Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными механизмами действия (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными механизмами действия (экспериментальное исследование)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Артюшкова Елена Борисовна

Старая Купавна - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович;

доктор медицинских наук, профессор Муляр Александр Георгиевич;

доктор биологических наук Башкатова Валентина Германовна.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» (РУДН)

Защита состоится 2009 г. на заседании диссертационного совета Д 217.004.01 при ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» ( ОАО «ВНЦ БАВ») (142450, Московская область, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ» и на сайте Высшей аттестационной комиссии в сети Интернет.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Корольченко Л.В.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Доказательства ведущей роли дисфункции эндотелия в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, в настоящее время весьма убедительны и представляют значительный теоретический и практический интерес (Белоусов Ю.Б., Намсараев Ж.Н., 2004; Романовская Г.А., Акатова Е.В., Гороховская Г.Н., 2005; Остроумова О.Д., Дубинская Р.Э., 2005). При длительном воздействии повреждающих факторов (атеросклеротическое повреждение эндотелия, гипоксия, воспаление, гемодинамическая перегрузка) происходит изменение эндотелиального ответа с тенденцией к доминированию и хронической гиперактивации вазоконстрикции и гемокоагуляции, факторов роста и пролиферации, способствующих ремоделированию сосудистой стенки, что, в свою очередь, приводит к усугублению эндотелиальной дисфункции (Петрищев Н.Н., 2003; Ольбинская Л.И., Найманн Ю.И., 2005). Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения эндотелиальной дисфункции являются важными клинико-экспериментальными задачами. В настоящее время стали известны научные факты, позволяющие по-новому взглянуть на парадигму профилактики сердечно-сосудистого континуума и существенного улучшения, таким образом, качества и продолжительности жизни пациентов при целом ряде массовых пандемий. Так, основным механизмом, лежащим в основе эндотелиальной дисфункции, является снижение образования и биодоступности NO при одновременном повышении продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М., 2005). При этом основными причинами дефицита NO в эндотелиальных клетках могут быть: сниженное содержание предшественника NO - L-аргинина, снижение экспрессии или активности eNOS, недостаток кофакторов синтеза NO (особенно тетрагидробиоптерина), повышение уровня эндогенных ингибиторов eNOS асимметричного диметиларгинина (АДМА) и монометил-L-аргинина (NMMA), повышенное образование реактивных форм кислорода (в частности, супероксид-аниона), а также липопротеидов низкой плотности (особенно их окисленных форм) (Cai C., Harrison D.G., 2000; Werner E.R., Gorren A.C.F., Heller R., 2003; Feletou M., Vanhoutte P.M., 2006).

Оксид азота синтезируется из L-аргинина под влиянием эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и является одним из наиболее мощных вазодилататоров, кроме того, он опосредует сосудорасширяющие эффекты эндотелийзависимых вазодилататоров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина и др.), тормозит образование эндотелиального сосудосуживающего фактора эндотелина-1 и высвобождение норадреналина окончаниями симпатических нейронов, препятствует осуществлению чрезмерных эффектов других вазоконстрикторов (ангиотензина, тромбоксана А₂), обладает противовоспалительным и антитромбогенным эффектами, оказывает антиоксидантное действие (Марков Х.М., 2005; Esper R.J., Nordaby R.A., Vilarino J.O., 2006). Широкий спектр биорегуляторных эффектов сосудистого NO указывает на то, что снижение его уровня в эндотелиальных клетках под влиянием тех или иных факторов вызывает существенные изменения их функций и системы кровообращения в целом.

Молекулярные основы функционирования и дисфункции сосудистого эндотелия - сложная и не до конца изученная проблема. Многочисленные исследования, проведенные в последние годы, свидетельствуют о ведущей роли в этих процессах системы L-аргинин-NO-NO-синтаза. Значение указанной системы определяется, с одной стороны, многогранным участием NO в осуществлении эндотелием своих функций, с другой - возможностью коррекции возникающих нарушений путем воздействия на различные звенья этой системы (Зодионченко В.С., Адашева Т.В., Сандомирская А.П., 2002; Бабак О.Я., Шапошникова Ю.Н., Немцова В.Д., 2004; Ющук Е.Н., Васюк Ю.А., Хадзегова А.Б., 2005; Чернявская Т.К., 2005; Марков Х.М., 2006).

Сегодня известно о положительном влиянии на функциональное состояние эндотелия препаратов различных фармакологических групп. Так нитраты восстанавливают дефицит эндогенного NO, ингибиторы АПФ помимо снижения синтеза AТ II препятствуют разрушению кининов, антагонисты кальция тормозят активность AТ II и эндотелина в гладких мышцах сосудов, усиливая вазодилататорный эффект NO, ингибиторы эндотелин-превращающего фермента и антагонисты рецепторов эндотелина-1 тормозят активность пептида (Бувальцев В.И., 2001; Бабак О.Я., Шапошникова Ю.Н., Немцова В.Д., 2004; Романовская Г.А., Акатова Е.В., Гороховская Г.Н., 2005; Галенко А.С., Шуленин С.Н., 2006; Herman A.G., Moncada S., 2005).

Однако в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции ЭД, поэтому большую ценность представляют данные о влиянии различных лекарственных средств на функциональные характеристики эндотелия. Будущее за препаратами, обладающими не только гипотензивным эффектом, но и органопротективным действием, опосредованным позитивным влиянием на эндотелиальную функцию. Большой практический интерес может представлять комплексное лечение эндотелиальной дисфункции при артериальной гипертензии, когда антигипертензивная терапия будет сочетаться с применением других препаратов-корректоров нарушений функций эндотелия и немедикаментозными методами улучшения эндотелиальной функции.

В связи с вышеизложенным явилось актуальным изучение эндотелиопротективных свойств препаратов с различными патогенетическими механизмами действия: природного донатора оксида азота - аминокислоты L-аргинина SR, активатора фермента NO-синтазы - резвератрола, антиоксиданта оксипиридинового ряда - мексикора, препарата, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, - фосфоглива, цитопротектора метаболического ряда - милдроната, а также афинно очищенных антител к эндотелиальной NO-синтазе - импазы при экспериментальном дефиците оксида азота.

Таким образом, результаты оценки эффективности различных путей фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции на ADMA- подобной модели дефицита оксида азота позволят раскрыть перспективу целенаправленного и патогенетически осмысленного изучения возможностей их использования как существенного дополнения к существующим методам лечения сердечно-сосудистых заболеваний и создать на их основе нового класса эндотелиотропных аддитивов.

Цель работы. Оценка возможности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными патогенетическими механизмами действия при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота.

Основные задачи исследования.

1. Оценить развитие эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, являющегося природным донатором оксида азота, L-аргинина SR при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

Исследовать влияние L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте.

3. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, являющегося активатором фермента NO-синтазы, резвератрола и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

4. Изучить эндотелиопротективную активность антиоксиданта оксипиридинового ряда препарата мексикор при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

5. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды - фосфоглив при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

6. Изучить эндотелиопротективную активность цитопротектора метаболического действия препарата милдронат при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

7. Изучить эндотелиопротективную активность препарата, содержащего в своем составе афинно очищенные антитела к эндотелиальной NO-синтазе, импаза при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

8. Провести интегральный векторный анализ для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, нитроксидергической системы, показателей сократимости и морфометрии миокарда с последующим расчетом вероятностного процента эндотелиопротекции на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Научная новизна. В работе сформировано новое направление в доклинической оценке эндотелиотропной активности фармакологических препаратов с использованием коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведением функциональных проб, определением биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

Впервые предложен способ оценки эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота с помощью расчета КЭД. Продемонстрировано, что эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (NOx, экспрессия NO-синтазы), а также отрицательной динамикой морфологических показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов).

По совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей подтверждено эндотелиопротективное действие природного донатора оксида азота L-аргинина SR. L-аргинин SR 30 мг/кг способствует преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, предупреждает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота NOx и предотвращает увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов у животных с L-NAME-индуцированной патологией.

Исследование влияния L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез в сравнении с рекомбинантными генами, кодирующими синтез эндотелиальных факторов роста (VEGF), показало, что полученные данные позволяют объективно говорить о том, что L-аргинин 200 мг/кг при системном введении способен активировать неоангиогенез и улучшать перфузию ишемизированных мышц. ангиогенез мексикор антиоксидант

В качестве потенциального эндотелиопротектора экспериментально обосновано использование перспективного препарата резвератрол (природный 3,5,4-тригидрокси-транс-стильбен), являющегося активатором фермента NO-синтазы. Впервые получены данные об эндотелио- и кардиопротективном эффекте резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предупреждении снижения содержания NOx. При этом нагрузочные пробы и морфометрия выявили уменьшение исчерпания миокардиального резерва, одновременно с ограничением увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов.

В ходе проведенного исследования на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO выявлена эндотелиопротективная активность антиоксиданта оксипиридинового ряда мексикора. Мексикор 30 мг/кг снижает КЭД до значения 1,9±0,2 у.е. по сравнению с группой нелеченых животных, где данный показатель равен 5,4±0,6 у.е., а также предупреждает снижение содержания стабильных метаболитов оксида азота NOx.

Оригинальными являются результаты функциональных проб на фоне лечения препаратом фосфоглив, содержащем в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте. При исследовании эндотелио- и кардиопротективного действия препаратов фосфоглив (капсулы) 2,2 г/кг, фосфоглив форте (капсулы) 0,515 г/кг, фосфоглив (лиофилизат) 5,0 мл/кг в дозах, сопоставимых по фосфотидилхолину, выявлено снижении КЭД по сравнению с группой нелеченых животных, предотвращение увеличения адренореактивности и снижения сократительного резерва миокарда.

Впервые установлено выраженное эндотелиопротективное действие цитопротектора метаболического действия препарата милдронат, ингибирующего активность гамма-бутиробетаингидроксилазы и вызывающего индукцию оксида азота в эксперименте. Милдронат 80 мг/кг способствует преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижает коэффициент эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных и оказывает положительное влияние на NO-продуцирующую функцию эндотелия.

Впервые показано выраженное эндотелиопротективное действие гомеопатически потенцированных антител к eNOS (C12, C30, C200) - препарата импаза на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания NOx. Одновременно результаты нагрузочных проб свидетельствовали о предотвращении повышения адренореактивности, уменьшении исчерпания миокардиального резерва.

Научная новизна подтверждается получением 10 патентов РФ.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции препаратами с различными патогенетическими механизмами действия: природным донатором оксида азота L-аргинином SR, активатором фермента NO-синтазы резвератролом, антиоксидантом оксипиридинового ряда мексикором, препаратом, содержащим в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, фосфогливом, цитопротектором метаболического действия милдронатом и гомеопатически потенцированными антителами к eNOS (C12, C30, C200) препаратом импаза, для коррекции L-NAME-индуцированной ЭД в эксперименте. Показано, что их использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД.

Одновременно результаты нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований свидетельствовали о положительной динамике морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (снижение адренореактивности, предотвращение исчерпания миокардиального резерва, уменьшение диаметра кардиомиоцитов) и о восстановлении активности NO-продуцирующей функции эндотелия (повышение продукции нитрит-ионов NOx).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические и клинические испытания исследуемых препаратов в качестве эндотелиотропных аддитивов при лечении патологических состояний, связанных с развитием эндотелиальной дисфункции.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов фосфоглив форте производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008120/08), фосфоглив производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ P N002528/01), препаратов мексиприм производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛС-001668) и мельдоний производства ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» (РУ ЛСР-006481/08), включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности биологически активной добавки L-аргинин (свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.2795.3.05 от 18.03.05), включены в состав документов, поданных на регистрацию в ГУ НИИ питания РАМН. Результаты работы используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии Белгородского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Комплекс методических подходов, включающий расчет коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведение функциональных проб, определение биохимических маркеров и оценку результатов морфологических исследований, является адекватным способом исследования эффективности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.

2. На основании проведенного комплексного изучения L-аргинина SR, резвератрола, мексикора, фосфоглива, милдроната, импазы на модели L_NAME-индуцированного дефицита NO можно в качестве потенциальных эндотелиопротекторов предложить следующие фармако-терапевтические группы:

- донаторы оксида азота

- активаторы эндотелиальной NO-синтазы

- антиоксиданты

- мембранопротекторы, содержащие «эссенциальные фосфолипиды»

- цитопротекторы метаболического действия

- гомеопатически потенцированные антитела к eNOS

3. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты исследованных препаратов на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота: природного донатора оксида азота L-аргинина SR, активатора фермента NO-синтазы резвератрола, антиоксиданта оксипиридинового ряда мексикора, препарата фосфоглив, содержащего в своем составе «эссенциальные» фосфолипиды, цитопротектора метаболического действия милдроната, гомеопатически потенцированных антител к eNOS (C12, C30, C200) импазы, свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического и клинического изучения данных препаратов в качестве потенциальных эндотелиопротекторов.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг., XIII-XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство», I-II Национальном конгрессе терапевтов, VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ, XII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов в НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева (2006). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 1, внутренних болезней № 2, гистологии, цитологии и эмбриологии, патофизиологии, НИИ Экологической медицины КГМУ (2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ, 22 из них - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, получено 10 патентов РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 532 источника, из них 132 отечественных и 400 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 348 страницах машинописи, содержит таблиц - 32, рисунков - 103, формул - 6.

Материалы и методы исследования

Опыты проводили на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводили ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг. На 7 день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы «Bioshell». Эндотелийзависимая (ЭЗР) и эндотелийнезависимая (ЭНЗР) сосудистые реакции оценивались посредством проведения функциональных сосудистых проб с внутривенным введением ацетилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J.B., 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика Р23ID «Gould», США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемодинамики: левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt_max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt_max), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт. ст. Ч уд. мин)).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1^.10^-5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек) (Меерсон Ф.З., 1980).

3. 3-минутная гипоксия (Пашин Е.Н., 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метельская В.А., 2004). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски. Уровень метаболитов NO (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NO_x) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaNO₂ в воде, который хранили при температуре -20^оС; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения калибровочной кривой.

Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) определяли в клеточном лизате по методу R.J. Hendrickson (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2004) с помощью поликлональных мышиных антител против eNOS (BD Transduction Labs) с последующим проявлением методом усиленной хемилюминесценции ECL.

После выведения животного из эксперимента отрезок крысиной аорты (20-30 мг) промывали в 0,9% р-ре NaCl и хранили в жидком азоте. Подготовленные образцы подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану методом Western-блоттинга. Мембрану инкубировали с мышиными поликлональными антителами против eNOS, затем обрабатывали по методу ECL и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение суток. Затем пленку проявляли и сканировали полосы, рассчитывая их интенсивность с помощью компьютерной программы TotalLab (Amersham). В качестве контроля использовали стандартно приготовленные образцы из 1 млн. культивируемых эндотелиальных клеток бычьей аорты (BAEC), интенсивность полос которых принимали за 100%.

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проводили гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксировали в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использовали окраски гематоксилином Рего и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов, по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов и определением диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова (1994).

Оценку уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс осуществляли методом лазерной допплеровской флоуметрии. Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазерный допплеровский флоуметр «Biopac-systems MP-100» и датчика «TSD-144». Запись и обработка данных осуществлялись при помощи программы AcqKnowledge 38.

Иммуногистохимическую визуализацию сосудов осуществляли на срезах мышц голени крысы моноклональными антителами к CD 31 (BD). Замороженные срезы фиксировали в 4% растворе формалина в фосфатном буфере в течение 5 минут при комнатной температуре, промывали фосфатным буфером (рН 7,4). Для визуализации антител срезы инкубировали в течение 6 минут с комплексом авидин/пероксидаза (Vector Laboratories, в разведениях 1:50 с реагентом а (авидин) и реагентом В (пероксидаза хрена) в фосфатном буфере). Далее на 10-20 секунд наносили раствор тетрахлорида диаминобензидина (Sigma) (0,5 мг/мл с 0,01% раствором перекиси водорода, профильтрованный через 0,22 мкм фильтр (Millipore, USA). Срезы ополаскивали дистиллированной водой, дегидратировали в водных растворах этанола (80%, 96%, 100%) и в толуоле, заливали в канадский бальзам. Подсчет сосудов на окрашенных гистологических срезах мышц крысы осуществляли на световом микроскопе Zeiss Axiovert 200M при увеличении х 20. На 5 срезах, сделанных на разных уровнях мышцы, обсчитывали по 5 полей зрения. Данные для каждого животного усредняли.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота исследуемые вещества вводили в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно или внутрижелудочно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований выполненных на крысах на данной модели патологии (Lopez R.M. еt al., 2004; Kataoka С. еt al., 2002; Ganzales W. еt al., 2000).

При выборе доз исходили из средней терапевтической дозы препаратов, с последующим межвидовым переносом доз, с использованием коэффициента пересчета доз для животных, в частности крыс (Freireich еt al., 1966; Уланова И.П. и др., 1968). Эндотелиотропная активность донатора оксида азота L-аргинина производства Ajinomoto Со. INC (Japan), в медленно высвобождающейся форме (“L-аргинин SR^®”, производства ОАО “ФармстандартЛексредства”) исследована в дозе 30 мг/кг при внутрижелудочном введении, что соответствует разрешенной суточной дозе в России по СанПИН - М.Р.2.3.1.1915 (2004) и данным литературы (Alan L. Miller, ND, 2006), согласно которым, именно в этой дозе L-аргинин SR проявляет эндотелио- и кардиотропные эффекты.

Сравнительную оценку ангиогенного эффекта L-аргинина и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) проводили на фоне внутрибрюшинного введения “L-аргинина^®”, производства Ajinomoto Со. INC (Japan) в виде водного раствора в дозе 200 мг/кг, на 2 сутки после операции моделирования ишемии конечности и транскутанной внутримышечной инъекции в m. tibialis anterior плазмиды гена VЕGF на 5 сутки после операции. Раствор плазмиды в стерильном фосфатно-солевом буфере объемом 250 мкл с содержанием плазмидной ДНК 250 мкг вводили в пять точек (по 50 мкл в каждую точку).

Эндотелиотропную активность активатора эндотелиальной NO-синтазы резвератрола (3,5,4- тригидрокси-транс-стильбен) производства Greensyn^TM (Guangzhou)., Ltd, исследовали в дозе 0,15 мг/кг, что соответствует разрешенной суточной дозе в России по СанПИН - М.Р.2.3.1.1915 (2004) и в дозе 2 мг/кг при внутрибрюшинном введении, которая определялась нами с учетом максимального его содержания в экстраординарных сортах вин (10 мкмоль/л, 600 мл/сут.). Согласно литературным данным, именно в дозе 2 мг/кг резвератрол проявляет максимальные эндотелио- и кардиотропные эффекты (Chen C.K. еt al., 1996; Naderali E.K. еt al., 2000; Orallo F. еt al., 2002).

Максимальная суточная доза цитопротектора метаболического действия, препарата “Милдронат^®” (3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата дигидрат) производства ПАО GRINDEX (Латвия), для человека массой 70 кг равна 500 мг, в результате переноса доз с человека на крысу (Freireich еt al., 1966; Уланова И.П. и др., 1968) получали дозу 80 мг/кг, которую применяли при внутрижелудочном введении экспериментальным животным для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности препарата.

Доза антиоксиданта оксипиридинового ряда, препарата “Мексикор^®” (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат) ЭкоФармИнвест ООО, производства Государственный завод медицинских препаратов ГУП (Россия), 30 мг/кг при внутрибрюшинном введении, была определена из средней терапевтической дозы препарата с использованием коэффициента пересчета доз для животных и соответствовала дозе минорного антиоксиданта рQ510 (аскорбиновая кислота, модифицированная титаном), ранее исследованного в нашей лаборатории, для которого были выявлены выраженные эндотелио- и кардиопротективные эффекты.

При изучении эндотелио- и кардиопротективной активности препарата фосфоглив, содержащего в своем составе “эссенциальные” фосфолипиды, животные на фоне L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота, внутрижелудочно получали препарат “Фосфоглив^®” (капсулы) производства ОАО “Фармстандарт-Лексредства” в дозе 2,2 г/кг, препарат “Фосфоглив форте^®” (капсулы) в дозе 0,515 г/кг, внутрибрюшинно препарат “Фосфоглив^®” (лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения) производства Государственное учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (Россиия) в дозе 5,0 мл/кг и 0,5 мл/кг. Дозы препаратов рассчитывались по входящему в их состав фосфатидилхолину, равноэквивалентно содержанию последнего в препарате “Эссенциале^® форте Н” (капсулы) производства Санофи-Авентис и последующему пересчету доз с человека на крысу в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Количественное содержание фосфатидилхолина в пересчете на безводное вещество для “Фосфоглива^®” (капсулы) и “Фосфоглива^®” (лиофилизат) составляло соответственно 73-79% и не менее 94,0%. При расчете доз субстанций глицирата и липоида С80 также учитывалось содержание последних в препарате “Эссенциале^® форте Н” (капсулы) с последующим пересчетом с человека на экспериментальное животное.

В качестве потенциального эндотелиотропного средства исследовался препарат “Импаза^®” (сверхмалые дозы аффинно очищенных антител к эндотелиальной NO-синтазе, смесь гомеопатических разведений С12+С30+С200), производства ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг» (Россия). Препарат разводили в поилках из расчёта 1 таблетка на 100 мл воды. Крысы получали импазу в свободном доступе к питью с учётом объема потребляемой жидкости 20±3 мл/животное/сут., что соответствовало суточной дозе 1 таб./кг массы животного.

Статистическая обработка результатов исследования. Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±m) и оценки достоверности различий сравниваемых параметров между группами с использованием t-test для групп с разными дисперсиями, достоверными считались различия сравниваемых параметров при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO

Длительное, в течение 7 суток, однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг привело к стойкому повышению АД (рис. 1).

Проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелийзависимое и эндотелийнезависимое расслабление показало существенные отличия в группе с L-NAME-индуцированной патологией в сравнении с интактными животными. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением артериального давления и брадикардией (рис. 2). После окончания миокардиального компонента артериальное давление восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления артериального давления принимался нами как площадь эндотелиальной реакции. При этом очевидно, что площадь эндотелийзависимой реакции при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в несколько раз меньше, чем у интактных животных.



Рисунок 1. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. Здесь и везде далее: КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АД - артериальное давление, АДр - адренореактивность, НС - нагрузка сопротивлением, eNOS - экспрессия NO-синтазы, NOx - концентрация стабильных метаболитов оксида азота, КМЦ - диаметр кардиомиоцитов; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных.

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на нитропруссид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади артериального давления на ацетилхолин.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,1, при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота - в 5 раз больше, его значение составило 5,4±0,6 (рис. 1_КЭД).

Развитие патологии привело к увеличению абсолютных значений ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе с нагрузкой сопротивлением (рис. 1_АД, _НС). У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 83,6±7,7%, а у животных с L-NAME-индуцированной патологией до значения - 66,0±5,5%.

Характерная динамика биохимических маркеров L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис. 1_{eNOS, NOx}. Так, концентрация нитрит-ионов (NOx) у животных, получивших L-NAME, составила 61,2±3,6, тогда как у интактных животных этот показатель был на уровне 114,1±4,1 мкМоль. Экспрессия эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) в группе интактных животных и животных с патологией составила соответственно 72,9±3,8% и 21,4±4,7%.

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, явились результаты морфологических исследований (рис. 4). На представленных гистологических препаратах а - интактные кардиомиоциты, б - кардиомиоциты животных с L-NAME патологией. При этом очевидно резкое увеличение площади поперечного сечения кардиомиоцитов при сохраненном диаметре ядер в группе животных, получавших L-NAME. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1±1,1, а у животных с патологией 18,5±1,1 мкМ (рис. 1).

Таким образом, для оценки эндотелио- и кардиопротективного действия исследуемых препаратов нами был использован комплекс функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований, позволяющий дать интегральную характеристику эндотелиальной и миокардиальной функции сердечно-сосудистой системы. С этой целью значения САД, ДАД, КЭД, диаметра кардиомиоцитов, NOx и значение исчерпания миокардиального резерва были представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, с последующим расчетом площадей векторных диаграмм, которые выражались в условных единицах (усл. ед.).

Рисунок 2. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональных проб на эндотелийзависимую вазодилатацию у интактных животных и крыс с L-NAME-индуцированной патологией.

Примечание. Здесь и везде далее: САД - систолическое артериальное давление (мм рт. ст.), ДАД - диастолическое артериальное давление (мм рт. ст.), ЧСС - частота сердечных сокращений (уд./мин).

Рисунок 3. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональных проб на эндотелийнезависимую вазодилатацию у интактных животных и крыс с L-NAME-индуцированной патологией.

Рисунок 4. (а, б). Морфология миокарда у интактных и опытных животных.

Примечание. а - кардиомиоциты у интактных животных на поперечном срезе; б - кардиомиоциты у животных с L-NAME-индуцированным дефицитом оксида азота (окр. гематоксилином и эозином; а, б - ув. 440).

При сравнении площадей векторных диаграмм имеют место выраженные различия между группой интактных животных и животных с патологией, которые можно объяснить за счет вклада достоверно более высокого значения систолического и диастолического давлений, КЭД, диаметра кардиомиоцитов, а также увеличения исчерпания миокардиального резерва и снижения NO-продуктивной активности эндотелия, что может соответствовать симптомокомплексу АГ и эндотелиальной дисфункции в эксперименте (рис. 5).

Рисунок 5. Векторные диаграммы функциональных, биохимических и морфологических показателей интактных животных и животных с моделированием L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. Здесь и везде далее: NO - суммарный уровень метаболитов оксида азота, ПА 5-25 - исчерпание миокардиального резерва, S - площадь векторной диаграммы; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных.

2. Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина SR при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота

2.1 Исследование эндотелиопротективной активности L-аргинина SR с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований

Проведенные нами исследования показали, что донатор оксида азота L_аргинин SR обладает дозозависимым эндотелиопротективным эффектом, выражающимся в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции. Так, КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,1, при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота - 5,4±0,6, на фоне введения L-аргинина SR (30 мг/кг) - 2,6±0,2 (рис. 6_КЭД). Обнаружено, что изучаемый препарат в исследуемых дозах не предотвращал развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 6_АД).

При проведении пробы на адренореактивность L-аргинин SR предотвращал повышение значений левожелудочкового давления, вызванного L-NAME-индуцированной патологией, так, на фоне препарата в дозе 30 мг/кг значение данного показателя было на уровне группы интактных животных и составляло 205,7±11,2 мм рт. ст. (рис. 6_АДр). Аналогичная тенденция получена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 6_НС). Сократимость левого желудочка на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±7,7% от величины 5 секунды, принятой за 100%, у животных с L-NAME патологией - 66,0±5,5%, в группах, получавших лечение L-аргинином SR 30 мг/кг данный показатель был на уровне 89,3±3,4%.

NO-продуцирующая функция эндотелия исследована нами на основании определения в сыворотке крови суммарного уровня стабильных конечных метаболитов оксида азота (NOx). Концентрация нитрит-ионов в сыворотке крови на фоне лечения L-аргинином SR 30 мг/кг увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от уровня интактных животных (рис. 6_NOx).

Изучение влияния исследуемого нами препарата на диаметр кардиомиоцитов также выявило существенные преимущества L-аргинина SR 30 мг/кг в способности предотвращать гипертрофию миокарда, что выражалось в уменьшении поперечного сечения кардиомиоцитов до 11,3±1,2 мкМ, по сравнению с группой нелеченых животных - 18,5±1,1 мкМ (рис. 6_КМЦ).

В качестве интегральной характеристики для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности L-аргинина SR нами использовались площади векторных диаграмм, которые позволили представить эффективность действия препарата в соответствующей дозе и наглядно отобразить различия между исследуемыми группами животных. В ходе выполнения исследования мы получили снижение значения площади векторной диаграммы в группе, получавшей L-аргинин SR 30 мг/кг до 7,41±0,42 усл. ед., против значения 10,12±1,2 усл. ед. в контрольной группе (рис. 7).

Рисунок 6. Влияние L-аргинина SR 30 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных.

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей свидетельствует о выраженной эндотелио- и кардиопротективной активности донатора оксида азота L-аргинина SR 30 мг/кг при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

2.2 Сравнительное исследование влияния L-аргинина и VEGF на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте

Исследование влияния L-аргинина на уровень микроциркуляции и ангиогенез при коррекции ишемии конечности в эксперименте показало, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг повышает уровень микроциркуляции на всех сроках наблюдения (10, 21, 28 сутки) после моделирования ишемии (рис. 8), а также активизирует неоангиогенез и улучшает перфузию ишемизированных мышц. Так, в группах животных, получавших L-аргинин и VEGF, методом лазер-допплеровской флоуметрии зафиксирована микроциркуляция соответственно на уровне 271,84±10,94 п.е. и 237,69±7,77 п.е. (14 сутки после моделирования ишемии), а плотность сосудов, полученная с использованием иммуногистохимической визуализации, соответствует значению 781,38±110,99 сосудов для L-аргинина и 1203,67±193,28 сосудов для VEGF в поле зрения, что достоверно превышает данные показатели по сравнению с группой плацебо (рис. 9).



Рисунок 7. Площади векторных диаграмм функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции L-аргинином 30 мг/кг и 200 мг/кг.

Примечание. Здесь и везде далее: контурной линией обозначена площадь векторной диаграммы показателей животных с L-NAME-индуцированным дефицитом NO; * - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME животных.

Рисунок 8. Результаты измерения уровня микроциркуляции на различных сроках наблюдения при моделировании ишемии конечности у крыс. Примечание. * - р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных.

Рисунок 9. Результаты изучения влияния L-аргинина 200 мг/кг в сравнении с VEGF 250 мкг на показатели микроциркуляции и неоангиогенез при коррекции ишемии конечности на 14 сутки наблюдения.

Примечание. VEGF - фактор роста эндотелия сосудов; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, # - р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших плацебо.

Полученные данные свидетельствуют о неоангиогенном эффекте L-аргинина, который возможно объяснить наличием у него свойств донора NO, оказывающего вазодилатирующее, эндотелиопротективное действие и создающего оптимальные условия для компенсации ишемии - неоангиогенеза.

3. Исследование эндотелиопротективной активности резвератрола при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота

Наши дальнейшие исследования по указанному протоколу выявили, что активатор eNOS резвератрол (2 мг/кг) и резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) не снижают АД до целевых значений, но проявляют выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня 1,2±0,1 и 1,9±0,2 соответственно (рис. 10_КЭД), а также в полном предупреждении снижения содержания нитрит-ионов NOx (рис. 10_NOx).

Проба на адренореактивность у животных с L-NAME-индуцированной патологией на фоне терапии резвератролом (2 мг/кг) также выявила снижение максимальных цифр левожелудочкового давления до значения 211,9±12,2 мм рт. ст. по сравнению с группой нелеченых животных, у которых этот показатель был на уровне 247,3±4,8 мм рт. ст. (рис. 10_АДр).

Аналогичная тенденция получена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением (рис. 10_НС). Сократимость левого желудочка на 25 секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±7,7% от величины 5 секунды, принятой за 100%, у животных с L-NAME патологией - 66,0±5,5%, в группе, получавшей лечение резвератролом (2 мг/кг) - 74,4±3,0%. При этом особого внимания заслуживает тот факт, что на фоне лечения резвератролом в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) имеет место значительное предотвращение снижения исчерпания миокардиального резерва, значение которого приближается к уровню интактных животных и соответствует 82,9±12,2 (рис. 10_НС).

Рисунок 10. Влияние резвератрола 2 мг/кг и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц 0,15 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Примечание. I - резвератрол 2 мг/кг, II - резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц 0,15 мг/кг; * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME животных.

Морфометрические исследования обнаружили способность резвератрола (2 мг/кг) и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) предотвращать гипертрофию миокарда, что выражалось в уменьшении поперечного сечения кардиомиоцитов соответственно до 9,8±1,2 и 11,1±1,1 мкМ по сравнению с группой нелеченых животных - 18,5±1,1 мкМ (рис. 10_КМЦ).

В качестве интегральной характеристики для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности исследуемого препарата нами использовались площади векторных диаграмм, которые позволили представить эффективность действия резвератрола и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц в соответствующих дозах и наглядно отобразить различия между исследуемыми группами животных. В ходе выполнения исследования мы получили снижение значений площадей векторных диаграмм в группах, получавших резвератрол (2 мг/кг) и резвератрол в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг), соответственно до 6,13±0,31 и 7,22±0,42 усл. ед., против значения 10,12±1,2 усл. ед. в контрольной группе, не получавшей лечения (рис. 11).

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей свидетельствует о выраженной эндотелио- и кардиопротективной активности активатора eNOS резвератрола (2 мг/кг) и резвератрола в составе фосфолипидных наночастиц (0,15 мг/кг) при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

Рисунок 11. Площади векторных диаграмм функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции резвератролом 2 мг/кг и резвератролом в составе фосфолипидных наночастиц 0,15 мг/кг.

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME животных.

4. Исследование эндотелиопротективной активности препарата мексикор при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота

Установлено, что антиоксидант оксипиридинового ряда мексикор (30 мг/кг) проявляет эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, что выражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных 1,9±0,2 (рис. 12_КЭД). При этом определено, что изучаемый препарат в исследуемой дозе не предотвращал развития выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов (рис. 12_АД).

Рисунок 12. Влияние мексикора 30 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота. Примечание. * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, ** - р<0,05 в сравнении с группой L-NAME животных.