71

Размещено на http://www.allbest.ru/

Получение антигенов и использование их для разработки средств диагностики и профилактики вирусных инфекций

03.01.06 - биотехнология

03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Агафонов Александр Петрович

Новосибирск, 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Дроздов Илья Геннадиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Аликин Юрий Серафимович

доктор медицинских наук, профессор Носик Дмитрий Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Трунов Александр Николаевич

Ведущая организация

Филиал Федерального Государственного Учреждения "48 Центрального Научно-Исследовательского Института Министерства Обороны Российской Федерации" - "Вирусологический Центр", Московская область, г. Сергиев Посад-6

Защита состоится " 24 " декабря 2010 г. в______часов на заседании диссертационного совета Д. 208.020.01 при ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор"

Автореферат разослан "____"______________2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д. б. н. Г.П. Трошкова

Общая характеристика исследования

Определение чувствительности культур клеток к вирусу Марбург

* титр вируса определен при внутрибрюшинном заражении морских свинок.

Таблица 2

Динамика накопления вируса Марбург в КВЖ при культивировании на монослойных культурах клеток ДК-58 и Л-68

* титр вируса определен при внутрибрюшинном заражении морских свинок.

Показано, что штамм Рорр вируса Марбург эффективно нарабатывается на использованных культурах клеток. Для дальнейшей работы была выбрана культура Л-68, которая решением ГИСК им. Л.А. Тарасевича от 09.06.87г. была рекомендована как возможный субстрат для производства медицинских иммунобиологических препаратов. Максимальных значений титр вируса достигал на 3-и сут после заражения и составлял 7,58 + 0,33 lg ЛД₅₀/мл. Проверка показала, что после смены питательной среды на 3 сут концентрация вируса в КВЖ на 5-й день вновь достигала высоких значений (7,2 lg ЛД₅₀/мл). После второй смены среды на 5-е сут и сбора КВЖ на 7-е сут вирус накапливается в КВЖ в меньших количествах (6,0 lg ЛД₅₀/мл). Исходя из результатов исследования, дальнейшее накопление вируса проводили на монослое клеток Л-68 с множественностью заражения 0,1 ЛД₅₀/кл., на однолитровых культуральных сосудах, используя двойной слив КВЖ.

Для получения препаратов белков NP и VP40 вируса Марбург использовали хроматографическое (ВГЖХ) фракционирование на колонке с носителем полисил-500-ОДС (рис.2). Препараты рекомбинантных белков GP и VP24 были любезно предоставлены д-ром S. Becker (Институт вирусологии, Марбург, Германия). В качестве препарата сравнения использован концентрированный очищенный инактивированный вирус Марбург, полученный по технологии, описанной в патенте RU 2029561 С1.

Изучение гуморального ответа на введение препаратов показало, что рекомбинантный белок GP, полученный в бакуловирусной системе, вызывал индукцию специфических антител в наибольших титрах как при иммунизации мышей, так и при иммунизации морских свинок (рис.3). Специфический клеточный ответ, изучаемый методом РБТЛ, регистрировался у животных только при введении белков NP и GP вируса Марбург. Иммунизация белком NP обеспечивала максимальную защиту морских свинок от введения летальных доз вируса Марбург - коэффициент защиты при введении дозы вируса Марбург 50 ЛД₅₀ равнялся 70+14 %. Для препарата белка VP40 уровень защиты составлял 16+8 %, для препарата белка VP24 - 14+4 %, а для препарата белка GP - 26+6 %.

Рис.2. Профиль элюции белков вируса Марбург (А) и электрофореграммы фракций, выделенных в 12% ПААГ белков NP и VP40 вируса Марбург (Б). Дорожка 1 - фракция, содержащая белок NP, дорожка 2 - фракция, содержащая белки NP и VP40, дорожка 3 - фракция, содержащая VP40, дорожка 4 - электрофорез очищенного вируса Марбург.

Рис.3. Формирования гуморального ответа у морских свинок после однократного (А) и двукратного на 0 и 14 сут (Б) введения препаратов белков вируса Марбург.

Таблица 3

Изучение протективной активности белков вируса Марбург при введении белка в дозе 20 мкг/ животное и дозе активного вируса Марбург для заражения 50 ЛД₅₀/животное

* - введение с интервалом 16 сут,

** - не исследовали,

GP (б) - препарат рекомбинантного белка GP, полученный в бакуловирусной системе,

GP (ВОВ) - рекомбинантный белок GP в составе осповакцины.

Таким образом, были получены и изучены иммунологические свойства препаратов четырех структурных белков вируса Марбург. На основе полученных экспериментальных данных может быть оценен возможный вклад каждого из изученных белков в формирование иммунного ответа против геморрагической лихорадки Марбург.

Разработка средств профилактики кори. Вакцина против кори в связи с принятием программы по элиминации этого заболевания, остро востребована. В настоящее время все производители выпускают живую вакцину для парентерального использования. Стратегия вакцинации, позволяющая индуцировать формирование барьерного иммунитета на слизистых оболочках, могла бы быть более эффективной при защите от кори.

Работа по изучению возможности получения эффективной пероральной формы вакцины проведена на двух видах животных кроликах и обезьянах. У животных после иммунизации оценивали показатели гуморального и клеточного иммунитета. Иммунизированные обезьяны кроме этого были заражены диким штаммом вируса кори. На модели кроликов показали принципиальную возможность создания вакцины против кори для перорального применения, а на модели обезьян подтвердили, что вирус при внесении в просвет кишечника, может вызвать формирование гуморального и клеточного иммунного ответов (табл.4).

Таблица 4

Изучение иммуногенных и протективных свойств живой коревой вакцины при пероральном применении в дозе 10^3,5 ТЦД₅₀/животное

* - показатель не изучался.

При заражении иммунизированных обезьян диким штаммом BIL вируса кори обнаружено, что вирус в лаваже и мононуклеарных клетках крови определялся только у контрольной обезьяны и у трех обезьян, у которых согласно приведенным в таблице 3 данным не был сформирован иммунный ответ. Обе обезьяны, вакцинированные внутримышечно, и одна из обезьян, которым вирус был введен в просвет тонкого отдела кишечника, оказались защищены от заражения.

В другой серии экспериментов был сконструирован и проверен вариант кандидатной ДНК-вакцины против кори, представляющий собой рекомбинантную плазмиду, содержащую встройку гена гемагглютинина вируса кори и включенного в ВПЧ (рис.4). Такого рода вакцина может быть востребована для иммунодефицитных пациентов, которым нельзя вводить аттенуированный вирус или для вакцинопрофилактики заболевания на поздних этапах выполнения программы элиминации кори.

Рис.4. Изучение гуморального (А) и клеточного (Б) ответа у мышей, 3-кратно иммунизированных вариантом кандидатной ДНК-вакциной против кори (стрелками обозначены сроки иммунизации).

Как следует из рисунка 4А, трехкратное введение препарата приводило к появлению общих и нейтрализующих антител в сыворотке крови мышей. Формирование гуморального иммунитета в ответ на введение кандидатной ДНК-вакцины подтверждено Вестерн-блот анализом. У иммунизированных препаратом ДНК-вакцины животных формировался также специфический клеточный ответ (рис.4Б), изученный с использование РБТЛ и метода ELISPot.

Таким образом, обоснована перспективность двух направлений в разработке новых вакцин против кори: первое - возможность создания более безопасного с точки зрения применения и экономически выгодного, с точки зрения обеспечения процесса вакцинации, препарата. Второе - возможность создания профилактического противокоревого препарата на основе реплицирующегося вектора, включенного в ВПЧ, альтернативного живой аттенуированной вакцине.

Получение антигена вируса кори и разработка средств диагностики на его основе. Тест-система для выявления антител класса М к вирусу кори необходима при ранней диагностики заболевания, а для антител класса G - для подтверждения диагноза, и для проведения серомониторинга.

Для разработки иммуноферментной тест-системы использовали референс-штамм Эдмонстон и штамм NovО96, выделенный во время вспышки кори в детском доме в Новосибирске. Проведение электронно-микроскопических исследований зараженных клеток Vero выявило репродукцию парамиксовируса. Инфицированные клетки содержали типичные для парамиксовирусов скопления трубчатых нуклеокапсидов, а на поверхности цитоплазматических мембран наблюдалось формирование вирусных частиц. В целом ультраструктурное строение вируса кори соответствовало описанному в литературе для парамиксовирусов (Scheid А., 1987). Вирус кори был очищен центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (10-60 %). После ультрацентрифугирования собранные фракции были изучены в реакции гемагглютинации с эритроцитами обезьяны Macaca mulatta; показано наличие гемагглютинирующей активности в двух фракциях (рис.5, А). При электронно-микроскопическом исследовании в очищенных препаратах обнаружены вирусные частицы и нуклеокапсиды с характерной для вируса кори структурой. Вирусные частицы различались по форме и размерам. Электрофоретический анализ препаратов в ПААГ (рис.5, Б) выявил высокую степень очистки вируса - 70-75 %. Видовая принадлежность штамма подтверждена в иммуноблоте (рис.5, В): антитела из сыворотки реконвалесцента (пациента с клиническим диагнозом "корь", подтвержденным лабораторными методами) связывались с белками NP и F вируса кори.

Рис. 5. Получение и изучение антигена вируса кори. (А) - Анализ фракций вируса кори после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в РГА. (Б) - Электрофорез белков вируса кори, шт. Эдмонстон. Дорожка 1 - маркеры мол. весов: 205, 116, 97, 84, 66, 55, 45, 36, 29, 24, 20, 14.2, 6.5 кД. Дорожка 2 - белки вируса кори. (В) - Вестерн-блот-анализ. Дорожка 1 - стрип обработан сывороткой человека с клиническом диагнозом корь, подтвержденным лабораторно (разведение 1: 500). Дорожка 2 - стрип обработан сывороткой человека, не имеющего антител к вирусу кори (разведение 1: 100). Стрелками указаны: белок NP (верхняя) и F (нижняя) вируса кори.

Для получения антигена использовали смесь фракций, собранных с градиента плотности сахарозы после ультрацентрифугирования. Фракции, содержащие очищенный вирус, смешивали с фракциями, содержащими нуклеокапсиды вируса в пропорции 1: 3. Используя полученный антиген, были подобраны условия проведения ИФА, оптимизированы концентрации основных компонентов тест-системы и сроки хранения. Оптимальная концентрация антигена составила 5 мкг/мл.

Проверка антигенных свойств штамма NovО/96 выявила существенное сходство с референс-штаммом Эдмонстон и с вакцинным штаммом Л-16 вируса кори (табл.5). Сыворотки, полученные от 6 иммунизированных очищенным вирусом кори, штамм Эдмонстон, мышей линии BALB/c, и сыворотки, полученные от 6 иммунизированных очищенным вирусом кори, штамм NovО/96, мышей линии BALB/с, были исследованы в ИФА и РТГА. Сыворотки от всех иммунизированных вирусом кори, штамм Эдмонстон, мышей реагировали как со штаммами Эдмонстон и Л-16, так и со штаммом NovО/96. С другой стороны, сыворотки от всех мышей, иммунизированных штаммом NovО/96, реагировали как с самим штаммом NovО/96, так и со штаммами Эдмонстон и Л-16 (см. табл.5).

Таблица 5

Изучение антигенных свойств вируса кори штамм NovO/96

Таким образом, штамм NovО/96 по антигенным свойствам близок к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16. Исходя из более высокой продуктивности штамма NovO/96 и близости к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16 по антигенным свойствам, штамм NovO/96 был использован для получения антигена ИФА-тест-системы, которая позволила эффективно выявлять антитела к вирусу кори как у переболевших, так и у вакцинированных лиц.

Лабораторные варианты тест-системы использовали для изучения иммунного статуса различных возрастных групп населения Новосибирска в отношении вируса кори. В период с апреля по октябрь 2003 года с целью определения специфических антител к вирусу кори были собраны образцы сывороток крови 364 здоровых доноров, проживающих на территории Новосибирска и в РТГА, РН и методом ИФА изучено содержание в них антител к вирусу кори (рис.6 и табл.6).

Рис.6. Изучение иммунного статуса у представителей различных возрастных групп населения Новосибирска в отношении вируса кори. По оси абсцисс: Количество отрицательных и положительных сывороток в возрастной группе, а также сывороток, содержащих протективные титры антител (%). По оси ординат: Возрастные группы (лет).

Таблица 6

Соотношение совпадения результатов определения антител к вирусу кори в сыворотках крови доноров Новосибирска методами ИФА, РТГА и РН

В соответствии с рекомендациями ВОЗ, все доноры, принимавшие участие в исследовании, были разделены на следующие возрастные группы:

· дети 3 - 4 года - вакцинированы в возрасте 1 года живой коревой вакциной (70 сывороток);

· дети 9 - 10 лет - вакцинированы в возрасте 1 года и ревакцинированы в 6 лет живой коревой вакциной (50 сывороток);

· подростки 16 - 18 лет - вакцинированы в возрасте 1 года и ревакцинированы в 6 лет живой коревой вакциной (72 сыворотки);

· доноры возраста 20 - 25 лет - без учета сведений о прививочном анамнезе (71 сыворотка);

· доноры возраста 30 - 35 лет - без учета сведений о прививочном анамнезе (46 сывороток);

· доноры старше 38 лет - не вакцинированы, без учета сведений о заболевании корью в анамнезе (55 сывороток).

В результате проведенных исследований выявлена возрастная категория доноров с низкими или отрицательными значениями титров противокоревых антител 20-25 лет. Кроме этого установлена не только выраженная корреляция между методами ИФА и РТГА, но и между методами ИФА и РН, что особенно важно, потому что ранее для доказательства наличия протективного иммунитета к кори проводили определение нейтрализующих антител в РН.

Известно, что РТГА является "золотым стандартом" определения антител к вирусу кори и давно используется для серомониторинга. Для доказательства возможности полноценной замены этого метода методом ИФА проведено их сравнение. В эксперименте были исследованы сыворотки, полученные от детей, вакцинированных живой коревой вакциной. Для определение противокоревых антител использовали стандартную РТГА и 3 лабораторные серии ИФА-тест-системы для выявления антител класса G к вирусу кори (табл.7). Коэффициенты корреляции величин титров антител в исследуемых сыворотках, определенных с помощью ИФА для 1, 2 и 3 серии тест-системы, с РТГА составили соответственно +0,87, +0,86, +0,89. Такая корреляция свидетельствует о высокой степени связи между показателями (Рокицкий П.Ф., 1961). Таким образом, использование ИФА позволили с большей чувствительностью выявлять антитела к вирусу кори в сыворотках крови людей, чем это возможно в РТГА. Учитывая высокие значения коэффициента корреляции между методом ИФА и РТГА, тест-системы на основе иммуноферментного анализа могут успешно использоваться для серомониторинге кори.

Для оценки качества используемых в России тест-систем для определения антител класса G к вирусу кори была разработана и аттестована стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к вирусу кори "Стандарт АТ-G (+/-) корь". Панель была сформирована таким образом, чтобы сыворотки, вошедшие в нее, не содержали белки ВИЧ и антитела к белкам ВИЧ, НВs-антиген, антитела к вирусу гепатита С. Шесть сывороток не содержали антитела класса G к белкам вируса кори, при этом две из них содержали антитела к основным специфическим белкам вируса краснухи, а две - аутоантитела, явившиеся причиной экзантемы их доноров. Одиннадцать сывороток содержали антитела к белкам вируса кори, их специфическая активность установлена в РТГА и РН. Для этих сывороток специфическая активность противокоревых IgG определена в международных единицах на мл (МЕ/мл). Замена понятия "титр" на понятие "специфическая активность, МЕ/мл" в широкой международной практике была предпринята ВОЗ для стандартизации серологических методов определения противокоревых антител. По заказу ВОЗ Национальным институтом биологических стандартов и контролей Великобритании в 1990 году был разработан первый Международный стандарт противокоревой сыворотки ("1^st International Standard, 1990, Anti-Measles antibody 66/202, 5 International Units per ampoule" (World Health Organization, WHO International Laboratory for biological standard, Hertfordshire, EN63QG, England). Каждая ампула с лиофильно высушенным пулом сывороток содержит 10 МЕ противокоревых антител.

Таблица 7

Сравнительные испытания трех лабораторных серий иммуноферментной тест-системы для определения антител к вирусу кори в сыворотках крови людей

* - сыворотки от переболевших пациентов с лабораторно подтвержденным диагнозом корь.

Приготовленная нами панель была откалибрована по этому стандарту при соблюдении условий рекомендованного ВОЗ и утвержденного национальным контрольным институтом ГИСК им. Л.А. Тарасевича теста на параллелизм и линейность для медицинских иммунобиологических препаратов. Панель была аттестована как "Отраслевой Стандартный Образец стандартной панели сывороток крови человека, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к вирусу кори" (ОСО 42-28-394-07).

Первые опытно-промышленные серии тест-системы были использованы для оценки параметров серийного продукта. С помощью РТГА были отобраны 76 отрицательных (титр ?1: 2) и 236 положительных (титр ?1: 4) сывороток, среди которых 134 сыворотки имели протективный титр (титр ?1: 8). Результаты сравнительных постановок в ИФА показали, что чувствительность и специфичность тест-системы "Корь-IgG-ДС" не уступает тест-системе "Enzygnost^® Anti-Measles-Virus/IgG" (Dade Behring, ФРГ) и превышает аналогичные показатели тест-системы "Measles IgG ELISA" (Wampole Laboratories, США). Чувствительность тест-системы "Корь-IgG-ДС" составила 98,7 %, специфичность - 96,2 %.

Европейское региональное бюро ВОЗ организовало тестирование тест-системы "Корь-IgG-ДС" в глобальной сети лабораторий Всемирной организации здравоохранения, которое было проведено в 2004-2005 гг. в НИИ эпидемиологии и микробиологии (Минск, Республика Беларусь) и Национальной лаборатории здравоохранения (Ньюфаундленд, Канада). В заключительном отчете показано соответствии результатов тестирования "Корь-IgG-ДС" в сравнении с национальными эталонами при анализе охарактеризованных панелей сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к вирусу кори. Сделан вывод о полной пригодности тест-системы "Корь-IgG-ДС" для оценки иммунитета к вирусу кори. Государственные испытания в ГИСК имени Л.А. Тарасевича подтвердили эффективность разработанной иммуноферментная тест-система "Корь - IgG-ДС" и она была разрешена для использования на территории Российской Федерации (ФСП 42-0155-7032-05).

Используя высокоспецифичный иммуносорбент, а также рабочую панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса М к вирусу кори, была разработана ИФА-тест-система для ранней диагностики заболевания. Для панели были отобраны положительные по наличию IgM образцы сывороток больных корью и краснухой с использованием рекомендованной ВОЗ и МЗ и СР РФ коммерческой ИФА тест-ситемы "Enzygnost Anti-Measles-Virus/IgМ" (Dade-Behring, ФРГ). В результате отбора сывороток, подходящих по специфичности, качеству и объемам материала, была сформирована рабочая панель из 16 образцов. Оптимизация тест-системы проходила в 3 этапа: сначала было определено конечное разведение образцов в лунках иммуносорбента, затем была подобрана оптимальная концентрация антигена. Оптимальный титр конъюгата анти-IgM человека с пероксидазой хрена в растворе конъюгата был определен, исходя из установленных первых двух параметров. На третьем этапе главным критерием было достижение 100 % специфичности тест-системы (отсутствие ложноположительного сигнала) с обязательным учетом параметра чувствительность (выявляемость положительных образцов). Примененный алгоритм оптимизации параметров тест-системы позволил добиться 100 % чувствительности и специфичности на охарактеризованной панели сывороток.

Таким образом, в результате проведенных исследований созданы два диагностических препарата, позволяющих выявлять антитела классов G и M к вирусу кори. Препараты успешно прошли испытания на национальном и международном уровнях и показали высокую чувствительность и специфичность в сравнении с лучшими зарубежными аналогами. Для корректного сравнительного испытания разработанных тест-систем была получена панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к вирусу кори "Стандарт АТ-G (+/-) корь" (ОСО 42-28-394-07), специфическая активность сывороток в которой выражается в международных единицах. На базе ЗАО "МБС" было налажено производство промышленных серий тест-систем "Корь - IgG-ДС" и "Корь-IgМ", которые были успешно применены для выполнения национальной программы элиминации кори.

Получение антигена вируса паротита и разработка средств диагностики на его основе. Для разработки иммуноферментной тест-системы были использованы референс-штамм Эндерс и штамм Драгун, выделенный при вспышке заболевания эпидемическим паротитом в р. п. Кольцово Новосибирской области в январе-июне 1994 года. Вирус паротита был очищен ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы из КВЖ и лизата зараженных клеток. Фракции, собранные с градиента плотности сахарозы после ультрацентрифугирования, были изучены в реакции гемагглютинации с эритроцитами обезьяны Macaca mulatta. Вирус обладал типичной для паротита способностью агглютинировать эритроциты обезьяны. Результаты анализа фракций в РГА приведены на рисунке 7, А. Концентрирование вируса из культуральной вируссодержащей жидкости позволило получить вирус в препаративных количествах уже после однократного ультрацентрифугирования. Изучение препаратов методом электронной микроскопии показало, что в очищенных препаратах находятся вирионы и нуклеокапсиды с характерной для вируса паротита структурой.

Для подтверждения принадлежности выделенного изолята Драгун к вирусу паротита из КВЖ была выделена суммарная РНК, синтезирована кДНК и проведена ПЦР. Для проведения полимеразной цепной реакции были использованы пары праймеров, перекрывающие районы генома в области, кодирующей участки генов F - и SH-белков (позиции 5276 - 5785 указаны для фрагмента кДНК вируса паротита, штамм SBL, изолят SBL-1). Расчетный размер данного участка с учетом включенных в праймеры сайтов для рестриктаз составляет 548 нуклеотидов, что соответствовал размеру ампликона. Первичная структура праймеров для фрагмента, соответствующего концу F-гена и SH-гену, приведена ниже:

F primer - TTGGATCCTTGTAGCAGCCTTAGTTTTGAG,

R primer - CGGAATTCTGCTTTTTTCTTTATGTCTCATG.

Секвенирование амплификационного фрагмента показало принадлежность штамма Драгун к вирусу паротита.

Рис.7. Получение и изучение антигена вируса паротита. (А) - Анализ фракций вируса паротита после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы в РГА. (Б) - Электрофорез белков вируса паротита, шт. Эндерс. Дорожки 1 и 4 - маркеры мол. весов: 66, 45, 36, 18 кД. Дорожка 3 - белки вируса паротита. Стрелками указаны: белок NP (верхняя полоса), М (нижняя полоса) вируса паротита.

Для разработки ИФА-тест-системы выбрали штамма вируса паротита с такими характеристиками как высокая репродуктивность штамма, антигенное родство (высокая серологическая перекрываемость) с другими штаммами вируса паротита, природное происхождение из географического региона проведения будущих исследований. Штаммы Эндерс, Л-3, Jeryl-Linn и Драгун вируса паротита использовали для получения препаративных количеств антигена. Штаммы культивировали на монослое культур клеток: ФЭК, Vero, CV-1, FRhK и Л-68. После культивирования собирали КВЖ и клеточный лизат для определения титра вируса. При получении урожая значительная часть вируса остается связанной с клеточными структурами, поэтому оставшиеся после слива КВЖ клетки разрушали замораживанием-оттаиванием, клеточный детрит осаждали низкоскоростным центрифугированием и надосадочную жидкость собирали. Результаты определения титра вируса паротита в КВЖ и клеточном лизате приведены в таблице 8. Как видно из данных таблицы 8 штаммы вируса паротита размножались во всех клеточных культурах. Максимальные титры вируса паротита достигались на 5-6 сут после заражения монослоя клеток Vero и для штамма Эндерс составляли 6,32 + 0,29 lg ТЦД₅₀/мл, а для штамма Драгун - 7,93 + 0,49 lg ТЦД₅₀/мл.

Таблица 8

Определения чувствительности культур клеток к вирусу паротита при стационарном способе культивирования

н. о. - титр вируса не определяли.

Для выбора антигена были взяты сыворотки лабораторных животных, любезно предоставленные к. б. н. Т.Н. Юнасовой (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Использование для сорбции на планшет фракций с цельным вирусом штамма Эндерс, выделенным из КВЖ, в отличие от использования фракций, выделенных из лизата клеток, инфицированных штаммом Эндерс (фракции, обогащенные нуклеокапсидами), повышает чувствительность реакции (табл.9). Максимальные титры противокоревых антител выявлялись при использовании для сорбции на планшет антигена на основе штамма Драгун. По этой причине в качестве иммуносорбента для ИФА был выбран суммарный антиген на основе штамма Драгун, полученный смешиванием фракций, выделенных на градиенте плотности сахарозы при очистке КВЖ и лизата зараженных вирусом клеток, в пропорции 1: 2 - 1: 3.