Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ВІННИЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. М.І. ПИРОГОВА

14.03.03 - нормальна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Вінниця - 2009

Робота виконана в Буковинському державному медичному університеті МОЗ України.

Анотації

Булик Р.Є. Морфофункціональне обґрунтування механізмів циркадіанних ритмів у щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальностями 14.03.01 - нормальна анатомія, 14.03.03 - нормальна фізіологія. - Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України, Вінниця, 2009.

Дисертацію присвячено з'ясуванню центральних механізмів циркадіанних ритмів у щурів, а також ролі шишкоподібної залози в механізмах корекції відхилень морфологічного та функціонального стану структур фотоперіодичної системи щурів за різної тривалості фотоперіоду. Проаналізовано ефекти постійного освітлення та тривалої темряви на хрономорфологічний та ультраструктурний стан супрахіазматичних (СХЯ) і паравентрикулярних ядер (ПВЯ) гіпоталамуса, гіпокампа, надниркових залоз, тісно пов'язаних з організацією та реалізацією циркадіанної ритміки. Вивчено щільність мелатонінових рецепторів у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса, гіпокампі залежно від періоду доби та при блокаді пейсмекера циркадіанних ритмів. Доведено, що індикатором раннього десинхронозу центральних механізмів циркадіанних ритмів головного мозку щурів є порушення експресії гена швидкої функціональної відповіді с-fos і детермінованого ним імуноспецифічного білка с-Fos у пейсмекерних нейронах СХЯ і кортикотропін-рилізинг-гормонпродукувальних та вазопресин-сиинтезувальних субядрах ПВЯ гіпоталамуса при зміні фотоперіоду. Вперше розкрито морфометричний та функціональний стан СХЯ, а також кортикотропін-рилізинг-синтезувальних медіальних дрібноклітинних субядер та вазопресин-продукувальних латеральних великоклітинних субядер ПВЯ гіпоталамуса в нормі та при гіпер- і гіпофункції шишкоподібної залози. Встановлено тісні кореляційні зв'язки між морфофункціональними перебудовами СХЯ та нонапептидергічних нейросекреторних популяцій субядер ПВЯ гіпоталамуса на фоні зміненої тривалості циклу світло-темрява в різні періоди доби. Синтетичний біорегулятор - епіталон (у дозі 0,5 мкг/кг) корегує інтенсивність синтезу і секреції гормонів досліджуваних структур, підвищує резистентність ультраструктур до світлового стресора та більш покращує показники площі перерізів компонентів нейронів СХЯ, а мелатонін (у дозі 0,5 мг/кг) - концентрацію в них РНК. Індол не корегує стрес-індукованого порушення ритму активності нейронів СХЯ, а застосування тетрапептиду нормалізує зазначений ритм. циркадіанний залоза щур

Ключові слова: циркадіанні ритми, шишкоподібна залоза, фотоперіод, десинхроноз, мелатонінові рецептори, епіталон, мелатонін.

Булык Р.Е. Морфофункциональное обоснование механизмов циркадианных ритмов у крыс. - Рукопись.

Изучено плотность мелатониновых рецепторов в СХЯ гипоталамуса, гиппокампе в зависимости от периода суток и при блокаде пейсмекера циркадианных ритмов. На основании комплексного исследования характера плотности мелатониновых рецепторов в нейронах СХЯ и гиппокампе в течение суток получено убедительные доказательства фотоиндуцированного ее нарушения с прекращением суточных колебаний в средних тенденциях, а также с усилением вариации индивидуальной реакции структуры лимбической системы животных на разрушение пейсмекерних нейронов.

Доказано, что индикатором раннего десинхроноза механизмов циркадианных ритмов у крыс является нарушение экспрессии гена раннего функционального ответа с-fos и детерминированного им иммуноспецифического белка с-Fos в пейсмекерных нейронах СХЯ, кортикотропин-рилизинг-гормонпродуцирующих и вазопрессин-сиинтезирующих субъядрах ПВЯ гипоталамуса при изменении фотопериода.

Исследовано влияние модификаций нормальной фотопериодики на состояние гена ранней функциональной активности c-fos в нейронах СХЯ гипоталамуса крыс в различные промежутки суток (днем и ночью). Экспрессия продукта этого гена - белка c-Fos - у животных, которых содержали в нормальных условиях чередования освещения и темноты демонстрировала довольно четкий циркадианный характер (с большим уровнем днем). Условия постоянного освещения в течение семи суток приводили к нарушению ритмики активности гена c-fos и нивелированию суточных вариаций уровня белка c-Fos. В условиях световой депривации в течение аналогичного периода наблюдалось очень значительное (более чем двукратное) увеличение концентрации белка c-Fos и его суммарного содержания в нейронах СХЯ в дневной период.

Обсуждаются возможные механизмы влияния модификаций фотопериодики на состояние гена c-fos в клетках данного ядра, в частности связь таких изменений с колебаниями уровня мелатонина. Отмечено, что естественные и экспериментально модифицированные изменения фотопериодики обусловливают заметные изменения геометрических размеров ядер нейронов СХЯ.

Впервые изучено морфометрическое и функциональное состояние СХЯ, а также кортикотропин-рилизинг-синтезирующих медиальных мелкоклеточных субъядер и вазопрессин-продуцирующих латеральных крупноклеточных субъядер ПВЯ гипоталамуса в норме и при гипер- и гипофункции шишковидной железы. Установлены тесные корреляционные связи между морфофункциональными перестройками СХЯ и нонапептидергических нейросекреторных популяций субъядер ПВЯ гипоталамуса на фоне измененной длительности свет-темнота в разные периоды суток. Синтетический биорегулятор - эпиталон (в дозе 0,5 мкг/кг) коррегирует интенсивность синтеза и секреции гормонов исследованных структур, повышает резистентность ультраструктур к световому стрессору и существенно улучшает показатели площади компонентов нейронов СХЯ, а мелатонин (в дозе 0,5 мг/кг) - концентрацию в них РНК. Мелатонин не коррегирует стресс-индуцированное нарушение ритма активности нейронов СХЯ, а применение эпиталона нормализирует указанный ритм.

Ключевые слова: циркадианные ритмы, шишковидная железа, фотопериод, десинхроноз, мелатониновые рецепторы, эпиталон, мелатонин.

Bulyk R. Ye. Morphofunctional substantiation of the circadian rhythms mechanisms in rats. - Manuscript.

The thesis for obtaining the academic degree of a Doctor of Medical Sciences in specialities - 14.03.01 - Normal Anatomy, 14.03.03 - Normal Physiology - M.I. Pyrogov Vinnytsia National Medical University of Ukraine's MPH, Vinnytsia, 2009.

The dissertation deals with ascertaining the central mechanisms of the circadian rhythms in rats, as well as the pineal gland role in the correcting mechanisms of morphological and functional deviations of the rat photoperiodic system under a diverse duration of a photoperiod. It has been analyzed the effects of steady illumination and prolonged darkness on the chronomorphologic and ultrastructural condition of the hypothalamic suprachiasmatic (SCN) and paraventricular nuclei (PVN), hippocamp, suprarenal glands closely connected with the organization and realization of circadian rhythmics. The density of melatonin receptors have been studied in the SCN, hippocamp depending on the diurnal period and while blocking the pacemaker of the circadian rhythms. It has been proved that the indicator of early desynchronosis of the central mechanisms of the circadian rhythms of the rat brain is a disturbance of the expression of quick functional response c-fos and determined by it immunospecific c-Fos protein in the pacemaker neurons of the SCN and corticotropin-releasing-hormone-producing and vasopressin-producing subnuclei of the PVN in case of a photoperiodic changes. For the first time, it has been disclosed the morphometric and functional condition of the SCN, as well as corticotrophin-releasing-hormone-producing medial tiny cellular subnuclei and vasopressin- producing lateral great cellular subnuclei of PVN in intact, hyper- and hypofunctioning pineal gland. Close correlations between morphofunctional structural changes of the SCN and nonapeptidergic neurosecretory populations of the PVN subnuclei has been established against the background of a changed duration of the cycle "light-darkness" during a 24-hour period. The synthetic bioregulator - epithalon (in a dose of 0,5 µg/kg) has corrected the hormones synthesis and secretion intensity of the structures under study, has raised the resistance of ultrastructures to a light stressor and has improved the indices of the square of the components of the SCN neurons, while melatonin (in a dose of 0,5 mg/kg) - the concentration of RNA. Indole has not corrected stress-induced rhythm disturbances of the SCN neurons activity, whereas the use of tetrapeptide normalized the rhythm in question.

Key words: circadian rhythms, pineal gland, photoperiod, desynchronosis, melatonin receptors, epithalon, melatonin.

Перелік умовних скорочень

ЕПР - ендоплазматичний ретикулум

КГ - комплекс Гольджі

КРФ - кортикотропін-рилізинг фактор

лвПВЯ - латеральні великоклітинні суб'ядра ПВЯ

мдПВЯ - медіальні дрібноклітинні суб'ядра ПВЯ

од.опт.щільності - одиниця оптичної щільності

ОІФ - одиниця імунофлуоресценції

ПВЯ - паравентрикулярне ядро

РНК - рибонуклеїнова кислота

СХЯ - супрахіазматичне ядро

ЦР - циркадіанний ритм

ШЗ - шишкоподібна залоза

Примітка до табл. 5-7: p - вірогідні зміни щодо параметрів тварин, які перебували в умовах стандартного фотоперіоду того ж часового інтервалу; p1 - щодо параметрів тварин попереднього часового інтервалу в межах серії; р 2 - щодо тварин, яким уводили розчинник; р 3 - щодо тварин, яким ін'єкували мелатонін за стандартного фотоперіоду; р 4 - щодо тварин, яких піддали дії постійного освітлення.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблема з'ясування механізмів періодичних коливань біологічних систем залишається одним з актуальних питань біології та медицини з огляду на те що, для будь-якого організму (від примітивних до високоорганізованих істот) ритмічність функціонування - невід'ємна і фундаментальна властивість (Пішак В.П., 1985-2008; Агаджанян Н.А. и соавт., 1998; Комаров Ф.И. и соавт., 2004; Sladek M. et al., 2007). Новітніми досягненнями в галузі хронофізіології визначено фундаментальні основи часової організації біологічних систем, її регулювальний вплив на ендокринні залози, з'ясовані принципи зворотного впливу гормонів периферійних залоз на ритморегулювальний апарат (Бондаренко Л.А., Губина-Вакулик Г.И., 2005; Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2006; Alarma-Estrany P., Pintor J., 2007). Однак цілісне розуміння механізмів циркадіанних ритмів (ЦР) головного мозку ссавців не можливе без подальшого поглибленого вивчення процесів хрононейроендокринної інтеграції в їх формуванні.

Найбільш вивченими є білядобові ритми з періодом, близьким 24-ом годинам (Ром-Бугославская Е.С., Бондаренко Л.А., 1995; Романов Ю.А., 2000; Tamanini F., 2007). На роль провідного водія (пейсмекера) ритму циркадіанних коливань у головному мозку ссавців претендують супрахіазматичні ядра (СХЯ) гіпоталамуса, а ендокринним посередником у цьому процесі є шишкоподібна залоза (ШЗ) (Пішак В.П., 1985-2008; Reiter R.J., 1989-2003; Анисимов В.Н., 2007). Унікальним положенням на межі нервової й ендокринної систем зумовлена своєрідна модулювальна роль ШЗ, здатної інтегрувати різні екзогенні й ендогенні сигнали, трансформувати їх у гормональну відповідь і сприяти адаптогенезу (Коркушко О.В., Шатило В.Б., 2004; Hofman M.A., Swaab D.F., 2006).

Універсальним регулятором біологічних ритмів є мелатонін - еволюційно давня молекула, яка виявляється у всіх хребетних, багатьох безхребетних тварин і навіть у деяких рослин та одноклітинних еукаріотів (Заморский И.И., Пишак В.П., 2003; Рапопорт С.И., Малиновская Н.К., 2006). Щодо ссавців, основна частка хронобіотика секретується в ШЗ та чітко підпорядкована фотоперіоду - найнадійнішому і найстабільнішому синхронізувальному чиннику для гомойотермних тварин, зокрема, людини. Тісно пов'язана з СХЯ і ПВЯ гіпоталамуса, структурами лімбічної системи та сітківкою ШЗ бере участь у спряженні з фотоперіодизмом ЦР (Логвинов С.В. и соавт., 2003; Mills E. et al., 2005; Hannibal J., 2006). Порушення світлового режиму (тривале освітлення, постійна темрява) є визначальним стресором, що призводить до дисбалансу синтезу мелатоніну і розвитку десинхронозу (Anisimov V.N., 2002; Губин Г.Д., 2004; Чибисов С.М. и соавт., 2006). Незважаючи на певні успіхи у вивченні структури і функції ШЗ, у літературі трапляються суперечливі та неоднозначні дані про її ефекти на хрономорфологічний та ультраструктурний стан СХЯ, структури лімбічної системи - гіпокампа, периферичної ланки - надниркових залоз, тісно пов'язаних з організацією та реалізацією ЦР. Виходячи із цих позицій, існує необхідність ретельного дослідження архітектоніки СХЯ, ШЗ, гіпокампа, надниркових залоз залежно від тривалості фотоперіоду, що дасть змогу детально проаналізувати функціональний взаємозв'язок між вказаними структурами.

Нез'ясованими залишаються питання стосовно щільності мелатонінових рецепторів у СХЯ, гіпокампі залежно від періоду доби та при блокаді пейсмекера ЦР, оскільки відомо, що ШЗ через мелатонінові рецептори (мембранні, цитозольні та ядерні) здійснює прямий контроль над структурами, залученими у формування часової організації (Witt-Enderby P.A. et al., 2003; Dubocovich M., Markowska M., 2005; Воронков А.Э.и соавт., 2005).

Недостатньо висвітленою в науковій літературі залишається проблема організації центральних механізмів ЦР головного мозку, пов'язаної з дисфункцією ШЗ. Не розкрито морфометричний та функціональний стан водія ЦР - СХЯ, а також кортикотропін-рилізинг-синтезувальних медіальних дрібноклітинних субядер ПВЯ (мдПВЯ) та вазопресин-продукувальних латеральних великоклітинних субядер ПВЯ (лвПВЯ) у нормі та при гіпер- і гіпофункції ШЗ.

Не з'ясовані питання, що торкаються залежності від зміни світлового режиму рівня експресії гена ранньої функціональної активності с-fos, який детермінує продукцію імуноспецифічного білка с-Fos у СХЯ, мдПВЯ, лвПВЯ. Відповідний білок причетний до організації ритмічної діяльності вказаних гіпоталамічних утворень.

Суперечливі літературні дані щодо стрес-індукованих порушень функціонування ШЗ: є посилання як на активацію, так і гальмування чи повну відсутність реакції з боку мелатонінутворювальної функції залози при стресі залежно від виду, інтенсивності та тривалості дії чинника, а також інтервалу доби, коли його застосовують (Фролькис В.В., 1999; Бондаренко Л.О., 2003).

На даний час отримані переконливі докази широкого кола ефектів як мелатоніну, так і епіфізарних пептидів, які здійснюють інформаційний зв'язок між різними клітинними групами, і таким чином, впливають на їх функціональну активність (Коркушко О.В. и соавт., 2004; Arendt J., 2005; Alarma-Estrany P., Pintor J., 2007). У Санкт-Петербурзькому Інституті біорегуляції і геронтології ПЗВ РАМН синтезований тетрапептид епіталон, що володіє високою біологічною активністю (Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2006). Накопичений експериментальний і клінічний досвід використання природних та синтезованих епіфізарних препаратів свідчить про безсумнівну перспективність їх застосування для лікування та профілактики десинхронозів. Однак відомості щодо впливу мелатоніну й епіталону на морфофункціональний стан та експресію гена с-fos у структурах, залучених у формування механізмів ЦР, залежно від тривалості фотоперіоду в різні добові періоди носять фрагментарний характер і не висвітлюють цілісного уявлення про проблему.

З'ясування архітектоніки і морфофункціональної організації головних (СХЯ, субядер паравентрикулярних ядер (ПВЯ) гіпоталамуса, шишкоподібної залози, гіпокампа) та периферичних (надниркові залози) компонентів хроноперіодичної системи, характеристика щільності мелатонінових рецепторів, аналіз рівня експресії гена ранньої функціональної активності с-fos у гіпоталамічних утвореннях залежно від тривалості фотоперіоду дасть можливість не тільки розширити сучасні уявлення про ступінь залучення вказаних структур у формування циркадіанних ритмів головного мозку ссавців, усвідомити вузькі місця у центральних механізмах їх регуляції, але й науково обґрунтувати застосування експериментальної терапії при хронопатологічних явищах, викликаних дисфункцією шишкоподібної залози.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом планової науково-дослідної роботи кафедри медичної біології, генетики та гістології Буковинського державного медичного університету (м. Чернівці) "Вплив стресу та солей важких металів на хроноритми функцій нирок та морфологічні показники деяких ендокринних органів" (№ державної реєстрації 0104U009025). Автор є співвиконавцем зазначеної теми, виконавцем фрагменту "Центральні механізми циркадіанних ритмів головного мозку щурів".

Мета і задачі дослідження. З'ясувати механізми циркадіанних ритмів у щурів, а також роль шишкоподібної залози в механізмах корекції відхилень морфологічного та функціонального стану структур фотоперіодичної системи тварин за різної тривалості фотоперіоду.

Для досягнення вказаної мети були поставлені такі задачі:

1. Оцінити морфологічні й ультрамікроскопічні зміни центральних (супрахіазматичні ядра, шишкоподібна залоза, гіпокамп) та периферичних (надниркові залози) структур фотоперіодичної системи щурів у різні періоди доби.

2. Вивчити динаміку світлооптичних та електронномікроскопічних перебудов компонентів фотоперіодичної системи в умовах світлового стресу.

3. Проаналізувати щільність мелатонінових рецепторів у структурах головного мозку за фізіологічної, гіпер-, гіпофункції шишкоподібної залози.

4. Охарактеризувати щільність мелатонінових рецепторів у гіпокампі за різної епіфізарної активності та при зруйнуванні супрахіазматичних ядер гіпоталамуса.

5. З'ясувати особливості морфометричних змін супрахіазматичних ядер гіпоталамуса щурів за різної функціональної активності шишкоподібної залози.

6. Оцінити коливання концентрації РНК у нейронах супрахіазматичного ядра гіпоталамуса у щурів при епіфізарній дисфункції.

7. Установити закономірності змін перерізу тіл, компонентів нейронів, концентрації в них РНК, ядерно-цитоплазматичного співвідношення, питомих об'ємів ядер і цитоплазми паравентрикулярних ядер гіпоталамуса в циркадіанному аспекті.

8. Охарактеризувати стан експресії гена ранньої функціональної активності c-fos у структурах гіпоталамуса щурів за фізіологічних умов та при порушенні світлового режиму.

9. Встановити кореляційні зв'язки між морфофункціональними перебудовами компонентів циркадіанного блоку на фоні зміненої тривалості циклу світло-темрява в різні періоди доби.

10. Провести медикаментозну терапію мелатоніном і епіталоном з метою корекції морфофункціональних змін при гіпопінеалізмі та обґрунтувати доцільність їх застосування.

Об'єкт дослідження: циркадіанні ритми головного мозку в щурів.

Предмет дослідження: залежність формування циркадіанних ритмів головного мозку в щурів від архітектоніки та морфофункціональної організації центральних і периферичних компонентів хроноперіодичної системи.

Методи дослідження: фізіологічні (з'ясування функціонального стану супрахіазматичних ядер, латеральних великоклітинних і медіальних дрібноклітинних субядер паравентрикулярних ядер гіпоталамуса), біохімічні (визначення концентрації мелатоніну в плазмі крові), імуногістохімічні (застосування поліклональних антитіл до мелатонінових рецепторів 1А), імунофлуоресцентні (ідентифікація імуноспецифічного білка c-Fos у гістологічних зрізах гіпоталамуса), морфометричні, денситометричні (аналіз нейронів гіпоталамуса і кількісне визначення вмісту в них РНК), гістологічні (вивчення досліджуваних структур на світлооптичному рівні), електронно мікроскопічні, математичної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. У дисертаційній роботі на основі експериментального дослідження вперше розкрито нові, невідомі раніше, закономірності хроноритмічної організації компонентів фотоперіодичної системи щурів залежно від функціональної активності ШЗ. Вперше експериментально обґрунтовано концепцію фотозалежної хроноорганізації циркадіанних ритмів, згідно з якою порушення тривалості фотоперіоду викликає дисбаланс синтезу мелатоніну, що є ключовою ланкою дезорганізації механізмів добової періодичності у щурів.

Вперше встановлено більш виражені загальні добові закономірності перебудов морфофункціональних параметрів компонентів циркадіанної системи - вентролатерального відділу супрахіазматичних ядер та нонапептидергічних нейросекреторних популяцій субядер паравентрикулярних ядер гіпоталамуса, шишкоподібної залози, гіпокампа, надниркових залоз при епіфізарній гіпофункції, ніж при її гіперфункції.

На підставі комплексного вивчення характеру щільності мелатонінових рецепторів у нейронах СХЯ та гіпокампа впродовж доби отримано переконливі докази фотоіндукованого її порушення з припиненням добових коливань у середніх тенденціях, а також з підсиленням варіації індивідуальної реакції структури лімбічної системи тварин на зруйнування пейсмекерних нейронів.

Вперше показано, що індикатором раннього десинхронозу центральних механізмів циркадіанних ритмів головного мозку щурів є порушення експресії гена швидкої функціональної відповіді с-fos і детермінованого ним імуноспецифічного білка с-Fos у пейсмекерних нейронах супрахіазматичних і кортикотропін-рилізинг-гормонпродукувальних та вазопресин-синтезувальних субядрах паравентрикулярного ядра гіпоталамуса при диспінеалізмі.

Встановлена закономірність, згідно з якою уведення синтетичного біорегулятора епіталону (0,5 мкг/кг) корегувало інтенсивність синтезу і секреції гормонів досліджуваних структур, підвищувало резистентність ультраструктур до світлового стресора та істотно покращувало показники площі перерізу компонентів нейронів СХЯ, а мелатоніну (0,5 мг/кг) - концентрацію в них РНК.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених експериментальних досліджень розширюють уяву про механізми хрононейроендокринної інтеграції у формуванні циркадіанних ритмів, і зокрема участь у них нейроендокринного трансдуктора - шишкоподібної залози.

Розкриття фундаментальних основ функціонування та генної експресії нейросекреторних клітин гіпоталамічних ядер залежно від тривалості фотоперіоду створює передумови для розробки схем профілактики і лікування десинхронозів, пов'язаних з порушеннями епіфізарної активності.

Здійснено пошук фармакологічних препаратів з метою стимуляції мелатонінутворювальної функції шишкоподібної залози. Науково обґрунтовано доцільність застосування синтетичного біорегулятора епіталону для корекції морфофукціональних та імуногістохімічних порушень центральних ланок циркадіанної ритміки при гіпопінеалізмі.

Результати роботи впроваджені в науковий та навчальний процеси на кафедрах медичної біології, генетики та гістології, нормальної, патологічної фізіології, фармакології, фармації Буковинського державного медичного університету, Чернівецького національного університету ім. Ю. Федьковича, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського, Дніпропетровської державної медичної академії, використовуються в науково-дослідній роботі НДІ медико-екологічних проблем МОЗ України.

За результатами досліджень отримано деклараційний патент України на корисну модель (№u 200707859) "Спосіб дослідження циркадіанних змін мелатонінових рецепторів 1А у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса", підготовлено інформаційний лист та галузеве нововведення.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку основних теоретичних положень роботи, проведено аналіз та реферування літературних джерел. Здобувач оволодів методами патофізіологічних досліджень, провів набір і обробку фактичного матеріалу. Електронномікроскопічні дослідження проведені на базі Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського під керівництвом та за участю д.б.н., проф. Волкова К.С. Морфомометричний і денситометричний аналіз нейронів гіпоталамуса та кількісний аналіз вмісту в них РНК проводили на базі Запорізького державного медичного університету за участю д.мед.н., проф. Абрамова А.В. Дисертантом написано всі розділи дисертації, сформульовано основні положення та висновки, підготовлено до друку результати власних досліджень Запозичень ідей та розробок співавторів публікацій не було. Матеріали кандидатської дисертації у написанні докторської дисертації не використовувалися.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дослідження доповідалися та обговорювалися на міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених "Вчені майбутнього" (м. Одеса, 2005); регіональній науково-практичній конференції "Актуальні питання імунології, алергології та ендокринології" (м. Чернівці, 2006); XVII з'їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю, присвяченому 125-річчю з дня народження О.О. Богомольця (Київ-Чернівці, 2006); Всеукраїнській науковій конференції "Актуальні питання вікової анатомії та ембріотопографії" (м. Чернівці, 2006); науково-практичній конференції з міжнародною участю "Хронобіологія і хрономедицина: теоретичні та клінічні перспективи" (м. Чернівці, 2006 р.); ХII Міжнародному симпозіумі "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2007); Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених "Медична наука - 2007" (м. Полтава, 2007); Всеукраїнській науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження проф. Н.М. Шінкермана "Патологоанатомічна діагностика хвороб людини: здобутки, проблеми, перспективи" (м. Чернівці, 2007); Міжнародному симпозіумі, присвяченому 80-річчю з дня народження акад. РАМН Н.А. Агаджаняна "Адаптационная физиология и качество жизни: проблемы традиционной и инновационной медицины" (Москва, 2008); Всеукраїнській науково-практичній конференції "Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень" (м. Тернопіль, 2008); V міжнародній медико-фармацевтичній конференції студентів і молодих вчених, присвяченій 600-річчю Чернівців (м. Чернівці, 2008); IV конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю (м. Славянськ, 2008); V Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю "Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів" (м. Запоріжжя, 2008); міжнародному конгресі студентів і молодих вчених (м. Новий Сад, Сербія, 2008); Всеукраїнській науково-практичній конференції "Актуальні проблеми сучасної морфології", (м. Луганськ, 2008); міжнародній Львівсько-Люблінській науково-практичній конференції з міжнародною участю "Сучасні аспекти експериментальної та клінічної біохімії", (м. Люблін, Польща, 2008); Первом Российском съезде по хронобиологии и хрономедицине с международным участием (м. Владикавказ, РПО-Аланія, Росія, 2008); підсумкових наукових конференціях співробітників Буковинського державного медичного університету (м. Чернівці, 2004-2008).

Публікації. Основні наукові положення, висновки і практичні рекомендації викладені в 35 опублікованих працях, із них 22 статті (одноосібних - 14) у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, де можуть публікуватися матеріали докторських та кандидатських дисертацій. Отримано деклараційний патент України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалу і методів дослідження, 11 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Обсяг основного тексту викладений на 324 сторінках машинописного тексту, робота ілюстрована 53 таблицями, 83 рисунками. Список літератури включає 520 джерел (256 - кирилицею, 264 - латиницею).

Основний зміст роботи

Матеріал, методи та моделі досліджень. Дослідження проведені на 342 статевозрілих нелінійних самцях білих щурів масою 200-230 г. Вибір статі тварин зумовлений більшою вразливістю нейроендокринної регуляції стрес-реактивності у самців (Ткачук С.С., 2000). Адаптивні системи самок динамічніші, надійніші і мають більшу резервну потужність, а, отже, саме у самців легше виявити нейрохімічні, ендокринні та морфологічні кореляти зрушень, викликаних впливом стресу. До початку експерименту тварин утримували в твариннику при сталій температурі, вологості повітря та вільному доступі до води й їжі. Усі експерименти проведені в літньо-осінній період, оскільки за літературними джерелами, це є період стабільної сезонної активності кори надниркових залоз (Клочкова Г.М. и соавт., 1990).

Експериментальні щури поділені на 9 серій досліджень. Кожна з останніх у свою чергу, складалася з двох груп. Тварини серії: №1 - (інтактні) перебували в умовах стандартного світлового режиму. Люмінесцентні лампи вмикали з 08.00 до 20.00 год, освітленість приміщення на рівні тварин становила 500 лк впродовж 7-ми діб; №2 - (контроль) знаходилися за тих же умов експерименту, як і щури серії №1, проте щоденно о 19.00 год внутрішньоочеревинно отримували ін'єкцію 1,0 мл розчинника (0,9% розчин етанолу на фізіологічному розчині); №3 - знаходилися в умовах експерименту, як і щури серії №1, щоденно о 19.00 год внутрішньоочеревинно уводили мелатонін (Sigma, США, ступінь очищення - 99,5%) у дозі 0,5 мг/кг, у 1,0 мл розчинника (0,9% розчин етанолу на фізіологічному розчині); №4 - перебували при постійному освітленні люмінесцентними лампами (моделювання гіпофункції ШЗ) протягом 7-ми діб; №5 - знаходилися в умовах експерименту, як і щури серії №4. Їм щоденно о 19.00 год внутрішньоочеревинно уводили мелатонін (Sigma, США, ступінь очищення - 99,5%) у дозі 0,5 мг/кг, у 1,0 мл розчинника (0,9% розчин етанолу на фізіологічному розчині); №6 - знаходилися в умовах експерименту, як і щури серії №4, які щоденно о 19.00 год підшкірно отримували ін'єкцію епіталону (Санкт-Петербурзький Інститут біорегуляції і геронтології ПЗО РАМН, Росія) у дозі 0,5 мкг/кг, у 0,5 мл фізіологічного розчину; №7 - перебували в умовах стандартного світлового режиму, їм проводили електролітичне зруйнування СХЯ гіпоталамуса; №8 - перебували в умовах стандартного світлового режиму, їм виконували псевдооперацію електролітичного зруйнування СХЯ гіпоталамуса; №9 - знаходилася в умовах постійної темряви - (моделювання гіперфункції ШЗ) впродовж 7-ми діб. Експерименти в серії №8 та в нічний період доби в серіях №1, 2, 3 проводили при слабкому (2 лк) червоному світлі, оскільки воно практично не впливає на біосинтез мелатоніну ШЗ.

При виконанні досліджень дотримувалися Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовують в експериментах та інших наукових цілях (1986), Директиви ЄЕС №609 (1986) та наказу МОЗ України №281 від 01.11.2000 р. "Про заходи щодо подальшого вдосконалення організаційних норм роботи з використанням експериментальних тварин".

Після закінчення 7-денного експерименту наступного дня о 14.00 і о 02.00 год здійснювали виведення тварин з експерименту шляхом одномоментної декапітації під етаміналовим наркозом (40,0 мг/кг внутрішньоочеревинно).

Концентрацію мелатоніна в сироватці крові визначали імуноферментним методом з використанням тест-системи Direct Saliva Melatonin Elisa фірми Bugelmann (Швейцарія).

З метою виявлення морфофункціональних відмінностей досліджуваних структур та враховуючи циклічність продукції мелатоніну забір біоматеріалу здійснювали з 12-годинним інтервалом (о 14.00 і о 02.00 год).

Для комп'ютерної морфометрії отримували цифрові копії зображень досліджуваних структур з використанням мікроскопа ЛЮМАМ-Р 8 (об'єктив 40х - для цитометричних досліджень, окуляр 10х - для гістологічних досліджень, окуляр 10х для всіх досліджень) та цифрової камери Olympus C740UZ. Потім цифрові копії зображення аналізували за допомогою ліцензійної версії комп'ютерної програми "ВидеоТест - Размер 5.0" (ООО Видеотест, Россия) - проводили комп'ютерну мікроденситометрію із застосуванням показників, які вказані в результатах дослідження.

Для електронно-мікроскопічних досліджень шматки завтовшки 2-3 мм з ділянки локалізації супрахіазматичних ядер гіпоталамуса, гіпокампа, шишкоподібну та надниркові залози поміщали в 2,5 % розчин глютаральдегіду з активною реакцією середовища 7,3-7,4 на фосфатному буфері Міллонга. Подальшу обробку і дослідження матеріалу проводили за загальноприйнятою методикою (Dykstra M.J., 1992). Вивчення і фотографування препаратів здійснювали за допомогою електронних мікроскопів ЕМВ-100 ЛМ та ЕМ 125 К.

Для ідентифікації c-Fos у гістологічних зрізах гіпоталамуса застосовували непрямий імунофлуоресцентний метод. Як первинні антитіла використовували кролячі антитіла (IGG) до cFos (Sigma-Aldrich, США). В якості вторинних антитіл слугували козячий гаммаглобулін проти глобулінів кролика, кон'югований з флуоресцеїнізотіоціонатом (FITC) (Sigma-Aldrich, США). Ідентифікацію c-Fos у нейронах гіпоталамуса і кількісний аналіз його вмісту проводили на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) в ультрафіолетовому спектрі.

Топографічну приналежність імунопозитивних нейронів окремим структурам гіпоталамуса картували відповідно до стереотаксичного атласу мозку щура (Paxinos G.D. Watson C.C., 1985). Приналежність ідентифікованих нейронів окремим субядрам паравентрикулярного ядра (ПВЯ) здійснювали на підставі топографічної і функціональної класифікації, що наведена в роботах Armstrong W.E. et al. (1980), Swanson L.W., Kupers H.G. (1980), Swanson L.W., Sawchenko P.E. (1983), Гоуфманом Е.И. (1985, 1990). З огляду на те, що медіальне дрібноклітинне субядро ПВЯ синтезує кортикотропін-рилізинг фактор (КРФ), а латеральне великоклітинне субядро містить вазопресин-синтезувальні нейрони і обидва залучені в нейроендокринну відповідь при різноманітних стресових реакціях організму, це визначило їх вибір для з'ясування реакції нейроендокринної системи при порушенні світлового режиму.

Морфометричний і денситометричний аналіз нейронів гіпоталамуса і кількісний аналіз вмісту в них РНК проводили на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина) у видимому спектрі: інтерактивно визначалися межі тіла нейрона, його ядра і ядерця, а потім автоматично обчислювали площу перерізу виділених об'єктів, концентрацію і вміст у них РНК.

На підставі отриманих показників обчислювалася концентрація РНК у виділених структурах нейронів Кi (умовних одиниць оптичної щільності - од.опт. щільності): Кi = |lg(Di /D0)|, і вміст РНК у виділених структурах нейронів Сi (одиниць оптичної щільності - од.опт. щільності): Сi = Si Й |lg(Di /D0)|, де Si - площа структури нейрона (мкм 2), а Di і D0 - показники оптичної щільності виділених структур нейронів і міжклітинної речовини ("фону" препарату), відповідно.

З метою виконання імуногістохімічної методики використані поліклональні антитіла до мелатонінових рецепторів 1А виробника Abcam (Велика Британія) та стрептавідинбіотинову систему візуалізації LSAB2 (пероксидазна мітка+діамінобензидин) виробника Chemicon International Inc. (США). Дофарбовування ядер проводили гематоксиліном Майера.

Тваринам 7-ої серії під етаміналовим наркозом (40,0 мг/кг внутрішньоочеревинно) здійснювали двобічну електрокоагуляцію супрахіазматичних ядер переднього гіпоталамуса. Щурів скальпували і проводили трепанацію черепа. Сталеві електроди (d=0,2 мм) уводили в головний мозок тварин за стереотаксичними координатами (Paxinos G., 1983): АР=-1,0, L=0,2, Н=9,4. Електрокоагуляцію здійснювали анодним струмом (1 мА) впродовж 20 с. Зруйнування супрахіазматичних ядер при електрокоагуляції верифікували на зрізах мозку, які зафарбовували крезил-віолетом.

У 8-ій серії щурам застосовували "псевдооперацію" для виключення можливого впливу оперативного втручання на інтерпретацію результатів: електроди уводили в головний мозок за указаними стереотаксичними координатами, однак при цьому не подавали електричного струму.

При статистичній обробці даних морфометрії надниркових залоз вираховували середню арифметичну та її похибку, використовуючи критерій Хана-Шапіро-Уілкі. Вірогідність різниці між групами дослідження визначали за допомогою двостороннього непарного критерію Стьюдента. Результати вважали вірогідними при р?0,05.

Коефіцієнт кореляції визначали за методом (О. І. Мерков, Л. Є. Поляков, 1974), де rху незалежно від знаку приймали за величин від 0 до 0,29 - як малу; 0,30 - 0,69 - як середню; 0,70 - 1,0 - як сильну кореляцію. Для виявлення вірогідності відмінностей результатів у дослідних і контрольних групах тварин визначали коефіцієнт Стьюдента (t), вірогідність відмінності вибірок (р) і довірчий інтервал середньої за таблицями розподілу Стьюдента. Вірогідними вважали значення, для яких p<0,05.

При імуноцитохімічному дослідженні комп'ютерну мікроденситометрію проводили за допомогою ліцензійної копії комп'ютерної програми "ВидеоТест - Размер 5.0" (ООО Видеотест, Россия). Враховуючи необхідність виконання множинних статистичних порівнянь середніх величин у статистичних вибірках, для визначення відмінностей між сукупностями використаний критерій Ньюмена-Кейлса. Розбіжність у варіюванні індивідуальних величин вимірюваного показника оцінювали за допомогою двох відповідних цьому завданню статистичних методів - критерію Фішера та критерію Левене (Hardle W. et al., 2007).

Результати дослідження та їх обговорення

Гістологічна та субмікроскопічна організація супрахіазматичних ядер гіпоталамуса, шишкоподібної залози, гіпокампа, надниркових залоз за різної тривалості фотоперіоду та введення епіталону

Результати ультраархітектоніки пейсмекерних нейронів СХЯ гіпоталамуса щурів, яким моделювали епіфізарну гіпер- чи гіпофункцію вказують на більш виражені порушення структури досліджуваних нейронів в умовах пригніченої функціональної активності ШЗ, ніж при її підвищеній функції. Ін'єкції синтетичного тетрапептиду епіталону (0,5 мкг/кг маси тіла) на фоні епіфізарної гіпофункції призвели до нормалізації нейронного складу нейросекреторних клітин вентролатерального відділу СХЯ гіпоталамуса, що особливо помітно проведеними дослідженнями о 02.00 год.

Аналіз морфологічної та ультрамікроскопічної архітектоніки ШЗ дозволяє підсумувати, що у тварин, які перебували в умовах світлової депривації ультраструктурна організація ШЗ показала переважання світлих клітин, ядра яких мають покраяний контур і містять у собі 1-2 ядерця; у цитоплазмі виявляється невелика кількість мітохондрій, активний КГ, вільні рибосоми та полісоми, багато дрібних везикул. У полі зору трапляються темні (запасні) форми пінеалоцитів. Описана структура свідчить про підвищену активність пінеальної залози 02.00 год. В умовах цілодобового освітлення гістологічна і субмікроскопічна організація пінеалоцитів віддзеркалюється більш вираженими порушеннями реактивного характеру на тлі пригнічення біосинтетичних внутрішньоклітинних процесів. Зокрема, о 02.00 год це структурно проявляється гіпертрофованими мітохондріями і зменшенням числа рибосом, помірно розширеними цистернами КГ і канальцями гранулярного ЕПР. Біохімічно відзначено різке пригнічення рівня гуморального медіатора організації циркадіанних ритмів у плазмі крові впродовж добових інтервалів.

Застосований епіталон (0,5 мкг/кг маси тіла) протективно впливає на ультраструктуру пінеалоцитів щурів, які знаходилися в умовах постійного освітлення; індукує компенсаторно-адаптаційні перебудови, спричинює відновлення серотонін-продукувальної активності залози в денний період та зростання о 02.00 год кількості гранул мелатоніну в пінеалоцитах і рівня хронобіотика в плазмі крові. Біохімічне визначення концентрації мелатоніну в плазмі крові підтвердило нормалізувальний ефект уведення епіталону на фоні стрес-індукованих змін, яка сягала 99,2 ± 13,89 пг/мл. Одним з механізмів впливу епіталону на функціональний стан ШЗ при дії постійного освітлення, на нашу думку, може бути тенденція до нормалізації балансу нейромедіаторів у мозкових структурах, і, як наслідок, відновлення чутливості залози до периферичних регуляторних сигналів.

За семидобової темряви (моделювання епіфізарної гіперфункції) світлооптична організація гіпокампа характеризується порушенням ритмічності та зниженням функціональної активності нейронів гіпокампа як о 14.00 год, так і о 02.00 год. В умовах цілодобового постійного освітлення (моделювання гіпофункції ШЗ), особливо о 02.00 год, мікроскопічна організація нейронів гіпокампа віддзеркалюється більш вираженими порушеннями реактивного характеру на тлі пригнічення внутрішньоклітинних регенеративних процесів. Зокрема, о 02.00 год це ультраструктурно проявляється такими ознаками: малою кількістю рибосом і полісом, вузьким просвітом канальців гранулярного ЕПР, нечіткими компонентами КГ, деструктивною зміною окремих органел.

Застосування епіталону (0,5 мкг/кг маси тіла тварини) при світловому стресі сприяло зростанню функціональної активності та регенерації досліджуваної структури. Поміж інших ознак, це проявлялося зростанням об'ємів ядер більшості клітин, рибосом і полісом в їх нейроплазмі, а також наявністю первинних і вторинних лізосом, що віддзеркалювало процеси утилізації пошкоджених дією тривалого освітлення ультраструктур.

При звичайному освітленні у надниркових залозах щурів відбуваються добові коливання цитологічних параметрів пучкової зони кіркової речовини, які разом вказують на більшу функціональну напруженість епітеліоцитів вказаної зони о 14.00 год порівняно з 02.00 год.

В умовах гіперфункції ШЗ в пучковій зоні спостерігається подібна тенденція - морфологічні зміни епітеліоцитів відповідають підвищенню їх функції о 14.00 год та зниженню о 02.00 год. При епіфізарній гіпофункції в пучковій зоні морфологічні зміни епітеліоцитів свідчать про зниження їх функції як о 14.00 год, так і о 02.00 год. У сітчастій зоні о 14.00 год у цитоплазмі епітеліоцитів морфологічні зміни вказують на підвищення функції, а о 02.00 год - зниження функціональної активності.

Світлова депривація призводить до реактивних змін ультраструктури клітин мозкового шару надниркових залоз щурів о 14.00 год. Водночас о 02.00 год вказані зміни особливо помітні, що віддзеркалюється ущільненням ядер, пронизаною інвагінаціями каріолемою, розширенням канальців ЕПР і диктіосом КГ. Цілодобове освітлення о 02.00 год досліду викликає більші реактивні зміни на електронномікроскопічному рівні порівняно з групою тварин о 14.00 год. Це проявляється зростанням кількості грудочок гетерохроматину, втратою структурованості ядерця, різким розширенням перинуклеарного простору, зменшенням розмірів секреторних гранул.

Застосування епіталону (0,5 мкг/кг маси тіла тварини) в умовах цілодобового освітлення запобігає розвитку морфофункціональних змін ендокриноцитів кори надниркових залоз щурів при денному та частково гальмує ступінь вказаних змін хромафінних клітин надниркових залоз при нічному спостереженнях.

Циркадіанні зміни щільності мелатонінових рецепторів 1A типу в гіпоталамічних ядрах і гіпокампі щурів за світлової експозиції та депривації: імуногістохімічний аналіз

Супрахіазматичні ядра гіпоталамуса. Чітке позитивне імуногістохімічне забарвлення визначалось у нейронах СХЯ у вигляді гранул різних розмірів та щільності, які концентрувалися переважно на периферії кожної клітини, що вочевидь відображає трансмембранне розташування мелатонінових рецепторів 1А. Імуногістохімічного забарвлення ядер не спостерігали - вони фарбувалися виключно гематоксиліном і характеризувалися типовою для нейронів СХЯ морфологією. Звертало на себе увагу те, що серед нейронів виділялися клітини дрібних розмірів (діаметром 5-10 мкм) переважно круглястої форми та великі клітини (діаметром 13-24 мкм) полігональної або грушоподібної форми. Характерно, що на 08.00 порівняно з 02.00 год. у 4,5 раза (з 641,2 до 140,8 у полі зору площею 1600 мкм 2 - р<0,001 за критерієм Ньюмена-Кейлса) зменшувалася кількість позитивно забарвлених дрібних нейронів.

Виявлено зменшення щільності у дрібних нейронах мелатонінових рецепторів до концентрації, яка нижча порогу чутливості застосованої імуногістохімічної методики. Окрім того, за мікроденситометричними даними на 8.00 порівняно з 02.00 год. у великих клітинах зменшувалася оптична щільність імуногістохімічного забарвлення (табл. 1), що також розцінюємо як зменшення щільності мелатонінових рецепторів.

О 14.00 год порівняно з 8.00 год відмічали сталу картину стосовно кількості позитивно забарвлених дрібних нейронів (161,4 та 140,8 у полі зору площею 1600 мкм 2 - р=0,28 за критерієм Ньюмена-Кейлса). Однак, у великих нейронах мало місце зростання щільності мелатонінових рецепторів, на що вказувало підвищення оптичної щільності забарвлення (табл. 1).

Таблиця 1 Циркадіанна динаміка оптичної щільності забарвлення на мелатонінові рецептори 1А у "великих" нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса ()

Примітка. * - вірогідність різниці порівняно з попереднім часовим інтервалом.

О 20.00 год. відмічали "повернення" величин показників до тих, які спостерігали о 02.00 год. Зокрема, кількість дрібних нейронів у полі зору площею 1600 мкм 2 становила 611,4 в.од.опт. щільності (вірогідність розбіжності з групою 02.00 год - р=0,079), величина оптичної щільності забарвлення у великих нейронах характеризувала аналогічну закономірність (табл. 1).

В умовах світлової депривації кількість позитивно забарвлених на мелатонінові рецептори 1А дрібних нейронів СХЯ у полі зору площею 1600 мкм 2 становила: о 02.00 год - 491,8, о 08.00 год - 471,4, о 14.00 год - 481,3, о 20.00 год - 481,8 в.од.опт.щільності. Розбіжності за критерієм Ньюмена-Кейлса між вказаними групами дослідження невірогідні (p>0,05).

Згідно з наведеними даними щільність мелатонінових рецепторів 1А у великих нейронах СХЯ при тривалій темряві є стабільно високою й у середньому не змінюється впродовж доби (табл. 2).

Таблиця 2 Оптична щільність забарвлення на мелатонінові рецептори 1А у нейронах супрахіазматичних ядер щурів в умовах моделювання різної функціональної активності шишкоподібної залози ()

Примітка. * - вірогідність різниці (p<0,05) порівняно з попереднім часовим інтервалом у межах групи.

Протилежну картину спостерігали у щурів, які знаходилися в умовах гіпофункції ШЗ. Зокрема, кількість позитивно забарвлених на мелатонінові рецептори 1А дрібних нейронів СХЯ у полі зору площею 1600 мкм 2 становила: о 02.00 год - 160,9, о 08.00 год - 151,1, о 14.00 год - 181,1, о 20.00 год - 171,0. Хоча розбіжності за критерієм Ньюмена-Кейлса між вказаними групами дослідження невірогідні (p>0,05), однак, має місце суттєве зниження даного показника у всі досліджувані періоди (p<0,001) порівняно з тваринами, яких утримували в умовах гіперфункції епіфіза мозку.