Дисфункція тимуса при експериментальному цукровому діабеті і в умовах порушеної толерантності до глюкози

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Дисфункція тимуса при експериментальному цукровому діабеті і в умовах порушеної толерантності до глюкози

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Цукровий діабет (ЦД) - важлива медична й соціально-економічна проблема для України і всіх країн світу, за даними Міжнародної Діабетичної Федерації в середньому 10% всіх витрат на охорону здоров'я становлять витрати на лікування ЦД (IDF reports, 2008). Рішенням Кабінету Міністрів України від 14.01.2009 р. (№17-р) була прийнята концепція державної цільової програми «Цукровий діабет» на 2009-2013 роки. Найбільш важкою формою захворювання за кількістю ускладнень і ступенем ризику для життя є ЦД І типу, що вражає переважно дітей і осіб молодого віку (Зак К.П. та ін., 2001; Полторак В.В. та ін., 2005; Дедов И.И. и др., 2007). Щорічно в нашій країні реєструється близько 800 хворих із уперше виявленим ЦД I типу віком від 0 до 14 років, а за статистикою на 01.01.2008 р. в Україні зареєстровано більше ніж 1,09 млн. хворих ЦД (2,4% населення), зокрема близько 8 тисяч дітей до 18 років, причому на одного хворого з виявленим ЦД припадає 3-4 хворих з недіагностованою хворобою й ранніми порушеннями вуглеводного обміну - порушеною толерантністю до глюкози (ПТГ) і порушеною глікемією натще.

Останнім часом велику увагу приділяють ролі імунних порушень у патогенезі розвитку різних захворювань (Бутенко Г.М. та ін., 2007; Алексєєва І.М. та ін., 2008). Картина патогенезу ЦД, істотно доповнена за останні роки, свідчить про активну участь центральних нейро-імунно-ендокринних механізмів у регуляції ендокринної функції панкреатичних острівців (Акмаев И.Г., 1996; Savino W. et al., 2000; Резніков О.Г., 2004; Колесник Ю.М. та ін., 1993-2008). У той самий час, пускові механізми автоімуноагресії й причини виникаючих порушень при ЦД І типу залишаються предметом дискусії (Geenen V. et al., 2005; Tsai S. et al., 2008). За останнє десятиліття було досягнуто величезних успіхів у сфері імунології ЦД І типу, запропоновані нові методи виявлення автоантитіл до різних острівцевих антигенів, що дало можливість діагностувати ЦД І типу ще до появи його клінічних ознак, була виявлена екстрапанкреатична експресія інсуліну й інших панкреатичних антигенів у тимусі (Chentoufi A. et al., 2004; Gillard G. et al., 2007). Участь тимуса в імунопатогенетичних механізмах розвитку ЦД підтверджується й експериментальними даними про можливість перешкоджати розвитку діабету або сприяти його ремісії шляхом відновлення толерантності до в-клітинних антигенів за допомогою таких засобів, як неонатальна тимектомія, внутрішньотимічне пересадження в-клітин, застосування моноклональних антитіл (МКАТ) проти CD3- і CD8-антигенів, введення популяцій дендритних і Т-регуляторних клітин (T_reg) і ін. (Bach J. et al., 2002; Sakaguchi S. et al., 2004; Chatenoud L. et al., 2007; Trucco M. et al, 2007). Про важливу роль дисфункції тимуса в механізмах розвитку ЦД свідчить і те, що з 2004 року діє 1 Європейський інтеграційний проект Euro-Thymaid (Thymus in Auto-immunity Development), що об'єднує зусилля провідних дослідницьких груп з 12 країн Євросоюзу (www.eurothymaide.org).

Проте дотепер відсутня чітка й фундаментальна концепція про участь дисфункції тимуса в механізмах розвитку ЦД І типу, що базувалася б на всебічному вивченні морфофункційного стану тимуса, його клітинних субпопуляцій, особливостей перебігу селекції й апоптозу тимоцитів, внутритимічної експресії панкреатичних антигенів, а єдиним на сьогодні ефективним методом лікування цього захворювання залишається замісна терапія інсуліном протягом усього життя, що призводить до необхідності пошуку нових патогенетичних методів лікування діабету. Розробка методів корекції ЦД повинна, у першу чергу, базуватися на всебічному вивченні патогенезу захворювання. Одним з найважливіших факторів, що роблять вплив на функціональний стан лімфоїдного й епітеліального компартментів тимуса в нормі й при експериментальній патології, є оксид азоту (NO), що може робити як про-, так і антиапоптотичну дію, здатний впливати на диференціювання й проліферацію тимоцитів і T_reg-клітин (Byung-Min C. et al., 2001; Jeong S. et al., 2004), зміщувати баланс Th1/Th2 і Th17/T_reg-лімфоцитів, відіграючи таким чином роль ефектору в селекції й розвитку клітин тимуса (Bogdan C., 2000; Niedbala W. et al., 2006-2007). Вивченню ролі NO в останні роки присвячено багато досліджень, результатом яких стало з'ясування ролі цієї молекули в патогенезі ряду захворювань (Alonso D. et al., 2003; Мойбенко О.О. та ін., 2004; Сагач В.Ф. та ін., 2004). Експресія індуцибельної NO-синтази (iNOS) виявлена в дендритних клітинах, макрофагах, лімфоцитах і епітеліоретікулоцитах тимуса, а індукцію гена iNOS викликають IL-1, IFNб, IFNг, TNFб, бактеріальні ліпополісахариди й оксидативний стрес (Vig M. et al., 2004). Введення інгібіторів NO-синтаз частково може захищати тварин від індукованого введенням стрептозотоцину ушкодження в-клітин (Haluzfk M. et al., 2000), а у мишей з інактивованим геном iNOS знижена чутливість до індукції стрептозотоцинового діабету (Flodstrom M. et al., 1999). Тому перспективним напрямком пошуку шляхів корекції дисфункції тимуса при ЦД є використання факторів, що впливають на продукцію й метаболізм монооксиду азоту в організмі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, результати яких були отримані в даній роботі, виконувалися в рамках фундаментальних, фінансованих МОЗ України науково-дослідних робіт Запорізького державного медичного університету «Роль порушень нейро-імунно-ендокринних взаємин у розвитку експериментальної й клінічної патології» (№ держреєстрації 0103U000937) і «Нейро-імунно-ендокринні механізми розвитку та вікові особливості формування ендокринної патології та метаболічних порушень внаслідок пренатальної дії патогенних факторів» (№держреєстрації 01080005114), у яких автор був співвиконавцем і відповідальним виконавцем.

Метою дослідження було з'ясувати роль дисфункції тимуса в патогенезі розвитку експериментального цукрового діабету (ЕЦД) і визначити пов'язані з цим імунні фактори ризику розвитку ендокринної і автоімунної патології при порушеній толерантності до глюкози.

Завдання дослідження:

1. Вивчити імуногістохімічні особливості локалізації інсулін-імунопозитивних клітин (Ins⁺) тимуса у щурів лінії Wistar і SHR у нормі, при ЕЦД, після введень L-аргініну (Lа) й N-нітро-L-aргініну (NnLa) діабетичним тваринам, у нащадків щурів з експериментальним гестаційним діабетом (ЕГД).

2. Вивчити особливості експресії автоімунного регулятора AIRE у тимусі в цих же групах експериментальних тварин.

3. Оцінити морфофункційний стан епітеліоретікулоцитів (ЕРЦ) і MHCII⁺-антиген-презентуючих клітин (АПК) в цих же групах експериментальних тварин.

4. Визначити особливості експресії про- і антиапоптотичних білків р53 і Bcl-2 у тимусі в цих же групах експериментальних тварин.

5. Вивчити особливості експресії індуцибельної NO-синтази й білків ранньої відповіді с-Fos у тимусі в цих же групах експериментальних тварин.

6. Вивчити особливості експресії імунної субодиниці протеасоми LMP-2 і білків теплового шоку Hsp70 у тимусі в цих же групах експериментальних тварин.

7. Визначити особливості диференціювання натуральних імунорегуляторних T_reg-клітин у тимусі й проліферативної активності тимоцитів в цих же групах експериментальних тварин.

8. Вивчити особливості структурно-функціональної організації лімфоїдної популяції й характеристику процесів диференціювання CD4⁺- і CD8⁺-лімфоцитів тимуса у експериментальних тварин.

Об'єкт дослідження - експериментальний цукровий діабет, експериментальний гестаційний діабет, порушена толерантність до глюкози.

Предмет дослідження - структура й функціональний стан тимуса, імунні механізми розвитку експериментального цукрового діабету й пошук шляхів корекції порушень, які виникають, патогенез розвитку імунних порушень у нащадків щурів з ЕГД.

Методи дослідження: для реалізації поставлених у дисертації завдань використовувалися сучасні морфометричні, гістохімічні, імунофлюоресцентні й імуногістохімічні методи аналізу гістологічного матеріалу, комп'ютерний аналіз зображень і математичний класифікаційний аналіз, методи кореляційного й кластерного аналізу, біохімічні методи й гель-електрофорез на поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) з наступним Western-блоттінгом на PVDF-мембрану, методи статистичного аналізу отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. На підставі комплексного вивчення всіх клітинних компартментів і субпопуляцій тимуса отримані нові дані про особливості структурно-функціональної організації центрального органу імуногенезу в щурів лінії Wistar і SHR в нормі, при ЕЦД, після введень Lа й NnLa діабетичним тваринам, у нащадків щурів з ЕГД. У результаті виділені ключові дефекти функціонального стану тимуса при діабеті й в умовах порушеної толерантності до глюкози: дефект апоптозу тимоцитів, дефект презентації периферичних тканиноспецифічних антигенів, дефект Т-регуляторної ланки, дефект процесингу антигенів, дефект диференціювання й проліферації тимоцитів. Науково обґрунтована гіпотеза про роль порушень морфогенезу й функціонального стану лімфоїдного й епітеліального компартментів тимуса в механізмах розвитку автоімунної і ендокринної патології у нащадків, визначені імунні фактори ризику розвитку ЦД при порушеній толерантності до глюкози, розроблена й досліджена нова модель ЕГД у щурів.

Вперше встановлено, що розвиток ЕЦД призводить до зниження у щурів ліній Wistar і SHR кількості інсулін-експресуючих клітин у тимусі й збільшує в них концентрацію тимічного інсуліну, а також супроводжується зниженням кількості клітин, експресуючих автоімунний регулятор AIRE у мозковій речовині тимуса у щурів лінії Wistar і в обох вивчених зонах тимуса щурів SHR. Доведено, що розвиток ЕЦД супроводжується дефектами процесингу антигенів, що викликано порушеннями функціонування й тимічної експресії у експериментальних тварин імунної субодиниці протеасоми LMP-2 й білків теплового шоку Hsp 70. Доведено, що розвиток ЕЦД призводить до зниження кількості натуральних імунорегуляторних клітин та змін морфофункційного стану ЕРЦ та антигенпрезентуючих MHC-ІІ⁺ клітин тимуса.

Встановлено, що в експериментальних тварин з порушеною толерантністю до глюкози - щурів лінії SHR і нащадків щурів з ЕГД - виявляється цілий ряд спільних функціональних порушень тимуса: зміни цитоархітектоніки, зниження кількості проліферуючих лімфоцитів, натуральних імунорегуляторних клітин, АПК, інсулін-імунопозитивних і клітин, експресуючих імунну субодиницю протеасоми LMP-2, гіперекспресія Bcl-2 і збільшення щільності популяції цитотоксичних CD8⁺-лімфоцитів.

Вперше встановлено, що у нащадків щурів з ЕГД спостерігаються порушення морфогенезу лімфоїдного та епітеліального компартментів тимуса, які є імунними чинниками ризику розвитку ЦД: зміни цитоархітектоніки тимуса, дисбаланс Т-хелперів та цитотоксичних лімфоцитів, зниження кількості проліферуючих лімфоцитів, Т_reg-клітин, АПК, епітеліоретікулоцитів, інсулін-експресуючих клітин, зміни рівня тимічної експресії таких регуляторів апоптозу, як білки Bcl-2, р53, білки ранньої відповіді с-Fos, індуцибельна NO-синтаза, імунна субодиниця протеасоми LMP-2.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження становлять практичний інтерес для сучасної діабетології, ендокринології, імунології й доводять те, що порушення функціонування центрального органа імуногенезу - тимуса - відіграють важливу роль в імунопатогенетичних механізмах розвитку ЕЦД. Отримані дані свідчать про важливу роль порушення морфогенезу тимуса в механізмах розвитку ендокринної й автоімунної патології у нащадків щурів з ЕГД, а оцінка функціонального стану тимуса у нащадків може бути одним із критеріїв ступеня ризику розвитку діабету. В експерименті встановлена ефективність курсового введення неселективного блокатора NO-синтаз NnLа на функціональний стан тимуса. Тому застосування факторів, що впливають на продукцію й метаболізм оксиду азоту в організмі, є перспективним шляхом корекції імунологічних порушень при ЦД.

У роботі була розроблена й апробована нова експериментальна модель гестаційного діабету у щурів (Пат. на корисну модель Україна, МПК09B 23/28, №17281), що має цілий ряд переваг перед раніше існуючими моделями й дозволяє вивчати механізми розвитку ендокринної та імунної патології у нащадків внаслідок пренатальної дії на плід в останньому триместрі вагітності хронічної гіперглікемії, що має важливе значення для практичної діабетології. Результати досліджень протягом 2007-2009 років були впроваджені в навчальний процес кафедр патофізіології Запорізького державного медичного університету, Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, Луганського державного медичного університету, Буковинського державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету ім. Горбачевського, ЦНДЛ Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, Харківського національного фармацевтичного університету, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно була визначена актуальність теми, поставлені мета й завдання дослідження, розроблені методи вирішення поставлених завдань, написані всі розділи дисертації. Дослідження структури лімфоїдної популяції й ЕРЦ тимуса, оцінка проліферативної активності тимоцитів і їх імунофлюоресцентне фенотипування за CD-антигенами, вивчення особливостей морфофункційного стану й процесів диференціювання в тимусі Т_reg-клітин і АПК, вивчення експресії в тимусі інсуліну, AIRE, білків Bcl-2, р53, с-Fos, iNos, імунної субодиниці протеасоми LMP-2 у щурів з ЕЦД і у нащадків щурів з ЕГД автором проведені самостійно. Розробка нової експериментальної моделі гестаційного діабету й класифікаційного аналізу клітин тимуса проведена разом зі співробітниками кафедри патофізіології Запорізького державного медичного університету. Дослідження з ідентифікації Hsp70 і iNos у тимусі методом електрофорезу на поліакриламідному гелі з наступним імуноблотингом виконані на базі НДІ фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України разом із зав. лабор. молекулярної біології МЦ АМЕД НАН України ст. н.с. Портніченко А.Г.

Апробація результатів дисертації. Результати наукових досліджень були представлені і обговорені на Всеукраїнській конференції з міжнародною участю «Нейроендокринні й імунні механізми регуляції гомеостазу в нормі та патології» (Запоріжжя, 2005), на Всеукраїнській науково-практичній конференції «Проблеми сучасної морфології» (Полтава, 2006), на науково-практичній конференції з міжнародною участю «Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів» (Тернопіль, 2006), на науковій конференції «Актуальні питання патофізіології» (Сімферополь - Ялта, 2006), на науково-практичній конференції «Сучасні питання ендокринології» (Харків, 2007), VII з'їзді асоціації ендокринологів України (Київ, 2007), на Всеукраїнській науковій конференції «Сучасні питання фізіології та медицини» (Дніпропетровськ, 2007), на III з'їзді фармакологів Росії «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на науково-практичній конференції «Роль месенджерних систем у патогенезі патологічних процесів різної етіології» (Тернопіль, 2007), на науково-практичній конференції з міжнародною участю «Фундаментальна та клінічна ендокринологія: проблеми, здобутки, перспективи» (Сьомі Данилевські читання, Харків, 2008), на IV з'їзді Російської спілки біохіміків і молекулярних біологів з міжнародною участю (Новосибірськ, 2008), на VIII міжнародному конгресі патологів України «Сучасні проблеми патологічної анатомії» (Полтава, 2008), на 12 міжнародній Пущинській школі-конференції молодих учених «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), на V національному Конгресі патофізіологів України «Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів» (Запоріжжя, 2008), на науково-практичній конференції «Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів на організм» (Тернопіль, 2008), на науково-практичній конференції з міжнародною участю «Вікові аспекти патофізіології, діагностики та терапії ендокринної патології» (Харків, 2008), на науково-практичній конференції з міжнародною участю «Фундаментальна та клінічна ендокринологія: проблеми, здобутки, перспективи» (Восьмі Данилевські читання) (Харків, 2009), на науково-практичній конференції «Морфологічний стан тканин і органів систем організму в нормі та патології» (Тернопіль, 2009), на науково-практичній конференції з міжнародною участю «Питання експериментального використання лабораторних тварин у медицині, біології, ветеринарії» (Полтава, 2009), на VII З'їзді алергологів і імунологів СНД і II Всесвітньому форумі з астми і респіраторної алергії (Санкт-Петербург, 2009), на міжнародній конференції «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), на спільному засіданні Київського обласного товариства патофізіологів і сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (22 квітня 2009 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опублікована 51 робота, у тому числі 30 статей у профільних журналах, рекомендованих ВАК України, з яких 11 одноосібно, 20 тез в матеріалах конференцій, конгресів і з'їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, шести розділів результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних літературних джерел із 642 найменувань. Робота викладена на 410 сторінках машинописного тексту, містить 123 таблиці та проілюстрована 40 малюнками, які займають 97 повних сторінок.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 243 самцях щурів лінії Wistar і SHR. Експериментальну частину роботи виконано відповідно до національних «Загальних етичних принципів досліджень на тваринах» (Україна, 2001) і положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних і інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).

Досліджувані тварини були розділені на сімнадцять експериментальних груп: контрольні щури лінії Wistar, яким одноразово в/очеревинно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5) (група 1); щури лінії Wistar з експериментальним стрептозотоциновим діабетом (ЕЦД) тривалістю перебігу 3 тижні (група 2); щури лінії Wistar з ЕЦД, яким починаючи з 2-го тижня розвитку діабету протягом 14 днів вводили в/очеревинно L-аргінін (Lа) в дозі 300 мг/кг (група 3), N-нітро-L-aргінін (NnLa) в дозі 10 мг/кг (група 4) або в дозі 50 мг/кг (група 5); контрольні щури лінії SHR, яким однократно в/очеревинно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5) (група 6); щури лінії SHR з ЕЦД тривалістю перебігу 3 тижні (група 7); щури лінії SHR з ЕЦД, яким починаючи з 2-го тижня розвитку діабету протягом 14 днів вводили в/очеревинно NnLa у дозі 10 мг/кг (група 8) або в дозі 50 мг/кг (група 9); нащадки щурів лінії Wistar (самці) віком 1 місяць (група 10), 2 місяці (група 11), 3 місяці (група 12), 6 місяців (група 13), народжені від контрольних щурів лінії Wistar, яким на 15-у добу датованої вагітності однократно в/очеревинно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5); нащадки щурів лінії Wistar (самці) з експериментальним гестаційним діабетом (ЕГД) віком 1 місяць (група 14), 2 місяці (група 15), 3 місяці (група 16), 6 місяців (група 17). У кожній експериментальній групі тварин крім вивчення тимуса проводили визначення концентрації глюкози в периферичній крові.

Для ініціації цукрового діабету у щурів застосовували стрептозотоцинову модель захворювання, що є однією з найпоширеніших експериментальних моделей ЦД І типу (Rees D.et al., 2005; Herrath M. еt al., 2009). За гормонально-метаболічними змінами стрептозотоциновий діабет у щурів багато в чому подібний до ЦД І типу у людини (Полторак В.В. та ін., 1999). При цьому ступінь важкості перебігу патологічного процесу характеризується чіткою залежністю від застосовуваної дози препарату. Стрептозотоцин (SIGMA Chemical, США) вводили щурам в/очеревинно в дозі 50 мг/кг, розчиненій у 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рн=4,5) перед самим моментом введення. Час, що пройшов від дня введення препарату, надалі вважали як тривалість перебігу діабету. Визначення концентрації глюкози в крові, що брали із хвостової вени, проводили глюкозооксидазним методом із застосуванням приладу Glucocard II Super через 12 годин і 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 і 20 діб після ін'єкції стрептозотоцину. Вимір рівня глікемії здійснювали через 6 годин з моменту останнього прийому їжі. На 3 день після введення стрептозотоцину для подальших досліджень відбирали тварин з рівнем глікемії натще > 8,0 ммоль/л. На 5 добу у всіх тварин проводився внутрішньоочеревинний тест толерантності до глюкози відповідно до протоколу, рекомендованого Фармакологічним центром України.

Для фармакологічної модуляції продукції оксиду азоту нами були використано курсові в/очеревинні введення: 1) субстрату для синтезу NO - амінокислоти L-аргініну (La) (Sigma-Aldrich, США); 2) неселективного блокатора NOS - N-нітро-L-аргініну (N_щ - Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, NnLa, L-NAME hydrochloride) (Sigma-Aldrich, США). Введення здійснювали один раз на добу (9:00) протягом 14 днів починаючи із другого тижня розвитку ЕЦД - у період автоімунної деструкції в-клітин панкреатичних острівців, що здійснюється при активній участі оксиду азоту. Дозування La для одноразового введення становило 300 мг/кг; NnLa - 10 мг/кг і 50 мг/кг, що відповідає літературним даним по вивченню їх в/очеревинного введения експериментальним тваринам (Nishikawa T. еt al., 1993; Сагач В.Ф. та ін., 2005).

Одним з недоліків стрептозотоцинової моделі ЦД І типу є вторинність змін в органах імунної системи, що виникають після розвитку гіперглікемії. Тому перспективне використання і таких моделей, при яких ще відсутня виражена гіперглікемія, але вже спостерігаються явища порушення толерантності до глюкози. Такий підхід має більше важливе практичне значення для діабетології та ендокринології, оскільки ПТГ є, фактично, переддіабетом, цей стан у більшості випадків не діагностується й протікає безсимптомно, а виявлення змін функціонального стану тимуса на цій стадії є більше доказовим щодо його участі в патогенезі розвитку ЦД у порівнянні зі стрептозотоциновою моделлю.

Однією з таких моделей ПТГ є щури лінії SHR (spontaneously hypertensive rats - SHR), що вважаються визнаною експериментальною моделлю есенціальної гіпертензії у людини (Dzielak D., 1991). За основними проявами патогенезу модель збігається з патологією людини, але відрізняється від клінічного прототипу тим, що передається нащадкам із 100% частотою. Останнім часом зростає кількість доказів того, що гіпертензія у щурів лінії SHR може бути викликана дисфункцією тимуса (Zhao X. et al., 1998; Marcil J., 2001). Ця гіпотеза базується на тому, що імуносупресивна терапія, імплантація тканин тимуса від нормотензивних щурів, лікування антитимоцитарною сироваткою або тимічними гормонами знижує артеріальний тиск у щурів SHR (Khraibi A. et al., 1984; Purcell E. et al., 1993; Hidekazu S. et al., 1999). У той же час механізми, через які імунологічна дисфункція приводить до гіпертензії, невідомі.

У якості ще однієї моделі ПТГ нами була розроблена модель експериментального гестаційного діабету (ЕГД) у самок щурів лінії Wistar (Колесник Ю.М. та ін., 2006). Характерно, що механізми виникнення ПТГ у цих експериментальних моделей різні - у щурів лінії SHR це генетично-обумовлений дефект, а у нащадків щурів з ЕГД - модельований штучно і викликаний впливом внутрішньоутробної гіперглікемії на плід, що порушує морфогенез лімфоїдного та епітеліального компартментів тимуса. ЕГД моделювали однократним введенням стрептозотоцину в дозі 45 мг/кг ваги тварини на 15 добу датованої вагітності, що відповідає останньому триместру вагітності. Після індукції діабету самок поїли в перший день 20% р-ром глюкози, на другий день - 10% р-ром глюкози для зниження ризику розвитку гострої гіпоглікемії, що розвивається внаслідок значної одночасної деструкції в-клітин і підвищення концентрації інсуліну в крові. На 2-3 добу після введення стрептозотоцину у всіх самок після 10-годинного голодування визначали рівень глюкози венозної крові із хвостової вени глюкозооксидазним методом. Для експерименту відбирали тварин з рівнем глікемії більше ніж 8 ммоль/л. Нащадки щурів з ЕГД перебували на висококалорійному раціоні з вільним доступом до води та їжі. Дослідження проведені на 1-місячних, 2-місячних, 3-місячних і 6-місячних самцях - нащадках щурів з ЕГД, яких декапітували під етаміналовим наркозом і виділяли тимус. В експериментальних групах ураховували вагу тварини й вагу внутрішніх органів (тимуса, селезінки), визначали концентрацію глюкози глюкозооксидазним методом, концентрацію інсуліну в плазмі визначали імуноферментним методом з використанням наборів фірми Peninsula Laboratories Inc. (США), вміст ліпідів, тригліцеридів і холестерину у плазмі крові визначали за допомогою стандартних наборів, проводили глюкозо-толерантний тест (ГТТ).

Структуру клітинних субпопуляцій тимуса вивчали на підставі аналізу серійних гістологічних зрізів з різних відділів органа й даних морфометричних і денсітометричних характеристик із наступним математичним класифікаційним аналізом при фарбуванні гематоксиліном-еозином або моноклональними антитілами (МКАТ) до різних антигенних детермінант тимуса. Для проведення даного дослідження на ротаційному мікротомі робили 5-мікронні серійні зрізи з різних ділянок тимуса, фіксованого по Буену, які потім депарафинували в ксилолі, проводили регідратацію в нисхідних концентраціях етанолу (100%, 96%, 70%), відмивали у фізіологічному розчині або 0,1 М фосфатному буфері (pН =7,4) і фарбували. При фарбуванні гематоксилін-еозином досліджували 4 морфофункційні зони тимуса: субкапсулярну зону, глибоку кору, медулярну зону й внутрішньодолькові периваскулярні простори (ВПП) кори й мозкової речовини. При імуногістохімічних методах фарбування досліджували 2 морфологічні зони тимуса - коркову й мозкову.

Вивчення морфометричних і денсітометричних характеристик клітин тимуса проводили на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Зображення, отримане на мікроскопі Axioskop за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4722 (COHU Inc., США), вводилося в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386. У скануючому режимі вводили всі поля зору в кожній із зон тимуса. Ідентифікація клітин в отриманому зображенні проводилося в автоматичному режимі за допомогою пакета прикладних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Основними морфометричними характеристиками клітин були їхня площа, периметр, максимальний й мінімальний еліптичні діаметри. Додатковими морфометричними характеристиками клітин були коефіцієнти форми, елонгації й еквівалентний діаметр. Денситометричними характеристиками клітин, які визначалися також в автоматичному режимі, були їх абсолютна GreyCONT і питома GreyLOG оптичні щільності, які обчислювалися за формулами: GreyLOG_i = |lg(D_i /D₀)| (одиниць оптичної щільності О_Ощ), де D_i і D₀ - показники оптичної щільності клітин та міжклітинної речовини («фону» препарату) відповідно. GreyCONT_i = S_i * GreyLOG_i (одиниць оптичної щільності О_Ощ), де S_i -площа клітини (мкм²), а GreyLOG_i - питома оптична щільність клітини. Крім зазначених характеристик клітин тимуса ми обчислювали абсолютну кількість клітин (на 1 мм² площі залози) і відносну (%) щільність розподілу кожного класу клітин в окремих зонах тимуса.

Характеристику процесів антигенного диференціювання лімфоцитів оцінювали імуноцитофлюоресцентним методом ідентифікації поверхневих антигенних детермінант CD4 і CD8 у серійних гістологічних зрізах тимуса за допомогою МКАТ до CD4- і CD8-антигенів щура, кон'югованих з FITC (Beckman Coulters, США) із наступним морфометричним аналізом і кількісною оцінкою імуноцитофлюоресцентної реакції. При цьому досліджуваними параметрами були: щільність CD-імунопозитивних лімфоцитів на 1 мм² тканини тимуса і їх частка в структурі лімфоїдної популяції, щільність відповідних CD-рецепторів на клітинній мембрані лімфоцитів, відповідність визначеному морфофункційному класу. Стан проліферативної активності лімфоцитів тимуса оцінювали на основі методики імунофлюоресцентного виявлення ядерного антигену проліферуючих клітин PCNA за допомогою первинних МКАТ до PCNA щура та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США).

Інсулін-експресуючі клітини (Ins⁺) у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом непрямої імунофлюоресценції (НІФ) з використанням МКАТ до інсуліну фірми Peninsula Laboratories Inc. (США) та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Експресію антиапоптотичного білка Bcl-2 та індуцибельної NO-синтази (iNOS) у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом НІФ за допомогою МКАТ до Bcl-2 та iNOS щура та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Для ідентифікації натуральних імунорегуляторних Т-клітин тимуса (Т_reg) у гістологічних зрізах тимуса застосовували метод прямої імунофлюоресценції (ПІФ) з використанням МКАТ до одного з основних маркерів Т_reg - CD25 (Caltag Laboratories, США) з наступним визначенням щільності CD25-рецепторів. Антиген-презентуючі клітини (АПК) у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом ПІФ з використанням МКАТ до MHC-II-антигену щура, кон'югованих з FITC (Beckman Coulter, США). Епітеліоретікулоцити (ЕРЦ) у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом ПІФ з використанням МКАТ до цитокератинів щура (monoclonal Anti-Pan Cytoceratin - MAPC), кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Експресію автоімунного регулятора AIRE у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом подвійної імунофлюоресценції з використанням МКАТ до AIRE та вторинних антитіл, кон'югованих з Texas Red (Santa Cruz Biotechnology, США), а також МКАТ до цитокератинів (Sigma Chemical, США) і CD4-антигену щура (Beckman Coulter, США), кон'югованих з FITC. Експресію білка р53 у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом подвійної імунофлюоресценції з використанням МКАТ до р53 та вторинних антитіл, кон'югованих з Texas Red (Santa Cruz Biotechnology, США), а також МКАТ до CD4-антигену щура (Beckman Coulter, США), кон'югованих з FITC. Експресію білка ранньої відповіді c-Fos у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом НІФ за допомогою МКАТ до c-Fos щура та вторинних антитіл, кон'югованих з FITC (Sigma Chemical, США). Експресію імунної субодиниці протеасоми LMP-2 у гістологічних зрізах тимуса виявляли методом подвійної імунофлюоресценції з використанням МКАТ до LMP-2 та вторинних антитіл, кон'югованих з Texas Red (Santa Cruz Biotechnology, США), а також МКАТ до цитокератинів (Sigma Chemical, США) і CD4-антигену щура (Beckman Coulter, США), кон'югованих з FITC. Додатково для візуалізації LMP-2⁺-клітин у тимусі ставили імуногістохімічну реакцію з первинними МКАТ до LMP-2 щура й вторинними антитілами rabbit ImmunoCruz^TM Staining system (Santa Cruz Biotechnology, США), кон'югованих з пероксидазою хріну.

Для виявлення експресії iNOS і білків теплового шоку Hsp 70 у тимусі використовували метод електрофорезу на поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) з наступним імуноблотингом (Western-blotting) на PVDF-мембрану. Для цього експериментальних тварин в останній день досліджень позбавляли їжі й наступного дня (після 16 годин голодування) декапітували під наркозом (етамінал натрію 40 мг/кг в/очеревинно). Тимус швидко витягали й заморожували в рідкому азоті. Для визначення експресії білків тимус спочатку механічно подрібнювали в рідкому азоті, а потім піддавали ультразвуковій гомогенізації в 2 частинах лізис-буфера (Тріс-HCl - 5 ммоль/л, рН=7,5, гліцерол - 10%, ЕДТА й ЕГТА - по 0,5 ммоль/л, дитіотреітол - 2 ммоль/л, PMSF - 0,2 ммоль/л, коктейль інгібіторів протеаз - 1%, Тритон Х-100 - 0,1%), центрифугували 20 хв. (10000 g, 4^оС). Відбирали супернатант, визначали в ньому вміст білка біцинхоніновим методом (Pierce) за допомогою набору реактивів ВСА-1 (Bicinchoninic acid protein assay kit, Sigma procedure №TPRO-562). Розраховували обсяг проби, у якій міститься 100 мкг білка. У зразки супернатантів (розчинені екстракти білків) додавали 20 мкл 4-кратного Sample buffer (Тріс-HCl 0,5 М, рн=6,8, гліцерол - 10%, SDS -10%, бромфеноловий синій -0,5%, в-меркаптоетанол) і піддавали денатурації на водяній лазні (7 хвилин) або в стерилізаторі та використовували надалі для дослідження методом імуноблотингу.

Імуноблотинг проводили за допомогою обладнання і протоколів BioRad Labs (USA), з використанням антитіл і реактивів фірми Sigma. Супернатанти (по 50-100 мкг білка) розділяли на 7,5% SDS-PAGE (n=3 у кожній пробі) за методом Леммлі (Laemmli U., 1970) та переносили на PVDF-мембрани. Для визначення експресії iNOS застосовували як первинні антитіла моноклональні мишачі анті-iNOS антитіла (BD Transduction Laboratories^TM) і кролячі антитіла до Ig-HRP миші (Sigma Chemical, США), мічені пероксидазою - як вторинні антитіла. Для визначення експресії білків теплового шоку Hsp70 застосовували як первинні антитіла моноклональні мишачі анті-HSP 70 антитіла (Sigma Chemical, США) і кролячі антитіла до Ig-HRP миші (Sigma Chemical, США), мічені пероксидазою - як вторинні антитіла. Для візуалізації реакції використовували набір реактивів ProteoQwest^TM Colorimetric Western Blotting Kit, TMB Substrate (Sigma Chemical, США), детекцію проводили шляхом реакції з тетраметілбензидіном (Sigma Chemical, США). Інтенсивність фарбування визначали за допомогою комп'ютерної денситометрії (програма TotalLab TL100, www.nonlinear.com) і представляли в у.о.

Усі отримані експериментальні дані обробляли на персональному комп'ютері пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина), EXCEL з пакета Microsoft Office 2003 (Microsoft Corp., США), пакета STATISTICA 6.0 (Stat-Soft, 2001). Для всіх показників розраховували значення середньої арифметичної вибірки (М), її дисперсії та помилки середньої (m). Для виявлення вірогідності розходжень результатів досліджень в експериментальних і контрольних групах тварин визначали коефіцієнт Стьюдента (t), після чого визначали ймовірність розходження вибірок (р) і ймовірний інтервал середньої. Критичний рівень значимості при перевірці статистичних гіпотез приймали рівним 0,05. Коефіцієнт вікової кореляції досліджуваних показників розраховували за допомогою пакета статистичних програм JMP 7 (SAS STATISTICS, США).

Результати досліджень та їх обговорення. Проведені дослідження показали, що у щурів лінії SHR і у нащадків щурів з ЕГД до 6-місячного віку розвиваються метаболічні порушення, що проявляються у змінах жирового (гіперліпідемія, гіпертригліцеридемія, гіперхолестеринемія) і вуглеводного (порушення толерантності до глюкози, гіперінсулінемія) обмінів, а рівень глюкози в крові знаходиться на рівні верхніх меж норми. Так, у щурів лінії SHR на тлі гіперінсулінемії при проведенні глюкозотолерантного тесту відзначене його порушення, що характеризується відсутністю ранньої (першої) фази секреції інсуліну й збереженням постпрандіальної гіперглікемії на 90 хвилині тесту. Обчислення індексу HOMA у щурів лінії SHR показало двократне (р<0,05) його збільшення в порівнянні з контролем (0,49 проти 0,23 відповідно). Результати дослідження нащадків, отриманих від самок з ЕГД, виявили у них збільшення маси тіла, макросомію органів. Так, на 1-му і 2-му місяці життя маса самців перевищувала значення групи порівняння практично в 2 рази (р<0,05) і дана тенденція зберігалася до 6 місяця постнатального періоду. У 1-місячних самців маса тимуса перевищувала значення групи порівняння в 2,2 раза (р<0,05), у 2-місячних - в 4 рази (р<0,05) і тільки з 6-го місяця відбувалося відносне вирівнювання маси цих органів у контрольних і експериментальних тварин. У нащадків самок з ЕГД вже з 4-х місячного віку були відзначені зміни ГТТ - запізнення появи піку гіперглікемії в крові - не з 15-ї, а з 30-ї хвилини тесту (при цьому пік концентрації глюкози в крові був вірогідно нижчим (p<0,05) ніж у контрольній групі), еуглікемічний рівень досягався не з 30-ї, а тільки з 90-ї хвилини тесту. У 6-місячних нащадків самок з ЕГД при проведенні ГТТ спостерігався діабетичний тип глікемічної кривої, для якого характерне порушення ранньої і пізньої фаз секреції інсуліну з розвитком інсулінорезістентності, про що свідчить високий рівень глікемії в постабсорбційний період тесту (після 90-ї хвилини). Концентрація інсуліну в плазмі крові у нащадків самок з ЕГД вже у 2-місячному віці вірогідно перевищувала значення групи контролю, досягнувши максимальних значень в 4 місяці, а обчислення індексу HOMA свідчило про формування інсулінорезистентності - у контрольних самців він складав у середньому 0,25-0,4, а у нащадків самок з ЕГД - 0,4-1,7.

Вивчення цитоархітектоніки тимуса у тварин з ПТГ показало достовірне зменшення сумарної щільності лімфоїдних клітин у всіх морфофункційних зонах тимуса у щурів лінії SHR на 22-35% (р<0,05), тоді як у нащадків щурів з ЕГД кількість тимоцитів вірогідно збільшувалася у ВПП і медулярній зоні тимуса в усі досліджені строки постнатального онтогенезу в порівнянні з контролем, а в субкапсулярній зоні й глибокій корі змінювалася різноспрямовано. Вивчення процесів диференціювання тимоцитів у тварин із ПТГ показало достовірне збільшення кількості цитотоксичних CD8⁺ лімфоцитів у порівнянні з контролем - у щурів SHR на 43-66% (р<0,05) і у нащадків щурів з ЕГД в 2-3 рази (р<0,05), тоді як кількість CD4⁺ лімфоцитів не змінювалась в тимусі у щурів SHR і вірогідно знижувалась у нащадків щурів з ЕГД.

Вивчення процесів диференціювання тимоцитів у щурів лінії Wistar і SHR з ЕЦД показало односпрямовані тенденції по зниженню кількості CD4⁺ лімфоцитів і щільності CD4-рецепторів у експериментальних тварин обох ліній і збільшенню кількості CD8⁺ лімфоцитів. Так, щільність популяції CD4⁺ лімфоцитів у корковій речовині тимуса діабетичних тварин лінії Wistar і SHR складала відповідно 574±32 та 386±17 клітин/мм² проти 769±38 та 810±32 у контролі, тоді як кількість CD8⁺ лімфоцитів у цій же зоні тимуса зростала від 328±18 клітин/мм² у контрольних щурів Wistar і 470±25 у щурів SHR до 576±24 та 779±39 клітин/мм² у діабетичних тварин. Введення La щурам з ЕЦД практично не впливало на чисельність CD4⁺ і CD8⁺ лімфоцитів у тимусі. Разом з тим, введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії Wistar і SHR призводило до достовірного збільшення загальної кількості CD4⁺ лімфоцитів у тимусі і знижувало рівень CD8⁺ лімфоцитів у порівнянні з діабетичними тваринами.

Довгий час вважалося, що в-клітини панкреатичних острівців є єдиним місцем продукції інсуліну в організмі. Однак в останнє десятиліття була виявлена екстрапанкреатична експресія інсуліну в тимусі, головному мозку, печінці, жировій тканині, кістковому мозку, селезінці у людини і експериментальних тварин (мишей, щурів) у нормі та при цукровому діабеті І і ІІ типів, а також при штучно підтримуваній гіперглікемії (Throsby M. et al., 1998; Kojima H. et al., 2004; Derbinski J. et al., 2005; Palumbo M. et al., 2006). Дослідження особливостей експресії інсуліну в тимусі в експериментальних тварин із ПТГ показали нижчу кількість Ins⁺-клітин порівняно з контролем: у щурів лінії SHR у корковій речовині їх менше в 2 рази (р<0,05), а в мозковій речовині - на 36% (р<0,05). Вивчення щільності популяції Ins⁺ -клітин в тимусі у нащадків щурів з ЕГД показало достовірне зниження їх кількості в корі тимуса на 23-53% (р<0,05) і в мозковій речовині на 46-58% (р<0,05) в усі досліджені вікові періоди постнатального онтогенезу в порівнянні з контрольними тваринами. Характерно, що популяція інсулін-експресуючих клітин тимуса, що сформована у контрольних тварин вже до 1 місяця постнатального періоду, з віком не тільки не зменшується, а навпаки, зокрема в корі, збільшується й зберігається до зрілого віку. Це дозволяє вважати, що формування імунних механізмів толерантності до інсуліну вимагає постійного синтезу інсуліну тимічного походження й відповідає літературним даним про виявлення в тимусі експресуючих інсулін АПК і ЕРЦ в зрілому віці (Pugliese A., 2004).

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості Ins⁺-клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії Wistar на 55% (р<0,05) і в мозковій речовині на 36% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин, при цьому концентрація інсуліну в Ins⁺-клітинах вірогідно зростала. Введення La щурам лінії Wistar з ЕЦД не супроводжувалося змінами сумарної щільності популяції Ins⁺-клітин в обох зонах тимуса. Разом з тим, введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводило до достовірного збільшення кількості Ins⁺-клітин у корі тимуса на 68% і 58% (р<0,05) відповідно у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як у медулярній зоні не впливало на щільність популяції Ins⁺-клітин. Введення NnLa призводило до зниження концентрації інсуліну в Ins⁺-клітинах на 31-39% (р<0,05) в корі і на 34-47% у мозковій речовині тимуса в порівнянні з діабетичними тваринами.

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням щільності попупуляції Ins⁺-клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії SHR на 23% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і не впливав на їх кількість у мозковій речовині. При цьому концентрація інсуліну в Ins⁺-клітинах коркової речовини тимуса при розвитку ЕЦД збільшувалася, а в мозковій речовині не змінювалася порівняно з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД не супроводжувалося змінами щільності популяції Ins⁺-клітин у тимусі, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до збільшення кількості Ins⁺-клітин у корі на 34% (р<0,05) і в медулярній зоні тимуса на 25% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. При цьому введення NnLa у дозах як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД робило односпрямовану дію й призводило до збільшення концентрації інсуліну в Ins⁺-клітинах коркової речовини тимуса на 30-38% (р<0,05) і мозкової речовини на 14-16% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Отримані нами дані збігаються з рядом інших досліджень. Так, перші повідомлення про клітинну локалізацію синтезу інсуліну в тимусі з'явилися в 1997 році (Smith K. et al., 1997). Тоді в тимусі мишей - головним чином, у мозковій речовині - були знайдені спеціалізовані клітини, експресуючі гени інсуліну й соматостатину. У 1998 році були здійснені перші спроби для встановлення клітинної приналежності АПК тимуса, експресуючих інсулін (Throsby M. et al., 1998). Отримані результати свідчили про те, що такими клітинами є дендритні клітини й макрофаги, був виявлений клітинний розподіл синтезу попередників панкреатичних гормонів: у дендритних клітинах виявлялася експресія тільки лише препроінсуліну, тоді як у макрофагах визначали експресію проглюкагону, просоматостатину й пропанкреатичного поліпептиду. Строгою виявилася послідовність і клітинна топографія експресії генів сімейства інсуліну в стромі тимуса: IGF-2 (епітеліальні клітини тимуса) - IGF-1 (тимічні макрофаги) - інсулін (епітеліальні клітини й/або дендритні клітини) (Geenen V. et al., 2003-2005). Разом з тим, за даними Derbinski J. et al. (2005) і Chentoufi A. et al. (2004) значимі кількості інсуліну, як і інших тканиноспецифічних молекул, у нормальних і NOD-мишей експресуються лише медулярнимі ЕРЦ тимуса, але не дендритними клітинами і не макрофагами. У дослідженнях Garcia et al. (2005) були виявлені проінсулін-експресуючі клітини не тільки в тимусі, але й у селезінці та циркулюючій крові, де не можуть існувати медулярні ЕРЦ тимуса. Знайдені клітини було запропоновано вважати спеціалізованими дендритними клітинами, відповідальними за формування аутотолерантності не тільки в тимусі, але й у периферичних лімфоїдних органах. Існуючі літературні дані збігаються з нашими дослідженнями, згідно яким розвиток ЕЦД супроводжується зниженням щільності популяції АПК і ЕРЦ у тимусі.

У наш час ЦД І типу розглядається як багатофакторне, полігенне захворювання, у патогенезі якого важливу роль можуть відігравати порушення функціонування цілої низки генів. До них відносять гени, що кодують молекули головного комплексу гістосумісності І і ІІ класів, інсулін, транскрипційний фактор Foxp3, цитотоксичний лейкоцитарний антиген CTLA-4, гени, що регулюють протеасомну деградацію білків і процесинг антигенів та ін. (Chentoufi A. et al., 2008). Особливе місце серед генів, критичних для розвитку автоімунної патології, займає ген автоімунного регулятора (AIRE) (Holmdahl R., 2007). Відкриття останніх років показали, що AIRE є регулятором ектопічної транскрипції в тимусі цілого ряду периферичних тканиноспецифічних антигенів (peripheral tissue-specific antigens, PTSAs) (Mathis D. et al., 2007; Kont V. et al., 2008), зокрема панкреатичних. Зміни рівня експресії AIRE у тимусі можуть істотно впливати на представництво в-клітинних антигенів і в такий спосіб порушувати процес формування центральної толерантності до них, створюючи загрозу для розвитку ЦД.

Вивчення серійних зрізів тимуса контрольних щурів, попередньо інкубованих з МКАТ до AIRE, показало, що сумарна щільність AIRE⁺-клітин у корковій речовині тимуса в 2 рази нижча (р<0,05) ніж у мозковій речовині, це відповідає даним Anderson M. et al. (2002) про переважну локалізацію AIRE⁺-клітин у медулярній зоні й на кортико-медулярній межі тимуса. При цьому метод подвійної імунофлюоресценції показав, що серед AIRE⁺-клітин ідентифікуються не лише ЕРЦ тимуса (AIRE⁺MAPC⁺), але й значна кількість тимоцитів (AIRE⁺CD4⁺). Отримані дані підтверджуються дослідженнями Suzuki E. et al. (2008), який методом проточної цитофлуоріметрії та RealTime-PCR продемонстрував, що в тимусі AIRE може бути виражений у дубль-позитивних CD4⁺CD8⁺ тимоцитах і B-лімфоцитах.

Дослідження з вивчення особливостей експресії автоімунного регулятора AIRE в тимусі експериментальних тварин з ПТГ показали вищу кількість AIRE⁺-клітин порівняно з контролем у щурів SHR при відсутності достовірних змін у нащадків щурів з ЕГД, що свідчить про можливість існування й AIRE-незалежних механізмів регуляції тимічної експресії панкреатичних антигенів. Розвиток ЕЦД не супроводжувався змінами кількості AIRE⁺-клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії Wistar, тоді як у мозковій речовині їх щільність популяції знижувалася на 35% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. При цьому концентрація білка AIRE у щурів лінії Wistar з ЕЦД вірогідно знижувалася в порівнянні з контролем в AIRE⁺-клітинах обох досліджених зон тимуса. Введення як La, так і NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД не впливало на чисельність популяції AIRE⁺-клітин тимуса. Введення La і NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД також не впливало й на показники концентрації AIRE у клітинах кори тимуса, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до достовірного зниження концентрації AIRE в AIRE⁺-клітинах у порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині тимуса введення La щурам лінії Wistar з ЕЦД призводило до достовірного зменшення концентрації AIRE у порівнянні з діабетичними тваринами. Схожі, однак більше виражені ефекти робило й введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг, що супроводжувалося зниженням концентрації AIRE в AIRE⁺-клітинах на 12-21% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості AIRE⁺-клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії SHR на 33% (р<0,05) і в мозковій речовині тимуса на 50% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД не супроводжувалося змінами сумарної щільності популяції AIRE⁺-клітин у корі тимуса в порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині тимуса введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД також не впливало на щільність популяції AIRE⁺-клітин, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до збільшення їх кількості на 73% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. Вивчення концентрації білка AIRE в AIRE⁺-клітинах тимуса щурів лінії SHR показало, що розвиток ЕЦД супроводжувався зменшенням даного показника на 12% (р<0,05) у корі й збільшенням на 18% в (р<0,05) у мозковій речовині в порівнянні з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД не впливало на концентрацію білка AIRE у корі тимуса, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до збільшення концентрації AIRE в AIRE⁺-клітинах на 10% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД призводило до зниження концентрації AIRE на 16% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг робило протилежний ефект і супроводжувалося збільшенням концентрації AIRE в AIRE⁺-клітинах на 19% (р<0,05).