сахарным диабетом альбумин не выявлен. Электрофоретически наиболее подвижной фракцией связывающих инсулин гликопротеинов больных сахарным диабетом является ₁-глобулин, содержание которого составило 21,51,12%. В нормальных сыворотках инсулинсвязывающие вещества с этой электрофоретической подвижностью отсутствуют.

В инсулинсвязывающей фракции здоровых доноров выявлено примерно двукратное превышение содержания фракции с подвижностью ₂-глобулина по сравнению со связывающей инсулин фракцией больных сахарным диабетом (32,21,54% по сравнению с 18,11,07%, табл. 6). Различие связывающих инсулин компонентов сывороток здоровых доноров и больных сахарным диабетом в содержании -глобулина оказалось не достоверным (20,81,26% в пробах здоровых доноров по сравнению с 18,91,07% в пробах больных сахарным диабетом).

На основании анализа электрофореграмм было сделано предположение о присутствии в пробах связывающих инсулин белков здоровых доноров альбумина и транспортных белков крови с подвижностью ₂ -глобулинов и -глобулинов. Кроме того, было высказано предположение о том, что связывающие инсулин фракции больных сахарным диабетом содержат белки острой фазы воспалительной реакции, обладающие подвижностью ₁-глобулинов, и транспортные белки с подвижностью -глобулинов. Для проверки высказанных предположений использованы методы иммуноферментного анализа и иммунонефелометрии.

Методом иммуноферментного анализа установлено, что в пробах здоровых доноров содержится 0,015±0,0007 мг/мл альбумина, во фракциях связывающих инсулин белков крови больных диабетом этот транспортный белок не выявлен, что согласуется с данными электрофоретического разделения полученных проб. По данным иммуноферментного анализа, пробы, выделенные из крови здоровых доноров содержат 6,7±0,3 нг/мл -фетопротеина - гликопротеина крови с подвижностью -глобулинов с доказанной транспортной, иммуномодулирующей и детоксицирующей функцией (Parmelee et. al., 1978; Hirohashi et. al., 1979; Savu et. al., 1981; Tyner et. al., 1990; Melbye et. al., 2000; Smith et.al., 2006; Mizejewski et. al., 2007). Присутствие -фетопротеина в пробах, выделенных из крови больных сахарным диабетом не выявлено. Методом иммунонефелометрии в пробах связывающих инсулин белков больных диабетом и здоровых доноров обнаружен трансферин - транспортный белок крови с подвижностью -глобулинов, что согласуется с результатами Н.К. Грачевой и соавторов (1972). Достоверных различий содержания трансферина в пробах больных сахарным диабетом и здоровых доноров не выявлено. Трансферин, согласно современным представлениям, относится к классу липокалинов и принимает участие в транспорте широкого спектра биологически активных соединений (Flower et al., 1996). При помощи метода иммунонефелометрии также показано, что в выделенных аффинным методом комплексах связывающих инсулин белков сыворотки крови больных сахарным диабетом присутствует белок острой фазы воспалительной реакции - ₁-кислый гликопротеин (орозомукоид). В норме ₁-кислый гликопротеин содержится в связывающих инсулин фракциях лишь в следовых количествах.