Таблица 9

Определение титра антител в сыворотках крови лабораторных животных

*1 - сыворотка кролика, иммунизированного цельным вирусом (получена из ГИСК им. Тарасевича);

2 - сыворотка кролика, иммунизированная очищенным нуклеокапсидом из лизата клеток;

3 - нормальная кроличья сыворотка;

4 - сыворотка крысы, иммунизированной цельным вирусом (получена из ГИСК им. Тарасевича).

** - в качестве антигенов использованы суммарные (цельный вирус и нуклеокапсиды) фракции, собранные с градиента плотности сахарозы.

В препарате очищенного инактивированного антигена определяли общий белок методом Лоури (Lowry O. H. et al., 1951). Исходя из концентрации белка, на карбонатно-бикарбонатном буфере (рН=9.6) готовили разведения препарата, содержащего 0,5; 1,0; 4,0 и 10,0 мкг/мл антигена вируса паротита, и вносили его по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов (Nunс, США). Показано, что 0,4 мкг препарата на лунку является оптимальной дозой антигена вируса паротита, обеспечивающей максимальные различия между положительными и отрицательными сыворотками (рис.8).

Далее был проведен подбор оптимального разведения конъюгата и изучены сроки хранения тест-системы для определения антител класса G к вирусу паротита.

Рис.8. Определение оптимальной концентрации антигена вируса паротита для постановки ИФА. По оси ординат показана разница соответствующих оптических плотностей положительного и отрицательного образцов.

Для выявления корреляции при определении титров антител между методами ИФА и РТГА были использованы сыворотки мышей линии BALB/c, иммунизированных очищенным вирусом паротита. Очищенный вирус паротита штаммов Эндерс и Драгун вводили животным внутрикожно трехкратно с интервалом 16 сут в дозе 50 мкг/животное, используя при первой иммунизации полный адъювант Фрейда, а при повторных - неполный адъювант Фрейда. Определение титра антител проводили через 21 сут после последней иммунизации. Результаты экспериментов приведены в таблице 10. Использование разработанной ИФА-тест-системы позволяет выявлять антитела в сыворотках крови животных, в титрах более высоких, чем это возможно в РТГА. С помощью разработанной ИФА-тест-системы использовали для выявления антител класса G в сыворотках крови людей, вакцинированных живой паротитной вакциной или переболевших эпидемическим паротитом разной степени тяжести. Всего в работу взяли сыворотки 41 пациента. Результаты анализа сывороток на содержание противопаротитных антител методом ИФА сравнивали с результатами, полученными в РТГА. Значения титров антител в исследуемых сыворотках крови людей, определенных с помощью тест-системы, коррелировало со значениями титров антител в этих сыворотках, определенных в РТГА.

Таблица 10

Сравнение эффективности выявления антител к вирусу паротита в сыворотках крови иммунизированных животных

Значения ОП контролей (положительный контроль, отрицательный контроль и контроль конъюгата) соответствовали требованиям, необходимым для учета результатов и указанным в проекте "Инструкции по применению тест-системы иммуноферментной для определения титра антител к вирусу паротита". Определение коэффициента корреляции между методами показало высокую степень корреляционных связей: значения коэффициентов корреляции находились в интервале значений от 0,73 (для сывороток людей) до 0,90 (для сывороток животных).

Таким образом, полученный антиген вируса паротита был использован для разработки тест-системы, позволяющей выявлять антитела класса G к вирусу паротита в сыворотке крови человека. Результаты определения титра антител, полученные с использованием разработанной тест-системы, имели высокий коэффициент корреляции с результатами определения титра антител, полученными с использованием "золотого" стандарта - реакции торможения гемагглютинации.

Изучение разнообразия вирусов кори и паротита, циркулирующих на территории Западной Сибири. Детальное изучение передачи инфекционного агента особенно важно в вирусологии и эпидемиологии. Анализ изолятов, выделенных в 50-60-е годы XX столетия, показал, что циркуляция Эдмонстон-подобного генотипа А вируса кори, по-видимому, была достаточно широко распространена в мире (Takeda М. et al., 1999). Выделенные в России штаммы Buk 88, Gag 88 и Il 88 (Tikhonova N. T. et al., 1992) и штамм Loss (Jin L. et al., 1996) также относились к генотипу А.

Начиная с 1996 года, проведена работа по сбору образцов от больных с клиническим диагнозом корь и генотипированию вируса кори, циркулирующего на территории Новосибирской области. В 1996 году при вспышке кори в детском доме у мальчиков 11 и 13 лет были получены образцы носоглоточных смывов и крови, из которых были выделены изоляты вируса кори Нов1/96 и Нов2/96. Фрагмент, включающий часть M - и F - генов (позиции 4725 - 5015) изолята Нов1/96, был секвенирован. Проведено сравнение нуклеотидной последовательности этого изолята с последовательностями других изолятов вируса кори. Результаты анализа показали генетическое сходство выделенного изолята Нов1/96 с выделенным в России штаммом Buk88 и используемым для вакцинации в России штаммом Л-16 вируса кори (Haider А. et al., 1997). Изолят принадлежал к генотипу А. В 1997 году выделены еще два изолята, отнесенные к генотипу А и один изолят, принадлежащий к генотипу D6, ранее не выявляемый на территории России. Этот изолят был выделен при локальной вспышке заболевания в детском коллективе у мальчика 8 лет с клиническим диагнозом корь. Различий в клиническом проявлении кори у больных, от которых были выделены изоляты с генотипом А, и у больного, от которого был выделен изолят с генотипом D6, отмечено не было. Вирус, вызвавший заболевание у ребенка, был наиболее близок по нуклеотидной последовательности штамму New Jersey. USA/94/1, являющемуся референс-штаммом генотипа D6. В 1998 были генотипированы еще 2 штамма вируса кори, принадлежащие к генотипу А. После этого генотип А вируса кори более не обнаруживался. Слежение за вирусом кори показало, что генотип А был вытеснен генотипом D6. Все 8 штаммов вируса кори, обнаруженные на территории Западной Сибири в срок с 1998 по 2001 гг, относились к генотипу D6.

Циркуляция генотипа D6 в Западной Европе была показана ранее: этот генотип был найден в Великобритании в 1992-1995 годах (Jin L. et al., 1997) и в Испании в 1994 (Rima B. K. et al., 1995). Известно, что генотип D6 вызвал вспышку заболевания корью в Бразилии в1997 году, в Аргентине - в 1998 году и в Уругвае - в 1999 (Baumeister E. et al., 2000). Есть предположение, что в РФ этот генотип попал из Европы, где он уже продолжительное время циркулирует.

Вирус паротита, как и вирус кори, в генетическом плане является стабильным вирусом с высокой степенью устойчивости к мутациям. Тем не менее, анализ последовательностей геномов различных изолятов, показал, что существует несколько различающихся вариантов вируса паротита - генотипов, которые циркулируют на определенных территориях. Ген SH (мРНК - 316 н. о., кодирует белок 57 а. о.) является самым вариабельным в геноме, и генотипирование штаммов вируса паротита проводится главным образом по этому гену. Филогенетический анализ, проведенный по генам HN и F, практически совпадает с данными, полученными по SH-гену.

Начиная с 1994 года, проведена работа по сбору образцов от больных эпидемическим паротитом и генотипированию вируса, циркулирующего на территории Западной Сибири.

В период с 12 января по 07 июня 1994 года в поселке Кольцово Новосибирской области была зарегистрирована вспышка заболевания эпидемическим паротитом. Всего за этот срок заболевание было диагностировано у 64 детей и 7 взрослых. Наибольший процент заболевших составили дети до 12 лет (35,8 % - дети 7-8-летнего возраста и 28,0 % - 11-12-летнего возраста). Течение инфекции было типичным: заболевание начиналось с повышения температуры тела до 38 ⁰C, появления припухлости околоушной слюнной железы (как правило, с одной стороны), через 1-2 дня появлялась припухлость и другой околоушной железы, которая исчезала через 8-10 дней после начала заболевания. На основании клинических проявлений и по нарастанию титров противопаротитных антител в парных сыворотках, определенных с помощью РТГА и ИФА, больным был поставлен диагноз - эпидемический паротит. От двух больных были выделены изоляты вируса паротита (табл.11).

Таким образом, был выделен и первично охарактеризован новый штамм вируса паротита, вызвавший вспышку заболевания эпидемическим паротитом в Новосибирской области в 1994 году. Штамм получил название "Драгун" (изоляты “Драгун-1" и “Драгун-2”) и был депонирован в коллекции вирусов ГНЦ ВБ РФ "Вектор" (номер - VB-05). Секвенирование нуклеотидной последовательности показало принадлежность штамма к генотипу С. Полная нуклеотидная последовательность штамма была расшифрована в 2004 году и депонирована в базу данных GenBank (№ AY669145).

Таблица 11

Получение и изучение свойств штамма "Драгун" вируса паротита

н. и. - не исследовалось

Штамм ПетроНов был выделен от больного (возраст 17 лет) с клиническим диагнозом: эпидемический паротит, средней степени тяжести (табл.12). Через 3 сут после появления температуры было зарегистрировано резкое увеличение околоушных слюнных желез, озноб, рвота, общая слабость, боли при глотании, головные боли. При осмотре зафиксировано увеличение подчелюстных лимфоузлов до 3,0 х 3,0 см, болезненность околоушных слюнных желез, ригидность затылочных мышц, повышение температуры тела до 39,9⁰С.

Таблица 12

Получение и изучение свойств штамма ПетроНов вируса паротита

н. и. - не исследовалось.

Для проведения работ по генотипированию выделенного изолята продукт ПЦР, полученный при использовании образца носоглоточного смыва, был секвенирован. Анализ генома вируса показал его принадлежность к генотипу Н (рис.9).

Рис. 9А

Рис. 9Б

Рис. 9В

Рис.9. Филогенетические деревья для изученных последовательностей вируса паротита, (А) - по SH-гену (сравнение с референс-штаммами), (Б) - по полным нуклеотидным последовательностям генома вируса, (В) - по М-гену.

Принятое обозначения штамма: AUS64Jl2 = A - генотип, US - страна выделения (США), 64-год выделения, Jl - сокращенное название штамма (Jeryl-Lynn), 2 - номер деривата штамма (если несколько дериватов одного штамма), Х - неизвестно.

CRU94DRA - штамм Драгун,

HRU03Pet - штамм ПетроНов.

Для изучения возможных изменений в геноме вируса, вызвавших тяжелое течение инфекции и столь длительную циркуляцию вируса в организме больного, из зараженной культуры клеток Vero (3-й пассаж вируса от исходного, выделенного из носоглотки больного) была выделена РНК в достаточном для проведения работ по секвенированию количестве. После секвенирования было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей для 16 полных геномов относительно штамма ПетроНов и построен график плотности распределения в них мутаций (рис. 10). Изученные геномы распределились по последовательностям на три группы. В первую группу попал штамм ПетроНов и наиболее близкий к нему штамм HUSXX881, другая группа, наиболее далекая от названных, представлена тремя вакцинными штаммами Jeryl Lynn (AUS64Jl1, AUS64Jl2, AUS64Jl3), остальные 12 штаммов образуют третью, промежуточную группу. Следует отметить, что точки пересечения кривых для этих трех групп отсутствуют, что говорит об отсутствии явных рекомбинационных механизмов для исследованных штаммов вируса паротита.

Филогенетический анализ, как для полных геномов в целом, так и отдельно для каждого гена показал, что между дикими и вакцинными штамммами явных отличий нет (см. рис.9). С незначительными перестановками внутри подгрупп, деревья для всех генов были схожи и практически повторяют дерево для полного генома (см. рис.9, Б). Тем не менее, интересно отметить, что филогенетическое дерево отдельно для М-гена отличается от деревьев для всех других генов: штамм ПетроНов попадает в подгруппу вакцинных штаммов А-генотипа; а описанный ранее авторами штамм Драгун по М-гену наиболее близок к вакцинному штамму AUS64Jl2 (см. рис.9, В). В настоящее время принято генотипировать изоляты вируса паротита по наиболее вариабельному фрагменту генома, включающему С-концевую часть гена F и SH-ген. Выделенный изолят относился к генотипу Н (см. рис.9, А). Для отнесения выделенного изолята к этому генотипу были использованы референс-штаммы, предложенные в работе L. Jin и соавт. (2005).

В результате проведенной работы был выделен и первично охарактеризован новый штамм вируса паротита. Штамм получил название ПетроНов и был депонирован в коллекцию микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (номер V-330). Полная нуклеотидная последовательность штамма была депонирована в базу данных GenBank (№ AY681495).

Рис.10. Плотность вариабельности для 16 полных геномов вируса паротита относительно штамма ПетроНов. Окно расчета 1500 н. о., шаг - 20 н. о.

Принятое обозначения штамма: AUS64Jl2 = A - генотип, US - страна выделения (США), 64-год выделения, Jl - сокращенное название штамма (Jeryl-Lynn), 2 - номер деривата штамма (если несколько дериватов одного штамма), Х - неизвестно.

В результате проведенных исследований впервые на территории России (Западная Сибирь) была показана циркуляция 2 генотипов вируса паротита - С и Н.

Таким образом, проведены молекулярно-эпидемиологические исследования, позволившие выявить основные генотипы вирусов кори и паротита, циркулирующие на территории Западной Сибири. Показана циркуляция генотипа D6 вируса кори в России и циркуляция генотипов С и Н вируса паротита. Выделенные изоляты этих генотипов позволили изучить основные свойства новых генотипов этих вирусов.

Выводы