Клітинно-тканинні технології у лікуванні хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

14.01.03 - хірургія

Клітинно-тканинні технології у лікуванні хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок

Попандопуло Андрій Геннадійович

Донецьк 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМН України.

Науковий консультант: - доктор медичних наук, професор Міміношвілі Омарі Ісідорович, Інститут невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМН України, завідувач відділу абдомінальної хірургії і політравми, Донецький державний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, завідувач кафедри госпітальної хірургії ім. В.М. Богославського.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, член - кореспондент НАН України Ніконенко Олександр Семенович, Запорізька медична академія післядипломної освіти МОЗ України, ректор,

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, лауреат Державної премії СРСР Дрюк Микола Федорович, Інститут хірургії та трансплантології ім. О.О. Шалімова АМН України,

завідувач відділу мікросудинної та пластичної хірургії доктор медичних наук, професор Гюльмамедов Фарман Ібрагімович, Донецький державний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, завідувач кафедри загальної хірургії.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук О.А. Штутін.

Анотація

виразковий раневий кінцівка лікування

Попандопуло А.Г. Клітинно-тканинні технології у лікуванні хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.01.03 - хірургія. Інститут невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака Академії медичних наук України, Донецьк, 2007. Дисертація присвячена проблемі лікування хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок з використанням клітинно-тканинних технологій.

Досліджено морфо - функціональні критерії клітинних популяцій ХВРД. Встановлено, що ХВРД мають ряд загальних характеристик, які не залежать від етіології і виявляються в ступені дезагрегації міжклітинного матриксу та зміною проліферативного потенціалу сполучній тканини. Ці критерії дозволяють прогнозувати ефективність лікування ХВРД. Для оцінки можливості терапевтичної дії за допомогою КТТ проведено in vitro моделювання їх місцевого застосування. Одержані дані доводять доцільність використання КТТ.

Наводяться дані про ефективність розробленого алгоритму в лікуванні 264 хворих з ХВРД з урахуванням патофізіологічних, технологічних і організаційних аспектів застосування біотехнологічних продуктів. При аналізі клінічних результатів встановлено, що використання КТТ в комплексній консервативній терапії дозволило в 1,2 рази збільшити частоту загоєння ХВРД, знизити тривалість лікування в 2,1 рази та зменшити кількість рецидивів в 2 рази. Використання хірургічної тактики в комбінації з КТТ дозволило досягти загоєння у 88,9% і знизити кількість незадовільних результатів в 2,3 рази та зменшити середні терміни лікування в 1,26 рази.

Ключові слова: хронічна рана, трофічна виразка, загоєння ран, біотехнології, лікування.

Аннотация

Попандопуло А.Г. Клеточно-тканевые технологии в лечении хронических язвенно - раневых дефектов нижних конечностей. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.01.03 - хирургия. Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака Академии медицинских наук Украины, Донецк, 2007. Диссертация посвящена вопросам лечения хронических язвенно-раневых дефектов нижних конечностей с использованием клеточно-тканевых технологий.

Для решения поставленной цели произведено изучение некоторых звеньев патогенеза хронических ран и трофических язв нижних конечностей. Изучен пролиферативный потенциал основных клеточных популяций ХЯРД - фибробластов в сравнительном аспекте с фибробластами здоровой кожи и фетальными клеточными культурами. Установлено, что по данным культивационных критериев, МТТ - анализа и морфологическим характеристикам имеются различия в пролиферативном потенциале фибробластов ХЯРД со снижением этого показателя в 1,5 раза, что проявляется сроками формирования монопласта на 22,3 ± 2,8 сутки и снижением скорости увеличения клеточности культур клеток в 3,7 раза.

При оценке функционального статуса фибробластов ХЯРД выявлены достоверные изменения в рецепторном аппарате, заключающиеся в отсутствии некоторых составляющих рецепторов коллагена, ламинина и фибробнектина, в частности Ь2, Ь4 и Ь6 цепи интегринов, что обуславливает неполноценность клеточно-субстратной адгезии и межклеточных взаимодействий. Сделан вывод о существенных изменениях свойств клеточных популяций ХЯРД, проводящих к хронизации раневого процесса и неэффективности традиционных методов лечения. Для оценки возможности терапевтического воздействия на функционально неполноценный раневой дефект при помощи КТТ произведено in vitro моделирование их местного применения, путем создания микс-культуры из фибробластов ХЯРД и функционально сохранных аллогенных клеток. Полученные данные (увеличение скорости пролиферации пула клеток ХЯРД в 2,3 раза, восстановление некоторых элементов рецепторного аппарата) говорят о положительном терапевтическом регуляторном воздействии, что доказывает целесообразность использования КТТ в клинической практике.

При анализе морфологических данных исследования установлено, что ХЯРД имеют ряд общих морфологических характеристик, не зависящих от этиологии и проявляющихся в степени дезагрегации межклеточного матрикса и изменением пролиферативного потенциала соединительной ткани и эпителия. В прогностическом плане, по результатам ретроспективного анализа эффективности консервативного лечения были определены прогностические критерии (изменение уровня детекции виментина, PCNA, плотность и направленность коллагеновых волокон при поляризационной микроскопии), которые позволяют достоверно определить эффективность консервативного лечения ХЯРД и сформулировать показания к оперативной тактике.

Уточнение некоторых звеньев патогенеза позволило сформулировать универсальный концептуальный подход к тактике местного лечения ХЯРД вне зависимости от этиологии заболевания, при условии невозможности его радикального излечения или полной компенсации. Для стандартизации методологического подхода в клинической части исследования разработана оригинальная классификация ХЯРД по глубине и площади поражения, которая позволила сформировать кластерные репрезентативные группы пациентов с консервативной и оперативной тактикой лечения. В каждой из групп были сформированы подгруппы с учетом применения КТТ в комплексном лечении и без них. Приводятся данные об эффективности разработанного алгоритма лечения ХЯРД с учетом патофизиологических, технологических и организационных аспектов применения биотехнологических продуктов. При сравнительном анализе полученных клинических результатов установлено, что использование КТТ в комплексной консервативной терапии позволило в 1,2 раза увеличить частоту заживления ХЯРД, снизить продолжительность лечения в 2,1 раза и снизить количество рецидивов в 2 раза по сравнению с традиционными методами консервативной терапии. Использование хирургической тактики в комбинации с КТТ позволило добиться заживления у 88,9% пациентов и снизить количество неудовлетворительных результатов в 2,3 раза по сравнению с традиционными хирургическими методами, уменьшить средние сроки лечения в 1,26 раза за счет ускорения эпителизации и улучшения приживления аутодермопластик. При анализе отдаленных результатов лечения выявлено, что при использовании КТТ в комплексе хирургического лечения снижается количество рецидивов ХЯРД.

Консервативное ведение ХЯРД с использованием клеточных технологий имеет ряд преимуществ, по сравнению с классическим консервативным ведением ран, но уступает по своей результативности даже классическому хирургическому подходу. Лучшие результаты лечения получены в группе больных, которым избрана активная хирургическая тактика ведения ХЯРД в комбинации с КТТ.

Ключевые слова: хроническая рана, трофическая язва, заживление ран, биотехнологии, лечение.

Annotation

Popandopulo A.G. Cellular and tissue technologies in treatment leg chronic ulcerous and wound defects. - Manuscript.

The dissertation on the competition of graduate scientific degree of doctor in medical sciences, speciality 14.01.03 - surgery. Institute of Urgent and Recovery Surgery named from Gusak of Ukrainian Academy of Medical Sciences, Donetsk, 2007. The dissertation is devoted to a problem of treatment leg chronic ulcerous and wound defects with using of cellular and tissue technologies.

Morphological and functional criteria of cellular populations of leg chronic ulcerous and wound defects have been investigated. It is established, that leg chronic ulcerous and wound defects have some general characteristics, which are not dependent from aetiology and are determined by a degree of intercellular matrix's disaggregation and change of connective tissue's proliferative potential. These criteria allow making efficiency of treatment prediction of leg chronic ulcerous and wound defects. The analysis of modelling in vitro local application of cellular and tissue technologies has been lead for an estimation of a capability of therapeutic action. The received data prove expediency use cellular and tissue technologies.

The results of treatment of 264 patients with leg chronic ulcerous and wound defects are cited on efficiency of the developed algorithm in with the account pathophysiological, technological and organizational aspects of application of biotechnological products.

At the analysis of clinical results it is established, that use of cellular and tissue technologies in complex conservative therapy has allowed to increase frequency of healing of leg chronic ulcerous and wound defects in 1,2 times, to lower duration of treatment in 2,1 times and to reduce amount of relapses in 2 times. Use of surgical tactics in a combination with cellular and tissue technologies has allowed to achieve healing in 88,9 % and to lower amount of unsatisfactory results in 2,3 times and to reduce average terms of treatment in 1,26 times.

Key words: chronic wound, trophic ulcer, healing of wounds, biotechnologies, treatment.

1. Загальна характеристика роботи

Лікування і догляд за ранами залишається однією з важливих проблем сучасної медицини. Хворі, що мають рани різного генезу, складають значну частину пацієнтів хірургічних стаціонарів. В останні роки відбувається перегляд багатьох уявлень про способи лікування ран різної етіології. З урахуванням етіологічних захворювань, що обумовлюють утворення хронічних виразково-раневих дефектів (ХВРД) нижніх кінцівок, поширеність цього патологічного стану в дорослого населення промислово розвинених країн досягає близько 6 %.

Незважаючи на значні досягнення в лікуванні (ефективність у спеціалізованих центрах коливається від 75% до 90% [Чернуха Л.М., Дрюк М.Ф., 2005; E.A. Nelson, S. O'meara, et al., 2006]), справжня частота загоєння ХВРД, при неможливості радикальної корекції основного захворювання, досі недостатня. Це пов'язано з тим, що при окремих патологічних станах радикальна реабілітація неможлива у зв'язку з особливостями патогенезу чи недостатньо ефективними засобами лікування на сучасному рівні [J.F. O'Brien, P.A. Grace, I.J. Perry et al.,2006; Smith P.C., 2006]. На сьогоднішній день для консервативного лікування трофічних виразок використовується найширший спектр засобів, але жоден з них не дає гарантованого клінічного ефекту [Кияшко В.А., 2002; Falanga V., 2005]. Запропоновані також різноманітні способи хірургічного закриття виразкових дефектів. На жаль, вони також мають свої обмеження і недоліки [Богачев В.Ю., Богданец Л.И., 2002; Harding K.G., Morris H.L., Patel G.K., 2002].

Встановлено, що резистентні до стандартної терапії ХВРД мають деякі відмінності в профілі експресії регуляторних молекул, що надають інгібіруючого впливу на клітинні процеси та формують дефіцит стимулюючих агентів [U. Wollina, K. Liebold, W.D. Schmidt et al., 2002; Drosou A., Falabella A., Kirsner R., 2003; Smith K.D., Wells A., Lauffenburger D.A., 2006; J.T. Trent, A. Falabella, W.H. Eaglstein, R.S. Kirsner, 2005]. Це обумовлює патологічний перебіг процесу раневого загоєння, а також пошук специфічних шляхів його корекції. Одним з найбільш перспективних напрямків в області створення адекватних терапевтичних схем є застосування клітинно - тканинних технологій (КТТ), який ґрунтується на їхній здатності до відновлення процесів фізіологічної регенерації як за рахунок стовбурових клітин різного рівня потентності, так і відновлення тканинних дефектів за рахунок стимуляції проліферації збережених диференційованих клітинних популяцій [Алексеев А.А., Яшин А.Ю., 1996; Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г., 2000; Angirasa A.K., Willrich A., Cooper B., Stuck R., 2006; Ehrlich H.P., 2004; H. Bannasch, M. Fohn, T. Unterberg et al., 2003; E. Tateishi-Yuyama, H. Matsubara, T. Murohara et al., 2003].

Таким чином, остаточно не вивчені особливості морфо-функціональних процесів в ХВРД, не обґрунтовані та не розроблені способи і алгоритми застосування КТТ в лікуванні цієї патології. Тому проблема лікування ХВРД нижніх кінцівок, особливо в ситуаціях, що супроводжуються неможливістю компенсувати чи радикально розв'язати основне захворювання, нажаль, дотепер є актуальною і соціально значимою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана у рамках НДР Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМН України “Розробити клітинно-тканинні технології для хірургічної профілактики та лікування хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок”, затвердженої постановою Президії АМН України № 1/5 від 12 січня 2004 року, номер держреєстрації 0104U006347, науковий напрямок №4. Тема дисертації затверджена на засіданні координаційної ради ІНВХ ім. В.К. Гусака АМН України 07.06.2004 року (протокол № 5) та на засіданні проблемної комісії зі спеціальності „Хірургія” (протокол № 17 від 11.11.2004 р.).

Мета дослідження: поліпшити результати лікування хворих із хронічними виразково - раневими дефектами нижніх кінцівок на підставі вивчення їхніх морфо-функціональних особливостей і розробки системи комплексного лікування з використанням клітинно-тканинних технологій.

Задачі дослідження:

Вивчити цитоморфологічні й функціональні особливості клітинних популяцій хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок з урахуванням етіологічних факторів.

Вивчити in vitro проліферативний потенціал клітинних популяцій хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок.

Обґрунтувати використання культуральних технологій у комплексному лікуванні хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок.

Розробити класифікацію хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок за глибиною й площею ураження тканин.

Розробити способи закриття хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок з використанням клітинно-тканинних технологій.

Вивчити особливості загоєння хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок при використанні клітинно-тканинних технологій.

Розробити алгоритм використання клітинно-тканинних технологій у хірургічному лікуванні хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок.

Вивчити клінічну ефективність розроблених технологій лікування хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок.

Об'єкт дослідження: репаративні процеси у хронічних виразково-раневих дефектах нижніх кінцівок та засоби їх корекції із застосуванням клітинно-тканинних технологій.

Предмет дослідження: морфо-функціональні особливості клітинних популяцій ХВРД та комплекс методів з використанням КТТ, спрямованих на поліпшення результатів лікування ХВРД нижніх кінцівок.

Методи дослідження: Загальноклінічні, інструментальні (ангіографічні, доплерографічні, електротермометричні, капіляроскопічні, електроміографічні) - для визначення особливостей клінічної картини та ефективності лікування. Культуральні, гістологічні, імунологічні, імуногістохімічні, цитологічні, вірусологічні, бактеріологічні - для вивчення особливостей морфо - функціонального стану клітинних популяцій ХВРД а також для прогнозування перебігу раневого процесу та вибору тактики лікування. Статистичні - для визначення вірогідності отриманих результатів.

Наукова новизна.

В роботі вперше: сформульована концепція універсальності цитоморфологічних, функціональних і проліферативних змін клітинних популяцій ХВРД незалежно від етіологічних чинників на визначеній стадії розвитку дефекту тканини; вивчені цитоморфологічні та функціональні особливості клітинних популяцій ХВРД нижніх кінцівок; визначено in vitro проліферативний потенціал клітинних популяцій ХВРД; обґрунтовано використання культуральних технологій у комплексному лікуванні ХВРД нижніх кінцівок; розроблена класифікація ХВРД за глибиною та площею, яка дозволяє проводити адекватну оцінку тяжкості місцевого ураження тканин; розроблений комплекс КТТ для лікування ХВРД нижніх кінцівок (підтверджено патентами України на винахід); визначені особливості загоєння ХВРД нижніх кінцівок при застосуванні клітинно-тканинних еквівалентів; розроблено алгоритм використання КТТ у комплексному лікуванні ХВРД нижніх кінцівок з вивченням його медичної ефективності, що підтверджено патентами України на винахід.

Практична значимість результатів дослідження.

На підставі проведеного дослідження надані рекомендації з діагностики та лікування ХВРД: рекомендована класифікація ХВРД за глибиною та площею, яка дозволяє проводити адекватну оцінку тяжкості місцевого ураження тканин; рекомендований алгоритм морфологічного дослідження з використанням окремих видів мікроскопії, зокрема, поляризаційної мікроскопії та ШИК-реакції, для прогнозування ефективності консервативного лікування ХВРД; рекомендовано алгоритм лікування місцевих запально-некротичних проявів захворювання, як перший обов'язковий етап терапевтичної програми; зроблені висновки щодо найбільш ефективного способу очищення ХВРД; розроблено та впроваджено в практику алгоритм застосування КТТ з урахуванням індивідуальних особливостей перебігу основного захворювання, що дозволив стандартизувати тактичні підходи в місцевому лікуванні ХВРД нижніх кінцівок; надані рекомендації щодо використання аутологічного та аллогенного клітинного матеріалу. Розроблений та впроваджено патогенетично обґрунтований комплекс діагностично-лікувальних заходів дозволив поліпшити результати лікування при консервативній тактиці в 1,2 рази, при хірургічному лікуванні ХВРД в 2,3 рази, зменшити середні строки лікування в 1,26 рази.

Впровадження результатів дослідження.

Результати дослідження впроваджені в практику роботи відділу термічних уражень, відділу абдомінальної хірургії і політравми, відділу невідкладної і відновної судинної хірургії Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМН України, хірургічних відділень Донецького обласного клінічного територіального медичного об'єднання, хірургічного відділення МЛ №9 м. Донецька, Донецького міського центру “Діабетична стопа”, хірургічного відділення Івано-Франківської Центральної міської клінічної лікарні. Матеріали наукового дослідження використовуються в учбовому процесі на кафедрі госпітальної хірургії ім. В.М. Богославського, кафедрі загальної практики - сімейної медицини, кафедрі комбустіології, пластичної хірургії і урології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України.

Особистий внесок здобувача.

Автору належить оригінальна ідея та методологія дослідження. Автором самостійно висунута концепція універсальності патоморфологічних змін клітинних популяцій ХВРД незалежно від етіологічних причин на визначеній стадії розвитку дефекту тканини. Самостійно проведено: підбір груп і клінічне обстеження пацієнтів; самостійно проведено консервативне лікування 75% пацієнтів та самостійно оперовано 85% хворих. В групах пацієнтів з застосованими КТТ цей відсоток складав 86% та 94% відповідно. Автором самостійно дана оцінка даних обстеження; трактування одержаних результатів та проведення статистичного аналізу; самостійно розроблено алгоритм використання КТТ в лікуванні ХВРД нижніх кінцівок та проаналізовано його клінічну ефективність. Автор брав безпосередню участь в розробці технологій та створенні біотехнологічних трансплантатів в Лабораторії клітинного та тканинного культивування ІНВХ ім. В.К. Гусака АМНУ. Сумісно з співавторами брав участь у розробці класифікації ХВРД. Морфологічні та цитологічні дослідження, що включені у дану роботу, проведені спільно з профільними фахівцями (Лабораторія фундаментальних досліджень Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМНУ).

Апробація роботи. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на науково-практичній конференції „Современные методы диагностики и комплексного лечения трофических язв” (Донецьк, 2003), міжнародній науково-практичній конференції „Проблеми клітинної та тканинної трансплантології” (Івано-Франківськ, 2003), на 3-й міжнародній науково-практичній конференції „Актуальные вопросы неотложной и восстановительной медицины” (Ялта, 2003, 2006), першому з'їзді хірургів „Актуальні питання пластичної, реконструктивної та естетичної хірургії” (Київ, 2004), науково-практичній конференції, присвяченій 200-річчю Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна (Харків, 2004), на конференції, присвяченій хірургічному лікуванню ран і дефектів м'яких тканин (Київ, 2004), XXI з'їзді хірургів України (Запоріжжя, 2005), на науково-практичній конференції „Актуальні проблеми клінічної хірургії та трансплантології” (Київ, 2005), міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 45-річчю Донецького опікового центру (2005), на І з'їзді комбустіологів Росії (Москва, 2005), міжнародній конференції „Инновационные технологии в современной медицине”, присвяченій 75-річчю Донецького державного медичного університету ім. М. Горького (2005), на засіданні Донецького наукового товариства хірургів (2005), всеукраїнській хірургічній конференції „ІІ Скліфосовські читання”, присвяченій 170-річчю з дня народження М.В. Скліфосовського (Полтава, 2006), VIII Українській конференції з питань клінічної і лабораторної імунології, алергології і імунореабілітації (Київ, 2006), I з'їзді судинних та ендоваскулярних хірургів України „Тяжкі форми хронічної венозної недостатності” (Київ, 2006), науково-практичній конференції „Рани, ранова інфекція” (Київ, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 49 робіт, з них у виданнях, затверджених переліком ВАК - 27 статей, у тому числі 5 самостійних. Отримано 8 патентів України на винахід. 14 робіт опубліковано в збірниках матеріалів і конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 369 сторінках комп'ютерного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, 6 розділів самостійних досліджень, аналізу й обговорення отриманих результатів, висновків і списку використаної літератури, що містить 446 джерел, (з них 284 латиницею), містить 91 рисунок і 53 таблиці.

2. Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Роботу виконано на аналізі матеріалу лікування 634 пацієнтів з трофічними виразками і хронічними ранами нижніх кінцівок. Після радикальної судинної реконструкції, або шкірно-пластичних операцій у 374 з них (86,6%) вдалось домогтися загоєння ХВРД. Для безпосереднього аналізу було відібрано 264 пацієнта з ХВРД нижніх кінцівок, яким у результаті огляду профільного фахівця і додаткових обстежень на попередньому етапі лікування зроблено висновок про неможливість радикальної корекції основного захворювання. Середній вік пацієнтів склав 58,5 років (від 21 до 72 років). Тривалість існування ХВРД в середньому була 2,4 роки. Початково середня площа ХВРД досягала 38,9 см². Жінок було 156 (59,1%), чоловіків - 108 (40,9%).За нозологічними одиницями пацієнти були представлені: ХВН - 98 хворих (37,1%); гіпертонічна хвороба - 6 пацієнтів (2,3%); артеріальна ішемія - 38 (14,4%); цукровий діабет - 61 пацієнт (23,1%); післятравматичні зміни м'яких тканин спостерігалися у 24 осіб (9,1%), нейротрофічні виразки - 11 пацієнтів (4,2%). В 26 спостереженнях (9,8%) було присутнє сполучення різних патогенетичних факторів, визначити основний з яких було неможливо. З 264 пацієнтів в анамнезі було оперовано 152 (57,6%). 43 пацієнтам (28,3% від операцій в анамнезі) раніше були виконані реконструктивні операції на магістральних артеріях, 63 хворим (41,4%) на попередньому етапі виконувалися флебокоригуючі оперативні втручання і 46 (30,3%) - різні шкірно-пластичні операції.

98 пацієнтам (37,1%) через особливості патогенезу захворювання з самого початку проводилася консервативна терапія місцевого дефекту тканини. З урахуванням пацієнтів, що відмовилися від показаного радикального оперативного лікування (14 осіб), частка хворих з консервативним способом в анамнезі лікування склала 42,4% (112 спостережень). Основою для формування груп став метод конвертів з попередньої кластерізацією за етіологічним чинником формування дефекту тканини. Були сформовані дві групи пацієнтів з ХВРД - перша група пацієнтів (КГ), яким проводилося консервативне лікування дефекту тканин і друга група (ХГ) - пацієнти, яким на етапі лікування застосовані хірургічні методи обробки ХВРД. При цьому в групи включалася рівна кількість хворих з основною патологією.

У кожній із груп, методом конвертів були сформовані по дві підгрупи - підгрупа з традиційними засобами впливу на раневий процес (традиційна терапія - ТТ) і підгрупа пацієнтів, яким у комплексному лікуванні застосовані клітинно-тканинні технології (КТТ). Результати лікування (РЛ) були ретроспективно розподілені на дві групи: перша - у якій досягнуто загоєння раневого дефекту (РЛ1) і друга - у якій включені спостереження, що не супроводжувалися епітелізацією дефекту (РЛ2). Ретроспективно був проведений аналіз морфологічних і імунологічних досліджень біопсійного й операційного матеріалу ХВРД у групах за результатами лікування з оцінкою ступеня кореляційної залежності ефективності використовуваних методів від морфо-функціональних даних. За основними кваліфікаційними характеристиками групи спостережень були репрезентативні і підлягали порівнянню за ефективністю застосованих методів лікування. Роботи з культивування клітин і створенню тканинних еквівалентів виконувалися в Лабораторії клітинного і тканинного культивування ІНВХ ім. В.К. Гусака АМНУ.

Імунологічні методи, що були використані при проведенні цієї роботи:

імуномаркірування поверхневих антигенів клітин у культурі при безферментативному знятті і без застосування хімічної фіксації з використанням моноклональних антитіл: молекули активації й адгезії - CD1a, 23, 22, 40, w60, 24, 141, 44, 58, 2, 166, 36, 147, 29, 49a, 49b, 49c, 49d, 49e, 49f, 104, 51, 54, 56, 62E, 62P, 62L, 31, 50, 11a, 11b, 11c, 41a, 95, 106, CLA; рецептори факторів росту і цитокінів - СD140б, 140в, IL-1б, IL-1в, 122, 126, 128; молекул МНС - HLA-A,B,C; HLA-DR; HLA-DQ; CLIP. В роботі використовувалися МКА, рекомендовані для специфічного маркірування поверхневих антигенів 7-ою Міжнародною робочою нарадою з лейкоцитарних диференційовочних антигенів (Harrogate, UK, 2000). Усі МКА і ізотип-контролі були виробництва BD PharMingen, США,

візуальний моніторинг РКН26 і РКН67 маркірованої мікс-культури в процесі культивування;

Морфологічні методики. Гістологічне вивчення препаратів проводилося в Лабораторії фундаментальних досліджень ІНВХ АМНУ (зав. лаб., к.мед.н., доц. Гнилорибов А.М.).

Тканини, призначені для морфологічного дослідження, фіксували в 10% розчині забуференого формаліну (рН 7,6) протягом 24 годин. Далі їх збезводнювали і заливали в парафін при температурі не більш 60°С на станції Leica EG1140 H/C. Зрізи тканин товщиною 5±1 мкм виготовляли на ротаційному мікротомі Microm HM325 c системою переносу зрізів (STS) на скельця Super Frost® Plus. Отримані зрізи офарблювали гематоксиліном та еозином, толуїдиновим синім при рН 2,6 і 5,3, сафраніном і стійким зеленим (fast green), за Ван-Гізоном, Вейгертом, ставили ШИК-реакцію. Пофарбовані зрізи укладали в канадський бальзам, а зрізи, пофарбовані толуїдиновим синім - у заключне водяне середовище Faramount (фірма DAKO, Данія).

Виконувалося фарбування імуногістохімічним методом для виявлення маркеру проліферації клітин PCNA і проміжного філаменту віментину в клітинах мезенхімального походження. Використовувалися моноклональні первинні антитіла до PCNA (клон PC10) і віментину (клон Vim 3B4), система візуалізації LSAB 2 Rat, барвник DAB (усі реактиви фірми DAKO, Данія). Методика фарбування відповідала рекомендованій виробником. Перед фарбуванням робили регенерацію антигенних властивостей тканин у розчині Antigen Retrieval Solution (DAKO) з використанням мікрохвильової печі. Дофарбовування препаратів робили гематоксиліном Майєра. Дослідження препаратів у проминаючому світлі здійснювали на мікроскопі Axiostar (Carl Zeiss, Німеччина) з додатковим використанням поляризаційних світлових фільтрів. Мікрофотографування і морфометричне дослідження проводили на мікроскопі Olympus AX70 (Японія) з використанням ліцензованої програми AnalySIS Pro 3.2 (SoftImaging, Німеччина).

МТТ-аналіз. Для порівняння динаміки росту і проліферації культур клітин фетальних фібробластів (ФФ), фібробластів здорової шкіри (ФЗК) і фібробластів хронічного виразково - раневого дефекту (ФХВРД), нами був проведений МТТ-аналіз клітинної проліферації (MTT-Cell Proliferation Assay). Оптична щільність рідини вимірювалась спектрофотометрично, визначаючи поглинання як функцію від концентрації перетвореного барвника. Був використаний барвник МТТ (Sigma, USA), ізопропанол (Merck, Німеччина). Спільне культивування ФХВРД і ФФ проводилося в 24-ямкових планшетах Costar (США), оптична щільність отриманого розчину вимірювалася з використанням фотометру для багатофункціонального аналізу Synergy HT Bio-Tek^® Instruments (США).

Цитологічні методики дослідження. Цитологічні відбитки одержували за методикою Макарова і Покровської. Клітинний склад виражали у відсотках, підраховуючи від 100 до 300 клітин у різних місцях препарату. Тип цитограм раневого відбитка оцінювали за класифікацією М.В.Камаєва, доповненої розділом, що описує ознаки аутоімунних порушень у рані.

Планіметрія ран. Планіметричні виміри виконувалися в кожного пацієнта при надходженні, і потім через кожні сім днів. Використовувалася наступна методика: на рану накладався стерильний лист целофану, на який наносилися її контури. Рисунок переносився на міліметровий папір і підраховувалася площа. Швидкість загоєння ран обчислювали за наступною формулою:

де: ДS - відносна швидкість загоєння ран у %;

S - величина площі рани при першому вимірі;

S_i - площа рани при наступних вимірах;

t - кількість днів між першим і наступним вимірами.

Клінічні критерії. Для визначення ефективності способів лікування використовувались наступні показники: строки загоєння ХВРД, візуальний характер грануляційної тканини, наявність та швидкість зникнення некрозів, характер та кількість ексудату, площа приживлення аутотрансплантатів. Віддалені результати лікування оцінювалися в терміни від 1 року до 3 років по наявності, площі та локалізації рецидивів ХВРД. Статистичні методики. Дані досліджень піддавалися обробці на персональному комп'ютері з ліцензованими програмами “Excel 7,0”, “Statistica 6.0” (“StatSoft Inc” USA). При цьому визначався довірчий інтервал і стандартне відхилення генеральної сукупності для ряду даних. Ступінь вірогідності розбіжностей середніх величин визначалася шляхом використання критеріїв Стьюдента і Фішера. Для характеристики взаємозв'язків між визначеними параметрами використовували підрахунок лінійної кореляції (критерій Пірсона). Для аналізу отриманих графічних даних був використаний підхід перекладу якісних показників у кількісні. Нормальність розподілу даних визначалася за критерієм Шапіро-Уілка (значимість р<0,01). Для оцінки стійкості ознаки був використаний непараметричний метод багатофакторного аналізу Краскала-Уолліса. Результати представлені в таблицях і графіках.

Результати власних досліджень та їх аналіз. У роботі проаналізований морфологічний матеріал, отриманий різними способами (біопсія і висічення) з ХВРД у 231 пацієнта (87,5%) з різною етіологією утворення дефектів.

При морфологічних дослідженнях були підтверджені дані про деякі морфологічні особливості ураження тканини в залежності від етіології ХВРД. Зокрема: проліферативні зміни ендотеліальних клітин при гіпертонічних виразках; розширення мережі лімфоїдних капілярів з утворенням муфт запально-компетентних клітин при хронічній лімфовенозній недостатності; неправильна архітектоніка капілярної мережі грануляційної тканини, купчасте розташування капілярів і виражене їх склерозування при післятравматичних дефектах та ін. Однак, ці ознаки зустрічалися також у хворих з іншою етіологією захворювання. Неоднорідною і неспецифічною була фібробластична реакція. Були відсутні специфічні критерії і зміни епітеліального шару. Всі ХВРД характеризувалися наявністю в дні рани різного ступеня виразності “некротичного тягаря”. В усіх спостереженнях під лейкоцитарно-некротичним шаром розташовувалася грануляційна тканина на різних стадіях дозрівання.

Таким чином, на підставі тільки стандартної оцінки гістологічної картини важко було висловити судження про етіологічний момент деструктивних змін. Ще більші утруднення викликало питання у відношенні прогнозу загоєння дефекту і надії на фізіологічну репарацію. Тому, для подальшої роботи були зроблені акценти на спробі визначення необоротності чи функціональної повноцінності гістологічних структур в зоні дефекту. Для цього нами проведені дослідження волокнистої міжклітинної речовини, що представлена колагеновими та еластичними волокнами. Розташування і характер колагенових волокон було неоднаковим у різних спостереженнях і не пов'язаним з етіологією виразки. У випадку наявності при дослідженні в поляризованому світлі безладно переплетених товстих, інтенсивно світних волокон відзначені більш виражені дистрофічні зміни в рані при фарбуванні толуїдиновим синім. Зміни колагенових волокон при поляризаційній мікроскопії корелювали з рівнем детекції віментину. Останній визначався в краях і дні рани у вигляді нерівномірних включень коричневого офарблювання при детекції з МА в парафін-фіксованих препаратах. Проліферативна активність епітелію, визначена за допомогою PCNA, була більш однорідною. В результаті виконання морфологічних досліджень нами були відзначені два варіанти сукупності морфологічних ознак ступеня дезорганізації тканин за їхніми функціональними ознаками, які можуть бути використані для прогнозу раневого загоєння:

Варіант перший - сприятливий прогноз (М+). Позитивне фарбування на віментин та PCNA виявлене не тільки в клітинах базального шару епітелію, але й в клітинах інших шарів, а в окремих спостереженнях - в одиничних клітинах строми й інфільтрату. Ці рани характеризувалися рівномірним розташуванням ШИК-позитивних колагенових волокон з адекватною кількістю фібробластів, лімфоцитів і плазматичних клітин і нормальним рівнем детекції віментину.

Варіант другий - несприятливий прогноз (М-). Проліферативна активність в краях рани була не виражена - епітелій був атрофований, представлений 3-4 рядами клітин. При PCNA позитивна реакція виявлялася в одиничних клітинах. Цей варіант спостерігався в ранах з вираженими дистрофічними змінами, різким набряком тканин, значним рівнем змін оптичних властивостей колагенових структур, порушенням архітектоніки капілярної мережі і зниженою продукцією віментину. Ці морфологічні групи містили в собі порівнянну кількість пацієнтів з різними етіологічними причинами утворення ХВРД, тобто були універсальними. На нашу думку, ці зміни можна трактувати як наслідок розвитку різних варіантів тканинної гіпоксії. При аналізі за допомогою культуральних методів безпосередньо клітинних популяцій, узятих інвазивними методами з ХВРД, були виявлені деякі закономірності. ФХВРД при їх ізоляції та культивуванні були значно більших розмірів, мали неправильну форму, відзначалося нагромадження великої кількості детриту в культурі у відмінності від однорідної, із правильними веретеноподібними клітинами культур ФФ і ФЗШ.

При одержанні культур фібробластів з експлантатів було відзначено, що зняття і перенесення клітин для подальшого культивування ФЗШ було можливе вже на 14,7 ± 2,1 доби з моменту внесення біоптату в живильне середовище. В той час як ФХВРД досягали припустимої щільності тільки на 22,3±2,8 доби. Таким чином, було встановлено, що проліферативна активність ФХВРД зменшена в 1,5 рази. Проліферативна активність клітин культур ФФ і ФЗШ по даним МТТ - аналізу відрізнялась недостовірно і складала +0,2±1,6 у бік фетальної культури (зростання концентрації мічених клітин у порівнянні з вихідною в 4,3±1,2 і 4,1±1,8 рази відповідно). Клітинність маркірованої культури ФХВРД практично не змінилася (збільшення кількості клітин лише в 1,1±0,23 рази). Таким чином, регенераторний потенціал ФХВРД виявився зниженим у 3,7 рази.

Для вивчення складу експресируємих мембранних антигенів на поверхні досліджуваних культур фібробластів було проведене фенотипування порівнянної кількості ліній ФФ, ліній ФЗШ і ліній ФХВРД. Було встановлено, що існують деякі фенотипічні розбіжності між популяціями клітин, зокрема в експресії на поверхні Ь-ланцюгів інтегринових рецепторів. Так, на клітинній поверхні ФФ були представлені ланцюги інтегринів Ь -2, 3, 5, 6 і в 1, що складають в комбінації рецептори ламініну Ь2в1, Ь3в1 і Ь6в1, колагену - Ь2в1 і Ь3в1, фібронектину - Ь3в1 і Ь5в1; наявність на поверхні клітини обох субодиниць інтегринового рецептору і приналежність даних рецепторів до групи в 1 чи VLA-інтегринового підсімейства свідчить про функціональну повноцінність як шляху клітинно-субстратної адгезії, так і міжклітинних взаємодій. Наявність на поверхні ФЗШ Ь-4 ланцюга інтегрину приводить до наявності додаткового рецептора фібронектину. На ФХВРД, не була відзначена експресія деяких складових рецепторів колагену, ламініну і фібронектину, зокрема Ь2, Ь4 і Ь6 ланцюга інтегринів. Відсутність декількох комбінацій рецепторів на фібробластах ХВРД є причинно - слідчим чинником порушення архітектоніки міжклітинного матриксу за рахунок функціональної неповноцінності шляху клітинно-субстратної адгезії. Відсутність адекватної адгезії субстратзалежних клітин, до яких відносяться і фібробласти і кератиноцити (КЦ), в свою чергу, може запускати механізми анаїкозу (субстрат залежного апоптозу).

Таким чином, було встановлено, що ХВРД характеризуються рядом цитоморфологічних, функціональних і проліферативних змін клітинних популяцій, при цьому, зміни їхніх властивостей корелюють зі ступенем деградації міжклітинної речовини та іншими морфофункціональними критеріями стану тканини (МТТ- аналіз, РСNА, рівень детекції віментину). Ці критерії можуть лежати в основі висновків про оборотність чи необоротність патологічної трансформації тканини в зоні ХВРД. Нами була проведена спроба оцінити можливість впливу КТТ на патогенетичні механізми порушень репарації при хронізації раневого процесу. З цією метою була сформована лабораторна модель, що являє собою мікс-культуру з ФХВРД і ФФ.

За даними порівняльного МТТ аналізу як моно, так і мікс-культури різних ліній фібробластів, було відзначено зростання проліферативної активності загальної культури в три рази в порівнянні з монокультурою ФХВРД на 5-у добу культивування (оптична щільність 0,075од. і 0,025од. відповідно). Розрахункові значення клітинності культур досліджуваних клітинних ліній свідчили, що при спільному культивуванні можливе збільшення клітинності культури в 2,7 рази в порівнянні з показником 1,1 для ізольованої культури ФХВРД (р<0,05), що за кількістю клітин на 5-у добу культивування мікс-культури перевищує в 2,3 рази клітинність культури ФХВРД (р<0,05). При візуальному моніторингу мікс-культури, компоненти якої були окремо маркіровані за допомогою фарбування барвниками PKH, було відзначене прискорення проліферації ФХВРД в присутності ФФ у порівнянні з ізольовано культивованими ФХВРД. Проліферація ФФ при цьому недостовірно знижувалась. Результати експерименту свідчать про можливості стимуляції і/чи відновлення швидкості проліферації фібробластів ХВРД при загальному культивуванні з функціонально збереженими клітинами in vitro. При проведенні спільного культивування ФХВРД з ФФ (РКН Green), з наступним маркіруванням МКА на Ь 2 і Ь 4 ланцюгу інтегрину в 3-х лініях з 10 (33,3%) було відзначено позитивне фарбування на поверхні ФХВРД даних маркерів. Цей факт може бути доказом можливості відновлення ряду функціональних здібностей клітинних популяцій ХВРД під впливом топічного використання біоінженерних продуктів.

Для оцінки клінічної ефективності застосування різних видів КТТ нами були проаналізовані результати лікування 264 пацієнтів із ХВРД різної етіології. В роботі, через неможливість радикальної корекції основного захворювання, нам довелося сконцентруватися на лікуванні місцевих проявів виразкоутворюючих нозологій. Алгоритм цього лікування складався з декількох основних етапів: діагностики ХВРД; вибору способу очищення і боротьби з ускладненнями ХВРД; вибір тактики лікування рани; закриття дефекту або шляхом корекції фізіологічних епітелізаційних процесів, або з використанням варіантів ауто- чи алотрансплантацій в різних варіантах.

Нами впроваджена оригінальна класифікація глибини та площі ХВРД нижніх кінцівок поза залежністю від етіології процесу. В основу її покладені принципи хірургічної анатомії нижньої кінцівки і факт наявності місцевих раневих ускладнень, що обумовлює результат лікування, а також відносні антропометричні принципи зіставлення площі дефекту тканини до площі поверхні тіла.

I ступінь - епідермальна виразка - дефект епідермісу, представлений гіперкератозом, ерозіями, схильними при сприятливих умовах до самостійної епітелізації без утворення рубця.

II ступінь - дермальна виразка - дефект, що поширюється на всю товщину дерми з можливим залученням підшкірної клітковини. Дно виразки виконане грануляційною і/чи фіброзною тканиною, обмежено поверхневою фасцією. При загоєнні формується рубець.

III ступінь - субфасціальна виразка. Дефект тканин, що проникає глибше власної фасції з залученням підлягаючих фасціальних порожнин і залученням у запально-некротичний процес м'яких тканин (сухожилля, м'язи, судинно-нервові пучки).

IV ступінь - тотальне ураження тканин зони (анатомічного утворення) частини тіла з розвитком некротичних змін в області усіх фасціальних просторів у цій зоні і/чи підлягаючих кісткових структур.

Оскільки мікробна колонізуюча чи контамінуюча флора у ХВРД присутня завжди, ми орієнтувалися на ступінь виразності і поширеності місцевої і/чи генералізованої запальної реакції. При цьому виділяємо:

A - відсутність ознак запалення; B - місцеві інфекційні ускладнення (абсцес, флегмона, гнійний затік, лімфонгоїт, бешиха в зоні виразки, і т. д.); C - раневий сепсис.

При визначенні площі ХВРД використана наступна градація з урахуванням антропометричних особливостей ураженої зони:

Малі ХВРД - до 0,1% поверхні тіла або до ? кола сегмента;

Середні ХВРД - до 1% поверхні тіла або до Ѕ кола сегмента;

Великі ХВРД - від 1% поверхні тіла або більш Ѕ кола сегмента.

При визначенні розмірів на великих анатомічних областях (стегно, гомілка) використовували принцип визначення площі дефекту за правилом долоні. При визначенні площі в області стопи та пальців орієнтувалися на діаметр анатомічного утворення. Був проведений порівняльний аналіз основних варіантів санації ХВРД. Позитивний ефект від хірургічного раневого очищення відзначений нами в 98 випадках (89,9%). Позитивний ефект від аутолітичного очищення відзначений в 33 випадках (61,1%). Позитивний ефект від ферментативного очищення спостерігався в 50 випадках (80,0%). При цьому швидкість виникнення позитивного ефекту складала в середньому 10 діб. Позитивний ефект від механічного очищення відзначений нами в 31 випадку (86,1%). Виникнення позитивного ефекту спостерігалося в середньому через 6 діб. При цьому, швидкість очищення при застосуванні ультразвукового кавітатору в середньому складала 4 доби і досягалася в середньому через 2 процедури. Таким чином, було встановлено, що найбільш ефективним способом очищення ХВРД є хірургічний. Альтернативним, хоча і трохи менш ефективним способом є ультразвукова кавітація.

10 пацієнтам застосовувалися аплікації в несановану рану фібробластно-колагеновий композит (ФКК), що містить суспензію культивованих алофібробластів. Позитивний ефект у виді зникнення некрозів і появи елементів грануляційної тканини був відзначений нами в усіх спостереженнях. Однак, швидкість зникнення некрозів була відносно невисокою і складала від трьох до 18 діб (в середньому 12,5 доби). Цей показник значно поступався часу очищення рани при хірургічній її санації (в середньому 2,3 доби) і наближався до показника при аутолітичній санації (в середньому 14 діб). Таким чином, можна говорити про потенційну теоретичну доцільність використання КТТ в фазі запально-некротичних змін при ХВРД. Однак, їхнє практичне застосування залишає бажати кращого і може бути здійснено тільки з використанням алогенного клітинного матеріалу.

Консервативна тактика закриття ХВРД була обрана нами в двох аналізованих групах: групі з традиційними методами лікування (КГ ТТ) - 70 пацієнтів; і в групі з використанням КТТ (КГ КТТ) - 69 пацієнтів. Нами використовувалися стандартні принципи спрямовані на: стимуляцію і регуляцію репаративних процесів у рані; захист грануляційної тканини від впливу негативних чинників; нормалізацію обмінних процесів; профілактику вторинного інфікування рани; профілактику аномальної проліферації і диференційовки клітинних пулів з формуванням гіпертрофічних і келоїдних фляків; прискорення епітелізації. Всі ці впливи на перебіг раневого процесу проводили на фоні неприпиняючогося лікування основного захворювання з метою досягнення максимального рівня його компенсації.

Результати консервативного лікування групи хворих КГ ТТ не відрізнялися принципово від літературних даних. При малій площі ХВРД, середні терміни загоєння (якщо воно було досягнуто взагалі) складали 15,2±2,1 доби; при середній площі - 21,4±3,4 доби; при великій площі - 27,4±4,7 доби. Під впливом традиційного консервативного лікування вдалося досягти епітелізації ХВРД в 55,7% спостережень, в 44,3% відзначений незадовільний результат лікування в ці терміни. При аналізі анамнестичних даних, нами була виявлена достовірна залежність результатів лікування від тривалості існування ХВРД. В КГ КТТ були застосовані наступні варіанти клітинного матеріалу: аутофібробласти у 10 хворих; алофібробласти у 36 пацієнтів; ауто КЦ у 13 хворих; комбінація алофібробластів і ауто КЦ в 10 спостереженнях.

При використанні аутологічного ФКК, його застосування технічно було можливо в залежності від темпів проліферації фібробластів з біопсийної ділянки здорової шкіри пацієнта. Середні терміни проліферації післянатальних дермальних фібробластів складали 18±3,0 доби. В 20% цей факт обумовив затримку застосування аутологічного ФКК на кілька діб при рані, яка вже очистилася. Аналогічна організаційна ситуація виникла і при використанні аутологічних шарів КЦ, терміни формування яких з біопсійного шкірного матеріалу в середньому складали 20±2,5 доби. У такий спосіб нам довелося пролонгувати терміни закриття ран аутологічними КЦ в 40% пацієнтів при використанні швидких методів очищення ХВРД. При місцевому застосуванні аутологічних і алогенних ФКК клінічний ефект був подібний. Швидкість епітелізації дорівнювала 3,49±0,30% при р<0,05 на добу, до 11 доби площа скоротилася до 30% від вихідної. Однак, з третього тижня нами відзначене розшарування результатів, частину з яких можна трактувати як позитивний ефект, що утримується, від застосування ФКК, а частину, як уповільнення процесів регенерації чи взагалі її припинення. Так у 20 пацієнтів (43,5%) групи КГ КТТ, яким застосований ФКК, утримувалася швидкість скорочення дефекту на середньому рівні 2,54±0,36% при р<0,05 на добу. У той же час у інших 26 пацієнтів (56,5%) помітно знижувалася швидкість епітелізації і в середньому складала 1,32±0,22% при р<0,05 на добу.

До результату четвертого тижня (28 доба), на фоні використання ФКК, раневий дефект був констатований у 14 пацієнтів цієї групи (30,4% від пацієнтів із ФКК і 20,2% від загальної кількості пацієнтів в КГ КТТ). При цьому, швидкість епітелізації в них прагнула до нуля, а в двох випадках (2,8%) було відзначено збільшення площі рани. У інших 32 пацієнтів, яким застосований ФКК, була зафіксована повна епітелізація (69,5% від пацієнтів із ФКК і 46,4% від загальної кількості пацієнтів в КГ КТТ). У випадках загоєння ХВРД під впливом консервативної терапії з використанням ФКК, середній термін епітелізації склав 21,2±2,05 доби.

При використанні шарів аутологічних КЦ повне приживлення шарів відзначене в 23,1%. Ще в 30,8% констатовано часткове приживлення шару. В 46,1% відбувся його швидкий лізис. Таким чином, загоєння ран у пацієнтів з ХВРД, яким були застосовані шари КЦ, досягнуте в 8 спостереженнях (61,5% від хворих із застосованими КЦ і 11,6% від загальної кількості пацієнтів в КГ КТТ групі). При цьому, швидкість епітелізації залишившихся ділянок раневої поверхні після часткового лізису трансплантатів, у тих випадках, коли спостерігалася повна епітелізація, не відрізнялася від такої в підгрупі хворих з використаними культурами фібробластів і в середньому складала 2,48±0,39% на добу. Повна епітелізація у цих хворих зареєстрована в середній термін 19,2±1,5 доби від моменту трансплантації. У випадках, коли було відзначено повне приживлення шарів КЦ, епітелій по всій поверхні визначався вже на першій перев'язці, тобто на 2-3 добу від трансплантації. На 5-8 добу відбувалося самостійне відділення марлевої підкладки від шарів епітелію. Саме ці терміни ми трактували як терміни епітелізації ран. В цілому, за умови загоєння дефекту, середній термін епітелізації при використанні шарів КЦ склав 14,2±1,5 доби від дати трансплантації. Однак, з урахуванням затримки трансплантації через неготовність шару ауто КЦ фактично середні терміни епітелізації складали 18,7±1,1 доби від моменту повного очищення рани. В 10 випадках нами застосований комбінований вплив на ХВРД із використанням однократної трансплантації алогенного ФКК і подальшої трансплантації ауто КЦ. При цьому удалося досягти збільшення відсоткового рівня приживлення шарів КЦ (40%). В цілому, терміни епітелізації в цій підгрупі не відрізнялися від термінів при моно використанні шарів КЦ і склали 19,0±1,0 діб, що пов'язано не стільки з особливістю раневої динаміки, скільки з особливостями технології (проліферативним потенціалом) популяції КЦ.