Мікробіологічна характеристика мікрофлори мигдаликів, Corynebacterium diphtheriae та особливості міжбактеріальних взаємовідносин за аеробних і мікроаерофільних умов

Постановка мети, завдань та обговорення одержаних результатів проводилися спільно з науковим керівником. Методичні рекомендації укладено за участю співробітників лабораторії специфічної профілактики краплинних інфекцій ДУ «ІМІ ім. І. І. Мечникова АМН України».

Автор висловлює щиру подяку лікарям оториноларингологічного відділення Харківської обласної клінічної лікарні та лікарям-бактеріологам міської СЕС (м. Харків) за допомогу в наданні клінічного матеріалу для досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення дисертації доповідались та обговорювались на Всеукраїнських науково-практичних конференціях (з міжнародною участю) «Вклад молодих вчених в розвиток медичної науки і практики» (м. Харків, 12 квітня 2006 р.; 13 листопада 2007 р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції (з міжнародною участю) «Сучасні досягнення молодих вчених на допомогу практичній медицині» (м. Харків, 20 жовтня 2006 р.); Міжвузівських конференціях молодих вчених «Медицина третього тисячоліття» (м. Харків, 16-18 січня 2007 р.; 18 січня 2008 р.); Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Шості Данилевські читання» (м. Харків, 22-23 лютого 2007 р.); Дні молодого вченого і спеціаліста в рамках проведення фестивалю науки в Україні «Вклад молодих вчених в розвиток медичної науки і практики» (м. Харків, 16 травня 2007 р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених «Медична наука-2008» (м. Полтава, 10-11 грудня 2008 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 25 наукових праць (із них 9 самостійно), у тому числі 8 статей у фахових виданнях, визначених ВАК України, 2 патенти на корисну модель, 2 методичні рекомендації та 13 тез у матеріалах наукових конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 184 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків. Робота ілюстрована 26 таблицями та 21 рисунком. Список використаних джерел, який викладено на 30 сторінках, містить 243 посилання, серед яких українсько- та російськомовних 162 та 81 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Огляд літератури містить 3 підрозділи, в яких стисло викладено проблемні питання дифтерійної інфекції в Україні й аспекти персистенції представників роду Corynebacterium в організмі людини; висвітлено відомості стосовно мікробіоценозів мигдаликів практично здорових і хворих на хронічний тонзиліт осіб; проаналізовано дані щодо впливу різних за концентрацією кисню умов культивування на мікроорганізми.

Матеріали і методи досліджень. Обстежено 50 хворих на хронічний декомпенсований тонзиліт (ХДТ), що знаходились на стаціонарному лікуванні у відділенні оториноларингології Харківської обласної клінічної лікарні, середній вік яких склав (32,4±1,5) роки. Як матеріал для дослідження використовували слиз із поверхні мигдаликів та тканини екстирпованих піднебінних мигдаликів вищезазначених пацієнтів.

Відбір клінічного матеріалу та бактеріологічні дослідження проводили згідно з Наказом № 535 МОЗ СРСР від 22.04.1985 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», методичними рекомендаціями «Лабораторна діагностика гнійно-запальних захворювань, обумовлених аспорогенними анаеробними мікроорганізмами» (Дяченко В. Ф., Бірюкова С. В. та ін., 2000). Ідентифікацію вилучених культур мікроорганізмів здійснювали за морфологічними, тінкторіальними, культуральними, біохімічними властивостями загальноприйнятими методами згідно з «Визначником бактерій Берджі», 1997. Кількість бактерій визначали шляхом підрахунку колонієутворюючих одиниць в 1 г матеріалу, що виражали в десяткових логарифмах (lg КУО/г). Ідентифікацію коринебактерій проводили у відповідності до Наказу № 192 МОЗ України від 03.08.1999 «Про заходи щодо покращення бактеріологічної діагностики дифтерії в Україні».

Мікроаерофільні умови культивування створювали в мікроанаеростатах за допомогою газогенеруючих пакетів Generator GENbox microaer (bioMerieux, Франція) або газової суміші, що була виготовлена у заводських умовах і складалася з 5% О₂, 10% СО₂ та 85% N₂.

Приготування суспензій мікроорганізмів із визначеною концентрацією мікробних клітин проводили з використанням електронного приладу Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema а.s., Чехія) за шкалою McFarland. Синхронізацію культур проводили однократною дією низької температури (Баснакьян І. А., 1992).

Для оцінки впливу мікроаерофільних умов культивування використовували 81 тест-культуру бактерій, у тому числі 31 штам циркулюючих коринебактерій, 18 музейних штамів коринебактерій (включаючи 3 еталонні штами C.d.gravis tox+ NCTC №№ 7282, 7285, 7289 та виробничий штам C.d.gravis tox+ PW-8 v. Massachusetts), клінічні ізоляти Staphylococcus aureus (n=21) та референс-штами бактерій Staphylococcus aureus ATCC 25923 (F-49), Escherichia coli ATCC 25922 (F-50); штами лактобактерій (n=9). Музейні тест-штами отримано з філії Музею патогенних мікроорганізмів ДУ «ІМІ ім. І.І. Мечникова АМН України», м. Харків.

Адгезивну активність та кінетику росту вивчали в 34 штамів коринебактерій і референс-штамів S.aureus ATCC 25923, E.coli ATCC 25922 впродовж десяти паралельних пасажів за аеробних та мікроаерофільних умов культивування; антикомплементарну - аналогічно у 25 штамів C.diphtheriae. Адгезивні властивості бактерій визначали за методикою Бриліса В. І. та ін. (1986), з обчисленням середнього показника адгезії (СПА), коефіцієнта адгезії (КА) та індексу адгезивності мікроорганізмів (ІАМ). Кінетику росту вивчали враховуючи приріст біомаси за визначену кількість часу з обчисленням абсолютної та відносної швидкостей росту (Ієрусалимський Н. Д. 1963; S. John Pirt, 1975; Коротяєв А. І., Бабичев С. А., 2002). Антикомплементарну активність (АКА) штамів коринебактерій визначали за допомогою фотометричного методу (Брудастов Ю. А., 1992; Лабінська А. С., 2004). В основних представників мікробіоценозів піднебінних мигдаликів (поверхневого слизу та більш глибоких прошарків) було визначено антибіотикочутливість (диско-дифузійним методом), адгезивну активність, а для золотавих стафілококів - ступінь прояву лецитиназної ознаки.

Вплив мікроаерофільних умов на антибіотикочутливість бактерій вивчали в 47 штамів коринебактерій, 6 циркулюючих штамів золотавих стафілококів та еталонних штамів S.aureus ATCC 25923 і E.coli ATCC 25922. Мінімальні інгібуючі концентрації (МІК) п'яти антибіотиків визначали згідно з Наказом № 167 МОЗ України від 05.04.2007 «Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» методом розведень в агарі. Отримані показники порівнювали з табличними граничними значеннями МІК антибіотиків для стійких, помірно стійких і чутливих штамів, та зараховували досліджувані культури до однієї з трьох категорій чутливості.

Особливості міжмікробних взаємовідносин за умов дефіциту кисню в атмосфері інкубації вивчали методом відстроченого антагонізму для 23 штамів коринебактерій та 22 штамів золотавих стафілококів (включаючи S.aureus ATCC 25923), 26 штамів коринебактерій та 9 штамів лактобактерій (у т.ч. Lactobacillus acidophilus та Lactobacillus plantarum - складові пробіотичних препаратів «Лактобактерин» (ЗАТ «Біолік», Харків та «Биомед», Пермь)).

Досліди проводили в трьох-чотирьох повтореннях. Результати аналізували статистично за допомогою комп'ютерних програм Microsoft Excel 2003 та «Biostat-4».

Результати досліджень та їх аналіз. Результати власних досліджень викладено в третьому - шостому розділах.

Першим етапом дослідження було встановлення мікробіологічних особливостей біоценозів слизових оболонок і більш глибоких прошарків тканин мигдаликів у хворих на ХДТ.

Усього під час проведення досліджень, сумарно з поверхні та з тканин мигдаликів, вилучено 356 штамів бактерій і 12 штамів дріжджеподібних грибів. Ідентифіковано 14 родів мікроорганізмів, концентрація яких коливалася в межах від 1,3 до 8,4 lg КУО/г дослідженого матеріалу. При цьому з поверхні мигдаликів вилучено представників 11 родів, а з тканин мигдаликів - 12 родів.

Видовий склад мікробіоценозів слизових оболонок і тканин мигдаликів відрізнявся у переважної більшості хворих (66±6,7)% (р=0,001): зі слизових оболонок частіше ніж із тканин мигдаликів виділявся Staphylococcus epidermidis, тканини мигдаликів, навпаки, частіше були заселені Lactobacillus spp, Neisseria sicca та Fusobacterium spp (рис. 1).

Тільки зі слизових оболонок були вилучені Corynebacterium spp та Stomatococcus mucilaginosus, а лише з тканин мигдаликів - Pseudomonas aeruginosa, Peptostreptococcus spp та Bacteroides spp.

У розвитку ХДТ найбільшу етіологічну роль відігравали S.aureus і Streptococcus pyogenes, що заселяли як слизові оболонки, так і тканини мигдаликів відповідно в 68% та 60% хворих. Досить часто виділяли також Enterococcus spp (з поверхні мигдаликів у 46% хворих, з тканин мигдаликів - у 38% хворих), Lactobacillus spp (у 24% хворих з поверхні мигдаликів та в 66% хворих із тканин мигдаликів), у той час як представники роду Staphylococcus - коагулазонегативні (S.epidermidis, S.saprophyticus); Streptococcus - в-гемолітичні стрептококи групи В (S.agalactiae), б-гемолітичні стрептококи (S.pneumoniae, S.mitis, S.dysagalactiae), негемолітичні стрептококи (S.mutans); Corynebacterium (C.pseudodiphtheriticum, C.jeikeium); дріжджеподібні гриби роду Candida; непатогенні представники роду Neisseria (N.sicca, N.mucosa); Aerococcus viridans, P.aeruginosa, S.mucilaginosus, та бактерії родів Peptostreptococcus, Veillonella, Fusobacterium, Bacteroides характеризувались низькою частотою виділення.

Установлено розбіжності не тільки якісного, але й кількісного складу мікробіоценозів різних прошарків мигдаликів. Так, ступінь мікробного заселення (lg КУО/г) тканин мигдаликів був у середньому в 1,3 рази вищим за відповідний показник слизових оболонок мигдаликів (р<0,001). При цьому, показник мікробного заселення лімфоїдних тканин для S.aureus і S.epidermidis був у 1,5 рази, S.pyogenes і S.pneumoniae - в 1,3 рази, N.mucosa та N.sicca - в 1,4 та 1,7 разів відповідно вищим за показники заселення поверхні мигдаликів.

Кількість асоціантів у мікробних угрупуваннях різних прошарків мигдаликів також достовірно відрізнялась. Зі слизових оболонок 1-3 компонентні асоціації вилучали частіше ніж із тканин мигдаликів: (52±7,1)% проти (24±6,0)% (р<0,005). Чотирьох-п'яти компонентні мікробні спільноти, навпаки, частіше заселяли глибокі прошарки (78±5,9)% ніж слизові оболонки мигдаликів (48±7,1)% (р<0,05).

Для того, щоб визначити, якою мірою мікроорганізми, що заселяють різні прошарки піднебінних мигдаликів, беруть участь у розвитку запальної патології, в подальших дослідах були вивчені біологічні властивості мікроорганізмів, що персистують у вказаних біотопах.

Встановлено, що швидкість продукції лецитинази (фосфоліпази) була достовірно вищою у «тканинних» ізолятів. Так, штами, вилучені з тканин мигдаликів, продукували вказаний фермент уже через 24 години росту в 1,5 рази частіше, ніж відповідні бактерії слизових оболонок (р<0,05).

Оскільки здатність бактерій до адгезії належить до основних механізмів колонізації слизових оболонок хазяїна, актуальним є вивчення та порівняння ступеня адгезивності мікроорганізмів, що заселяють поверхню слизових оболонок і лімфоїдні тканини.

Серед ізолятів S.aureus, б- та в-гемолітичних стрептококів, вилучених з поверхні слизових оболонок та з прошарків тканин мигдаликів, останні володіли достовірно вищою адгезивною активністю: СПА та ІАМ «тканинних» штамів усіх зазначених мікроорганізмів були в 1,2-1,6 разів більшими за відповідні показники «поверхневих» (р<0,05).

Показано, що популяції золотавих стафілококів і піогенних стрептококів, що персистували в різних прошарках мигдаликів, відрізнялися і за чутливістю до антибактеріальних препаратів (рис. 2). Ізоляти золотавих стафілококів, вилучені з тканин мигдаликів, характеризувалися підвищеною стійкістю до оксациліну, азитроміцину, гентаміцину та цефотаксиму в порівнянні з вилученими зі слизових оболонок. Так, питома вага чутливих до оксациліну «тканинних» штамів S.aureus була в 4,3 рази меншою за відповідний показник «поверхневих» ізолятів, натомість кількість резистентних штамів виявилася в 1,5 рази вищою (р<0,05). Хоча стосовно азитроміцину кількість резистентних штамів зі слизових оболонок і тканин мигдаликів виявилась однаковою, доля чутливих «тканинних» ізолятів була достовірно меншою в 1,4 рази, а штами, помірно стійкі до вказаного препарату, вилучалися тільки з тканин мигдаликів.

Помірно резистентні до гентаміцину штами зустрічалися також тільки серед золотавих стафілококів, вилучених із тканин мигдаликів. До цефотаксиму резистентними були тільки «тканинні» ізоляти S.aureus, зі слизових оболонок вилучались чутливі та помірно стійкі штами.

Представники S.pyogenes, вилучені з тканин мигдаликів, виявились більш резистентними до кларитроміцину та тобраміцину, але чутливішими до ципрофлоксацину й амоксициліну, ніж штами, вилучені зі слизових оболонок. Так, серед «тканинних» ізолятів S.pyogenes кількість чутливих до кларитроміцину штамів була в 3,7 разів меншою за відповідний показник для штамів, вилучених зі слизових оболонок (р<0,05). Кількість вилучених із тканин мигдаликів культур, резистентних до тобраміцину, була в 2 рази достовірно вищою за кількість стійких «поверхневих» ізолятів. До ципрофлоксацину резистентними виявились тільки штами S.pyogenes, вилучені зі слизових оболонок мигдаликів. У 1,5 рази більше резистентних до амоксициліну штамів визначено серед поверхневих ізолятів стрептококу, натомість, поміж «тканинних» представників S.pyogenes - більше помірно резистентних штамів (р<0,05).

Наступна ланка дослідів була присвячена вивченню біологічних властивостей патогенів (насамперед збудників дифтерії) та міжбактеріальних взаємовідносин за експериментально відтворених умов зниженого парціального тиску кисню (мікроаерофільні умови).

Вихідні показники адгезії для коринебактерій склали в середньому: СПА - (2,41±0,12), КА - (82,9±1,81)%, ІАМ - (2,85±0,09). При цьому найбільшою здатністю прикріплюватися до клітин людини володіли C.d.gravis tox+ NCTC та C.d.gravis tox+ PW-8 v. Massachusetts. СПА й ІАМ вказаних культур були вищими за аналогічні показники для музейних в 1,8 і 1,4 рази (р<0,001) та циркулюючих штамів в 1,2 й 1,1 рази відповідно (р<0,05) (рис. 3). У свою чергу, адгезивна активність циркулюючих штамів перевищувала музейні в 1,5-1,3 рази (р<0,001), в той час, як КА для різних груп коринебактерій вірогідно не відрізнявся.

Реакція мікроорганізмів на вплив умов мікроаерації залежала від групової належності коринебактерій. Перший пасаж за умов мікроаерації сприяв незначному зниженню показників адгезії музейних культур коринебактерій. Другий та третій пасажі призвели відповідно до підвищення адгезивних властивостей із подальшим їх зниженням. Стабілізація адгезивної активності на контрольному рівні спостерігалася впродовж четвертого та п'ятого пересівів, з подальшою стимуляцією адгезивних ознак після шостого-восьмого пасажів. Після дев'ятого пасажу показники СПА та ІАМ для культур, вирощених у різній за газовим складом атмосфері, встановились на однаковому рівні, десятий пасаж відзначився підвищенням показника СПА в 1,2 рази в порівнянні з аеробно вирощеними штамами (р<0,05) при сталому значенні ІАМ.

Для циркулюючих штамів впродовж перших трьох пасажів за мікроаерофільних умов характерним було пригнічення здатності до адгезії з поверненням показників СПА та ІАМ до контрольних після четвертого пасажу й посиленням адгезивної активності після п'ятого-восьмого пересівів, повторним поверненням до контрольних значень після дев'ятого пасажу та збільшенням після десятого (р<0,05).

Для еталонних штамів C.d.gravis tox+ NCTC зміни показників адгезії впродовж десяти паралельних пасажів за аеробних та мікроаерофільних умов виявилися статистично не достовірними. Зміни ступеня адгезивності промислового штаму C.d.gravis tox+ PW-8 v. Massachusetts носили різноспрямований характер із чергуванням зниження та підвищення.

Референс-штам S.aureus володів високою вихідною адгезивною активністю з СПА - (4,13±0,04), КА - (94,7±1,33)% та ІАМ - (4,37±0,04). У залежності від кратності пересівів встановлено різноспрямований вплив умов мікроаерації на здатність S.aureus АТСС №25923 до адгезії. Так, після перших двох пересівів показники СПА й ІАМ достовірно перевищували контрольні (після аеробного культивування) відповідно в 1,2-2,0 та 1,1-1,8 разів. Вказана стимуляція адгезивної активності змінилась її пригніченням до середнього рівня після третього-четвертого пасажів зі зниженням СПА й ІАМ в 1,1-1,2 рази. П'ятий-восьмий пасажі знов відзначилися підвищенням показників адгезії в 1,1-1,4 рази у порівнянні з контрольними. Зниження СПА й ІАМ в 1,5 рази порівняно з контролем після дев'ятого пересіву змінилося їх підвищенням в 1,1 рази після десятого пасажу.

Для E. coli АТСС № 25922 СПА склав (3,3±0,16), КА - (97,3±0,67)%, ІАМ - (3,39±0,16). При вирощуванні еталонного штаму кишкової палички за умов зниженого парціального тиску кисню спостерігали послідовну зміну стимуляції та пригнічення здатності прикріплюватись до клітин крові людини. Підвищення показників адгезії в 1,1-1,3 рази відзначали після першого, третього, шостого та восьмого пасажів. Четвертий, сьомий, дев'ятий і десятий пасажі призводили до зниження адгезивності в 1,1-1,3 рази. Після другого та п'ятого пасажів достовірних відмінностей адгезивних ознак E.coli за аеробних та мікроаерофільних умов культивування не спостерігали.

Зміна темпів приросту біомаси після впливу мікроаерофільних умов культивування також залежала від групи досліджуваних коринебактерій. Вирощування музейних штамів C.diphtheriae в малонасиченій киснем атмосфері інкубації сприяло стимуляції абсолютної та відносної швидкостей росту впродовж експоненціальної фази в 1,4-1,6 та 1,2-1,3 рази відповідно в порівнянні з контролем після п'ятого, сьомого, восьмого й десятого пасажів. Для циркулюючих культур після першого пасажу за умов мікроаерації встановлено пригнічення абсолютної й відносної швидкостей росту впродовж експоненціальної фази в 1,6 та 1,3 рази відповідно порівняно з контрольними дослідами (р<0,05). Другий-шостий пересіви сприяли поверненню зазначених показників швидкості росту до контрольних рівнів, з їх достовірним підвищенням в 1,2-1,4 рази після сьомого-десятого пасажів (рис. 4).

Найбільш стабільною після впливу мікроаерації залишалась кінетика росту еталонних штамів C.d.gravis tox+ NCTC. Достовірна стимуляція ростових властивостей за мікроаерофільних умов відзначена тільки після третього та четвертого пересівів, при цьому абсолютна швидкість росту перевищувала показники, визначені за аеробних умов, в 1,3-1,4 рази, а відносна - в 1,2 рази (р<0,05). Решта часу контрольні й дослідні показники швидкості росту не відрізнялися між собою. У протилежність вищенаведеним даним, для промислового штаму C.d.gravis tox+ PW-8 v. Massachusetts після восьми з десяти пасажів за умов мікроаерації відзначено достовірне пригнічення росту в експоненціальній фазі - показники абсолютної та відносної швидкості росту були нижчими за контрольні в 1,4-4,9 та 1,2 - 3,0 рази відповідно (р<0,05).

Для референс-штаму золотавого стафілококу після однократної дії вказаного фактору спостерігали дуже значне пригнічення ростових властивостей. По-перше, тривалість лаг-фази збільшилася вдвічі, по-друге, в експоненціальній фазі абсолютна та відносна швидкості росту зменшилися в 3,6 та 1,4 рази відповідно в порівнянні з контролем (р<0,05). Упродовж другого-десятого пасажів у різних за концентрацією кисню умовах культивування достовірних змін кінетики росту не відзначалося.

Стосовно еталонного штаму E. coli АТСС №25922 достовірних змін активності роcту в залежності від газового складу атмосфери культивування не спостерігали впродовж усього терміну вирощування (десять пасажів).

При визначенні вихідних показників антикомплементарної активності коринебактерій за аеробних умов встановлено, що (16±7,3)% штамів характеризувались дуже високим рівнем вказаної активності, (60±9,8)% - високим, (24±8,5)% штамів - середнім. Статистично достовірної різниці між АКА циркулюючих та музейних штамів коринебактерій не виявлено (р=0,36).

Установлено, що зміни АКА коринебактерій під впливом мікроаерації не залежали від групи досліджених бактерій. Після першого пасажу вищезазначені умови викликали пригнічення здатності до інактивації комплементу в 1,4 рази порівняно з аеробними (р<0,05). При подальшій інкубації за умов зниженого тиску кисню з другого по десятий пасаж вказане пригнічення змінювалося стимуляцією ознаки зі збільшенням показників АКА в 1,3 рази в порівнянні з контролем після другого та третього пасажів і в 1,7-1,9 разів після подальших пересівів (р<0,05).

Як видно з рис. 5, у результаті культивування коринебактерій за мікроаерофільних умов з першого по десятий пасаж питома вага бактерій з дуже високою АКА достовірно зросла від (8±5,4)% до (32±9,3)% (р<0,001), з високою активністю від (20±8)% до (48±10)% (р<0,001), а питома вага штамів із середньою та низькою здатністю до інактивації комплементу зменшилась від (72±9)% до (20±8)% (р<0,001).

За аеробних умов культивування діапазон МІК бензилпеніциліну для коринебактерій становив 0,06-0,25; цефазоліну - 0,25-0,5; гатіфлоксацину - 0,015-0,06; еритроміцину - 0,002-0,015; рифампіцину - 0,0005-0,004 мкг/мл за винятком одного штаму, МІК препарату для якого складала 250 мкг/мл. При цьому всі коринебактерії виявилися чутливими до цефазоліну, гатіфлоксацину та еритроміцину, (57,4±7,2)% штамів виявились помірно резистентними до пеніциліну й один штам (2,1±2,1)% - резистентним до рифампіцину.

Вплив мікроаерофільних умов вирощування на антибіотикочутливість коринебактерій представлений у табл. 1. За мікроаерофільних умов культивування МІК бензилпеніциліну, цефазоліну та гатіфлоксацину підвищувалися для коринебактерій на 1-2 двократних розведень препарату в порівнянні з контролем відповідно для (95,7±3,0)%, (53,2±7,3)% і (72,3±6,5)% штамів коринебактерій, МІК еритроміцину та рифампіцину збільшувалися на 1-4 розведення антибіотиків відповідно для (87,2±4,9)% та (89,4±4,5)% культур збудників дифтерії.

Таблиця 1

Мінімальні інгібуючі концентрації антибіотиків для коринебактерій за аеробних та мікроаерофільних умов культивування, мкг/мл (M±m)

Примітки: * - достовірна різниця між зазначеними показниками за аеробних та мікроаерофільних умов постановки дослідів (р<0,05);

** - достовірна різниця між зазначеними показниками за аеробних та мікроаерофільних умов постановки дослідів (р<0,01).

Показники МІК цефазоліну та гатіфлоксацину зберігалися на рівні контрольних відповідно для (40,4±7,2)% і (23,4±6,2)% коринебактерій упродовж усіх десяти пасажів за умов зниженого парціального тиску кисню.

Вищезазначені зміни МІК антибактеріальних препаратів після пасажів у малонасиченій киснем атмосфері призвели до того, що всі штами, чутливі до пеніциліну за аеробних умов (42,6±7,2)%, ставали помірно стійкими до нього, помірної стійкості до цефазоліну набували (46,8±7,3)% культур. Незважаючи на збільшення МІК гатіфлоксацину, еритроміцину та рифампіцину для збудників дифтерії за умов мікроаерації, тест-штами, чутливі до препаратів за аеробних умов, не можна було зарахувати до груп помірно стійких чи стійких за критеріями, визначеними у чинних нормативних документах.

Для референс-штаму S.aureus ATCC №25923 за аеробних умов вирощування МІК бензилпеніциліну склала 2 мкг/мл, цефазоліну - 0,25 мкг/мл, гатіфлоксацину - 0,12 мкг/мл, еритроміцину - 0,5 мкг/мл, рифампіцину - 0,016 мкг/мл. Вирощування референс-штаму стафілококу за умов мікроаерації призвело до зниження МІК бензилпеніциліну на 3-4 розведення, гатіфлоксацину та еритроміцину - на 1-2 розведення. МІК цефазоліну щодо S.aureus ATCC №25923 навпаки підвищувалася вдвічі в порівнянні з контролем після першого та залишалась на досягнутому рівні до десятого пасажу за мікроаерофільних умов; МІК рифампіцину підвищувалися вдвічі у вигляді піків після другого, четвертого, п'ятого та восьмого пасажів за умов мікроаерації.

Усі циркулюючі штами золотавих стафілококів були чутливими до цефазоліну, гатіфлоксацину, еритроміцину та рифампіцину. До бензилпеніциліну чутливими виявились (83,3±15,2)% S.aureus, решта штамів (16,7±15,2)% проявляли резистентність до вказаного препарату. Після культивування за мікроаерофільних умов зазначені штами достовірно не змінювали своєї чутливості до бензилпеніциліну та гатіфлоксацину, проте МІК цефазоліну підвищувалася вдвічі з першого по дев'ятий пасаж, а еритроміцину та рифампіцину, навпаки, знижувалася на 1-2 розведення препарату після другого-сьомого пасажів для еритроміцину та другого-третього, восьмого-дев'ятого пасажів для рифампіцину.

Вихідні МІК бензилпеніциліну, цефазоліну, гатіфлоксацину, еритроміцину та рифампіцину для E.coli ATCC №25922 склали відповідно 32 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,03 мкг/мл, 64 мкг/мл і 16 мкг/мл.

Установлено, що після впливу малонасиченого киснем середовища інкубації на E.coli ATCC №25922 МІК бензилпеніциліну, цефазоліну та рифампіцину підвищувалася на одне дворазове розведення препарату вже після першого пасажу й трималася на такому рівні до десятого пасажу. МІК еритроміцину залишалася стабільною впродовж 1-9 пасажів за умов мікроаерації, збільшення показника в два рази визначено тільки після десятого пасажу. Чутливість референс-штаму до гатіфлоксацину, навпаки, підвищувалась: після першого та другого пасажів МІК препарату була в два рази нижчою за вихідні показники, після третього пасажу знижувалася ще вдвічі та зберігалася на вказаному рівні до десятого пасажу.

Слід зазначити, що при подальшій інкубації мікроорганізмів при атмосферній концентрації кисню змінена чутливість до етіотропних препаратів відновлювалась. МІК бактерій були тотожні контрольним значенням після 1-4 пасажів за аеробних умов, тобто вказані зміни були адаптивними.

При вивченні міжмікробних взаємовідносин установлено, що представники роду Corynebacterium в умовах культивування, різних за концентрацією кисню, зовсім не подавляли життєдіяльність золотавих стафілококів і лактобактерій.

Показано, що антагоністичну активність стосовно коринебактерій проявляли (95,5±4,3)% досліджених культур S.aureus. При цьому найбільш вираженим конкурентом C.diphtheriae виявився референс-штам S.aureus АТСС №25923. Антагоністичні властивості клінічних ізолятів золотавих стафілококів були виражені різною мірою.

Лактобактерії подавляли розмноження патогенних коринебактерій у (66,6±15,7)% випадках. Частота виявлення вказаної активності залежала від походження штамів-антагоністів. Так, циркулюючі штами проявляли конкурентні властивості в (85,7±13,2)% випадків, а складові пробіотичних препаратів (Lactobacillus plantarum та Lactobacillus acidophilus) зовсім не впливали на ріст тест-культур.

Вирощування стафілококів та лактобактерій за мікроаерофільних умов спричиняло збільшення зон затримки росту тест-культур коринебактерій в 1,5-2,3 рази та 1,4-2,7 разів відповідно (табл. 2).

Таблиця 2

Характеристика антагоністичної активності стафілококів та лактобактерій стосовно коринебактерій у різних за газовим складом умовах культивування, (M±m)

Примітка. ** - достовірна різниця між зазначеними показниками за аеробних та мікроаерофільних умов постановки дослідів (р<0,01).

При цьому питома вага штамів C.diphtheriae, нечутливих щодо лактобактерій, достовірно зменшилася від 65,4% до 9,6%, а до стафілококів - від 46,7% до 10%, у той час як питома вага високочутливих тест-культур збудника дифтерії стосовно антагоністичної дії лактобактерій збільшилася від 0,6% до 48,7%, стосовно дії S.aureus - від 20,3% до 54,9% (р<0,01).

Відомо, що кінцевий результат конкурентної боротьби між мікроорганізмами визначається як здатністю штаму-антагоністу в різній мірі продукувати інгібуючі сполуки, так і ступенем зворотної чутливості до них інших представників мікробіоценозів. З метою визначення векторної направленості мікробних взаємовідносин, були проведені досліди, в яких штами-антагоністи вирощували за аеробних умов, а тест-культури після підсіву - за мікроаерофільних і навпаки.

При цьому збільшення зон затримки росту спостерігали саме за мікроаерофільних умов культивування штамів-антагоністів, різні умови вирощування тест-культур C.diphtheriae за однакових умов росту штамів-конкурентів (S.aureus та Lactobacillus spp) не спричиняли достовірної зміни зазначених показників. Це свідчить про те, що мікроаерофільні умови призводять до посилення антагоністичної активності мікробів-конкурентів і не впливають на ступінь чутливості тест-культур.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення й нове вирішення наукового завдання щодо відмінностей кількісного й якісного за видовою характеристикою та біологічними властивостями складу мікробіоценозів різних прошарків мигдаликів при хронічному тонзиліті, а також впливу мікроаерофільних умов культивування на інвазивні ознаки штамів патогенних коринебактерій і чутливість їх до окремих представників мікрофлори мигдаликів та антибіотиків, що поглиблює уявлення про механізми різної тривалості персистенції мікробів у біологічній ніші й дає можливість більш обґрунтовано вибирати для лікування та санації протимікробні препарати.