Дисфункція тимуса при експериментальному цукровому діабеті і в умовах порушеної толерантності до глюкози

Виявлена нами експресія AIRE тимоцитами (AIRE⁺CD4⁺) дозволяє припустити можливість їх участі у генерації ендогенних пептидів для негативної селекції. Крім цього, експресія AIRE була виявлена в тимоцитах і периферичних лімфоцитах і іншими дослідниками (Suzuki E.et al., 2008). У периферичній крові білок AIRE був виражений тільки в B-лімфоцитах, дендритних клітинах і макрофагах, але не в T-лімфоцитах, а мРНК AIRE була більш інтенсивно виражена в B-лімфоцитах у порівнянні з T-лімфоцитами. Nagafuchi S. et al. (2006) показали, що AIRE експресується також у людських периферичних CD4⁺ T-лімфоцитах. Дефіцит AIRE, як нещодавно продемонстрували Li J. et al. (2007), порушує пізні етапи диференціювання CD4⁺-однопозитивних тимоцитів, призводячи до скупчення незрілих клітин цього фенотипу в тимусі. Цей результат вказує, що на додаток до індукції вираження PTSAs, AIRE може також впливати на заключні етапи дозрівання тимоцитів. Оскільки AIRE-регульовані гени мають тенденцію локалізуватися в певних групах (кластерах), Kaufmann B. et al. (2007) було запропоновано, що AIRE функціонує як регулятор геномних кластерів і активізує гени в стохастичній манері. Hаssler S. et al. (2008) виявили, що дефіцит Aire викликає збільшену сприйнятливість до стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету. Крім того, макрофаги Aire^{-/ -} мишей продукують вищі рівні продіабетогенного цитокіна TNFЬ і нижчі рівні супресорного цитокіну IL-10 після індукції стрептозотоцинового діабету, у Aire^{-/ -} мишей також спостерігається більш висока частота виявлення автоантитіл до клітин панкреатичних острівців (Hаssler S. et al., 2008).

Основна частина панкреатичних антигенів і AIRE презентується ЕРЦ коркової й мозкової речовини тимуса й класичними «професійними» АПК - В-лімфоцитами, макрофагами й дендритними клітинами (Pugliese A. et al., 2001; Garcia C. et al., 2005). Тому на наступному етапі роботи ми вивчили морфофункційний стан цих компартментів тимуса в експериментальних тварин. Дослідження епітеліального компартменту і АПК тимуса в експериментальних тварин із ПТГ показали нижчий рівень кількості MHC-II⁺-клітин і збільшення числа ЕРЦ у щурів SHR, тоді як у нащадків щурів з ЕГД спостерігалася односпрямована тенденція до зниження кількості ЕРЦ і MHC-II⁺-клітин у тимусі протягом усього вивченого періоду постнатального онтогенезу.

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості ЕРЦ у щурів лінії Wistar у корковій речовині тимуса на 22% (р<0,05) і в мозковій речовині на 24% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і супроводжувався змінами співвідношення окремих типів ЕРЦ. Характерно, що введення як La, так і NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД робило односпрямовані ефекти й призводило до достовірного збільшення загальної кількості ЕРЦ у корі на 38-47% (р<0,05) і в медулярній зоні тимуса на 22-44% у порівнянні з діабетичними тваринами.

Розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості ЕРЦ у корковій речовині тимуса щурів лінії SHR на 23% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і не впливав на їх кількість у мозковій речовині. Введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД призводило до збільшення кількості ЕРЦ у корковій речовині тимуса на 23-35% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як у мозковій речовині їх щільність популяції вірогідно не змінювалася.

Вивчення MHC-II⁺ АПК тимуса у щурів лінії Wistar показало, що розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості MHC-II⁺ клітин у корковій речовині тимуса на 44% (р<0,05) і в мозковій речовині на 25% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. При цьому спостерігалось зниження щільності популяції MHC-II⁺-макрофагів (на 46-72%, р<0,05) і MHC-II⁺-В-лімфоцитів (на 29-37%, р<0,05) в обох зонах тимуса і зростання кількості MHC-II⁺-дендритних клітин (на 55%, р<0,05) у порівнянні з контролем. Введення La супроводжувалося збільшенням сумарної щільності популяції MHC-II⁺ клітин в обох вивчених зонах тимуса. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД також супроводжувалося збільшенням у корі тимуса кількості MHC-II⁺ клітин на 36-60% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як у медулярній зоні відзначалися дозозалежні ефекти: введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД не впливало на кількість MHC-II⁺ клітин, а збільшення дози NnLa до 50 мг/кг супроводжувалося зростанням кількості MHC-II⁺ клітин на 79% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Розвиток ЕЦД характеризувався збільшенням кількості MHC-II⁺ клітин у корковій речовині тимуса щурів лінії SHR на 45% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і зменшенням на 24% (р<0,05) у мозковій речовині. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД викликало односпрямовані ефекти й супроводжувалося збільшенням щільності популяції MHC-II⁺ клітин у корковій речовині тимуса 2,8-2,9 раза (р<0,05) і в мозковій речовині в 2,2-3,3 раза (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Отримані дані дозволяють припускати про важливу роль зниження кількості АПК і ЕРЦ у тимусі як про один із важливих імунних механізмів розвитку ЕЦД, тому що саме ці клітини є основними інсулін- і AIRE-експресуючими клітинами, а зміна їх кількості впливає на інтенсивність презентації в-клітинних антигенів і формування центральної толерантності до них. Крім того, ЕРЦ здатні впливати на перебіг процесів селекції тимоцитів за допомогою синтезу цілого ряду цитокінів, факторів росту, нейропептидів і власних тимічних гормонів (Savino W. et al., 2000; Anderson G. et al., 2001).

Проблема дослідження молекулярних механізмів апоптозу та його ролі в розвитку автоімунних захворювань, у тому числі і ЦД, в останні роки є однією із найважчих і актуальних проблем медико-біологічних наук (Ярилин А.А. и др., 2001; Барышников А.Ю. и др., 2002; Langenau D. et al., 2005). Одними з основних регуляторів апоптозу в тимусі є білки Bcl-2 і р53. Продукт гена bcl-2 - білок Bcl-2 є найважливішим репресором апоптозу, що має подвійну дію: може функціонувати і як іонний канал, і як адапторний білок (Marsden V. et al., 2003). Він експресується на мембрані мітохондрій, меншою мірою - на ядерній мембрані і на поверхні клітин (Zhang N. et al., 2005; Hemann M. et al., 2006).

Нами встановлено, що у експериментальних тварин із ПТГ спостерігався вищий рівень експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 порівняно з контролем. Так, у щурів лінії SHR у корковій речовині тимуса кількість Bcl-2⁺-клітин була більшою на 44% (р<0,05), а в мозковій речовині на 18% (р<0,05). Вивчення щільності популяції Bcl-2⁺-клітин в тимусі у нащадків щурів з ЕГД показало збільшення їхньої кількості в корковій речовині в 2,4-4,5 раза (р<0,05) і в мозковій в 1,5-2,7 раза (р<0,05) в усі вивчені вікові періоди постнатального онтогенезу в порівнянні з контрольними тваринами відповідного віку.

Розвиток ЕЦД у щурів лінії Wistar супроводжувався збільшенням кількості Bcl-2⁺-клітин у корковій речовині тимуса в 2 рази (р<0,05) і в мозковій речовині на 64% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин та призводив до підвищення концентрації білка Bcl-2 в усіх класах Bcl-2⁺-клітин у корі (на 18-39%, р<0,05) та у Bcl-2⁺-середніх лімфоцитах у медулярній зоні. Введення La щурам лінії Wistar з ЕЦД не впливало на чисельність популяції Bcl-2⁺-клітин у тимусі, тоді як введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг призводило до зниження кількості Bcl-2⁺-клітин у корі тимуса на 52-53% (р<0,05) і в медулярній зоні на 43-56% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR супроводжувався збільшенням кількості Bcl-2⁺-клітин у корковій речовині тимуса на 63% (р<0,05) і в мозковій речовині на 41% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і призводив до зростання концентрації білка Bcl-2 в Bcl-2⁺-клітинах кори на 13-17% (р<0,05) і мозкової речовини на 9-15% (р<0,05). При цьому спостерігались порушення співвідношення окремих класів Bcl-2⁺-клітин у щурів обох ліній. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД призводило до зменшення кількості Bcl-2⁺-клітин у корі тимуса на 64-65% (р<0,05) і в мозковій речовині на 62-64% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами.

Особливе місце в регуляції апоптозу тимоцитів займає проапоптотичний білок р53 (Royds J. et al., 2006; Levine A. et al., 2006; Чумаков П.М., 2007). Відомо, що ушкодження ДНК сприяє накопиченню р53, що, у свою чергу, блокує прогресію клітинного циклу у фазі G1, перешкоджаючи, таким чином, реплікації ДНК до репарації ушкодження (Adimoolam S. et al., 2002). Якщо репарація ушкодження неможлива, то білок р53 запускає механізм апоптозу. При цьому білок р53 здатний не тільки активувати гени, що беруть участь в індукції клітинної смерті за рахунок своєї транскрипційної функції, але й бере безпосередню участь в індукції мітохондріального шляху апоптозу (Braithwaite A. et al., 2005; Chipuk J. et al., 2006; Deppert W., 2007). Р53 вступає у взаємодію з BH4-доменом антиапоптотичних білків BclXL і Bcl2 (Hemann M. et al., 2006), зв'язування з якими вивільняє й активує проапоптотичні білки Bax і Bid.

У експериментальних тварин із ПТГ спостерігалися зміни рівня експресії білка р53: щільність популяції р53⁺-клітин була на 18-24% (р<0,05) вища, ніж у контролі, в обох вивчених зонах тимуса щурів SHR, вірогідно знижувалася в корковій речовині тимуса у нащадків щурів з ЕГД у дво- і шестимісячному віці та змінювалася різноспрямовано в мозковій речовині: знижувалася в 1-місячних нащадків, збільшувалася у 2-місячних у порівнянні з контрольними тваринами відповідного віку, і не змінювалася в більш пізні терміни постнатального онтогенезу.

Вивчення експресії білка р53 у щурів лінії Wistar показало, що розвиток ЕЦД супроводжувався збільшенням кількості p53⁺-клітин у корковій речовині тимуса на 36% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і зростанням концентрації білка р53 в усіх класах p53⁺-клітин кори на 7-21% (р<0,05), і не впливав на ці показники у медулярній зоні. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД не впливало на кількість p53⁺-клітин у корі тимуса, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг призводило до зниження їх щільності популяції на 19% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині тимуса введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам з ЕЦД не супроводжувалося змінами кількості p53⁺-клітин. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR супроводжувався зниженням кількості p53⁺-клітин у корковій речовині тимуса на 45% (р<0,05) і в мозковій речовині на 30% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин, а також призводив до зниження концентрації білка р53. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг і 50 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД викликало односпрямовані ефекти в корі тимуса й призводило до збільшення кількості p53⁺-клітин на 38% (р<0,05) і 53% (р<0,05) відповідно в порівнянні з діабетичними тваринами. У мозковій речовині введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам лінії SHR з ЕЦД також призводило до збільшення щільності популяції p53⁺-клітин на 62% (р<0,05), тоді як збільшення дози NnLa до 50 мг/кг викликало протилежні ефекти і призводило до зниження кількості p53⁺-клітин на 33% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами й в 2,1 раза (р<0,05) у порівнянні з контролем.

Серед факторів, що роблять важливий вплив на функціональний стан лімфоїдного і епітеліального компартментів тимуса в нормі і при експериментальній патології, є оксид азоту (NO), що може дозозалежно впливати на апоптоз і диференціювання тимоцитів (Fehsel K. et al., 1995; Zhou X. et al., 2000; Hildeman D. et al., 2003). Так, W. Niedbala et al. (2006) встановили, що високі дози NO роблять цитотоксичну дію, у той час як низькі - підсилюють виживаність Т-лімфоцитів і вибірково збільшують диференціювання мишачих h 1 типу, не впливаючи на h 2-клітини. Основним продуцентом NO у тимусі є індуцибельна NO-cинтаза. Дослідження з вивчення особливостей тимічної експресії iNOS у експериментальних тварин із ПТГ показали достовірне зниження кількості iNOS⁺-клітин в тимусі у щурів лінії SHR і збільшення їх щільності популяції порівняно з контролем у нащадків щурів з ЕГД. Так, у корковій речовині тимуса у нащадків щурів з ЕГД кількість iNOS⁺-клітин протягом 1-6 місяців постнатального онтогенезу зростала на 23-78% (р<0,05), у мозковій - на 19-75% (р<0,05) порівняно з контрольними тваринами відповідного віку.

Розвиток ЕЦД у щурів лінії Wistar супроводжувався збільшенням кількості iNOS⁺ клітин у корковій речовині тимуса на 62% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і не впливав на їх щільність у мозковій речовині. Введення La щурам з ЕЦД призводило до збільшення щільності популяції iNOS⁺ клітин у корі тимуса на 21% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами і не спричиняло до змін щільності популяції в медулярній зоні. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг щурам лінії Wistar з ЕЦД викликало односпрямовані ефекти й супроводжувалося зниженням щільності популяції iNOS⁺ клітин у корі на 72-75% (р<0,05) і в мозковій речовині на 56-62% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. Визначення кількості білка iNOS у гомогенатах тимуса методом SDS-PAGE-електрофорезу з наступним імуноблотингом показало, що розвиток ЕЦД супроводжується збільшенням експресії iNOS у тимусі щурів лінії Wistar в 4 рази (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД призводить до зниження кількості iNOS в 2,3 раза (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, залишаючись проте на 79% (р<0,05) вище рівня контрольних значень. Підвищення дози NnLa до 50 мг/кг робить більш вираженим ефект і супроводжується зменшенням кількості iNOS в 7,4 раза (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами й у 1,8 раза (р<0,05) у порівнянні з контролем. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR супроводжувався збільшенням кількості iNOS⁺ клітин у корковій речовині тимуса на 31% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин і не впливав на їх кількість у мозковій речовині.

Отримані результати дають можливість припустити наявність тісного зв'язку між змінами експресії Bcl-2, р53, iNOS і рівнем апоптотичних процесів у тимусі. Можливо, що гіперекспресія Bcl-2, з одного боку, захищає від NO-опосередкованого апоптозу, а з іншого сприяє виживанню аутореактивних клонів лімфоцитів. Крім того, можна припустити односпрямованість ефектів NO і Bcl-2 відносно блокування апоптозу - антиапоптотична дія NO може бути опосередкована через синтез цГМФ із наступним інгібуванням каспаз або підвищенням експресії Bcl-2 (Bogdan C., 2000). Проте є й протилежні дані, згідно з якими при дії NO на клітину знижується рівень білка Bcl-2 через каспаз-індуковане розщеплення (Tejedo J. et al., 1999) або р53-залежне придушення його експресії (Mebmer U. et al., 1996). З іншого боку, Сагач В.Ф і співавт. (2004) продемонстрували, що преінкубація мітохондрій з інгібітором NO-синтаз L-NAME вірогідно збільшувала величину Са²⁺-індукованого набрякання мітохондрій серця й стимулювала відкриття мітохондріальної пори (МП), тоді як введення в інкубаційне середовище донора NO нітропрусиду натрію після додавання L-NAME відновлювало типове Са²⁺-індуковане набрякання. Ці результати суголосні нашим даним про зниження експресії Bcl-2 у тимусі після введень блокаторов NOS, оскільки відомо, що білок Bcl-2 перешкоджає відкриттю МП.

Не менш важливим регулятором процесів апоптозу й диференціювання тимоцитів є білок c-Fos. Відомо, що стимуляція спочиваючих клітин призводить до проліферації, що супроводжується експресією генів «негайної ранньої відповіді», серед яких особливий інтерес представляє протоонкоген c-fos (Mikula M. et al., 2003). Короткочасна активація експресії c-fos має важливе значення для переходу клітин з фази G0 у фазу G1 клітинного циклу. Продукт гена c-fos (білок c-Fos) утворює гетеродимер з білками сімейства c-jun, формуючи транскрипційний комплекс АР-1 (Wagner E., 2001; Shaulian E. et al., 2001; Raivich G. et al., 2006), який бере участь у підтримці базального рівня експресії багатьох генів. АР-1 є однією з головних мішеней для сполук, що викликають клітинну проліферацію або диференціювання (Ameyar M.etal., 2003). Останнім часом встановлений тісний зв'язок між інтенсивністю експресії c-Fos і рівнем апоптотичних процесів у тимусі. Зокрема, Okada S. (2003) показав можливість впливу с-Fos на NO-залежний апоптоз, що обумовлено його можливістю виступати в ролі негативного регулятора транскрипції iNOS. Крім того, була виявлена можливість впливу с-Fos на апоптоз через систему рецепторів до фактору некрозу пухлини альфа (TNFб) (Koichi M. et al., 2004), а дослідження молекулярних механізмів функціонального дозрівання тимоцитів показало зростання трансляції c-fos при проходженні позитивної селекції (Nunomura S. et al., 2000).

Дослідження з вивчення особливостей тимічної експресії білків ранньої відповіді c-Fos у експериментальних тварин з ПТГ показали збільшення кількості c-Fos⁺ клітин на 52% (р<0,05) у мозковій речовині тимуса у щурів лінії SHR і достовірне зменшення їхньої щільності популяції в порівнянні з контролем у нащадків щурів з ЕГД. Розвиток ЕЦД у щурів лінії Wistar супроводжувався зменшенням кількості c-Fos⁺ клітин у корі тимуса на 27% (р<0,05) і в мозковій речовині на 23% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин, а також призводив до зниження концентрації білків ранньої відповіді на 11-24% (р<0,05) у корковій речовині і на 14-26% (р<0,05) у мозковій в усіх класах c-Fos⁺ клітин. Введення La щурам з ЕЦД не впливало на щільність популяції c-Fos⁺ клітин у корі і супроводжувалося зниженням на 18% (р<0,05) їх кількості в медулярній зоні тимуса. У той же час, введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг призводило до достовірного збільшення кількості c-Fos⁺ клітин у корі тимуса на 47-73% (р<0,05) і в мозковій речовині на 26-31% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR також супроводжувався зменшенням кількості c-Fos⁺ клітин у корковій речовині тимуса на 34% (р<0,05) і в мозковій речовині на 61% (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин, але призводив до достовірного зростання концентрації білків ранньої відповіді. При цьому у щурів обох ліній при діабеті спостерігались порушення співвідношення окремих класів c-Fos⁺-лімфоцитів. Характерно, що введення NnLa щурам лінії SHR з ЕЦД призводило до зниження кількості c-Fos⁺ клітин у тимусі в порівнянні з діабетичними тваринами.

Важливими регуляторами процесинга антигенів у тимусі є білки теплового шоку. Велика кількість функцій Hsp пов'язана з їх здатністю зв'язуватися практично з усіма пептидами, що синтезуються в клітці - як з нормальними, так і з патологічно зміненими й у вигляді таких комплексів брати участь у різноманітних клітинних процесах (фолдінг, транспортування білків, захист клітин від стресів різного генезу та ін.) (Schmitt E. et al., 2007; Asea A., 2007; Whitham M. et al., 2008; Saibil H., 2008). Зміни рівня експресії Hsp у тимусі можуть впливати на диференціювання тимоцитів через виражені антиапоптотичні ефекти стрес-білків (Gabai V. et al., 2002; Garrido C. et al., 2003; Aria R. et al., 2007; Daugaard M. et al., 2007). Можливість активної участі Hsp у патогенезі автоімунних захворювань обумовлена їх здатністю зв'язувати в клітині фрагменти практично будь-яких білків, що підтверджується структурними дослідженнями Zhu X. et al., 1996, Linderoth N. et al., 2000, Vogen S.et al., 2002, у яких була показана наявність пептид-єднальних кишень у молекулах Hsp70 і gp96. На поверхні АПК були виявлені рецептори до Hsp-пептидних комплексів (Hsp-pc), у ролі яких можуть виступати CD91, CD14, молекули TLR2 і TLR4 (Binder R. et al., 2000; Asea A. et al., 2002). АПК, активовані Hsp-pc, викликають активацію клітинної і гуморальної імунних відповідей проти антигенів тканин, з яких ці Hsp-рс виділені, що створює передумови для розвитку автоімунної реакції (Raska M. et al., 2005).

Аналіз інтенсивності специфічного фарбування PVDF-мембран показав, що розвиток ЕЦД супроводжується збільшенням кількості Hsp70 у тимусі щурів лінії Wistar в 2,6 раза (р<0,05) у порівнянні з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозі 10 мг/кг щурам з ЕЦД призводить до зниження кількості Hsp70 на 47% (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, тоді як підвищення дози NnLa до 50 мг/кг робить більш виражений ефект і супроводжується зменшенням кількості Hsp70 в 2,9 раза (р<0,05) у порівнянні з діабетичними тваринами, сприяючи поверненню показників до рівня контрольних значень. Виявлене нами збільшення експресії Hsp70 у тимусі при ЕЦД може сприяти виробленню центральної толерантності до панкреатичних антигенів через їх додаткову «незаплановану репрезентацію» у комплексі зі стрес-білками в ході негативної селекції тимоцитів. Цей процес «репрезентації» (тобто виділення антигенних детермінант із комплексів з одними молекулами й презентація в комплексах з іншими) містить у собі переміщення антигенних пептидів певними внутрішньоклітинними структурами і супроводжується також синтезом широкого спектру прозапальних цитокінів і костимулюючих молекул (Basu S. et al., 1998; Doody A. et al., 2004; Multhoff G., 2007).

Важливими регуляторами апоптозу й процесингу антигенів у тимусі є імунні протеасоми, що генерують пептиди для селекції тимоцитів (Wojcik C., 2002; Konstantinova I. et al., 2008; Murata S. et al., 2008). Заміна конститутивних субодиниць протеасом на імунні відбувається за певних умов, наприклад, під впливом IFN (Goldberg A., 2007; DeMartino G. et al., 2007). При цьому конститутивні каталітичні субодиниці X(5), Y (1) та Z(2) заміщуються на імунні субодиниці LMP7 (5i), LMP2 (1i) і LMP10 (2i) (Borissenko L. et al., 2007). При гідролізі білків імунними протеасомами в кілька разів зростає вихід олігопептидів довжиною 8-11 амінокислотних залишків. Олігопептиди такої довжини відповідають розмірам антигенних епітопів. У комплексі з молекулами MHC I класу вони виносяться на поверхню клітини та більш ефективно презентуються тимоцитам у ході їх селекції (Абрамова Е. Б и др., 2005; Шарова Н.П. и др., 2006). Протеасоми є важливими регуляторами селекції тимоцитів. Причому, якщо імунні субодиниці контролюють головним чином негативну селекцію (Sharova N., 2006), тo нещодавно відкрита субодиниця в5t, виражена винятково в коркових ЕРЦ і названа «тимопротеасомою», як припускають, є відповідальною за позитивну селекцію тимоцитів (Murata S. et al., 2007). Субодиниця в5t включається в 20S протеасому замість субодиниці b5i (LMP-7). Характерно, що інші дві каталітичні субодиниці, що входять у тимопротеасому - це LMP-2 і MECL1, однак вони представлені в коркових ЕРЦ слабкіше, ніж b5t.

Нами встановлено, що у експериментальних тварин із ПТГ спостерігалися зміни експресії імунної субодиниці протеасоми LMP-2: щільність популяції LMP-2⁺-клітин достовірно знижувалася у щурів лінії SHR і в корі тимуса у нащадків щурів з ЕГД, і змінювалася фазно в медулярній зоні - знижувалася у 1-місячних нащадків, збільшувалася у дво- і тримісячних нащадків, а з 6-місячного віку відзначалася друга хвиля зниження їх кількості порівняно з контрольними тваринами відповідного віку.

Розвиток ЕЦД супроводжується зниженням кількості LMP-2⁺-клітин на 35-44% (р<0,05) в обох вивчених зонах тимуса у щурів лінії Wistar і в мозковій речовині у щурів SHR, що, можливо, спричиняє дефект генерації ендогенних пептидів для негативної селекції тимоцитів. Кількість LMP-2⁺-клітин після введень NnLa діабетичим тваринам достовірно збільшується в тимусі у щурів лінії SHR, тоді як у щурів лінії Wistar знижується в корі й збільшується в медулярній зоні тимуса. Характерно, що серед LMP-2⁺-клітин методом подвійної імунофлюоресценції ідентифікувалися як ЕРЦ (LMP-2⁺MAPC⁺), так і тимоцити (LMP-2⁺CD4⁺). Виявлена експресія імунних протеасом тимоцитами, а також виявлені дані про експресію AIRE цими ж клітинами, дозволяє нам припустити, що не тільки ЕРЦ тимуса, а й тимоцити беруть активну участь у генерації ендогенних пептидів для негативної селекції. Отримані нами дані збігаються з рядом інших досліджень. Так, вивчення імунних протеасом у тимусі щурів методом Western blotting та імуногістохімії (Melnikova V. et al., 2008) показало, що LMP2 і LMP7 субодиниці виявляються в ЕРЦ як кори, так і мозкової речовини тимуса. Крім того, експресія LMP2 і LMP7 була виявлена й у тимоцитах також. Однак кількість імунопозитивного матеріалу в тимоцитах була нижче, ніж в ЕРЦ. Вивчення внутрішньоклітинної локалізації LMP2 і LMP7 субодиниць показало їхнє розташування в цитоплазмі клітин. Імунні субодиниці LMP7 і LMP2 виявляються в достатній кількості й у пулах протеасом селезінки щурів та інших лімфоїдних органах (Sharova N., 2006).

Численні дослідження останніх років свідчать, що важливу роль у забезпеченні імунологічної аутотолерантності і негативному контролі як патологічних, так і фізіологічних імунних реакцій відіграє популяція натуральних CD4⁺CD25⁺регуляторних Т-клітин (Т_reg) (Фрейдлин И.С., 2005; Piccirillo C. et al., 2004; Annunziato F. et al., 2002; Paust S. et al., 2004; Randolph D. et al., 2006). Елімінація або інактивація цих клітин викликає розвиток важких автоімунних захворювань, а також призводить до посилення імунної відповіді на алоантигени і пухлинні клітини (Sakaguchi S., 2004; Ярилин А.А. и др., 2005).

У експериментальних тварин із ПТГ спостерігалося зниження кількості Т_reg-клітин у тимусі за винятком 3-місячних нащадків щурів з ЕГД, у яких їх щільність популяції в корі тимуса зростала порівняно з контролем. Розвиток ЕЦД у щурів лінії Wistar супроводжувався зниженням кількості Т_reg-клітин у корковій речовині тимуса на 45% (р<0,05) і в мозковій речовині на 61% (р<0,05) порівняно з контрольною групою тварин. Введення La щурам щурів лінії Wistar з ЕЦД не впливало на щільність популяції CD25⁺ лімфоцитів, тоді як введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводило до зростання кількості Т_reg-клітин у корі тимуса відповідно на 46% і в 2,4 раза (р<0,05) та у медулярній зоні в 3-3,1 раза (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR викликав ідентичні ефекти та супроводжувався зниженням кількості Т_reg-клітин в обох вивчених зонах тимуса на 31-32% (р<0,05) порівняно з контрольною групою тварин. Введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводило до збільшення кількості Т_reg-клітин у корі тимуса відповідно на 77% і в 2,3 раза (р<0,05) і у мозковій речовині на 35% і в 2 рази (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами.

Отримані результати збігаються з численними даними про функціональну дефектність Т_reg - клітин, що була виявлена при багатьох автоімунних захворюваннях людини і моделюючій їх експериментальній патології, насамперед при ЦД І типу (Sakaguchi S., 1995-2004). Так, у мишей-самок лінії NOD, у яких спонтанно розвивається захворювання, що моделює ЦД типу І, Т_reg - клітини-продуценти TGFв визначаються в острівцевій тканині, але їхній зміст і функціональна активність знижуються з віком (Pop S. et al., 2005). Введення СD4⁺СD25⁺ Т-клітин дозозалежно знижує частоту спонтанного розвитку діабету у мишей лінії NOD. Ці клітини скасовують індукцію діабету при адоптивному переносі СD4⁺СD25⁺-клітин від мишей NOD (Piccirillo C. et al., 2005). Дефект супресорних функцій Т_reg -клітин був виявлений і у пацієнтів з ЦД І типу, що проявлялося зниженням продукції IL-10 і зміною змісту внутрішньоклітинного CTLA 4 (Lindley S. et al., 2005). Цікаво, що дослідження Aschenbrenner та ін. (2007) показали залежність диференціювання T_reg у тимусі від рівня експресії Aire, а Chen Z. et al. (2005) продемонстрували спільні дії в ефектах мутацій у генах Foxp3 і Aire: хвороба в мишей, мутантних за двома генами протікала значно важче, ніж при дефіциті хоча б одного фактору.

У експериментальних тварин із ПТГ спостерігалася більш низька кількість проліферуючих лімфоцитів: так, у корі тимуса у щурів SHR їхня щільність популяції була нижчою в 4,3 раза (р<0,05) і в медулярній зоні в 2 рази (р<0,05) порівняно з контролем, у нащадків щурів з ЕГД протягом 1-6 місяців постнатального життя відповідно на 68-75% (р<0,05) нижче в корі і на 44-65% (р<0,05) у мозковій речовині тимуса. Вивчення проліферативної активності лімфоцитів тимуса у щурів лінії Wistar показало, що розвиток ЕЦД супроводжувався зниженням кількості PCNA⁺ лімфоцитів у корковій речовині тимуса на 76% (р<0,05) і в мозковій речовині тимуса на 61% (р<0,05) порівняно з контрольною групою тварин. Введення La щурам з ЕЦД не супроводжувалося змінами сумарної щільності популяції PCNA⁺ лімфоцитів, тоді як введення NnLa у дозах 10 мг/кг і 50 мг/кг призводило до збільшення кількості проліферуючих клітин в обох досліджених зонах тимуса в 2,1-3,7 раза (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами, при цьому більше виражений ефект спостерігався при дозуванні NnLa 10 мг/кг. Розвиток ЕЦД у щурів лінії SHR не впливав на кількість PCNA⁺ лімфоцитів у тимусі. Введення NnLa у дозі як 10 мг/кг, так і 50 мг/кг призводило до збільшення сумарної щільності популяції проліферуючих клітин у корі тимуса відповідно в 2,4 раза і 2,8 раза (р<0,05) та у мозковій речовині в 2 рази й 2,4 раза (р<0,05) порівняно з діабетичними тваринами.

У цілому аналіз впливів курсових введень блокатора NOS NnLa на функціональний стан тимуса, незважаючи на існуючі лінійні відмінності й дозозалежні особливості, дозволяє виділити ряд загальних закономірностей (мал. 1). По-перше, варто виокремити той факт, що введення NnLa як у щурів лінії Wistar, так і у щурів лінії SHR кардинально змінюють цитоархітектоніку тимуса, що, насамперед, обумовлено його здатністю підсилювати проліферативну активність. По-друге, звертає на себе увагу загальна тенденція по впливу введень блокаторів NOS на диференціювання тимоцитів - у тварин обох ліній спостерігається достовірне зменшення числа цитотоксичних CD8⁺ лімфоцитів і збільшення кількості CD4⁺ лімфоцитів порівняно з діабетичними тваринами (див. мал. 1). При цьому введення NnLa призводять і до збільшення кількості натуральних імунорегуляторних Т-клітин. По-третє, посилення проліферативної активності клітин тимуса після введень NnLa, вочевидь, є однією із причин виявленого нами збільшення кількості ЕРЦ і MHCII⁺ клітин. Зі зміною морфофункційного стану АПК тимуса після введень NnLa, безумовно, пов'язані й виявлені нами зміни кількості тимічного інсуліну й автоімунного регулятора, тому що саме ЕРЦ і MHC-II⁺ клітини є основними інсулін- і AIRE-експресуючими клітинами тимуса.

Ще однією характерною рисою ефектів введень NnLa на функціональний стан тимуса є виявлена нами його здатність впливати на рівень експресії білків-регуляторів апоптозу р53, Bcl-2, c-Fos. Причому, якщо у відношенні антиапоптотичного білка Bcl-2 відзначалася односпрямована тенденція зі зменшення кількості Bcl-2⁺-клітин у порівнянні з діабетичними тваринами, то кількість р53⁺-клітин у щурів лінії Wistar після введень NnLa знижувалася у корі при дозуванні NnLa 50 мг/кг і не змінювалася в медулярній зоні тимуса порівняно з діабетичними тваринами, а у щурів SHR спостерігалася протилежна й більше дозозалежна тенденція зі збільшення кількості p53⁺-клітин. У динаміці змін рівня c-Fos⁺ клітин після введень NnLa також простежувалися чіткі лінійні розходження: якщо у щурів лінії Wistar кількість c-Fos⁺ клітин у тимусі вірогідно збільшувалася порівняно з діабетичними тваринами на 47-73% (р<0,05) у корі й на 26-31% (р<0,05) у мозковій речовині, то у щурів лінії SHR відзначалася зворотна тенденція до зниження їхнього числа.

Множинні імунні порушення нами були виявлені у нащадків щурів з ЕГД: зміни цитоархітектоніки тимуса, дисбаланс Т-хелперів і цитотоксичних лімфоцитів, зниження кількості проліферуючих лімфоцитів, АПК, Ins⁺-клітин, зміни рівня тимічної експресії таких регуляторів апоптозу, як білки Bcl-2, р53, білки ранньої відповіді с-Fos, білки теплового шоку, індуцибельна NO-синтаза та ін. Дані функціональні зміни тимуса є фактором ризику розвитку автоімунної патології у нащадків і відповідають літературним даним про частіший розвиток надалі у нащадків жінок з гестаційним діабетом як інсулін-залежного, так і інсулін-незалежного ЦД (Assche F. et al., 2001).

Важливим аспектом застосованої і розробленої нами моделі ЕГД є можливість звести до мінімуму токсичну дію стрептозотоцину на плід. Стрептозотоцин як низькомолекулярна речовина здатна частково проникати через плацентарний бар'єр, однак в-клітини панкреатичних острівців плода є надзвичайно резистентни до його дії, порівняно з в-клітинами матері, а виявлені нами порушення морфогенезу тимуса і дисфункцію його лімфоїдного і епітеліального компонентів ми пов'язуємо, головним чином, з внутрішньоутробною гіперглікемією, що діє на плід при ЕГД. Можливо гіперглікемією, що розвивається при моделюванні стрептозотоцинового діабету, можна частково пояснити і ті зміни в тимусі, які спостерігались й у щурів ліній Wistar і SHR із тритижневим ЕЦД, про що свідчить і виявлений нами паралелізм змін у центральному органі імуногенезу в цих експериментальних групах і у нащадків щурів з ЕГД. Підтвердженням такого припущення є й отримані Kojima H. і ін. (2004) дані про те, що не тільки при експериментальному стрептозотоциновому діабеті, але й в умовах штучно підтримуваної гіперглікемії спостерігається ряд морфофункційних змін у тимусі, зокрема зміни рівня інсулін-продукуючих клітин і концентрації тимічного інсуліну.

Проведений нами кореляційний аналіз виявив наявність цілого ряду сильних позитивних і негативних зв'язків в тимусі у нащадків щурів з ЕГД протягом перших 6 місяців постнатального періоду між кількістю клітин різного фенотипу, а також між концентраціями тимічного інсуліну, білка AIRE і кількістю клітин різного фенотипу. Виявлені кореляційні зв'язки підтверджують існування чіткої залежності процесів диференціювання тимоцитів від рівня експресії тимічного інсуліну, про- і антиапоптотичних білків р53 і Bcl-2, а також ЕРЦ тимуса, що формують необхідне мікрооточення для їхнього дозрівання. Важливо було виявити сильну позитивну кореляцію між числом AIRE⁺-клітин і CD25⁺-лімфоцитів (r=+0,97, р<0,05), ЕРЦ і Ins⁺-клітин (r= +0,82, р<0,05), інтригуюче виглядає кореляційний зв'язок між кількістю р53⁺ і Bcl-2⁺-лімфоцитів (r=+0,85, р<0,05). У першому випадку підтверджується припущення про можливий вплив Aire на процеси диференціювання Тreg - клітин тимуса, виявлений раніше Aschenbrenner та ін. (2007). Тісна пряма залежність між кількістю ЕРЦ і Ins⁺-клітин підтверджується даними про переважну локалізацію панкреатичних антигенів саме в цих клітинах (Chentoufi A. et al., 2002), тоді як взаємини між р53 і Bcl-2, білками із здавалося б протилежними функціями, вочевидь, більш складні і неоднозначні, чим передбачалося раніше. Це підтверджується й нещодавніми даними Janicke R. et al. (2008), що показали цілий ряд антиапоптотичних ефектів р53 в огляді із красномовною назвою «The dark side of a tumor suppressor: anti-apoptotic p53».

Звертає на себе увагу і виявлений нами паралелізм змін у центральному органі імуногенезу у експериментальних тварин із ПТГ і при ЕЦД: загальні тенденції зі зниження кількості проліферуючих лімфоцитів, натуральних імунорегуляторних клітин, АПК, Ins⁺-клітин, CD4⁺-лімфоцитів, клітин, експресуючих імунну субодиницю протеасоми LMP-2 і збільшенню щільності популяції Bcl-2⁺-клітин і цитотоксичних CD8⁺-лімфоцитів (див. мал. 2). Напевно деякий виняток із цього ряду становлять тільки щури SHR з ЕЦД, у яких не змінюється вірогідно кількість проліферуючих і CD4⁺-лімфоцитів. Крім того, виявлені закономірності доводять, що функціональні зміни в тимусі розвиваються ще до вираженої гіперглікемії, на етапі «переддіабету», однак викликані вони, очевидно, різними причинами - у щурів SHR це генетично-обумовлений дефект, а у нащадків щурів з ЕГД - модельований штучно й викликаний впливом внутрішньоутробної гіперглікемії на плід, що порушує морфогенез лімфоїдного і епітеліального компартментів тимуса. Виявлені ж зміни функціонального стану тимуса при експериментальному стрептозотоциновому діабеті, безумовно, є вторинними й відіграють роль не у виникненні діабету, а в його розвитку й прогресуванні, що підтверджується набагато більш м'яким перебігом стрептозотоцинового діабету у тимектомованих експериментальних тварин. Викликані ці зміни, очевидно, комплексом гормонально-метаболічних порушень, що розвиваються при ЕЦД - насамперед це гіперглікемія з її глюкозотоксичним ефектом на клітини тимуса, що призводить до посилення неферментативного глікозування білків і розвитку оксидативного стресу, посилення вироблення активних кисень-вмісних радикалів, у тому числі й оксиду азоту, пероксинітріту. Крім того, це і гіпоінсулінемія і цілий ряд інших метаболічних (гіперліпідемія, гіпертригліцеридемія, гіперхолестеринемія, гіперазотемія) і гормональних порушень (зміна синтезу й секреції як власних тимічних гормонів - тимуліну, тимозинів, так і глюкокортикоїдів і цілої низки гіпоталамічних нейропептидів - окситоцина, вазопресина, нейропептиду Y, холецистокініна та ін.).

Проведені нами дослідження і виявлені закономірності дозволяють виділити кілька ключових дефектів функціонального стану тимуса (див. схему), які, на нашу думку, є важливою ланкою в патогенезі розвитку ЕЦД і факторами ризику розвитку ендокринної і автоімунної патології при порушеній толерантності до глюкози:

1. Дефект апоптозу тимоцитів, що проявляється у виявлених нами змінах рівня тимічної експресії таких найважливіших його регуляторів як білки Bcl-2, р53, білки ранньої відповіді с-Fos, білки теплового шоку Hsp 70, індуцибельна NO-синтаза. Необхідно сказати й про складні контури їхньої взаємної регуляції (Bcl-2 - р53, Bcl-2 - iNOS, с-Fos - p53, HSP - iNOS та ін.), які виходять за рамки простих парних взаємин, є багаторівневими й можуть призводити до переваги про - або антиапоптотичних впливів. У цілому кожний з вище перерахованих регуляторів може виступати залежно від умов як у ролі інгібітору апоптозу, так і в ролі його індуктору. Тому виявлені зміни рівня їхньої експресії в тимусі викликають дисбаланс про- і анти-апоптогенних стимулів, що призводить до порушень процесів селекції тимоцитів, здійснюваної шляхом апоптозу.

2. Дефект презентації периферичних тканиноспецифічних антигенів (PTSAs), обумовлений виявленими нами при ЕЦД змінами морфофункційного стану ЕРЦ і «класичних» АПК тимуса - макрофагів, дендритних клітин, В-лімфоцитів, а також зменшенням представництва в тимусі основного панкреатичного антигену - інсуліну й регулятора експресії PTSAs - AIRE. Необхідно сказати про тісний функціональний зв'язок даних регуляторів - ектопічна транскрипція в тимусі цілого ряду PTSAs, зокрема панкреатичних антигенів переважно виявляється саме на MAPC⁺ і MHCII⁺-клітинах (Kojima H. et al., 2004), а їхній кількісний рівень залежить від рівня тимічної експресії AIRE. Таким чином, виявлене нами зниження кількості АПК тимуса й рівня експресії AIRE і тимічного інсуліну у щурів з ЕЦД може істотно впливати на представництво в-клітинних антигенів і порушувати процес формування центральної толерантності до них. Можливо, що ще одним важливим аспектом даної проблеми є не висвітлені нами в цій роботі дефекти костимуляції, що можуть виражатися в змінах рівня експресії при ЕЦД основних костимуляторних молекул - СD80 (B7.1) і CD86 (B7.2) на АПК і CD28, CTLA-4, ICOS на тимоцитах (Birebent B. et al., 2004).

3. Дефект Т-регуляторної ланки, що виражається у виявленому нами зменшенні при розвитку ЕЦД кількості Т_reg-клітин тимуса, які відіграють важливу роль у забезпеченні периферичної імунологічної аутотолерантності й негативному контролі як патологічних, так і фізіологічних імунних реакцій. При негативній селекції припустимий поріг афінності TCR Т_reg-клітин до аутологічного пептиду завжди вищий, ніж для інших тимоцитів, а з огляду на те, що цей поріг визначає елімінацію аутоспецифічних клонів у процесі їх негативної селекції, його підвищення створює можливість виживання й наступного виходу на периферію Т_reg - клітин з досить високою спорідненістю до аутоантигенів (Jordan M. et al., 2001). Можливо, що даний дефект викликаний зміною рівня тимічної експресії транскрипційного фактору Foxp3 і спричиняє наступні зміни кількості адаптивних (індуцибельних) Tr1 і Th 3-клітин, супресорна активність яких обумовлена продукованими ними цитокінами IL-10 і TGF-в (Fontenot J. et al., 2005).

4. Дефект процесингу антигенів, обумовлений порушеннями функціонування і тимічної експресії при ЕЦД імунних протеасом, білків теплового шоку Hsp70 і, ймовірно, тимопротеасоми. Імунопротеасомний дефект проявляється виявленим зниженням експресії імунної субодиниці протеасоми LMP2, що може порушувати генерацію ендогенних пептидів для негативної селекції тимоцитів. Виявлені зміни рівня експресії при ЕЦД білків теплового шоку Hsp70, крім впливу на інтенсивність апоптозу тимоцитів, роблять й істотний вплив на процесинг антигенів. Це обумовлено їх здатністю зв'язуватися практично з усіма пептидами, що синтезуються в клітині, й у вигляді таких комплексів брати участь у різноманітних клітинних процесах (фолдінг, транспортування білків у протеасоми, транспорт пептидів на постпротеасомному етапі, додаткова «незапланована репрезентація» тканиноспецифічних антигенів та ін.) (Whitham M.et al., 2008).

5. Дефект диференціювання й проліферації тимоцитів полягає у виявленому нами зниженні проліферативної активності клітин тимуса й розвитку вираженого дисбалансу основних популяцій тимоцитів - збільшенні кількості цитотоксичних CD8⁺лімфоцитів і зниженні рівня Т-хелперів. Причому очевидно даний дисбаланс може стосуватися й субпопуляцій Т - хелперів, і в цьому аспекті важливу роль може відіграти рівень експресії в тимусі транскрипційного фактору RORг (retinoid-related orphan receptor gamma), що є регулятором диференціювання з незрілих тимоцитів найбільш агресивної й продіабетогенної субпопуляції - Th 17-клітин (Romagnani S., 2008). Цікаво, що вивчена нами популяція Т_reg-клітин тимуса має спільність генерації з Th 17-клітинами: якщо в ролі індуктора диференціювання виступає тільки TGFв, то диференціювання йде в напрямку Т_reg, а якщо разом з TGFв діє й IL-6, то утворюються Th 17-клітини (Bettelli E. et al., 2007).

Висновки

У дисертації наведене теоретичне і експериментальне рішення важливої наукової проблеми - з'ясування ролі дисфункції тимуса в патогенезі експериментального цукрового діабету. У результаті виділені ключові дефекти функціонального стану тимуса при діабеті і в умовах порушеної толерантності до глюкози: дефект апоптозу тимоцитів, дефект презентації периферичних тканиноспецифічних антигенів, дефект Т-регуляторної ланки, дефект процесингу антигенів, дефект диференціювання й проліферації тимоцитів. Науково обґрунтована гіпотеза про роль порушень морфогенезу й функціонального стану лімфоїдного й епітеліального компартментів тимуса в механізмах розвитку автоімунної і ендокринної патології у нащадків, визначені імунні фактори ризику розвитку цукрового діабету при порушеній толерантності до глюкози.

1. Порушення толерантності до глюкози у статевозрілих щурів лінії SHR і нащадків щурів з гестаційним діабетом призводить до змін цитоархітектоніки тимуса, що проявляється у зниженні кількості проліферуючих лімфоцитів, Т_reg-клітин, інсулін-імунопозитивних, антигенпредставляючих і клітин, експресуючих імунну субодиницю протеасоми LMP-2. Дані порушення супроводжуються збільшенням кількості цитотоксичних CD8⁺-лімфоцитів і Bcl-2⁺-клітин і змінами рівня тимічної експресії таких регуляторів апоптозу, як білки р53, транскрипційний фактор с-Fos, індуцибельна NO-синтаза.

2. Розвиток діабету супроводжується зниженням кількості проліферуючих лімфоцитів у тимусі у щурів лінії Wistar і не впливає на щільність популяції PCNA⁺ лімфоцитів у щурів лінії SHR, при односпрямованій тенденції до зниження кількості CD25⁺-лімфоцитів і CD4⁺ лімфоцитів, зменшення щільності CD4 - рецепторів у тварин обох ліній, збільшення кількості CD8⁺ лімфоцитів, формуванню дисбалансу CD25⁺-лімфоцитів окремих класів.

3. Розвиток діабету у щурів ліній Wistar і SHR супроводжується зниженням кількості інсулін-експресуючих клітин у тимусі при збільшенні в них концентрації інсуліну, призводить до зменшення кількості AIRE⁺-клітин у мозковій речовині тимуса у щурів лінії Wistar і в обох вивчених зонах тимуса щурів SHR, а також до переважного зниження концентрації білка AIRE.

4. Розвиток діабету призводить до змін морфофункційного стану епітеліального компартменту тимуса, що проявляється у зниженні кількості й зміні співвідношення окремих типів ЕРЦ в обох вивчених зонах тимуса щурів лінії Wistar і в корковій речовині тимуса щурів лінії SHR. Ці зміни супроводжуються зниженням кількості MHC-II⁺-АПК тимуса й щільності їх MHC-II рецепторів у щурів лінії Wistar і різноспрямованими змінами цих показників у щурів лінії SHR, а також порушенням співвідношення окремих типів MHC-II⁺-клітин.

5. Розвиток діабету супроводжується збільшенням кількості Bcl-2⁺-клітин і підвищенням концентрації білка Bcl-2 в тимусі у щурів ліній Wistar і SHR, тоді як у змінах кількості р53⁺-клітин і концентрації білка р53 виявляються лінійні розходження - збільшення даних показників в корі тимуса у тварин лінії Wistar і зниження в корковій і мозковій речовині тимуса у щурів лінії SHR у поєднанні з порушеннями співвідношення окремих класів Bcl-2⁺ і р53⁺-лімфоцитів.

6. При діабеті зменшується кількість c-Fos⁺-клітин у тимусі й порушується співвідношення окремих класів c-Fos⁺-лімфоцитів, при цьому концентрація білків ранньої відповіді c-Fos змінюється різноспрямовано - знижується в тимусі у щурів лінії Wistar і зростає у щурів лінії SHR. Ці зміни поєднуються зі збільшенням кількості iNOS⁺-клітин винятково в корковій речовині тимуса, при цьому концентрація білка iNOS у гомогенатах тимуса у щурів лінії Wistar зростає в 4 рази.

7. Розвиток діабету супроводжується збільшенням в 2,5 рази концентрації білків теплового шоку Hsp70 в тимусі у щурів лінії Wistar і формуванням імунопротеасомного дефекту внаслідок зниження експресії імунної субодиниці протеасоми LMP-2 в обох вивчених зонах тимуса у щурів лінії Wistar і в мозковій речовині у щурів лінії SHR, що спричиняє дефект генерації ендогенних пептидів для негативної селекції тимоцитів.

8. Введення блокатора NO-синтаз N-нітро-L-аргініну щурам ліній Wistar і SHR змінює цитоархітектоніку тимуса за рахунок зниження кількості цитотоксичних CD8⁺ - лімфоцитів і збільшення кількості CD4⁺ і CD25⁺-лімфоцитів. При цьому введення N-нітро-L-аргініну підсилює проліферативну активність тимоцитів, збільшує кількість ЕРЦ і MHCII⁺-клітин тимуса, призводить до змін рівня експресії білків-регуляторів апоптозу тимоцитів, концентрації тимічного інсуліну й автоімунного регулятору AIRE. Результати досліджень демонструють властивість блокаторів NO-синтаз робити виражені ефекти на функціональний стан тимуса при діабеті, що є актуальним для практичного їхнього застосування в клінічній ендокринології і діабетології для корекції дисфункції тимуса при цукровому діабеті.

9. Проведені дослідження становлять практичний інтерес для сучасної діабетології, ендокринології, імунології й доводять, що порушення функціонування центрального органа імуногенезу - тимуса - відіграють важливу роль в імунопатогенетичних механізмах розвитку цукрового діабету. Отримані дані свідчать про значимість порушення морфогенезу тимуса в механізмах розвитку ендокринної й автоімунної патології у нащадків щурів з гестаційним діабетом, а оцінка функціонального стану тимуса у нащадків може бути одним із критеріїв ступеня ризику розвитку діабету.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Камышный А.М. Изучение процессов дифференцировки лимфоцитов тимуса и выраженности инсулита у крыс с экспериментальным сахарным диабетом / А.М. Камышный // Вісник проблем біології і медицини. - 2006. - №2. - C. 99-101.

2. Колесник Ю.М. Эффекты NO в иммунной системе: NO и тимус / Ю.М. Колесник, А.М. Камышный, А.В. Абрамов // Запорож. мед. журн. - 2006. - №2. - С. 5-11 (здобувач провів аналіз даних, сформулював висновки, внесок-80%).

3. Абрамов А.В. Вплив L-аргініну на будову лімфоїдної популяції тимуса / А.В. Абрамов, О.М. Камишний, Є. Ю. Преподобний // Вісник наук. досліджень. - 2006. - №3. - С. 84-85 (здобувачем проведені експериментальні дослідження та їх аналіз, внесок-80%).

4. Колесник Ю.М. Морфофункциональная характеристика эпителиоретикулоцитов тимуса у потомства крыс с экспериментальным гестационным диабетом / Ю.М. Колесник, А.М. Камышный, А.В. Абрамов, Н.А. Калиниченко // Патологія. - 2006. - Т. 3, №2. - С. 32-37 (здобувачем проведені експериментальні дослідження та їх аналіз, внесок-70%).