"Король пробиотиков" Bacillus coagulans в современном комбинированном пробиотическом препарате Лактовит Форте

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДУ «Інститут мікробіології та імунології іч. І. І. Мечникова НАМН України»

УДК 579:579.26:574.2

«Король пробиотиков» Bacillus Coagulans в современном комбинированном пробиотическом препарате Лактовит Форте (полный обзор)

Бочко Т. В.

Каблучко Т. В.

Одним из наиболее перспективных пробиотических микроорганизмов является спорообразующая лактобактерия Bacillus coagulans. В форме спор она хорошо переносит технологические процессы и хранение, не разрушается под влиянием желудочного сока и желчи. Попадая в двенадцатиперстную кишку, споры Bacillus coagulans могут прорастать в вегетирующие бактерии в просвете кишечника человека и оказывать свои пробиотические эффекты [1].

Рисунок 1. Микрофотография Bacillus coagulans при небольшом увеличении

Bacillus coagulans входит не только в состав биодобавок. В последнее время на основе этой бактерии на мировом фармацевтическом рынке появился ряд препаратов с доказанной клинической эффективностью [2].

Эта бактерия задепонирована в американской коллекции клеточных культур (ATCC, Rockville, MD): Bacillus coagulans Hammer NRS 727 (ATCC No. 1 1014), Bacillus coagulans Hammer strain C (ATCCNo 11369); Bacillus coagulans Hammer (ATCCNo 31284), Bacillus coagulans Hammer NCA 4259 (ATCC No 15949), Bacillus coagulans штаммАТСС 7050. Очищенные бактерии Bacillus coagulans также доступны в коллекциях Deutsche Sarumlungvon Mikroorganismenund Zellkuturen GmbH (Braunschweig, Germany) со следующими номерами классификатора: Bacillus coagulans Hammer 1915 (DSMNo 2356), Bacillus coagulans Hammer 1915 (DSMNo 2383, аналогична с ATCCNo 1 1014), Bacillus coagulans Hammer (DSMNo 2384, аналогична ATCCNo 11369), и Bacillus coagulans Hammer (DSMNo 2385, аналогична ATCCNo 15949). Bacillus coagulans также производится в промышленных масштабах такими производителями, как Sabins aCorporation (Piscataway, NJ) или KK Fermentation (Kyoto, Japan) [3].

Оригинальное название этого микроорганизма - Lactobacillus sporogenes [4]. Это название также широко применяется в научной литературе, поскольку оно представлено бюллетене ВОЗ, в котором различные классификации бактерий в пробиотиках приведены к единой системе стандартизации [5,6]. Однако в последнем издании каталога Bergey этот микроорганизм снова был отнесен к роду Bacillus, поскольку анализ ДНК показал его наибольшую близость именно к этому роду.

На рисунке 1 показана микрофотография Bacillus coagulans [7].

Биологические свойства Bacillus coagulans

Общие биологические свойства

Bacillus coagulans - грам-положительный эндоспороформирующий непатогенный, нетоксигенный микроорганизм. Оптимальный рост бактерии наблюдается при 35-50⁰С и рН в пределах от 5.5 до 6.2.

Это факультативный анаэроб. Bacillus coagulans является микроаэрофильным микроорганизмом, т.е. для его роста, в отличие от других анаэробов, требуется наличие небольших количеств кислорода.

Пик накопления бактериальной массы наблюдается через 18 часов. Особенностью данной бактерии является её кислотостойкость [8].

Бактерия имеет удлиненную форму (0,3-0,8 мкм), иногда изогнутую, с закругленными концами.

Спора B. coagulans располагается на одном из полюсов клетки и имеет форму эллипса, устойчива к нагреванию и другим неблагоприятным условиям внешней среды и способна прорастать из разбавленных растворов соляной кислоты и гидроксида натрия. Образует колонии около 2,5 мм в диаметре, которые имеют выпуклую форму, блестящие, не выделяющие каких-либо пигментов. иммунитет lactobacillus пробиотический бактериоцин

Отмечается слабовыраженная подвижность - с помощью круглоресничных жгутиков.

По биологическим свойствам занимает промежуточное положение между двумя родами - Bacillus и Lactobacillus. Являясь спорообразующей бактерией, она одновременно производит молочную кислоту, не способна восстанавливать нитраты и не содержит оксидазы [9].

Ряд свойств объединяют Bacillus coagulans с представителями рода Bacillus. Это, прежде всего, способность образовывать споры и колонии. Для своего роста микроорганизм использует такие вещества как углеводы, пептоны, мясо и дрожжевой экстракт. Продуцирует кислоты из таких субстратов как арабиноза, ксилоза, глюкоза, галактоза, манноза, фруктоза, мальтоза, сахароза и трегалоза. Не гидролизует крахмал, казеин, желатин. Не продуцирует сероводород и индол. Однако имеются и характеристики, отличающие Bacillus coagulans от рода Bacillus. Так, бактерия Bacillus coagulans имеет преимущественно изогнутую форму, и молочнокислые бактерии - изогнутые. Как и Bacillus coagulans, молочнокислые бактерии проявляют очень слабую подвижность. У Bacillus coagulans и у молочнокислых бактерий споры расположены в терминальном участке клетки, а не в центре, как у Bacillus. Они дают отрицательный оксидазный тест. Продуцирует правовращающую молочную кислоту из глюкозы, фруктозы, сахарозы и трегалозы. В отличие от большинства Bacillus, не восстанавливает нитраты до нитритов. В ДНК Bacillus молярный процент пары гуанин-цитозин достигает 69%, а у Lactobacillus - не превышает 53%.

В таблице 1 представлены основные свойства Bacillus coagulans, объединяющие его с бактериями родов Bacillus или Lactobacillus.

Таблица 1. - Основные характеристики Bacillus coagulansB сравнении с родамиBacillus и Lactobacillus

Антибиотикорезистентность

Анализ антибиотикочувствительности

Bacillus coagulans subsp. Hammer (ATCC- 31284) был проведен с применением метода Kirby-Bauer (подсчет колоний на пластинах) и метода Vitek (определение оптической плотности в культуре). Методология включала тестирование чувствительности данного микроорганизма к специфическим противомикроб- ным компонентам, которые могут быть эффективными как для элиминации, так и для ограничения колонизации Bacillus coagulans. Вегетирующая форма бактерии при использовании метода Kirby-Bauer была чувствительна к ампициллину, цирофлоксацину, три- метаприм-сульфаметоксазолу, эритромицину, цифам- пину, ванкомицину, гентамицину, оксациллину и различным производным тетрациклина. С использованием методики Vitek была установлена чувствительность Bacillus coagulans к пенициллину, ванкомицину, гентамицину (500 мкг/мл), стрептомицину (2000 мкг/мл), нитрофурантоину, норфлоксацину, хлорамфениколу, а к тетрациклину Bacillus coagulans в данном эксперименте был устойчив. Дополнительно было показано, что инкубация Bacillus coagulans с нитроцефином приводит к индукции синтеза низких концентраций р-лактамазы [10]. Следовательно, в случае непредвиденного и/или нежелательного роста и размножения бактерии в кишечнике, ее можно быстро инактивировать.

В то же время споры Bacillus coagulans устойчивы к действию антибиотиков. Благодаря этому пробиотик можно применять вместе со стандартной химиотерапией, без риска подавления его активности [11].

Устойчивость к агрессивным факторам организма

Bacillus coagulans в вегетирующей форме, по данным опытов in vitro, не выдерживает пребывание в среде с рН < 3 [12], хотя показано, что штамм Bacillus coagulans CNCMI-1061, используемый в качестве пробиотика у цыплят, сохраняет до 50% живых форм в кислой среде желудка.

Для спор Bacillus coagulans кислотная активация не описана. Отмечается, что споры минуют желудок и прорастают только в двенадцатиперстной кишке [13].

Таким образом, тот факт, что Bacillus coagulans применяется в форме спор, обеспечивает его устойчивость к кислому содержимому желудка.

Устойчивость к желчи сильно варьирует у разных штаммов кишечных бактерий. Так, из 38 пробиотических штаммов Lactobacillus (в основном L. rhamnosus) 3 были классифицированы как резистентные к действию желчи, 5 - толерантные, 3 - с низкой толерантностью, 11 - чувствительные [14]. Подобная вариабельность была получена при сравнительных исследованиях 47 штаммов Lactobacillus [15], Propionibacterium [16], Bifidobacterium [17]. Среди бифидобактерий наибольшей толерантностью к желчи обладает штамм B. longum [18].

Для Bacillus coagulans, даже не в споровой форме, показана достаточно высокая устойчивость к действию желчи. Было проведено сравнительное исследование 13 видов спорообразующих молочнокислых бактерий, используемых в качестве пробиотиков, на предмет их устойчивости к действию желчи. В данном исследовании изучены следующие штаммы бактерий: B. racemilactus DSM445 и DSM2309, Sporolactobacillus inulinus CIP103279, DSM30348, NCFB1389, Sp. laevus IAM12384, Sp. racemicus IAM12395, Bacillus laevolacaticus DSM442, DSM6475, DSM6477, B. racemilacticus DSM445, DSM2309, B. coagulans CIP5264, CIP6625, BC14. Образцы инкубировали при 37оС в течение 24 часов с 0,3% раствором желчи и без нее. Каждый час оценивали оптическую плотность суспензий. Определяли значения МИК желчи по отношению к каждой из культур и оценивали время (d, мин), необходимое для достижения различия в оптической плотности 0,3 ед. по отношению к контролю (по методу Chateau). Было установлено, что только 5 из изученных бактерий прорастали при наличии желчи. Это были штаммы Bacillus coagulans и Bacillus racemilacticus. Эти штаммы были толерант- ны к желчи (15<d<40 мин). Приведем полученные в данном исследовании значения МИК желчи:

Таким образом, в данном исследовании in vitro была доказана высокая, в сравнении с другими микроорганизмами-пробиотиками, устойчивость Bacillus coagulans к действию желчи. Дальнейший пассаж Bacillus coagulans по тонкому и, далее, по толстому кишечнику, уменьшает вероятность инактивации желчью в связи с уменьшением ее концентрации.

Однако следующим неблагоприятным фактором является снижение в процессе продвижения по кишечнику содержания кислорода и переход к анаэробным условиям [19]. Если Bacillus coagulans достаточно устойчив к действию первых двух факторов (кислоты и желчи), то возникновение анаэробных условий (при том, что он не является облигатным анаэробом) или, возможно, какие-либо другие неблагоприятные факторы (например, дефицит глюкозы, как это отмечено в опытах in vitro [20]), приводят к тому, что этот микроорганизм в дистальных отделах кишечника подвергается респоруляции, и в значительной степени именно в этой форме покидает организм человека.

Взаимодействие с содержимым и стенками кишечника

Способность бактерий к адгезии к слизистой оболочке кишечника является важной характеристикой и параметром отбора пробиотиков, поскольку указывает на ее жизнестойкость. Стабильное прикрепление бактерии к стенке кишечника ассоциируется с более короткими сроками диареи, иммунотроп- ным действием, конкурентным исключением и др. Исследования in vitro относительно адгезивных свойств Bacillus coagulans в литературе не выявлены.

Между тем установлено, что бактерии рода Bacillus обладают некоторыми адгезивными свойствами по отношению к кишечному эпителию. Степень адгезии различна, на что указывает различное время транзита желудочно-кишечного тракта. Предполагается, что она зависит от способности бактерии образовывать пленки, которые присоединяются к поверхности частиц пищи или к слизистой оболочке кишечника [21]. Бактерии рода Bacillus способны образовывать многоклеточные структуры - колонии и биопленки [22]. Способностью образовывать колонии обладает и Bacillus coagulans [23,24]. Отмечена сильная адгезия B. coagulans к эпителиоцитам кишечника, намного более выраженная, чем у B. subtilis JT143 и L. acidophilus LY24, выделенных соответственно из пробиотиков BioPlus2B и FloraFIT. Активность адгезии достигает 44,5 ± 3,2, 48,9 ± 2,6, 42,6 ± 3,3 и 37,6 ± 2,4% соответственно к тощей кишке, подвздошной кишке, ободочной кишке и сигмовидной кишке.

Важный аспект действия пробиотиков, а также их безопасности - способность проникать через стенку кишечника и поступать в системный кровоток или в лимфоток. Для бактерий рода Bacillus показано только проникновение в лимфатическую систему через пейеровы бляшки кишечника. Так, указывается на то, что после 5-дневного введения мышам спор B. subtilis в дозе 10⁹ на животное бактерии (преимущественно в виде спор) обнаруживали в пейеровых бляшках и лимфатических узлах. Между тем, во внутренних органах (печени и почках) они не выявлялись, поэтому на основании этих данных нельзя говорить о системном всасывании спор [25]. В исследовании на инбредных (Balb/c) и аутбредных мышах также было показано, что споры Bacillus subtilis не проникали через слизистую кишечника [26]. Это является позитивным фактором, поскольку указывает на безопасность пробиотиков.

Клинический опыт применения пробиотиков на основе Bacillus coagulans также указывает на то, что они безопасны, и их фармакологическая активность определяется только местным действием в просвете кишечника или иммунологическими механизмами, в том числе опосредованными попаданием бактерий или их спор в лимфатическую систему.

Важными аспектами в действии пробиотиков на основе спор микроорганизмов является установление факта прорастания спор и формирования вегетирующих форм, относительное количество вегетирующих форм, степень пролиферации, а также вопрос, какие формы проявляют биологическую активность - споры, вегетирующие микроорганизмы или их элементы (метаболиты, клеточная стенка).

Приведем выявленные в открытой печати данные о кинетике Bacillus coagulans в кишечнике человека. Данные литературы свидетельствуют о том, что в среднем время между приемом Bacillus coagulans и прорастанием спор составляет 4 часа. Пик накопления бактериальной массы наблюдается через 18 часов.

Bacillus coagulans выделяется из организма медленно -- после последнего приема пробиотика споры в фекалиях обнаруживают в течение 7 дней. Этот феномен расценивают как большое клиническое преимущество, поскольку после последнего приема препарата его действие продолжается еще целую неделю, что позволяет быстро, в полном объеме, без риска осложнений и рецидивов, восстановить функцию желудочно -кишечного тракта после перенесенного заболевания. Вместе с тем большое значение имеет тот факт, что Bacillus coagulans, в конце концов, покидают организм человека -- это способствует восстановлению собственной, родной для человека, микрофлоры, без риска внедрения в нее генетически чужеродных штаммов. Таким образом, Bacillus coagulans относится к полурезидентным лактобактериям - выполнив в организме человека функцию пробиотика, он покидает организм.

Механизмы пробиотических эффектов

Bacillus coagulans улучшает микробиологический состав кишечника, увеличивая количество облигатных микроорганизмов и вытесняя патогенную флору. Так, в исследованиях на лабораторных животных с экспериментальным бактериальным дисбиозом после введения Bacillus coagulans наблюдался эффект подавления роста патогенных микроорганизмов и возобновление функционирования, в т.ч. за счет восстановления ферментообразования, а также нормализация количества микробных клеток нормальной микрофлоры кишечника. Искусственно вызванные у животных патогенными микроорганизмами острые патологии кишечника также быстро устранялись применением Bacillus coagulans [27]. При введении Bacillus coagulans CNCMI-1061 в качестве пробиотика поросятам до введения и на 1, 4 и 10 неделе введения оценивалось содержание в каловых массах различных бактерий: лактобактерий, лактококков, энтерококков, аэробных и анаэробных кокков, общих и фекальных колибактерий, клостридий, бактероидов, бифидобактерий. Было выявлено снижение числа энтерококков и колибактерий, причем эффект был более выраженный, чем при действии антибиотиков [28].

Исследование на мышах с ванкомицин- рецистентными энтерококками показало, что применение Bacillus coagulans приводит к статистически достоверному уменьшению количества этих энтерококков в сравнении с нелеченными мышами. В этом опыте бактерии вводили в дозе 10⁷ КОЕ на животное (или солевой раствор в контроле) один раз в день в течение 4 дней. В опытной группе количество ванко- мицин-резистентных энтерококков после терапии Bacillus coagulans уменьшилось на 35% против 0% в контроле (Р=0,03). Опыт показал перспективность Bacillus coagulans для подавления колонизации кишечника мультирезистентными бактериями, и в перспективе - как средства терапии мультирезистентных колитов [29].

В отношении патогенной микрофлоры пробиотики в целом могут оказывать следующие эффекты:

1. Прямое антагонистическое, подавляющее, действие на определенные группы микроорганизмов. Механизмы - продукция веществ с антибактериальным действием; конкуренция за пищевые субстраты; конкуренция за места связывания.

2. Изменение метаболизма микроорганизмов - повышение или подавление ферментативных активностей.

3. Стимуляция иммунитета - повышение уровня антител, активности макрофагов.

Рассмотрим, какие из этих механизмов действия свойственны Bacillus coagulans и какие, возможно, являются наиболее важными в осуществлении его пробиотических эффектов.

Выработка молочной кислоты

Вегетирующие формы Bacillus coagulans могут оказывать подавляющее действие на другие микроорганизмы за счет выделения основного продукта своей жизнедеятельности - молочной кислоты. Bacillus coagulans вырабатывает молочную кислоту из лактозы и других углеводных субстратов [2].

Высокая секреция пробиотиками молочной кислоты повышает кислотность в просвете кишечника до 4-5 и тем самым подавляет рост гнилостной флоры и E. coli, оптимум рН которых составляет 6-7. Однако, поскольку Bacillus coagulans не обладает свойством колонизации кишечника, этот механизм действия (путем изменения рН кишечника) вряд ли является значимым в его пробиотических эффектах.

Установлено, что молочная кислота может оказывать антибактериальное действие и за счет метаболического эффекта - в недиссоциированной форме она проникает через мембраны бактерий, снижает внутриклеточный рН, влияет на окислительное фосфорилирование в клетках.

Синтез бактериоцинов

Считают, что ингибиторная активность Bacillus coagulans в отношении гнилостных бактерий частично определяется выделяемыми им бактериоцинами.

Этот микроорганизм продуцирует коагулин - бакте- риоцин, относящийся к семейству педиоцинов [30]. Он является пептидом, состоящим из 44 аминокислотных остатков, последовательность которых сходна с таковой педиоцинов. Коагулин и педиоцин различаются только по одной аминокислоте в С- терминальном участке. Его молекулярная масса находится в пределах 3-4 кДа. Этот бактериоцин кодируется приблизительно 14 кБ фрагментом в плазмиде pI4. Последняя довольно стабильно и независимо экспрессирует данный бактериоцин. [31]. Установлено подавляющее действие коагулина в отношении кишечных бактерий родов Enterococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Listeria и Pediococcus. При этом пробиотик может проявлять как бактериостатическое, так и бактерицидное действие. Коагулин стабилен при температуре до 60^оС, рН в интервале 4-8, не расщепляется под действием а-амилазы, липазы или органических растворителей. Будучи пептидом, инактивируется протеазами.

Другой хорошо изученный бактериоцин из этого микроорганизма - лактоспорин [32] - выделяется бактерией в меньшей концентрации, и только при наличии в питательной среде или в кишечнике болезнетворной бактерии-мишени [33]. Антимикробная активность лактоспорина была показана в отношении Micrococcus luteus ATCC 10420 методом диффузии в агар. Протеиновая природа лактоспорина подтверждена путем его инактивации протеолитическими ферментами. Хотя активность лактоспорина зависела от рН, он был стабилен к нагреванию. Изоэлектриче- ская точка лактоспорина находилась в пределах 3.54.0.

В целом отмечается, что бактериоцины Bacillus coagulans ингибируют как грам- положительную, так и грам-отрицательную флору, и некоторые гнилостные грибы рода Fusarium [34].

Воздействие на нормофлору кишечника

В исследовании на цыплятах-бройлерах было показано, что Bacillus coagulans позитивно влияет на состав микрофлоры кишечника, причем этот эффект является дозозависимым. Цыплята (192 особи) были рандомизированы на 4 группы, в которых животные в течение 42 дней вместе со стандартным кормом получали пробиотик Bacillus coagulansв дозах 0 (контроль); 0,005; 0,02 и 0,04% от общей массы корма. Пробиотик во всех дозах (0,005-0,04%) увеличивал прирост массы тела цыплят в сравнении с контролем на 21 -42 дни исследования. При этом в группах животных, получавших Bacillus coagulans в дозах 0,02 и 0,04%, отмечено значительное увеличение в кишечнике числа бактерий рода Lactobacillus и снижение - E. coli. На основании этих данных авторами исследования был сделан вывод о том, что Bacillus coagulans является наилучшим микроорганизмом-пробиотиком, модулирующим состав кишечной микрофлоры цыплят [35].

В ряде клинических исследований показано, что пробиотики на основе Bacillus coagulans не только не подавляют нормальную флору кишечника, но и способствуют ее восстановлению при подавлении антибиотиками или в пожилом возрасте. Так, в исследовании (см. разд. Клинический опыт) с участием пожилых пациентов со сниженным содержанием бифидобактерий и ослабленной иммунной защитой, после применения Bacillus coagulans достоверно увеличились, в сравнении с исходными показателями, популяции Faecalibacter iumprausnitzii и бактерий рода Bacillus. Следует отметить, что этот вид действия сопровождался иммунотропным и противовоспалительным действием пробиотика, что, по- видимому, и определяло его позитивное влияние на нормоценоз [36].

Как отмечалось выше, Bacillus coagulans не остается в организме человека навсегда, а покидает его через 7 дней после последнего приема. Следовательно, он не нарушает природный микробиоценоз кишечника, который формировался в течение всей жизни конкретного человека [37].

Воздействие на иммунитет

В слизистой оболочке кишечника человека сосредоточено около 80% всех иммунологически активных клеток организма. Поэтому, несмотря на присутствие в кишечнике достаточно большого количества патогенов, инфицирование происходит редко.

Пероральное воздействие антигена (в том числе микробов и их токсинов) обычно создает местную IgA-защиту (секреторный иммунитет) и клеточноопосредованную реакцию. Молекулы IgA окружают бактерию и не дают ей присоединиться к стене кишечника или проникнуть в сосуды.

Иммуноглобулины образуют комплексы с антигенами, нейтрализуют токсины, препятствуют контакту микроорганизмов с клетками-«мишенями» макроорганизма, способствуют быстрому выведению микроорганизмов из ЖКТ благодаря агглютинации.

Для Bacillus coagulans, также как и для других сапрофитных бактерий рода Bacillus, установлено иммуномодулирующее действие. Оно было доказано в ряде экспериментальных и клинических исследований.

Иммуномодулирующие свойства Bacillus coagulans были изучены в экспериментах на мышах и крысах. Так, было установлено [38], что введение в течение 14 дней порошка бактерий крысам массой тела около 200 г в дозе 1 г на животное вызывало достоверное повышение уровня лейкоцитов в крови в сравнении с группой контроля. При этом повышался процент нейтрофилов и лимфоцитов (табл.3). После введения пробиотика у крыс также повышалась адгезия нейтрофилов к нейлоновым волокнам, что коррелировало с повышением числа нейтрофилов.

Была выявлена способность Bacillus coagulans влиять на гуморальный иммунитет - вызывать повышение уровня антител в крови.

Таблица 3. Влияние введения Bacillus coagulans на состав лейкоцитов крови крыс

Стимулирующее действие пробиотика на клеточный иммунитет установлено у крыс и у мышей в ответ на воздействие Т-зависимого антигена. Предварительное введение пробиотика вызывало уменьшение толщины стопы крыс в динамике после введения вакцины BCG.

Выявлено достоверное повышение индекса фагоцитарной активности у мышей, что указывает на стимулирующее влияние Bacillus coagulans на неспецифическую иммунную реакцию.

Полученные данные указывают на то, что Bacillus coagulans обладает стимулирующим действием в отношении как клеточного, так и гуморального иммунитета.

В научной литературе обсуждается вопрос о том, за счет чего в большей степени пробиотики оказывают свое действие - благодаря активным компонентам клеточной стенки или метаболитам, выделяемым живыми бактериями [39]. И тот, и другой механизмы в настоящее время экспериментально подтверждены. Приводятся данные исследования воздействия Bacillus coagulans на иммунную систему и на свободнорадикальные процессы в опытах in vitro, причем было оценено влияние, как метаболитов живых бактерий (супернатанта), так и изолированной клеточной стенки [40]. Споры Bacillus coagulans активировали нагреванием до 70^оС в течение 30 минут и инкубировали в течение 2 суток при 37^оС в питательной среде RPMI-1640. Путем центрифугирования получали супернатант живых бактерий, а для получения фрагментов клеточной стенки бактерии разрушали путем замораживания-оттаивания, затем центрифугировали и ресуспендировали осадок. Проведено изучение влияния бактерии на периферические кровяные мононуклеарные и на полиморфноядерные клетки.

Было установлено, что супернатант и клеточная стенка бактерий ингибировали спонтанное образование реактивных метаболитов кислорода в полиморфноядерных лейкоцитах человека. Клеточная стенка оказывала дозозависимое действие, а супернатант проявлял выраженное противовоспалительное действие в низких концентрациях. Присутствие супернатанта в соотношении 1:1000 уменьшало образование реактивных метаболитов кислорода на 20% (р < 0.004), а клеточная стенка вызывала подобный эффект (уменьшение на 30%) при соотношении 1:10. Предва рительная инкубация полиморфноядерных клеток с супернатантом и клеточными стенками до воспроизведения оксидативного стресса ингибировала образование Н202-индуцированного реактивного кислорода. Эффективными были разведения 1:10 и 1:100.

Изучение влияния на фагоцитоз проводилось иммунофлуоресцентным методом. Экспозиция поли- морфнояденых лейкоцитов с супернатантом в разведении 1:10 достоверно увеличивала фагоцитоз на 40%, а с клеточными стенками в том же разведении - на 25%. Инкубация с супернатантом и клеточными стенками в этой концентрации увеличивала популяцию полиморфноядерных лейкоцитов в целом, причем ряд клеток в ней были фагоцитирующими, остальные - нет. Дальнейшее разведение приводило к снижению числа фагоцитирующих клеток.

Супернатант оказывал выраженное дозозависимое влияние на миграцию полиморфноядерных лейкоцитов, причем на оба типа миграции - спонтанную и направленную (вызванную хемотаксисом). Направленная миграция вызывалась тремя агентами - бактериальным пептидом f-MLP, провоспалительным интерлейкином IL-8 и лейкотриеном LTB-4. При разведении супернатанта 1:10 спонтанная миграция повышалась на 300%, клеточные стенки вызывали более слабое повышение - на 25%. Миграцию, вызванную пептидом, супернатант в разведении 1:10 повышал на 200%, клеточные стенки - на 25%. Миграция, вызванная интерлейкином-8, подавлялась клеточными стенками на 60%, а супернатаном - в несколько меньшей степени. Выраженной дозозависимости эффекта не наблюдалось. Миграция лейкоцитов под действием лейкотриена В-4 также достоверно, на 60%, подавлялась клеточными стенками бактерий при разведении 1:1000, а супернатант оказывал менее выраженное действие.

Отмечалось выраженное дозозависимое индуцирующее действие супренатанта и клеточных стенок на экспрессию клеток-киллеров. Достоверное увеличение отмечено при разведениях 1:400, 1:1600 и 1:6400. Повышение содержания маркера CD69 на 32% отмечалось при разведении супернатанта 1:400, и на 36% - при том же разведении клеточных стенок.

Влияния на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов не было установлено при 5-дневной инкубации. Это указывает на отсутствие у бактерии митогенного потенциала.

Изучение влияния Bacillus coagulans на продукцию цитокинов показало, что оба продукта вызывали подавление выработки IL-2, усиление продукции IL-4, IL-10 и особенно IL-6, незначительное увеличение продукции TNF-a, достоверное увеличение INF-у.

Следовательно, Bacillus coagulans оказывает выраженное противовоспалительное действие, поддерживает основные механизмы природного иммунитета. Активность в опытах in vitro проявляют, как клеточная стенка бактерии, так и ее метаболиты. Проявление выявленных видов активности полезно не только с точки зрения защиты кишечника от болезнетворных микроорганизмов, но и в плане противовоспалительного действия, поддержания целостности эпителия и нормального пищеварения. Еще одним доказательством иммуномодулирующего действия Bacillus coagulans является его клинически выраженный эффект при артритах у животных и людей. Детально результаты контролируемого клинического исследования эффективности данного пробиотика при артритах представлены ниже (в разделе клинических исследований). Однако, учитывая ведущую роль иммунных механизмов в развитии артрита, можно сделать вывод о проявлении Bacillus coagulans системных противовоспалительных и иммуномодулирующих свойств [41].

В последние годы (2011 г.) был установлен иммуномодулирующий эффект Bacillus coagulans в условиях анитибиотикоассоциированной диареи, связанной с Clostridium difficile [42]. Данное заболевание - одно из осложнений, встречающееся у пациентов, принимающих антибиотики. В литературе имеется ряд доказательств эффективности при этом заболевании применения пробиотиков Lactobacillus spp. и Saccharomyces boulardii [43].

Bacillus coagulans в экспериментальных исследованиях проявлял эффективность на модели колита у мышей, вызванного Clostridium difficile. Bacillus coagulans (или физиологический раствор) вводили мышам внутрь по 2 х 10⁹ КОЕ в течение 15 дней. Патологию вызывали путем введения смеси антибиотиков с 5 по 8 дни, клиндамицина на 10 день и культуры C. difficile по 10⁴ КОЕ на 11 день эксперимента. Исследование показало, что в условиях введения Bacillus coagulans не происходило гибели мышей, а в группе контроля погибло 2 животных. На 12 день было выявлено достоверное (р = 0.0002) различие между группами по числу мышей с нормальным стулом - 66,7% против 13,0% в контроле. На 16 день этот показатель составил соответственно 23% и 0%. Микроскопия кишечника показала, что введение мышам Bacillus coagulans существенно снижало выраженность патологических изменений в толстом кишечнике - повреждения крипт, отека, лейкоцитарной инфильтрации. Отмечено также уменьшение связывания ядерного фактора NF-kB и снижение содержания хемокина MIP-2 до 16,3 против 24,6 пг/2 см) [44].

Подобные результаты были получены и в аналогичной постановке эксперимента при введении на 6-10 дни ванкомицина в дозе 50 мг/кг. Под действием Bacillus coagulans значительно лучшей была консистенция стула мышей. На 17 день он был нормальным у 88,9% животных опытной группы и ни у одного в контроле патологии. Значительно снижалась активность миелопероксидазы (маркера воспалительного процесса в кишечнике) - с 4,3 до 2,6 ЕД/2 см. Значительно лучшими были и показатели гистологических исследований, а также уровень хемокина кератиноци- тов [45].

Механизм терапевтического эффекта Bacillus coagulans при данной патологии заключался в подавлении под его действием высвобождения хемокинов, ослаблении притока нейтрофилов и уменьшении воспалительного процесса в толстой кишке. Bacillus coagulans снижал экспрессию ЦОГ-2 в толстой кишке мышей с колитом, вызванным Clostridium difficile [46].

Следует отметить, что в экспериментальных исследованиях на моделях колита, вызванного C. difficile у животных, была доказана эффективность и других пробиотиков: Saccharomyces boulardii у хомячков [47,48], Saccharomyces boulardii у мышей [49], Saccharomyces cerevisiae 905 у мышей [50], Lactobacillus rhamnosus у хомячков [51], Lactobacillus acidophilus у мышей [52] и Bacillus coagulans GBI-30, 6086 у мышей. Однако в обзоре ведущего специалиста в этой области (FitzpatrickL.R., 2013) указывается на то, что наилучшие результаты дает Bacillus coagulans, поскольку он оказывает действие и на начальную стадию колита, и на процесс выздоровления после введения ванкомицина.

Это же мнение нашло подтверждение и в клинических исследованиях. Результаты Кокрановского обзора 2008 года указывают на то, что в клинических условиях рекомендованные для лечения анитибиотик- ассоциированной диареи, связанной с Clostridium difficile, традиционные пробиотики на основе Saccharomyces boulardii и Lactobacillus spp., были недостаточно эффективны [53]. В этой связи составители обзора считают более перспективным доказательство клинической эффективности при этом заболевании нового пробиотика - Bacillus coagulans. В настоящее время клинические данные об опыте его применения в этой области отсутствуют.

Эффекты Bacillus coagulans на иммунную систему при воздействии на Т-клетки аденовирусом и вирусом гриппа А были изучены на 10 здоровых добровольцах (средний возраст 44 года). Испытуемые принимали пробиотик в виде капсул 1 раз в сутки в дозе 2 х 106 КОЕ в течение 30 дней. До приема пробиотика и по его окончании отбирали пробы крови добровольцев и в условиях in vitro определяли уровень цитокинов после предварительной экспозиции Т- клеток с аденовирусом и вирусом гриппа А. Было выявлено существенное увеличение выработки фактора некроза опухоли TNF-a в ответ на воздействие аденовируса и вируса гриппа А - на 250% и 709% соответственно в сравнении с исходными показателями. Это указывает на иммуномодулирующие свойства Bacillus coagulans - повышение Т-клеточного ответа при вирусных инфекциях [54].

В клиническом исследовании показана способность Bacillus coagulans значительно увеличивать выработку иммунологических маркеров. В контролируемом исследовании 10 здоровых добровольцев получали в течение 28 дней Bacillus coagulans (GanedenBC30) по одной капсуле, содержащей 500 млн КОЕ, в сутки, после чего оценивали содержание в сыворотке крови различных иммунологических маркеров. Было выявлено статистически достоверное повышение в сравнении с исходным уровнем CD3- СБ69+-клеток, интерлейкинов IL-6 и IL-8, у- интерферона и TNF-a в ответ на экспозицию с аденовирусом AdenoVI и вирусом гриппа FluTex. Увеличивалось также содержание IL-ip в ответ на воздействие аденовируса, но снижалось при действии вируса гриппа [55].

В цитируемом выше исследовании с участием пожилых пациентов со сниженным содержанием бифидобактерий и ослабленной иммунной защитой применение Bacillus coagulans повышало количество представителей нормальной флоры кишечника, причем этот эффект сопровождался иммунотропным и противовоспалительным действием, что, по мнению авторов, и определяло его позитивное влияние на нормоценоз.

Другие виды активности

Bacillus coagulans улучшает пищеварение. При этом рассматриваются следующие механизмы действия. Бактериявыделяет протеиназы, расщепляющие белки до полипептидов; полипептидазы, расщепляющие полипептиды до аминокислот; липазы, расщепляющие триглицериды до жирных кислот. Расщепление белков и липидов до более простых компонентов делает пищу более легко усваиваемой, что особенно полезно для новорожденных, реконвалесцентов и пожилых людей, Bacillus coagulans способен расщеплять лактозу, что делает его полезным у лиц с врожденной или приобретенной лактазной недостаточностью. В опытах in vitro Bacillus coagulans увеличивает активность р-галактозидазы (лактазы) и лактатдегид- рогеназы - ферментов, превращающих лактозу в молочную кислоту и осуществляющих ее дальнейший метаболизм, т.е. улучшает перевариваемость лактозы [56].

Это свойство лактобактерий - превращать лактозу в молочную кислоту - широко используется у пациентов с непереносимостью лактозы.

Как известно, молочная кислота (или лактат) существует в виде двух изоформ D(-) и L(+) - левовращающая и правовращающая:

соон соон сн сн

L (+) правовращающая молочная кислота

Bacillus coagulans секретирует преимущественно L(+) правовращающую молочную кислоту. В желудочно-кишечном тракте человека абсорбируются обе формы. Однако далее L^-форма быстро и эффективно метаболизируется, превращаясь в гликоген, а D^-форма метаболизируется слабо и в значительной степени экскретируется с мочой в неизмененном виде. Слабая метаболизация D(-)-лактата может привести к развитию метаболического ацидоза у детей. Именно эта форма молочной кислоты вырабатывается микрофлорой кишечника, а именно бактериями Bacteroides fragilis, некоторыми грамотрицательными кишечными аэробами, такими как Escherichia coli, а также L. acidophilus, применяемым в качестве пробиотика. В этом плане предпочтительным является Bacillus coagulans, который продуцирует хорошо усваиваемую L(+)-молочную кислоту.

Bacillus coagulans удаляет реактивный кислород, который образуется в кишечнике в результате различных метаболических реакций, проявляет антиоксидантную активность. Этот вид действия отмечается в период экспоненциального роста и в стационарной фазе развития микроорганизма при выращивании в середе, содержащей глюкозу и минеральные соли. Антиоксидантная активность Bacillus coagulans и его способность гасить свободные радикалы показана в различных экспериментах, причем в ряде исследований она была сопоставимой с активностью таких антиоксидантов как витамины С и Е. Было установлено, что выраженное антиоксидантное и антирадикальное действие Bacillus coagulans осуществляется за счет выделяемых бактерией гетерополимеров, содержащих 4 моносахарида [57].

Было установлено системное противовоспалительное действие Bacillus coagulans на модели каррагенанового отека стопы у крыс. Показано достоверное значительное уменьшение воспалительной реакции. В данной работе приведены результаты исследования двух пробиотических микроорганизмов - Bacillus coagulans и B. bifidum, как в капсулах, так и в виде порошка при пероральном введении. Диклофенак натрия использовали в качестве стандартного препарата в дозе 150 мг/кг массы тела животных. Отек был вызван введением 1% каррагеннана через 30 минут после применения препаратов. Степень отека определяли через 1,2,4 и 24 часа. Критериями эффективности служили толщина лапы и степень подвижности сустава. Как капсулированные пробиотики Bacillus coagulans и B. bifidum, так и некапсулированные, показали статистически достоверное (P<0.05) уменьшение отека в опытной группе животных. Степень ингибирования отека (толщина лапы) некапсулированных и капсулированных пробиотиков несколько отличалась и составила 37 ± 3% и 43 ± 2% после 24 часов лечения. В обеих группах значительно усилилась подвижность животных - подъемы по лестнице и общая подвижность. Эти результаты свидетельствуют о наличии у Bacillus coagulans выраженной противовоспалительной активности и перспективе его использования в комплексной терапии воспалительных патологий опорно-двигательной системы [58].

Bacillus coagulans выделяет короткоцепочечные жирные кислоты, кроме того, поглощает (включает в свои клеточные структуры) холестерин и нарушает энтерогепатическую циркуляцию желчных кислот вследствие деконъюгации желчных солей, что влияет на уровень холестерина крови человека. Еще один механизм гипохолестеринемического действия пробиотика - ингибирование холестерин- синтезирующего фермента 3-гидрокси-3- метилглутарин-коэнзим-редуктазы. Гипохолестери- немическое действие Bacillus coagulans показано в исследованиях на кроликах [59] и у человека [60].

Эффекты комбинации с витаминами

Пробиотики традиционно сочетают с витаминами группы В. Имеется ряд клинических исследований, доказывающих эффективность таких комбинаций, в частности, приведенное ниже, в разд. Клиническая эффективность, исследование комбинации на основе трех пробиотиков, в том числе Bacillus coagulans, и витаминов РР и группы В при синдроме раздраженной толстой кишки.

В препарате Лактовит Форте Bacillus coagulans находится в комбинации с витаминами В₉ (фолиевой кислотой) и В12 (цианокобаламином). При оценке целесообразности этого сочетания следует учитывать следующие аспекты.

Сама по себе культура Bacillus coagulans в процессе своей жизнедеятельности способна в некоторой степени синтезировать эти витамины. В целом синтез и секрецию витаминов группы В, в том числе и витаминов В₉ и В₁₂, осуществляют бактерии, заселяющие кишечник человека. Однако, как известно, это не покрывает потребность организма в данных витаминах, и остается потребность в их поступлении с пищей.

Приводятся результаты исследований, в которых были выявлены штаммы Bacillus coagulans - 406 и 416, наиболее интенсивно секретирующие витамин В₁₂. Изучение секреции витамина показало, что этот процесс происходит наиболее интенсивно при культивировании бактерии в среде с рН 6-7,5 при использовании синтетических и несинтетических сред, обязательно содержащих минеральные соли, микроэле- мены, аминокислоты, витамины (биотин, рибофлавин, пиридоксин, пантотеновая кислота и ниацин). Необходимыми условиями для эффективной выработки витамина В₁₂ является температура не менее 37^оС и наличие аэробных условий. При оптимальных условиях культивирования выработка витамина В12 штаммами Bacillus coagulans 406 и 416 составляет соответственно 2-3 и 3-6 мг/л среды. Однако в медицине используются другие, менее продуктивные, штаммы бактерии, и условия для ее роста в кишечнике не являются оптимальными. По этим причинам, а также вследствие того, что Bacillus coagulans в организме значительную часть времени находится в виде спор, нам представляется, что синтез витаминов В9 и В12 этим пробиотиком не имеет клинического значения.

С другой стороны, для большинства микроорганизмов фолиевая кислота и цианокобаламин являются факторами роста. Витамин В12 необходим для культивирования бактерий рода Bacillus в промышленных масштабах, он способствует их росту и интенсивной экскреции ферментов [61]. В одном из ранних исследований, с использованием 20 штаммов Bacillus coagulans,показано, что для роста бактерий всех этих штаммов требуется наличие в питательной среде фолиевой кислоты [62]. В другом исследовании также подтвердили усиление роста колоний бактерий Bacillus coagulans в присутствии фолиевой кислоты, а также других компонентов: основных аминокислот, тиамина (витамина В₁) и биотина (витамина В₇) [63]. Прямые данные по оценке влияния витаминов В9 и В₁₂ на культуральные и секреторные свойства Bacillus coagulans не выявлены. Однако их вносят как необходимые компоненты в среды для культивирования данного микроорганизма. Следовательно, введение этих витаминов в состав препарата Лактовит Форте является благоприятным фактором роста и развития Bacillus coagulans.

Витамины В12 и В9 являются необходимыми компонентами для скорейшей вегетации спор в толстом кишечнике. Феномен стимуляции этими витаминами проклёвывания спор был подтвержден в эксперименте, а в клинике показано ускорение на 1 -2 суток начальных проявлений клинических эффектов Bacillus coagulans, что довольно критично при острых диареях микробного происхождения, абдоминальных болях и спазмах.

Рассмотрим целесообразность введения в состав препарата витаминов В₉ и В₁₂ с точки зрения их собственных клинических эффектов.

Цианокобаламин обладает высокой биологической активностью. Он активирует жировой, белковый и углеводный обмен, участвует в биосинтезе нуклеиновых кислот. Он повышает регенерацию тканей, нормализует кроветворение, функции печени и нервной системы, активирует свертывающую систему крови, понижает содержание холестерина в крови (при атеросклерозе). В организме (преимущественно в печени) превращается в кофактор -- кобамид, входящий в состав многочисленных ферментов-редуктаз. Кобамид участвует в переносе метильных и других одноуглеродистых фрагментов и поэтому необходим для образования дезоксирибозы и ДНК, креатина, метионина -- донора метильных групп, в синтезе липотропного фактора -- холина, для превращения метилмалоновой кислоты в янтарную, входящую в состав миелина, для утилизации пропионовой кислоты. Способствует накоплению в эритроцитах соединений, содержащих сульфгидрильные группы, чем объясняется увеличение их толерантности к гемолизу.

Фолиевая кислота является незаменимым компонентом для синтеза нуклеиновых кислот и белков [64]. В организме человека она восстанавливается до коэнзима - тетрагидрофолиевой кислоты. Этот коэн- зим необходим для многих важных метаболических процессов. Он участвует в образовании пуринов, пи- римидинов, нуклеиновых кислот и аминокислот, необходим для эритро- и лейкопоэза, для обмена холина. Фолиевая кислота необходима для клеточного роста и репликации, поэтому она обладает репаративными свойствами, способствуя восстановлению повреждений эпителия.

Между витаминами В₉ и В₁₂ имеется синергизм, поскольку цианокобаламин в составе фермента редуктазы восстанавливает фолиевую кислоту в активную тетрагидрофолиевую. В синергизме с витамином В12 фолиевая кислота стимулирует кроветворение - дифференциацию и дозревание мегалобластов, принимает участие в эритропоэзе. Взаимодействие этих витаминов заключается также в том, что при длительном применении фолиевой кислоты возможно снижение концентрации в крови витамина В₁₂. Поэтому длительное применение фолиевой кислоты рекомендуется комбинировать с приемом витамина В12.

Важным аспектом биологического действия витаминов В9 и В12 является их влияние на иммунную систему.

Витамин В12 обладает иммунотропным действием, сходным с дибазолом, - повышает неспецифическую сопротивляемость бактериальным инфекциям, что, по-видимому, является следствием активации всей совокупности механизмов, определяющих антиинфекционную резистентность организма. Введение витамина B₁₂ приводит к повышению бактерицидной и опсонизирующей активности сыворотки крови, увеличению продукции нормальных и иммунных антител, усилению фагоцитарной активности лейкоцитов и ретикулоэндотелиальной системы. Стимуляция фагоцитоза проявляется и в условиях анти- биотикотерапии. В действии витамина В₁₂ значительный интерес вызывает его способность стимулировать образование интерферона и проявлять некоторое защитное действие при вирусных инфекциях при отсутствии непосредственного влияния на вирусы. Под действием витамина В12 отмечено повышение резистентности к различного рода неблагоприятным воздействиям, в том числе инфекционным, при этом адаптогенное действие витамина отчетливо проявляется лишь при профилактическом применении.

Витамин В₉ также оказывает действие на иммунную систему. При дефиците этого витамина отмечено подавление активности CD8- и NK-клеток, что ассоциировано с уменьшением резистентности к инфекциям [65]. Фолатный рецептор (или рецептор витамина В₉) интенсивно экспрессируется на поверхности Т-регуляторных клеток [66] и выполняет специфическую регуляторную функцию подавления апоптоза в этих клетках. В отсутствие витамина В9 нативные Т-клетки могут дифференцироваться в Т- регуляторные клетки, но дифференцированные Т- регуляторные клетки не выживают вследствие подавления экспрессии антиапоптозных молекул (в т.ч. Bcl- 2). Как результат, у мышей с дефицитом витамина В₉ отмечается значительно меньшее количество кишечных Т-регуляторных клеток, чем у мышей с достаточным уровнем этого витамина [67]. При дефиците фолиевой кислоты наблюдается ослабленная выживаемость Т-регуляторных клеток, что приводит к повышению чувствительности кишечника к воспалительным процессам инфекционного и аутоиммунного характера [68]. Витамины группы В осуществляют контроль иммунного ответа через мукозо- ассоциированный инвариант Т-клеток (MAIT). Клетки MAIT это неспециализированные Т-клетки, экспрессирующие полу-инвариантные ав-Т-клеточные рецепторы и ограниченные молекулами MR1 комплекса гистосовместимости МНС-1; эти клетки в больших количествах обнаруживаются в кишечнике [69]. Клетки MAIT могут мгновенно реагировать на бактериальные инфекции (в т.ч., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis). Для иммунного ответа достаточно, чтобы антигены этих бактерий были представлены на MR1. Индуцируемые бактериями метаболиты витаминов В9 и В2 связываются с молекулами MR1 и бактериальными антигенами на поверхности клеток MAIT и совместно запускают иммунный ответ [70]. Данные этих исследований свидетельствуют о том, что витамины группы В являются обязательным компонентом устранения иммунного дисбаланса - восстановлению иммунитета при иммунодефиците и при аллергических реакциях, и являются обязательными для проявления нормальной иммунной реакции на появление бактерий в кишечнике.

Таким образом, витамины В₉ и В₁₂ необходимы для процесса кроветворения, препятствуют развитию анемии, обладают репаративными и иммуностимулирующими свойствами. Поэтому совместное применение этих витаминов целесообразно при анемиях, а также при состояниях, связанных с недостаточностью функции кишечника (при нарушениях всасывания), в восстановительный период после перенесенных инфекционных заболеваний, операций, ожогов и травм, лучевой и химиотерапии, как средства профилактики инфекционных заболеваний.

Комбинированное применение Bacillus coagulans и витаминов В₉ и В₁₂ является обоснованным, как с точки зрения стимуляции витаминами роста и размножения бактерии, так и с целью оказания системных, в том числе иммунотропных, эффектов. Сочетание витаминов В₉ и В₁₂ с Bacillus coagulansпозволяет нормализовать функцию кишечника, восстановить процессы пищеварения и всасывания при колитах. Является целесообразным также применение этой комбинации при нарушениях баланса микрофлоры вследствие антимикробной терапии, кишечных инфекций или других причин.