Морфофункціональне обґрунтування механізмів циркадіанних ритмів у щурів

Дані таблиці 2 щодо результатів мікроденситометричних досліджень вказують на зниження (p<0,001) імуногістохімічної щільності мелатонінових рецепторів 1А також у великих нейронах СХЯ у тварин, яким моделювали гіпофункцію ШЗ порівняно з епіфізарною гіперфункцією, хоча впродовж доби коливання показника в середньому не відрізнялися.

Таким чином, якщо щільність мелатонінових рецепторів 1А у нейронах СХЯ гіпоталамуса щурів в умовах фізіологічної функції ШЗ характеризувалася чіткими добовими коливаннями, то дисфункція залози призвела до вираженого їх порушення. При гіпофункції епіфіза мозку щільність досліджуваних структур вірогідно менша, ніж при гіперфункції. Крім того, в умовах пригнічення активності ШЗ максимальна кількість мелатонінових рецепторів у нейронах СХЯ гіпоталамуса зміщується з 02.00 год на 14.00 год і становить 0,35 0,012 в.од.опт.щільності, а при активації залози - найбільший показник відзначається о 20.00 год, складаючи 0,43 0,015 в.од.опт. щільності.

Препаратом, який використовували для корекції порушень, викликаних тривалим перебуванням щурів в умовах постійного освітлення, щільності мелатонінових рецепторів 1А у нейронах СХЯ гіпоталамуса був синтетичний епіфізарний тетрапептид - епіталон у дозі 0,5 мкг/кг маси тіла тварини.

Проведеними імуногістохімічними дослідженнями о 14.00 год при уведенні препарату вірогідних змін щільності досліджуваних структур щодо до такої у тварин, яким не проводили ін'єкції тетрапептиду на фоні світлового стресу не виявлено (табл. 2). Якщо при світловій експозиції число позитивно забарвлених на мелатонінові рецептори 1А дрібних нейронів СХЯ у полі зору площею 1600 мкм 2 становила у нічний період (02.00 год) 160,9, а в денний (14.00 год) - 181,1, то при застосуванні епіталону на фоні тривалого освітлення кількість досліджуваних нейронів складала о 02.00 год - 220,7 та 14.00 год - 190,8 відповідно. За критерієм Ньюмена-Кейлса між групами, зразки яких забирали для дослідження вночі, розбіжність вірогідна (p<0,05).

Гіпокамп. Чітке позитивне імуногістохімічне забарвлення визначалось у нейронах гіпокампа у вигляді гранул різних розмірів та оптичної щільності, які концентрувалися переважно по периферії кожної клітини, що вочевидь відображає трансмембранне розташування мелатонінових рецепторів 1А. Імуногістохімічного забарвлення ядер не спостерігали - вони фарбувалися виключно гематоксиліном і характеризувалися типовою для нейронів гіпокампа морфологією.

Результати вимірювань оптичної щільності специфічного забарвлення на мелатонінові рецептори 1А подані у таблиці 3.

Як видно з даних таблиці, найвища щільність мелатонінових рецепторів 1А у нейронах гіпокампа щурів відмічається о 02.00 год, причому, хоча відмінність порівняно з 20.00 у середньому є невеликою (довірчий інтервал різниці середніх при р=0,05 знаходиться у межах всього 0,00015-0,05985 в. од. опт. щільності), але розбіжність достатньо вірогідна (p=0,048).

Для прикладу більшої розбіжності наводимо довірчий інтервал різниці середніх при р=0,05 між показниками щільності мелатонінових рецепторів 1А у нейронах гіпокампа щурів о 02.00 та 08.00 год, який становить 0,10727-0,15272 в. од. опт. щільності.

Таблиця 3 Циркадіанна динаміка оптичної щільності імуногістохімічного забарвлення на мелатонінові рецептори 1А у нейронах гіпокампа щура ()

Примітка. * - вірогідність різниці порівняно з показниками попереднього часового інтервалу

Середні дані мікроденситометричних досліджень імуногістохімічної щільності мелатонінових рецепторів 1А в нейронах гіпокампа при моделюванні гіперфункції ШЗ представлені у таблиці 4. Відмітимо, що щільність мелатонінових рецепторів 1А в нейронах СХЯ при тривалій темряві є стабільно високою в нічний період, а в ранковий та денний період вона вірогідно знижується.

На відміну від тварин, які перебували при постійній темряві, у щурів, які знаходилися в умовах гіпофункції ШЗ кількість позитивно забарвлених на мелатонінові рецептори 1А нейронів гіпокампа вірогідно менша. Найвищих значень вона сягала о 14.00 год, коли показник перебував у межах 0,29 0,008 в. од. опт. щільності, вірогідно відрізняючись від такої о 08.00 год - 0,24 0,009 в. од. опт. щільності. Порівняння отриманих показників оптичної щільності забарвлення на мелатонінові рецептори 1А у нейронах гіпокампа щурів у різні добові періоди з моделюванням різної епіфізарної активності, дало змогу встановити вірогідність різниць за критерієм Ньюмена-Кейлса, крім 14.00 год.

При корекції епіталоном (0,5 мкг/кг маси тіла тварини) змін, спричинених світловим стресом, щільності мелатонінових рецепторів 1А в нейронах гіпокампа щурів вірогідної різниці щодо щільності досліджуваних рецепторів у тварин, яким не застосовували тетрапептид на фоні світлового стресу імуногістохімічно о 14.00 год не виявлено (табл. 2).

Таблиця 4 Оптична щільність забарвлення на мелатонінові рецептори 1А у нейронах гіпокампа щурів в умовах моделювання різної функціональної активності шишкоподібної залози ()

Примітка. * - вірогідність різниці (p<0,05) порівняно з попереднім часовим інтервалом у межах групи.

Однак, о 02.00 год така різниця чітка, а сама кількість позитивно забарвлених на мелатонінові рецептори 1А нейронів гіпокампа становила 035 0,009 в.од.опт. щільності.

Нами також з'ясовано вплив СХЯ гіпоталамуса на щільність мелатонінових рецепторів 1А в нейронах гіпокампа тварин. Проведені експерименти показали практично повну відсутність істотного впливу псевдооперації на щільність досліджуваних мелатонінових рецепторів 1а у центральному відділі лімбічної системи головного мозку, що дозволило нам об'єднати дані та сформувати групи контрольних параметрів в обрані періоди доби.

При неушкоджених СХЯ у лабораторних щурів згідно з мікроденситометричними даними, які отримані на імуногістохімічних препаратах, відмічали добові коливання щільності мелатонінових рецепторів 1А у гіпокампі. Зокрема, на 02.00 год припадав максимум оптичної щільності забарвлення - 0,370,009 в.од.опт.щільності, вірогідно нижчу оптичну щільність забарвлення виявлено о 20.00 год (0,340,011 в.од.опт. щільності), ще меншу - о 14.00 год (0,27 0,008 в. од. опт. щільності), а мінімальна величина вказаного показника (0,240,006 в. од. опт. щільності) зафіксована о 08.00 год ранку.

При електролітичному зруйнуванні СХЯ вказана циркадіанна закономірність коливання щільності мелатонінових рецепторів 1А у гіпокампі порушувалася. У результаті статистичної обробки отриманих даних обчислені наступні середні величини оптичної щільності специфічного забарвлення на мелатонінові рецептори 1А у нейронах гіпокампа: о 02.00 год - 0,250,013 в.од.опт.щільності, о 8.00 год - 0,24 0,012 в.од.опт. щільності, о 14.00 год - 0,240,011 в.од.опт. щільності, о 20.00 год - 0,260,012 в.од.опт. щільності. Згідно з критерієм Ньюмена-Кейлса та Стьюдента розбіжностей між середніми величинами не виявлено (р>0,05), не відзначено навіть тенденції до розбіжності (р>0,1).

Отже, щільність мелатонінових рецепторів 1А у нейронах СХЯ щурів підпорядкована чіткій циркадіанній організації. Найвища щільність спостерігається о 02.00 та 20.00 год, а о 08.00 та 14.00 год вона суттєво знижується. Дисфункція ШЗ призвела до вираженого порушення добових коливань досліджуваної щільності. При гіпофункції епіфіза мозку щільність досліджуваних структур вірогідно менша, ніж при гіперфункції. Крім того, імуногістохімічне дослідження показало, що в умовах пригнічення активності ШЗ максимальна кількість мелатонінових рецепторів у нейронах СХЯ гіпоталамуса зміщується з 02.00 год на 14.00 год і становить 0,35 0,012 в.од.опт. щільності, а при активації залози - найбільший показник відзначається о 20.00 год, складаючи 0,43 0,015 в.од.опт. щільності. Водночас, при застосуванні епіталону на фоні тривалого освітлення кількість досліджуваних рецепторів о 02.00 год вірогідно вища щодо числа структур у тварин, яким на фоні світлового стресу препарат не уводили.

Упорякована циркадіанна ритмічність властива і для виявлення мелатонінових рецепторів 1А у нейронах гіпокампа щурів за фізіологічних умов. Максимальна щільність рецепторів візуалізується о 20.00 та 02.00 год, з подальшим зниженням о 08.00 та 14.00 год.

Моделювання епіфізарної гіпофункції, на відміну від гіперфункції залози, віддзеркалюється вірогідним зниженням щільності рецепторів до мелатоніну в центральному відділі лімбічної системи головного мозку - гіпокампі. Ін'єкції епіталону (0,5 мкг/кг) зменшують о 02.00 год прояв порушень, викликаних світловим стресором.

При експериментальному зруйнуванні СХЯ у щурів відбувається десинхронізація циркадіанних ритмів щільності мелатонінових рецепторів 1А нейронів гіпокампа з припиненням добових коливань у середніх тенденціях, а також з підсиленням варіації індивідуальної реакції тварин на моделювання виключення функції СХЯ гіпоталамуса.

Морфометрична характеристика нейронів супрахіазматичних ядер, медіальних дрібноклітинних, латеральних великоклітинних субядер паравентрикулярних ядер гіпоталамуса щурів за різної тривалості фотоперіоду та експериментальної терапії СХЯ гіпоталамуса. Тривалість фотоперіоду істотно впливає на фоторецепторні пейсмекери СХЯ. Вивчення морфометричних характеристик нейронів СХЯ гіпоталамуса виявило добову динаміку показників. Так, порівняно з денним періодом (14.00 год), до 02.00 год відмічали вірогідне збільшення (на 7,5±1,5%) площі перерізу тіла нейронів СХЯ, зумовлене зростанням площі перерізу ядра клітин, що підтверджено прямим кореляційним зв'язком (r=0,27). У свою чергу, збільшення площі перерізу ядра нейрона зумовлено вірогідним зростанням площі перерізу його ядерця, яка становила 5,53±0,234 мкм 2, коефіцієнт кореляції між досліджуваними показниками дорівнював 0,54. При цьому в нічний період спостереження ядерно-цитоплазматичне співвідношення в пейсмекерних нейронах становило 1,7±0,05% і вірогідно більше (на 27,6±3,12%), ніж у денний проміжок. Водночас питомий об'єм ядра нейрона зростав на 18,2±2,16%, а цитоплазми, навпаки, знижувався на 14,2±1,98%. Ці зміни поєднувалися зі зростанням концентрації РНК у самих ядрах на 7,3±1,5%, а також із підвищенням концентрації РНК в ядерцях нейронів на 8,5±1,7% і займаній ними площі перерізу на 26,5±5,2% порівняно з денним періодом. При цьому змін площі перерізу цитоплазми і концентрації в ній РНК не реєстрували

Постійний світловий режим десинхронізує морфофункціональну активність нейронів СХЯ, змінює у концентрацію РНК в їх ядрі, ядерці та цитоплазмі. Уведення мелатоніну тваринам, що перебували в умовах постійного освітлення нормалізувало показники площі перерізу нейронів СХЯ і концентрацію у них РНК.

Водночас, індол не корегував ритм активності нейронів СХЯ, який залишався таким, як і при тривалому фотоперіоді та інверсним щодо тварин, які перебували за звичайного світлового режиму. Рівень РНК у нейронах СХЯ о 02.00 год не зазнає вірогідних змін у групах порівняння, що, ймовірно, свідчить про залучення додаткових ендогенних механізмів, спрямованих на збереження функціональної активності нейронів у вказаний період, коли в нормі продукується найбільше мелатоніну.

Медіальні дрібноклітинні субядра ПВЯ гіпоталамуса. Активність медіальних дрібноклітинних субядер ПВЯ гіпоталамуса характеризуються добовою ритмічністю зі зниженням у нічний період доби. На це вказує вірогідне зменшення площі перерізу нейрона внаслідок зниження площі перерізу ядра (r=0,66) та цитоплазми (r=0,64), низька концентрація РНК у цитоплазмі на фоні збільшення ядерно-цитоплазматичного співвідношення до 1,44±0,019 од. порівняно з денними величинами. Результати нічного етапу експерименту у тварин, які утримувалися в умовах епіфізарної гіперфункції вказують на порушення ритмічності активності нейронів мдПВЯ гіпоталамуса та зміщення максимальних величин площі перерізу складових нейрона з денних на нічні години. Проте низькі концентрації РНК в ядрі, ядерці та цитоплазмі нейротрансдуктора можна пояснити присутністю в цьому інтервалі доби підвищеної кількості в крові епіфізарного хронобіотика - мелатоніну, який в якості стрес-лімітувального чинника інгібує продукцію кортикотропін-рилізинг гормону медіальними дрібноклітинними субядрами ПВЯ гіпоталамуса.

Хоча тривале освітлення є значним стресором і пусковим чинником розвитку десинхронозу, у даному випадку це мало стосується досліджуваних субядер нейросекреторних клітин гіпоталамуса. Практично відсутність ознак підсилення функціональної активності структур ПВЯ та вірогідних різниць площі перерізу нейронів і його компонентів при постійному та стандартному режимі освітлення дозволяє дійти висновку про широкий діапазон пластичності мдПВЯ при 7-добовій експозиції яскравим світлом та визначальний вплив на їх діяльність світлового подразника

Ін'єкції мелатоніну (0,5 мг/кг маси тіла тварини) на тлі епіфізарної гіпофункції істотно не вплинули на добовий ритм морфофункціональної активності нейроендокринних трансдукторів ПВЯ гіпоталамуса, який залишався схожим до такого в інтактної групи щурів та тварин із зниженою функціональною активністю

Порівнюючи з мелатоніном, в умовах постійного освітлення епіталон (0,5 мкг/кг маси тіла) призводить до більшого пригнічення о 14.00 год та, навпаки, зростання о 02.00 год морфометричних показників дрібноклітинних нейронів субядер ПВЯ гіпоталамуса

Латеральні великоклітинні субядра ПВЯ гіпоталамуса. В інтактних тварин простежується циркадіанна ритмічність морфофункціональної активності досліджуваних нейротрансдукторів лвПВЯ гіпоталамуса з максимальними показниками близько 14.00 год. Гіперфункції ШЗ викликає десинхроноз функціональної активності нейронів лвПВЯ гіпоталамуса та інверсію максимальних величин з денних на нічні години, що розцінюємо, як ефекти мелатоніну, який в якості стрес-лімітувального чинника пригнічує синтез вазопресину латеральними великоклітинними субядрами ПВЯ гіпоталамуса самців щурів

Вивчення добових коливань та функціональної активності нейронів лвПВЯ у щурів, які перебували за гіпофункції ШЗ показало згладжуваність різниці між денними та нічними показниками. І хоча при тривалому освітленні вдень вірогідних різниць щодо показників інтактних тварин не виявлено, уночі площа перерізу компонентів досліджуваних субядра нейросекреторних клітин гіпоталамуса вірогідно зростає. Це дозволяє дійти висновку, що за тривалого світлового стресу розвивається десинхроноз з проявами реактивних змін морфометричних параметрів латеральних великоклітинних субядер ПВЯ гіпоталамуса.

Застосування мелатоніну (0,5 мг/кг маси тіла тварини) на фоні гіпофункції епіфіза мозку нормалізували порушення циркадіанного ритму морфофункціональної активності нейротрансдукторів ПВЯ гіпоталамуса, спричинене світловим стресом. Порівнянням морфометричних параметрів з показниками стресованих світлом щурів о 14.00 год встановлено вірогідне підвищення площі перерізу соми нейрона лвПВЯ на 12,2 ± 1,04% за рахунок зростання площі перерізу ядра (r=0,99) та ядерця на 19,4±1,10% на тлі вірогідного зменшення питомого об'єму цитоплазми з одночасним зростанням питомого об'єму ядра структури. О 02.00 год реєстрували вірогідно нижчу площу перерізу ядерця на 8,7± 1,42% та вищу площу перерізу цитоплазми на 10,4±2,02% порівняно з щурами, яких піддавали тривалій експозиції постійним світлом. Зменшувалася і концентрації РНК у складових нейрона в періоди експерименту.

На відміну від мелатоніну, в умовах постійного освітлення епіталон (0,5 мкг/кг маси тіла) не нормалізує добового ритму морфофункціональної активності нейронів лвПВЯ, який залишається подібним до такого у щурів, яким моделювали гіпопінеалізм і не уводили пептид. Крім того, тетрапептид призводить до істотного пригнічення морфометричного стану латеральних великоклітинних субядер ПВЯ о 14.00 год. Уночі дія препарату на фоні постійного освітлення викликала збільшення площі перерізу нейрона внаслідок зростання площі перерізу цитоплазми на 7,7±0,65% (r=0,61). У добовому аспекті концентрація РНК у стресованих світлом щурів, яким уводили епіталон, о 02.00 год зростала в ядрі - на 13,5±1,10%, в ядерці - на 13,3 ± 1,25% та цитоплазмі - на 19,0±1,28%.

Стан гена ранньої функціональної активності c-fos в ядрах гіпоталамуса щурів за різної тривалості фотоперіоду та застосуванні мелатоніну й епіталону СХЯ гіпоталамуса. Експресія продукту активності гена "надранньої відповіді" c-fos - білка c-Fos - у нейронах СХЯ щурів, утримуваних в умовах нормальної фотоперіодики, зазнає чітких циркадіанних коливань (табл. 5).

За моделювання різної функціональної активності ШЗ - змін фотоперіоду (стандартного світлового режиму, постійного освітлення та темряви) нами досліджено їх впливи на стан гена ранньої функціональної активності c-fos у нейронах СХЯ гіпоталамуса щурів у різні проміжки доби шляхом визначення інтенсивності експресії відповідного протеїну (c-Fos) з використанням імунофлуоресцентної методики.

Як показало імунофлуоресцентне виявлення білка c-Fos (продукт експресії гена "надранньої відповіді" c-fos) у нейронах СХЯ, ділянки, де інтенсивність флуоресценції вірогідно перевищувала фон, містилися в межах перерізів ядер нейронів зазначеної структури. Середні значення площ таких імунопозитивних ділянок ядер (Sі) дещо варіювали, але і в інтактних тварин, і в щурів, які перебували в умовах світлової стимуляції та депривації, і в підгрупах, в яких зразки СХЯ для дослідження відбиралися вдень (о 14.00 год) та вночі (о 02.00 год), міжгрупові різниці не досягали рівня вірогідності.

Можна лише відмітити, що у фізіологічних умовах та в умовах постійної темряви дещо більші площі матеріалу, імунореактивного відносно c-Fos, виявлялись у нічний проміжок доби, а у тварин, що зазнали тривалої світлової стимуляції, більша площа матеріалу наявна вдень (табл. 5).

У той же час помітні відмінності спостерігалися між величинами площі перерізу ядер нейронів СХЯ (Sя). Так, усереднені для всієї групи в цілому (без урахування періоду доби) у тварин, котрих утримували у змінених умовах освітлення, показники вірогідно менші, ніж відповідні значення в контрольній групі (у групі стресованих світлом тварин на 23,3, а в групі щурів, які перебували при постійній темряві - на 13,2 %; р<0,05 в обох випадках). Різна й добова динаміка варіацій площі перерізу ядер нейронів СХЯ. У контрольній групі ця площа вночі в середньому на 19,1 % більша, ніж вдень. Водночас у групі, яка зазнала світлової депривації зміни протилежні - середнє значення даної площі вночі на 13,2 % менше, ніж вдень. Крім того, проведений кореляційний аналіз встановив о 02.00 год тісний обернений зв'язок між площами ядра нейрона і матеріалу, імунореактивного відносно c-Fos (r=-0,78).

У групі, якій моделювали епіфізарну гіпофункцію (тварини, котрі знаходилися в умовах постійного освітлення) середні значення площі перерізу ядер СХЯ вночі і вдень майже однакові. При попарному порівнянні відповідних величин, виміряних у різних групах вдень, середня площа перерізу ядра в стресованих світлом особин вірогідно менша, ніж в інтактній, а в тварин з епіфізарною гіперфункцією - майже ідентична тій, що спостерігалася в умовах норми. Що ж стосується значень даного параметра в зразках, відібраних вночі, то і в групі, на яку діяли світловим подразником і в групі, яких утримували в постійній темряві ці величини вірогідно менші (на 31,3 і 25,7 % відповідно), ніж в інтактній групі.

Отже, середні значення площ перерізу ядер нейронів СХЯ в різних експериментальних групах і підгрупах помітно різнилися. Тому можна було б вважати, що коректнішим показником, який характеризує кількість імунореактивного до c-Fos матеріалу, є не абсолютні, а відносні значення площ імунопозитивних ділянок перерізу ядер, нормовані щодо повних площ цих органел. Згідно з розрахунками даних показників, у групі контролю такі нормовані площі складали дещо менше половини загальних площ перерізу ядер і дуже подібні (приблизно 47,5 % вдень і 44,5 % вночі; різниця невірогідна). В умовах постійного освітлення ці значення більші, ніж в інтактній групі. Вдень цей показник у середньому по підгрупі сягав 60,8 %, а вночі - 55,3 %, тобто тенденція перевищення відносної площі c-Fos-імунореактивного матеріалу вдень зберігалася. Обидва згадані показники в групі з епіфізарною гіпофункцією вірогідно вищі при попарному порівнянні з аналогічними величинами в інтактній групі (р<0,05). Інша картина спостерігалась у тварин, котрі перебували в умовах постійної темряви. Вдень нормована площа імунореактивного матеріалу (48,8 %) у тварин цієї групи дуже близька до відповідного значення в групі щурів, яких утримували при стандартному фотоперіоді, але у тварин, в яких зразки відбирали вночі, даний показник сягав у середньому 65,6 %. Останнє значення високовірогідно перевищувало відповідний показник у згаданій групі вдень та аналогічні значення для нічного періоду в інтактній і групі щурів, яким моделювали знижену функцію ШЗ (р<0,05) (табл. 5).

Зміни характеристик світлового режиму істотно впливали на показники інтенсивності флуоресценції, які віддзеркалюють концентрацію білка c-Fos в ядрах нейронів СХЯ. Індекс концентрації c-Fos (Ki)• в умовах постійного освітлення вдень менший у середньому на 12,8 %, а вночі, навпаки, більший на 19,0 % порівняно з аналогічними величинами в групі контролю. Проте найбільші зрушення в концентрації білка c-Fos спостерігали у зразках, взятих вдень у тварин, утримуваних в умовах постійної темряви. Відповідний індекс концентрації сягав у цій підгрупі в середньому 0,603 ± 0,11 ум.од., тобто у два рази більший (241 %), ніж аналогічне значення в групі контролю (р<0,001). Деяке перевищення індексу концентрації білка c-Fos в ядрах нейронів СХЯ порівняно з інтактними значеннями відмічали у групі з моделюванням епіфізарної гіперфункції і вночі: воно невелике (на 6,9 %), але вірогідне (р<0,05). В інтактних тварин і тих, котрих утримували в умовах постійної темряви, індекс концентрації білка c-Fos, виміряний вдень, вірогідно вищий (р<0,05), ніж аналогічне значення вночі - в інтактній групі остання величина становила в середньому 69,6 % денного значення. При постійній темряві середній індекс концентрації c-Fos, визначений вдень, перевищував нічне значення в цій самій групі більш, ніж втричі. У той же час у тварин, які знаходилися в умовах постійного освітлення, денні та нічні значення індексу концентрації c-Fos майже не відрізнялись одне від одного (табл. 5).

Таблиця 5 cFos -імунопозитивні нейрони в супрахіазматичному ядрі гіпоталамуса щурів ()

Виявлені зрушення значною мірою зумовлювали групову специфіку та добову динаміку такого інтегрального показника, як індекс вмісту білка c-Fos в ядрах нейронів СХЯ (Cі).

В інтактній групі цей індекс вночі вірогідно менший (на 20,6 %, р<0,05), ніж вдень. У щурів, котрі знаходилися в умовах постійного освітлення, значення індексу вмісту c-Fos досить близькі до таких в інтактній групі. Подібною виявилась і добова динаміка даного показника, проте різниця між денним і нічним рівнями в групі стресованих світлом тварин не вірогідна.

Зрозуміло, що підвищення концентрації білка c-Fos в ядрах нейронів СХЯ вдень у щурів, утримуваних в умовах постійної темряви, зумовлювало високі значення й індексу сумарного вмісту цього білка (246 % порівняно з відповідним значенням в інтактній групі). Вночі цей індекс у тварин згаданої групи істотно зменшувався, і його значення ставали досить близькими до аналогічних величин у двох інших групах (інтактних тварин та щурів, яким створювали світловий стрес).

Спираючись на результати описаних вище вимірювань і розрахунків ми намагалися охарактеризувати інтегральну щільність імунореактивного матеріалу щодо c-Fos у тканині СХЯ в цілому. Для цього розраховували щільність локалізації c-Fos-імунопозитивних нейронів у досліджених перерізах зазначеного ядра. Даний параметр у різних групах і підгрупах варіював у межах 453-574 нейрони на 1 мм 2 площі перерізу. Щільність розташування c-Fos-позитивних нейронів не виявила певних чітких міжгрупових відмінностей та залежності від того, коли відбирався експериментальний матеріал - вдень або вночі. Слід все таки відмітити, що в інтактних щурів дещо більші значення щільності локалізації c-Fos-позитивних нейронів у СХЯ спостерігалися вночі, а в групі тварин, які зазнали світлової депривації добова динаміка даного показника зворотна - щільність більша вдень. При утримуванні особин за гіперілюмінізованих умов середні значення щільності нейронів з c-Fos-позитивними ядрами, виміряні вдень і вночі, практично однакові. Невірогідність міжгрупових різниць середніх значень щільності розташування c-Fos-позитивних нейронів могла бути значною мірою зумовлена досить великою дисперсією цього параметра при його визначенні у випадково вибраних зонах зрізів СХЯ (табл. 5).

Оскільки міжгрупові та "добові" відмінності таких параметрів, як площа імунореактивного щодо c-Fos матеріалу в ядрах нейронів СХЯ та щільність локалізації клітин, імунопозитивних щодо вказаного протеїну, відносно помірні, ймовірно, що визначальний вплив на індекс інтегральної щільності c-Fos у тканині СХЯ справляли зміни концентрації даного білка та похідного параметра - індексу вмісту c-Fos в ядрах нейронів. Значення індексу інтегральної щільності c-Fos у тварин інтактної та стресованої світлом груп досить близькі і не виявляли вірогідних розбіжностей. Варто відзначити тенденцію до зменшення значень цього параметра в групі тварин, котрі знаходилися при постійному освітленні. При цьому індекс сумарної щільності білка c-Fos у щурів, яких утримували в умовах світлової депривації, вдень майже втричі вищий (297 %), ніж аналогічне значення в інтактній групі. Вночі згаданий індекс у групі тварин з епіфізарною гіперфункцією повертався до значень, близьких до тих, котрі спостерігались у двох інших групах (табл. 5).

При проведенні експериментальної терапії мелатоніном у стресованих світлом тварин, в яких зразки відбирали вночі, концентрація білка с-Fos у структурах вірогідно вища стосовно щурів, яким уводили гормон за стандартного фотоперіоду та інтактних особин, однак у добовому аспекті слід відмітити істотне зниження параметра о 02.00 год. Застосування епіталону на фоні постійного освітлення не викликало таких виражених змін, які проявлялися після їх корекції мелатоніном. Зокрема, вдень концентрація протеїну перебувала на рівні 0,212 ± 0,0022 Оіф, а вночі - 0,174 ± 0,0020 Оіф. У цій серії дослідження нами не виявлено і вірогідних відмінностей відносно інтактної групи щурів.

Медіальні дрібноклітинні субядра ПВЯ гіпоталамуса. Як і в СХЯ, так і в медіальних дрібноклітинних субядрах ПВЯ гіпоталамуса щурів динаміка експресії продукту активності гена "надранньої відповіді" c-fos - білка c-Fos - має чітку циркадіанну ритмічність. Отримані результати дозволяють припустити, що визначальними чинниками, які вплинули на індекс інтегральної щільності c-Fos у тканині мдПВЯ гіпоталамуса щурів були зміни концентрації даного білка та індексу вмісту c-Fos в субядрах нейронів. Показники індексу інтегральної щільності c-Fos за фізіологічної, гіпер- та гіпофункції епіфіза мозку о 02.00 год вірогідно нижчі, ніж о 14.00 год, а саме в інтактних тварин - на 26,3 %, при світловій стимуляції - на 47,0 %, в мовах постійної темряви на 62,8 %.

Тижневі внутрішньоочеревинні ін'єкції щурам мелатоніну (0,5 мг/кг маси тіла тварини) за стандартного фотоперіоду сприяли нічному зростанню площі матеріалу, імунореактивного до c-Fos на 14,8 % стосовно інтактних тварин, істотно не змінюючи при цьому денних значень.

На фоні постійного освітлення мелатонін сприяв наближенню до норми концентрації білка с-Fos у субядрах мдПВЯ гіпоталамуса в нічний проміжок. Удень спостерігали різкий підйом показника до 0,519±0,0089 Оіф. Такої різниці у добовому аспекті не реєстрували при застосуванні епіталону (0,5 мкг/кг маси тіла тварини), коли концентрація білка о 14.00 год вірогідно нижча (на 10,0 %), а о 02.00 год вища (на 10,6 %) щодо такої в тварин, яких піддали дії світлового стресора і корекцію не проводили.

Латеральні великоклітинні субядра ПВЯ гіпоталамуса. Враховуючи отримані результати добової експресії гена ранньої функціональної активності c-fos у латеральних великоклітинних субядрах ПВЯ гіпоталамуса, відмітимо її вірогідне зростання у денні години. В особин, які перебували в умовах світлового стресу, денний показник індексу вмісту c-Fos на 33,0 % нижчий, а в нічний - наближався до контрольних величин за збереженої добової динаміки.

Виражене підвищення концентрації білка c-Fos в субядрах нейронів лвПВЯ о 14.00 год у щурів в умовах постійної темряви відповідно спричинило високі значення й індексу сумарного вмісту цього білка. О 02.00 год вказаний індекс в особин суттєво зменшувався, наближаючись до аналогічних значень інтактних щурів і тварин, яким моделювали гіпофункцію епіфіза мозку.

Ін'єкції мелатоніну (0,5 мг/кг маси) стресованим світлом тваринам віддзеркалилися на добовій динаміці індексу вмісту білка с-Fos у субядрах лвПВЯ, здебільшого в умовах гіпофункції ШЗ. У цьому випадку о 14.00 год показник майже вдвічі перевищував дані експерименту на стресованих тваринах без уведення гормону, наближаючи його до норми. Крім того, він вірогідно вищий і порівняно з таким у зрізах, узятих о 02.00 год. При застосуванні тетрапептиду епіталону (0,5 мкг/кг маси) спостерігали зростання досліджуваного індексу вдень відносно особин з епіфізарною гіпофункцією без проведення експериментальної терапії епіталоном. Уночі такого впливу на індекс вмісту білка у субядрах лвПВЯ не зафіксовано.

Таблиця 6 cFos-імунопозитивні нейрони у мдПВЯ гпоталамуса щурів ()

Таблиця 7 cFos-імунопозитивні нейрони у лвПВЯ гіпоталамуса щурів ()

Висновки

У дисертаційній роботі на основі експериментального дослідження розкрито нові, невідомі раніше, закономірності хроноритмічної організації компонентів фотоперіодичної системи залежно від функціональної активності шишкоподібної залози, що є необхідним для пізнання центральних механізмів циркадіанних ритмів головного мозку ссавців. Обґрунтовано концепцію фотозалежної хроноорганізації циркадіанних ритмів, згідно з якою порушення тривалості фотоперіоду викликає дисбаланс синтезу мелатоніну, що є ключовою ланкою дезорганізації механізмів добової періодичності в щурів.

1. Встановлено, що загальні добові закономірності ритмічних перебудов морфологічної та ультрамікроскопічної структури вентролатерального відділу супрахіазматичних ядер переднього гіпоталамуса, шишкоподібної залози, гіпокампа, наднирникових залоз полягають у адаптивних змінах до тривалості циклу світло-темрява. Головні процеси хрононейроендокринної інтеграції у формуванні циркадіанних ритмів у щурів спрямовані на збереження співвідношення регуляторних гормонпродукувальних клітин та морфофізіологічних ознак з боку ефекторних клітинних ланок.

2. Експериментальне моделювання гіпопінеалізму (тривале освітлення) та гіперпінеалізму (постійна темрява) призвело до порушення досліджуваних компонентів циркадіанного блоку на світлооптичному та електронномікроскопічному рівнях. Це віддзеркалилося істотним кількісним перерозподілом типів нейросекреторних клітин у структурах головного мозку (зменшення вмісту активних і зникнення нейроцитів у фазі накопичення, поява інтенсивно світлих і функціонально виснажених, збільшення числа пікноморфних клітин), що свідчить про порушення фазного характеру нейросекреції. Десинхроноз архітектоніки досліджуваних утворень більш виражений в умовах гіпофункції шишкоподібної залози, ніж при її гіперфункції, що вказує на інтегральний вплив нейроендокринного трансдуктора в пейсмекерній системі організму щурів.

3. Дано оцінку щільності рецепторів мелатоніну 1А у пейсмекерних нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса, яка тісно корелює з концентрацією мелатоніну в плазмі крові щурів, досягаючи максимуму о 02.00 год. За умов пригнічення активності шишкоподібної залози максимальна кількість мелатонінових рецепторів у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса зміщується з 02.00 год на 14.00 год і становить 0,35 0,012 відносних одиниць оптичної щільності (в.од.опт. щільності), а при активації мелатонінутворювальної функції залози - найбільший показник відзначається о 20.00 год, складаючи 0,43 0,015 в.о.опт. щільності.

4. Доведено, що гіперфункція шишкоподібної залози супроводжується стабільно високою імуногістохімічною щільністю мелатонінових рецепторів (0,37 0,010 в.о.опт.щільності) у нейронах гіпокампа в нічний період, а в денний період вона вірогідно знижується (0,29 0,009 в.о.опт.щільності). При епіфізарній гіпофункції кількість позитивно забарвлених на мелатонінові рецептори нейронів гіпокампа вірогідно менша щодо контролю в усі періоди спостереження. Найвищих значень вона сягала о 14.00 год, коли показник перебував у межах 0,29 0,008 в.о. опт. щільності, вірогідно відрізняючись від такої о 02.00 год - 0,25 0,007 в.о.опт.щільності. При зруйнуванні супрахіазматичних ядер відбувається десинхронізація циркадіанних ритмів щільності мелатонінових рецепторів нейронів гіпокампа з припиненням добових коливань у середніх тенденціях, а також з підсиленням варіації індивідуальної реакції тварин на зруйнування основного координатора добових ритмів.

5. Встановлено виражене порушення добового ритму морфометричних показників пейсмекерних нейронів супрахіазматичних ядер гіпоталамуса при гіпофункції шишкоподібної залози о 02.00 год. Так, площа перерізу нейрона становила 31,04±0,319 мкм 2 і була меншою за аналогічну в інтактних тварин і щурів з гіперфункцією шишкоподібної залози. Вказані зміни супроводжувалися зменшенням площі перерізу ядра до 20,54 ± 0,255 мкм 2 (r=0,78) та цитоплазми - до 10,51 ± 0,189 мкм 2 (r=0,84). Ядерно-цитоплазматичне співвідношення сягало 1,95±0,024 і перевищувало таке в інтактних тварин на 14,04±1,017% внаслідок зростання питомого об'єму ядра, який складав 66,17±0,821% та зменшення питомого об'єму цитоплазми нейрона.

6. Доведено, що в основі змін морфометричних показників пейсмекерних нейронів супрахіазматичних ядер гіпоталамуса при гіпофункції шишкоподібної залози лежить виснаження їх функціональної активності, що підтверджується значним гальмуванням біосинтетичних процесів. Зокрема, о 14.00 год концентрація РНК в ядрі перебувала в межах 0,276 ± 0,0045 од.опт.щільності, в ядерці - 0,382 ± 0,0062 од.опт.щільності, в цитоплазмі - 0,147 ± 0,0024 од.опт.щільності і вірогідно нижча щодо аналогічних показників інтактних тварин.

7. Аналіз площ перерізів компонентів нейронів, концентрації в них РНК, ядерно-цитоплазматичного співвідношення, питомих об'ємів ядер і цитоплазми медіальних дрібноклітинних та латеральних великоклітинних субядер паравентрикулярних ядер гіпоталамуса в циркадіанному аспекті показав інверсію (зростання величин у нічні години замість звичайного їх зниження в цей добовий період) циркадіанної ритміки при гіперпінеалізмі та широкий діапазон пластичності структур при гіпопінеалізмі.

8. Виявлено, що експресія продукту активності гена "надранньої відповіді" c-fos - білка c-Fos - у пейсмекерних нейронах супрахіазматичних і кортикотропін-рилізинг-гормонпродукувальних та вазопресин-сиинтезувальних субядрах паравентрикулярного ядра гіпоталамуса щурів, утримуваних в умовах нормальної фотоперіодики (12 год світло / 12 год темрява), зазнає чітких циркадіанних коливань з максимальним значенням індексу концентрації білка c-Fos 0,250 ± 0,0095 од. імунофлуоресценції о 14.00 год. Експериментально обґрунтовано, що індикатором раннього десинхронозу механізмів циркадіанних ритмів у щурів є порушення експресії гена с-fos і детермінованого ним імуноспецифічного білка с-Fos у нейронах досліджуваних ядер переднього гіпоталамуса при зміні фотоперіоду.

9. Встановлено тісні кореляційні зв'язки між морфофункціональними перебудовами досліджуваних параметрів супрахіазматичних ядер переднього гіпоталамуса та нонапептидергічних нейросекреторних популяцій субядер паравентрикулярних ядер переднього гіпоталамуса на фоні зміненої тривалості циклу світло-темрява в різні періоди доби.

10. Показано доцільність застосування синтетичного біорегулятора - епіталону (у дозі 0,5 мкг/кг), який підвищує резистентність ультраструктур компонентів циркадіанної системи до світлового стресора та істотно покращує показники площі перерізів компонентів нейронів СХЯ, а мелатонін (у дозі 0,5 мг/кг) - концентрацію в них РНК. Мелатонін не корегує стрес-індукованого порушення ритму активності нейронів СХЯ, а застосування епіталону нормалізує зазначений ритм.

Практичні рекомендації

Встановлені в роботі стрес-протективні властивості синтетичного тетрапептиду епіталону визначають доцільність подальшого всебічного дослідження біорегулятора з метою корекції змін, викликаних різноманітними стресорами.

При призначенні медикаментозної терапії доцільно враховувати добову залежність мелатонінутворювальної функції шишкоподібної залози.

Дисбаланс вмісту мелатоніну в організмі може бути використаний як патогенетичний критерій у розвитку органної та системної патології внутрішніх органів.

Особам, робота яких пов'язана з вахтовим режимом, при широтних перельотах, для попередження десинхронозу фізіологічних функцій рекомендується проводити періодичний контроль за показниками концентрації мелатоніну.

Враховуючи високу ефективність застосування мелатоніну як протекторного засобу в попередженні ендокринних, неврологічних, вікових, онкологічних розладів, тощо рекомендується провести подальші клінічні випробовування препарату.

Список опублікованих наукових праць за темою дисертації

1. Пішак В.П. Центральні механізми циркадіанних ритмів у ссавців / В.П. Пішак, Р. Є. Булик. - Чернівці : Медуніверситет, 2009. - 320 с. (Докторант написав 2-5 розділи монографії).

2. Булик Р. Є. Активність гена "надранньої відповіді" c-fos у субядрах паравентрикулярного ядра гіпоталамуса за зміненої тривалості циклу світло-темрява / Р. Є. Булик // Клін. та експерим. патол. - 2009. - Т. 8, № 1. - С. 9--15.

3. Булик Р. Є. Корекція стрес-індукованих змін активності гена "надранньої відповіді" c-fos у латеральних великоклітинних субядрах паравентрикулярного ядра гіпоталамуса щурів / Р. Є. Булик // Морфологія. - 2009. - Т. 3, № 1. - С. 32--37.

4. Булик Р. Є. Вплив зруйнування супрахіазматичних ядер гіпоталамуса на циркадіанну щільність рецепторів мелатоніну 1А у нейронах гіпокампа щурів / Р. Є. Булик // Патологія. - 2008. - Т. 5, № 1. - С. 54--57.

5. Булик Р. Є. Щільність мелатонінових рецепторів 1а типу в нейронах гіпокампа білих щурів впродовж доби: імуногістохімічний аналіз / Р. Є. Булик // Вісник морфології. - 2008. - Т.14, №1 - С. 69--71.

6. Булик Р. Є. Вплив епіталону на субмікроскопічні зміни пінеалоцитів при тривалому освітленні / Р. Є. Булик // Український морфологічний альманах. - 2008. - Т. 6, № 1. - С. 57--60.

7. Булик Р. Є. Вплив тетрапептиду епіталону на стрес-індуковані ультрамікроскопічні зміни нейронів супрахіазматичних ядер гіпоталамуса / Р. Є. Булик // Експериментальна та клінічна медицина. - 2008. - № 3. - С. 32-36.

8. Булик Р. Є. Структурна організація нейросекреторних клітин супрахіазматичних ядер гіпоталамуса під дією світлової стимуляції / Р. Є. Булик // Галицький лікарський вісник. - 2008. - Т. 15, № 2. - С. 11--13.

9. Булик Р. Є. Ультраструктура нейронів супрахіазматичних ядер гіпоталамуса за умов світлової депривації / Р. Є. Булик // Вісник наукових досліджень. - 2008. - № 1 (50). - С. 78--80.

10. Булик Р. Є. Світлооптичне дослідження нейронів гіпокампа щурів при епіфізарній дисфункції / Р. Є. Булик // Вісник проблем біології і медицини. - 2008. - Вип. 3. - С. 61--64.

11. Булик Р. Є. Динаміка порушень ультраструктури клітин мозкової речовини надниркових залоз щурів під впливом світлової депривації / Р.Є.Булик // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2008. - № 4 (44). - С. 7-10.

12. Булик Р. Є. Стрес-індуковані морфофункціональні зміни нейронів супрахіазматичних ядер гіпоталамуса щурів / Р. Є. Булик // Одеський медичний журнал. - 2008. - № 5 (109). - С. 4--6.

13. Булик Р. Є. Ультрацитоархітектоніка нейронів гіпокампа щурів за різної тривалості фотоперіоду / Р. Є. Булик // Науковий вісник Ужгородського університету, серія "Медицина". - 2008. - Вип. 34. - С. 6--9.

14. Pishak V. Effect of melatonin on the state of neurons of the suprachiasmatic nuclei of the rat hypothalamus under conditions of permanent illumination / V. Pishak, R. Bulyk // Annales UMCS, Pharmacia. - 2008. - Vol. XXI, N 1, 29. - P. 187--190. (Докторантом особисто проведені дослідження на статевозрілих щурах з моделлю експериментального гіпопінеалізму).

15. Пішак В.П. Залежність морфофункціонального стану супрахіазматичних ядер гіпоталамуса щурів від тривалості освітлення / В.П. Пішак, Р.Є.Булик // Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти - 2008. - Т. 4, № 1. - С. 44--47 (Здобувач особисто провів експериментальне дослідження, узагальнив отримані результати, підвів висновки та підготував результати до друку).

16. Пишак В.П. Сравнительная характеристика действия мелатонина и эпиталона на состояние нейронов супрахиазматических ядер гипоталамуса крыс, находящихся в условиях постоянного освещения / В.П. Пишак, Р.Е. Булык // Архив клинической и экспериментальной медицины. - 2008. - Т. 17, № 1. - С. 33--36 (Дисертант провів огляд літератури, брав участь у дослідженнях, підготував матеріали до публікації).

17. Пішак В.П. Добові зміни щільності мелатонінових рецепторів 1А у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса за умов різної функціональної активності шишкоподібної залози / В.П. Пішак, Р. Є. Булик // Фізіол. журн. --2008. - Т. 54, № 4. - С. 11--15. (Докторант особисто провів дослідження на щурах з моделлю експериментального гіпо- та гіперпінеалізму).

18. Пішак В.П. Стан гена ранньої функціональної активності c-fos у нейронах супрахіазматичних ядер гіпоталамуса щурів в умовах модифікацій фотоперіоду / В.П. Пішак, Р. Є. Булик, Д.А. Василенко // Нейрофізіологія. - 2008. - Т. 40, № 2. - С. 112-119 (Здобувач провів огляд літератури, проаналізував отримані матеріали, брав участь у підготовці їх до друку).

19. Пішак В.П. Хрономікроскопічна характеристика пінеалоцитів в умовах гіпофункції шишкоподібної залози / В.П. Пішак, Р. Є. Булик // Клін. та експерим. патол. - 2008. - Т. 7, № 2. - С. 91--94 (Автор особисто провів статистичну обробку отриманих результатів, підготував матеріали до видання).

20. Булик Р. Є. Хроногістологічна характеристика надниркових залоз щурів на тлі гіперфункції шишкоподібної залози / Р.Є.Булик, В.П. Пішак, І. С. Давиденко // Бук. мед. вісник. - 2007. - Т. 11, № 4. - С. 91--94 (Автор провів огляд літератури та аналіз отриманих результатів).

21. Пішак В.П. Залежність ультраструктури пінеалоцитів у щурів від світлового режиму / В.П. Пішак, Р. Є. Булик // Проблеми ендокринної патології. - 2008. - № 3. - С. 62--67. (Здобувач провів огляд літератури, виконав дослідження на статевозрілих щурах з моделлю експериментального гіпер- та гіпопінеалізму).

22. Булик Р. Є. Циркадіанні зміни мелатонінових рецепторів 1А у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса / Р. Є. Булик // Інтегративна антропологія. - 2007. - № 2 (10). - С. 22--24.

23. Булик Р. Є. Морфологічні зміни надниркових залоз щурів за умов тривалої експозиції постійним світлом / Р. Є. Булик // Актуальні проблеми сучасної медицини: вісник Української медичної стоматологічної академії. - 2007. - Т. 7, Вип. 4 (20). - С. 242--245.

24. Пішак В.П. Механізми участі шишкоподібної залози в забезпеченні циркадіанної ритмічності фізіологічних функцій / В.П. Пішак, Р. Є. Булик // Бук. мед. вісник. - 2006. - Т.10, № 4. - С. 5-8.

25. Булик Р. Є. Спосіб дослідження циркадіанних змін мелатонінових рецепторів 1 А у супрахіазматичних ядрах гіпоталамуса / Р. Є. Булик, В.П. Пішак, В.М. Магаляс, І. С. Давиденко / Патент № 36648, UA, МПК А 61 В 10/00, Заявка № u 200707859, Заявл. 12.07.2007. Опубл. 10.11.2008, Бюл. № 21.