Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

доктора медичних наук

Біохімічні аспекти формування тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну гомоцистеїну та цистеїну

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

біохімічний тромбофілія гомоцистеїн

Актуальність теми. Тромбози та тромбоемболії посідають одне з перших місць в структурі смертності та інвалідизації населення. За даними ВООЗ артеріальні тромбози є причиною 14 млн смертей щорічно [Бокарев И.Н., Бокарев М.И., 2002]. Венозний тромбоемболізм реєструється у 5 млн людей в світі і щорічно збільшується на 1-2 нових випадки на 1000 населення [Вавилова Т.В., 2004; Яворская В.А. та ін., 2005]. В 70% випадків підґрунтям для розвитку тромбозів, тромбоемболій та їх ускладнень є тромбофілія [Бокарев И.Н., Бокарев М.И., 2002].

З кожним роком накопичується все більше даних про те, що провідну роль у формуванні підвищеної схильності до тромбозів (тромбофілій) поряд зі спадковими дефектами рецепторів тромбоцитів та протеїнів системи гемостазу відіграють генетично-детерміновані та набуті порушення метаболізму сірковмісних амінокислот [Шевченко О.П., 2004; Козлова И.В., 2005; Вашукова Е.С. и др., 2008; Sykes T.C. et al., 2000; Keijzer M.B. et al., 2002; Frederiksen J. et al., 2004; Ivanoviс Z., 2006]. Накопичення в плазмі крові гомоцистеїну (ГЦ) - гіпергомоцистеїнемія (ГГЦ) збільшує ризик артеріальних та венозних тромбозів в 2-3 рази [Sykes T.C. et al., 2000; Ivanoviс Z., 2006]. В окремих роботах показано, що підвищення вмісту цистеїну в плазмі крові також асоціюється з розвитком патології судин та тромботичними ускладненнями [Андрушко І.І., 2007; Marcucci R. et al., 2001].

Негативна дія ГГЦ на організм реалізується через порушення процесів метилування, хімічну модифікацію протеїнів, стимуляцію оксидативного стресу, вплив на експресію генів та інші процеси [Пентюк О.О. та ін., 2003; Sharma Р. et al., 2006]. Саме тому механізми протромбогенної дії ГГЦ є надзвичайно різноманітними і здійснюються через ураження судинної стінки, активацію тромбоцитів та пошкодження окремих протеїнів системи гемостазу [Козлова И.В., 2005; Шевченко О.П., 2004; Sauls D.L. et al., 2003; Jakubowski H., 2007; Каrolczak K., Olas B., 2009]. Незважаючи на значний прогрес у розумінні шляхів формування ГГЦ-індукованої патології, цілісного погляду на патогенез тромбофілій, асоційованих з порушенням обміну cірковмісних амінокислот, нині не існує. Виявлені лише окремі мішені в системі гемостазу, на які впливають високі рівні ГЦ, однак ключова ланка, через яку реалізується протромбогений ефект ГГЦ, залишається невідомою. Не з'ясовано, чи тромбогенна дія притаманна одному лише ГЦ чи продукти його обміну також здатні впливати на систему гемостазу. Практично не приймається до уваги внесок в дестабілізацію системи гемостазу порушень у спряжених з обміном ГЦ метаболічних ланках, наприклад, в обміні вазодилятатора та антиагреганта аденозину. Характер змін в системі гемостазу за умов гіперцистеїнемії взагалі не досліджувався, тому не ідентифіковані молекулярні мішені та інтимні механізми тромбогенної дії високих рівнів цистеїну.

Нещодавно були відкриті нові, невідомі раніше аспекти обміну ГЦ та цистеїну. З'ясувалось, що ці сірковмісні амінокислоти є джерелом біологічно-активного метаболіту - гідроген сульфіду (Н₂S) [Kashiba М. et al., 2002; Lowicka E., Beltowski J., 2007; Wang R., 2010]. За даними літератури Н₂S бере участь в регуляції судинного тонусу, нейромодуляції, запаленні тощо [Zanardo R. et al., 2006; Wagner F. et al., 2009]. Гіпотетично H₂S, подібно до інших вазодилятаторів (NO, аденозину), може виявитись причетним до регуляції стану тромбоцитів та процесів тромбогенезу, однак інформації стосовно впливу цього метаболіту на систему гемостазу практично не існує. Не вивчена також регуляція утворення Н₂S в тканинах за умов ГГЦ та гіперцистеїнемії. Відсутність цих даних стримує розробку патогенетично обґрунтованих шляхів профілактики та корекції розладів в системі гемостазу при патологічних станах, які асоціюються з ГГЦ та гіперцистеїнемією.

Порушення обміну сірковмісних амінокислот є досить поширеними в Україні: підвищені рівні ГЦ (вище 15 мкМ) виявляються у 10% здорових дорослих осіб, 2% юнаків та підлітків та 43% пацієнтів з серцево-судинною патологією; гіперцистеїнемія реєструється у 10% здорових дорослих осіб та 40% пацієнтів з ішемічною хворобою серця [Пентюк О.О. та ін., 2005; Андрушко І.І., 2007; Андрушко І.І., 2008]; частота поліморфізму С677Т в гені метилентетрагідрофолатредуктази (MTHFR) - ключового ензиму фолатного циклу і детермінанти порушень обміну ГЦ - в популяції східної України сягає 40,7% [Гречанина Е.Я. и др., 2009]. Водночас вклад мутації С677Т MTHFR у формування порушень обміну цистеїну та Н₂S залишається невідомим, відсутня інформація стосовно поширеності гіперцистеїнемії у осіб з тромбофіліями, не визначені біохімічні критерії оцінки ризику тромбозів при порушеннях метаболізму сірковмісних амінокислот.

Вважаємо, що розкриття біохімічних аспектів формування тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну ГЦ та цистеїну, розробка підходів до їх корекції, встановлення біохімічних критеріїв оцінки ризику тромбозів при генетично-детермінованих та набутих порушеннях метаболізму сірковмісних амінокислот становить значний науковий інтерес і є актуальною проблемою медичної біохімії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планової НДР кафедри біологічної та загальної хімії Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова «Обмін гомоцистеїну в умовах дії нутрієнтних чинників та при різних патологічних станах» № держреєстрації 0106V005134 та фундаментальної НДР Науково-дослідного інституту реабілітації інвалідів Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова «Вивчити метаболічні, генетичні та гемокоагуляційні фактори ризику тромботичних ускладнень у пацієнтів з патологією серцево-судинної системи та розробити рекомендації по реабілітації інвалідів» № держреєстрації 0108U008139 (автор - відповідальний виконавець).

Мета дослідження. З'ясувати біохімічні механізми формування тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну гомоцистеїну та цистеїну, і на цій основі розробити підходи до корекції зазначених патологічних станів модуляторами обміну сірковмісних амінокислот, а також запропонувати метаболічні критерії оцінки ризику тромбозів.

Завдання дослідження:

Вивчити активність ензимів метилування, транссульфування, синтезу H₂S, обміну цистеїну та аденозину, тіол-дисульфідного обміну в печінці та визначити їхній зв'язок з рівнем ГЦ та цистеїну в плазмі крові за умов експериментальної ГГЦ (гострої метіонінової, гіповітамінозно-метіонінової, тіолактон ГЦ-індукованої, її поєднання з введенням L-NAME - метилового ефіру L-Nщ-нітроаргініну) та гіперцистеїнемії у щурів.

Дослідити вміст вазоактивних молекул (H₂S та NO), маркерів процесів метилування, транссульфування, нуклеотидного обміну, окисної деструкції протеїнів та ліпідів в плазмі крові і оцінити їхній зв'язок з рівнем ГЦ та цистеїну у щурів з експериментальними порушеннями обміну сірковмісних амінокислот.

Виявити найбільш чутливі до розладів метаболізму сірковмісних амінокислот ланки системи гемостазу та оцінити патогенетичну роль порушень процесів метилування, транссульфування, метаболізму цистеїну, аденозину, вазоактивних молекул (H₂S та NO) у формуванні тромбофілій в дослідах на щурах та кролях (моделі гострої та тривалої ГГЦ і гіперцистеїнемії).

Дослідити функціональний стан системи гемостазу експериментальних тварин (щурі, кролі) за умов дефіциту та надлишку H₂S в плазмі крові, індукованих введенням інгібітору цистатіонін-г-ліази - D,L-пропаргілгліцину та донору H₂S - Na₂S•9H₂O, з'ясувати вклад порушень обміну H₂S у формування тромбофілії.

Вивчити в модельних системах in vitrо вплив амінотіолів (ГЦ, цистеїну), їхніх дисульфідних і тіоефірних похідних, неорганічних метаболітів сірковмісних амінокислот на процес агрегації тромбоцитів, функціональний стан системи зсідання та протизсідання крові і на цій основі ідентифікувати молекулярні мішені, через які реалізується протромбогенний ефект ГГЦ та гіперцистеїнемії.

Експериментально обґрунтувати підходи до корекції та профілактики тромбофілій, асоційованих з ГГЦ та гіперцистеїнемією, засобами, що впливають на різні ланки метаболізму сірковмісних амінокислот (бетаїн, комплекс вітамінів В₆, В₉, В₁₂ та мікроелементів цинку, хрому, ванадію).

Вивчити поширеність ГГЦ, гіперцистеїнемії, генетичних маркерів тромбофілії (мутації в генах метилентетрагідрофолатредуктази - MTHFR C677T, фактора V G1691A - FV Leiden, протромбіну - FII G20210A) у хворих з тромбозами глибоких вен нижніх кінцівок (ТГВ) та порівняти її з такою в загальній популяції, з'ясувати внесок поліморфізму C677T в гені MTHFR у формування порушень метаболізму сірковмісних амінокислот, оцінити прогностичне значення змін рівнів сірковмісних метаболітів (ГЦ, цистеїну та Н₂S) в плазмі крові як факторів ризику тромбозів.

Об'єкт дослідження: патогенез тромбофілій, асоційованих з порушеннями метаболізму ГЦ та цистеїну.

Предмет дослідження: механізми впливу сірковмісних амінокислот, продуктів їхнього метаболізму та засобів, які нормалізують обмін ГЦ та цистеїну, на стан системи гемостазу.

Методи дослідження: біохімічні, імуноферментні, молекулярно-генетичні, гемостазіологічні, агрегатометрія, патофізіологічні, фармакологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі вивчення змін в різних ланках метаболізму сірковмісних амінокислот (метилування, транссульфування, деградація цистеїну) та пов'язаних з ним процесів (синтез H₂S, нуклеотидний та тіол-дисульфідний обмін), комплексного аналізу системи гемостазу, встановлення зв'язків між метаболічними та гемокоагуляційними розладами сформована концепція патогенезу тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну ГЦ та цистеїну, обгрунтовані підходи до їхньої діагностики та корекції.

Показано, що спільними патогенетичними ланками синдромів ГГЦ та гіперцистеїнемії є такі метаболічні розлади як гіпометилування, дефіцит вазоактивних молекул (H₂S, NO, аденозину), оксидативний стрес та дисбаланс в тіол-дисульфідному обміні, які суттєво змінюють умови для утворення та функціонування ефекторних клітин та молекул системи гемостазу. Характерними ознаками тромбофілій при порушеннях обміну ГЦ та цистеїну є гіперреактивність тромбоцитів, тромбінемія, зниження активності інгібіторів зсідання крові - антитромбіну ІІІ та протеїну С, підвищення кількості інгібітора активатора плазміногену 1 (ПАІ-1). За здатністю дестабілізувати стан системи гемостазу гіперцистеїнемія поступається ГГЦ. Маркери тромбофілії корелюють з рівнем сірковмісних метаболітів (ГЦ, цистеїну та H₂S) в плазмі крові, показниками гіпометилування та окисної модифікації протеїнів.

Вперше з'ясовано, що за ГГЦ та гіперцистеїнемії посилення агрегаційних властивостей тромбоцитів пов'язані з підвищенням їхнього середнього об'єму (MPV), зниженням порогу чутливості до ADP, зменшенням активності екто-ензимів (апірази, 5'-нуклеотидази) та підвищенням активності PGH-синтази. Порушення активності тромбоцитарних ензимів в найбільшій мірі асоціюються з тіол-дисульфідними розладами та дефіцитом H₂S, а збільшення MPV - з високим рівнем ГЦ та маркерами гіпометилування.

В дослідах in vitro показано, що ГЦ, тіолактон ГЦ та цистеїн, на відміну від гомоцистину та цистатіоніну, здатні дозозалежно посилювати процеси агрегації тромбоцитів та зсідання крові. Ключовими мішенями для дії сірковмісних модуляторів виступають початкові етапи ADP-індукованої агрегації тромбоцитів, процес активації протромбіну, тромбін, фактор Х, інгібітори зсідання крові.

Доведено, що метаболічною основою розвитку тромбофілій за ГГЦ та гіперцистеїнемії є депримуючий вплив високих рівнів ГЦ та цистеїну на активність ензимів циклу метилування (метіонінаденозилтрансферази, бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази, S-аденозилгомоцистеїнгідролази), синтезу H₂S (цистатіонін-г-ліази, тіосульфатдитіолсульфідтрансферази) та обміну нуклеотидів (апірази, 5?-нуклеотидази) і стимулюючий вплив на активність NADPH-оксидази. Спектр біохімічних порушень за ГГЦ є більш широким, ніж за гіперцистеїнемії, і включає зменшення активності ключових ензимів транссульфування (цистатіонін-в-синтази), тіол-дисульфідного обміну (тіоредоксинредуктази), катаболізму цистеїну.

Вперше в експериментальних дослідженнях in vivo та in vitro встановлена роль H₂S (метаболіту ГЦ та цистеїну) як незалежного модулятора функціонального стану системи гемостазу. Показано, що H₂S, на відміну від ГЦ та цистеїну, проявляє антитромботичні властивості: дозозалежно пригнічує індуковану агрегацію тромбоцитів, процес активації протромбіну, зменшує активність тромбіну в модельних системах in vitro. В дослідах на тваринах доведено, що за умов дефіциту H₂S, індукованого введенням пропаргілгліцину, значно посилюється чутливість тромбоцитів до ADP-стимуляції та виникають ознаки активації системи зсідання крові, в той час як введення донору H₂S (Na₂S•9H₂O) справляє антиагрегантний та антикоагулянтний ефект.

На основі дослідження здатності засобів з гіпогомоцистеїнемічною дією, а саме вітамінно-мікроелементного комплексу (ВМК) та бетаїну, коригувати зміни процесів метилування, транссульфування, синтезу H₂S, обміну цистеїну та аденозину визначено підходи до профілактики тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну сірковмісних амінокислот. Вперше показано, що ВМК не лише ефективно коригує метаболічні процеси та стримує розвиток тромбофілії за умов ГГЦ, а й запобігає розвитку гіперцистеїнемії та асоційованих з нею біохімічних та гемокоагуляційних розладів.

Досліджено вміст ГЦ, цистеїну, H₂S в плазмі крові осіб з клінічними маніфестаціями тромбофілій у вигляді ТГВ та практично здорових осіб, проаналізовано зв'язок виявлених порушень з поліморфізмом С677Т в гені MTHFR. Показано, що поширеність ГГЦ та гіперцистеїнемії серед осіб з ТГВ в 4 рази вище (38-40%), ніж в загальній популяції (10-12%), а у 30% пацієнтів ці метаболічні розлади поєднуються.

Вперше показано, що у пацієнтів з ТГВ гіперцистеїнемія, дефіцит H₂S та гіперреактивність тромбоцитів в 32-33% випадків асоціюється з гомозиготним носійством мутації MTHFR С677Т. Ризик тромбозів за умов гіперцистеїнемії зростає в 2-2,5 рази, а за її поєднання з ГГЦ - в 5-6 разів. Низький базальний рівень H₂S в плазмі крові є негативною прогностичною ознакою і свідчить про високу ймовірність тромботичних подій.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розкривають нові аспекти формування синдромів ГГЦ та гіперцистеїнемії, поглиблюють існуючі уявлення щодо патогенезу тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну сірковмісних амінокислот, висвітлюють роль гіперцистеїнемії та дефіциту H₂S як самостійних чинників гіперреактивності тромбоцитів та гіперкоагуляції. Встановлення біохімічних механізмів, через які відбувається спряження системи гемостазу з обміном сірковмісних амінокислот, визначення підходів до корекції їх порушень модуляторами процесів метилування, транссульфування та синтезу H₂S мають важливе значення для подальшої розробки та впровадження в клінічну практику засобів профілактики метаболічних тромбофілій при різних патологічних станах, асоційованих з порушеннями обміну ГЦ та цистеїну.

За результатами роботи з'ясована поширеність мутацій С677Т в гені MTHFR, G1691A в гені фактору V зсідання крові (мутація FV Leiden) та G20210А в гені протромбіну, а також частота ГГЦ та гіперцистеїнемії у осіб з клінічними маніфестаціями тромбофілій та практично здорових осіб - мешканців Вінницької області. Частота вказаних протромботичних детермінант серед мешканців Вінницької області відповідає даним щодо поширеності цих аномалій у практично здорових осіб та осіб з тромбозами в європейських країнах.

Доведена доцільність комплексної оцінки вмісту сірковмісних метаболітів - ГЦ, цистеїну та H₂S в плазмі крові для визначення ризику тромбозів, знайдена критична межа падіння базального рівня H₂S, яка вказує на високу ймовірність зазначеної патології.

Практичне значення результатів даного дослідження підтверджується 3 Патентами України на корисні моделі. Видані затверджені МОЗ України 2 методичних рекомендацій, включена до Реєстру галузевих нововведень 1 пропозиція. Результати дослідження впроваджено в роботу науково-дослідної клініко-діагностичної лабораторії Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, клініко-діагностичної лабораторії НДІ реабілітації інвалідів Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. Результати дослідження використовуються в науковій роботі та навчальному процесі кафедр біологічної та загальної хімії, патологічної фізіології, фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова; кафедр медичної біохімії та клініко-лабораторної діагностики, фармакології з клінічною фармакологією Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського; кафедр біохімії, фармакології, клінічної фармакології та фармакоекономіки Дніпропетровської державної медичної академії; кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (Київ).

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, розроблено методологію досліджень, зроблено пошук та аналіз даних літератури, сформульовано основні положення та висновки. Всі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Автором самостійно проведено моделювання порушень метаболізму cірковмісних амінокислот, біохімічні, імуноферментні, гемокоагуляційні дослідження та агрегатометрія. Оформлення наукових публікацій, патентів, впроваджень виконано автором особисто. Частина досліджень стану системи гемостазу виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (Київ) сумісно з д.б.н., пров. н.с. відділу структури та функції білка Т. М. Платоновою, д.б.н., зав. відділу хімії і біохімії ферментів Т.В. Гриненко, м.н.с. Т.М. Чернишенко. Генетичні дослідження виконані у НДІ ГІОРПФ Вищого державного навчального закладу України «Українська медична стоматологічна академія» (Полтава) під керівництвом д.мед.н., проф. І.П. Кайдашева за участі к.мед.н. О.А. Шликової. Автор висловлює глибоку вдячність колегам за допомогу в проведенні досліджень, співучасть яких у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях. Автор не запозичував ідеї та розробки співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на: науково-практичній конференції з міжнародною участю «Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії» (Чернівці, 2005), міжнародній науково-практичній конференції «Біологічне окиснення в нормі і патології» (Тернопіль, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), всеукраїнській науково-практичній конференції «Сучасні проблеми реабілітації інвалідів» (Вінниця, 2007), міжнародній науково-практичній конференції «Фундаментальна медицина - практиці охорони здоров'я» (Київ, 2008), всеукраїнській науково-практичній конференції «Актуальні проблеми реабілітації інвалідів» (Вінниця, 2009), всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії» (Тернопіль, 2009), ХІІІ Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств «100 років Українському лікарському товариству» (Львів-Київ-Чікаго, 2010), Х Українському біохімічному з'їзді (Одеса, 2010), VI Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології «Клінічна та експериментальна фармакологія метаболічних коректорів, органопротекція, доказова медицина» (Вінниця, 2010), засіданнях вченої ради НДІ реабілітації інвалідів та ВНМУ ім. М. І. Пирогова (2008-2010).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 44 наукові праці, в тому числі 26 статтей в фахових виданнях, рекомендованих ВАК України (одноосібних - 11), 12 - в збірках, матеріалах з'їздів та конференцій, 3 патенти України на корисні моделі, 1 нововведення, 2 методичних рекомендацій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 353 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 6 розділів власних досліджень, розділу, присвяченого аналізу і узагальненню одержаних результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел, що включає 448 найменувань (69 кирилицею, 379 латиницею). Робота містить 31 рисунок, 113 таблиць, 272 сторінки основної текстової частини.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на 320 білих нелінійних щурах-самцях масою 200-270 г та 15 кролях-самцях масою 3,5-3,6 кг. Всі етапи досліджень виконані згідно «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1986) та затверджені комітетом з біоетики Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (протокол № 13 від 7 жовтня 2010 р.).

Під час дослідів щурів годували напівсинтетичною крохмально-казеїновою дієтою з контрольованим вмістом всіх нутрієнтів (у тому числі вітамінів та мінеральних солей) [Пентюк О.О. та ін., 2004], яку модифікували в залежності від мети експерименту. На щурах відтворено моделі ГГЦ, гіперцистеїнемії, дефіциту та надлишку H₂S, кролі використані в короткочасному досліді. Дози, шляхи та тривалість введення речовин запозичені з літератури і не викликали загибелі тварин.

Модель гострої метіонінової ГГЦ дозволяє швидко збільшити вміст ГЦ в плазмі крові тварин в 4-5 разів на кілька годин. Щурам вводили L-метіонін (Sigma, США) 500 мг/кг маси тіла в шлунок (в/шл) і через 2 години, на пікові рівня ГЦ в плазмі крові [Пентюк О.О. та ін., 2004] тварин піддвали евтаназії після забору крові для досліджень.

Модель гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ викликає підвищення вмісту ГЦ в плазмі крові піддослідних щурів в 10-13 разів протягом 14 діб. Модель відтворювали шляхом годування тварин дієтою, що містила L-метіонін (1% до сухої маси) і була позбавлена вітамінів В₆, В₉, В₁₂ [Чехун В.Ф. та ін., 2004]. Після досягнення цільових рівнів ГЦ частину тварин переводили на основну дієту і проводили корекцію метаболічних порушень вітамінно-мікроелементним комплексом (ВМК) та бетаїном протягом 7 діб.

ВМК є сумішшю вітамінів В₆, В₉, В₁₂, координаційних сполук цинку (Zn²⁺) та хрому (Cr³⁺) з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою і амоній ванадату (V⁵⁺), яку розроблено в ДУ «Інститут фармакології та токсикології АМН України» спільно з ВНМУ ім. М.І. Пирогова. 1 г ВМК містить вітаміну В₆ - 10 мг, В₉ - 2 мг, В₁₂ - 0,2 мг, Zn²⁺ - 14 мг, Cr³⁺ - 105 мкг, V⁵⁺ - 13 мкг. ВМК вводили в/шл 71,5 мг/кг маси 1 раз на добу, що забезпечувала надходження 714 мкг вітаміну В₆, 143 мкг вітаміну В₉, 14,3 мкг вітаміну В₁₂, 1 мг іонів Zn²⁺, 7,5 мкг іонів Cr³⁺ та 0,93 мкг іонів V⁵⁺ на 1 кг маси тіла тварин.

Бетаїн (N,N,N-триметилгліцин) - донор метильних груп в реакції реметилування ГЦ до метіоніну за участі бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази. Бетаїн (Sigma, США) вводили в дозі 450 мг/кг маси в/шл 1 раз на добу.

Модель тіолактон ГЦ-індукованої ГГЦ забезпечує підвищення вмісту ГЦ в плазмі крові щурів в 2-6 разів [Stangl G.I. et al., 2007]. Тіолактон D,L-ГЦ (Sigma, США) вводили в/шл в дозі 200 мг/кг маси 14 діб (підгостра ГГЦ) або 100 мг/кг маси 28 діб (тривала ГГЦ), тривалу ГГЦ також поєднували з введенням L-NAME (Sigma, США) 30 мг/кг маси в/шл. З профілактичною метою частина тварин отримувала дієту, збагачену ВМК (781 мг/кг сухої дієти - відповідає дозі 71,5 мг/кг маси).

Модель гіперцистеїнемії у щурів створювали введенням L-цистеїну (Sigma, США) 250 мг/кг маси в/шл 28 діб [Kim Y.G., 2003], з профілактичною метою частина тварин отримувала дієту, збагачену ВМК (781 мг/кг сухої дієти).

Дефіцит та надлишок H₂S в плазмі крові у щурів викликали введенням відповідно інгібітору цистатіонін-г-ліази D,L-пропаргілгліцину (Sigma, США) 50 мг/кг та донору H₂S - Na₂S ^. 9H₂O (Sigma, США) 3,36 мг/кг маси внутрішньоочеревинно 1 раз на добу протягом 7 діб [Zhu Y. Z. et al., 2007].

У кролів досліджено процеси агрегації тромбоцитів та зсідання крові до та через 60 хв після в/в введення тіолактону D,L-ГЦ (100 мг/кг), L-цистеїну (200 мг/кг) та донору H₂S - Na₂S ^. 9H₂O (3 мг/кг).

Гемостазіологічні та біохімічні дослідження. Кров у щурів отримували з серця, у кролів - з крайової вени вуха в пробірки Vacuette (Greiner Bio-One, Австрія): з 3,8% розчином цитрату натрію (9:1), К₂ЕДТА, без антикоагулянтів. Плазму та сироватку крові виділяли відомими методами [Меньшиков В.В., 1987]. Плазму збагачену тромбоцитами (ПЗТ) отримували центрифугуванням цитратної крові при 300 g 5 хв при 18-22^оС. Тромбоцити виділяли з ПЗТ центрифугуванням при 1500 g 20 хв при 18-22^оС, осад тричі відмивали 0,05 М Тріс-HCl буфером (pH 7,4) з 0,13 М NaCl [Карбовський В.Л. та ін., 2007], ресуспендували в 1,0 мл цього ж буферу і використовували для досліджень.

Агрегацію тромбоцитів досліджували в ПЗТ на агрегометрі АР2110 (Солар, Білорусь). В якості індукторів застосовували ADP, адреналін, колаген (Технологія-Стандарт, Росія). Середній об'єм тромбоцитів (MPV, фл) та інші параметри визначали на гемоаналізаторі Erma PCE-210 (Японія).

Активований частковий тромбопластиновий час (AЧTЧ), протромбіновий час (ПЧ), тромбіновий час (ТЧ) визначали за наборами «Техпластин-тест», «АПТВ-ЕІ-тест», «Тромботест» (Технологія-Стандарт, Росія), вміст фібриногену - спектрофотометричним методом [Беліцер В.О. та ін., 1997], вміст розчинних фібрин-мономерних комплексів (РФМК) - з використанням фосфатних буферів [Платонова Т.М. и др., 2000]. Активність фактора Ха в плазмі крові визначали за швидкістю гідролізу хромогенного субстрату S2765 (Chromogenix, Швеція); антитромбіну ІІІ - за залишковою активністю тромбіну в присутності гепарину за набором «ХромоТех-Антитромбин» (Технологія-Стандарт, Росія); протеїну С - за набором «Реахром-Протеин С» (РЕНАМ, Росія). Час лізису еуглобулінів визначали як описано [Меньшиков В.В., 1987], вміст ПАІ-1 в плазмі крові - методом ІФА за набором «Zymutest Rat - PAI-1 (Antigen)», Франція.

Активність ензимів обміну сірковмісних амінокислот досліджували в постядерному супернатанті гомогенатів печінки щурів. Активність H₂S-утворюючих ензимів - цистатіонін-в-синтази (КФ 4.2.1.22) в реакції конденсації ГЦ з цистеїном, цистатіонін-г-ліази (КФ 4.4.1.1) в реакції десульфурування цистеїну, цистеїнамінотрансферази (КФ 2.6.1.3) в реакції переамінування цистеїну до 3-меркаптопірувату, тіосульфатдитіолсульфідтрансферази (КФ 2.8.1.5) в реакції відновлення тіосульфат-аніону - визначали за утворенням сульфід-аніону [Пат. України № 45018]. Активність цистатіонін-в-синтази в реакції конденсації ГЦ з серином оцінювали за утворенням цистатіоніну [Goldstein J.L. et al., 1972], цистатіоназну активність цистатіонін-г-ліази - за утворенням цистеїну з цистатіоніну [Heinonen K., 1973], S-аденозилгомоцистеїнгідролази (КФ 3.3.1.1) - за вивільненням ГЦ з S-аденозилгомоцистеїну [Isa Y. et al., 2006], сульфітоксидази (КФ 1.8.3.1) - за швидкістю окиснення сульфіт-аніону [Cohen H. J. et al., 1971], цистеїндіоксигенази (КФ 1.13.11.20) - за швидкістю споживання цистеїну, г-глутамілцистеїнсинтетази (КФ 6.3.2.2), бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази (КФ 2.1.1.5), метіонінаденозилтрансферази (КФ 2.5.1.6) - як описано [Ericson L. E., 1960; Chiang P. K. et al., 1977; Orlowski M. et al., 1971], NADPH-оксидази (КФ 1.6.3.1) - по падінню поглинання NADPH при 340 нм [Fukui T. et al., 1997], тіоредоксиндисульфідредуктази (КФ 1.8.1.9) - за швидкістю NADPH-залежного відновлення 5,5?-дітіобіс(2-нітробензоату) [Jung H. I. et al., 2004].

Активність ензимів нуклеотидного обміну досліджували в постядерному супернатанті гомогенатів печінки, сироватці крові, суспензії відмитих тромбоцитів щурів. Активність 5ґ-нуклеотидази (КФ 3.1.3.5) та NTPDase (КФ 3.6.1.5, апірази) визначали за кількістю неорганічного фосфату, який утворився при гідролізі АМP чи ADP [Рыбальченко В. К., Коганов М. М., 1988; Frassetto S. et al., 2000]. Активність аденозиндезамінази (КФ 3.5.4.4) оцінювали за кількістю аміаку, що утворився при дезамінуванні аденозину [Орехович В.Н., 1968]. Активність PGH-синтази (КФ 1.14.99.1) визначали в мікросомній фракції тромбоцитів за накопиченням окисненої форми адреналіну [Мевх А.Т. и др., 1982]. Вміст протеїну визначали за методом Лоурі [Lowry O. H., 1951].

Рівень загального ГЦ в плазмі крові визначали методом ІФА за набором «Homocysteine EIA» (Axis-Shield, Англія), загального цистеїну - за реакцією з нінгідрином після відновлення дисульфідів дітіотреітолом, а вміст непротеїнового цистеїну - після осадження протеїнів ацетонітрилом [Gaitonde M.K., 1967], вміст H₂S - за реакцією з пара-фенілендіаміном [Пат. України №52136], вміст нітритів та нітратів - за реакцією з реактивом Грісса після відновлення нітратів зависсю цинкового порошку в розчині аміаку [Коренман И.М., 1975]. Рівень SH-груп протеїнів визначали за реакцією з 5,5'-дітіобіс(2-нітробензоатом) [Веревкина И.В. и др., 1977], карбонільних груп - за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином [Заічко Н.В., 2003], малонового діальдегіду (МДА) - за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972]. Фракції фосфоліпідів в плазмі крові визначали методом тонкошарової хроматографії на силікагелі Л5/40 [Кейтс М., 1975]. Забезпеченість вітаміном В₆ оцінювали за ПАЛФ-ефектом [Глинка Е.Ю. и др., 1989] та екскрецією 4-піридоксилової кислоти [Спиричев В.Б., 1984], вітаміном В₁₂ - за екскрецією метилмалонової кислоти [Черноброва О.І. та ін., 2007]. Вміст фолієвої кислоти в плазмі крові визначали мікробіологічним методом за допомогою фолатдефіцитного штаму Lactobacillus casei АТСС 7469 [Островский Ю.М., 1979].

Дослідження впливу сірковмісних метаболітів на агрегацію тромбоцитів та процес зсідання крові in vitro. Використані D,L-ГЦ, L-цистеїн, L-цистатіонін, Na₂S ^. 9H₂O (Sigma, США), тіолактон D,L-ГЦ, L-гомоцистин (Fluka, Німеччина), Na₂SO₃, Na₂S₂O₃ ^. 5H₂O, Na₂SO₄. Сірковмісні сполуки додавали до аліквот ПЗТ та бідної тромбоцитами цитратної плазми практично здорових осіб в кінцевих концентраціях 10, 100, 1000 мкМ у вигляді водних розчинів. В ПЗТ реєстрували спонтанну та індуковану агрегацію тромбоцитів. Індуктори: ADP 0,625, 2,5 мкМ, адреналін 2,5 мкМ, колаген 2 мкг/мл. Вплив сірковмісних сполук на процес активації протромбіну, індукованої тромбопластином, оцінювали за амідолітичною активністю утвореного тромбіну по відношенню до хромогенного субстрату S2238 (Chromogenix, Швеція), а також в коагуляційних тестах (ПЧ, АЧТЧ). Вплив сірковмісних сполук на амідолітичну активність тромбіну (Merck, Німеччина) визначали з використанням S2238; на протеїн С та фактор Х - за зміною амідолітичної активності їх активованих форм (протеїн Са, фактор Ха) по відношенню до S2366 та S2765 (Chromogenix, Швеція), на активність антитромбіну ІІІ - за залишковою активністю тромбіну в присутності гепарину.

Біохімічні та молекулярно-генетичні дослідження у осіб з тромбофіліями. Матеріалом були зразки крові 148 пацієнтів з ТГВ в анамнезі (середній вік 53±1 рік, 56,1% чоловіків) та 82 практично здорових осіб (середній вік 50±1 рік, 51,2% чоловіків). У 57 пацієнтів відмічались рецидиви тромбозів, у 66 - післятромбофлебітичний синдром. Дослідження проводилось в міжтромботичний період. Вміст ГЦ, цистеїну, H₂S в плазмі крові визначали як описано раніше. Мутації генів MTHFR С677Т, фактору V G1691A (FV Leiden) та протромбіну FІІ G20210А визначали методом полімеразно-ланцюгової реакції за набором «Genotyping kit - Venous Thrombosis» (Technoclone, Австрія). Латентну гіперреактивність тромбоцитів виявляли за зміною параметрів агрегатограми в присутності 10 мкМ ГЦ та цистеїну [Пат. України № 45019].

Статистичний аналіз проводили за допомогою пакету прикладних програм «MS Excel XP» та «Statistica SPSS 10.0 for Windows» (ліцензійний № 305147890). Оцінювали середнє значення, стандартні помилки, достовірність відмінностей. Для оцінки міжгрупової різниці застосовували t-критерій Ст'юдента, при порівнянні частоти змін - критерій F Фішера, проводили кореляційний аналіз по Пірсону. Визначали показники відносного ризику (OR) [Бабич П.Н. и др., 2005], застосовували ROC-аналіз, метод персентилів. Достовірною вважалась різниця при Р<0,05. Результати наведено як М±m.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Активність ензимів обміну сірковмісних амінокислот та асоційованих з ним процесів в печінці щурів за ГГЦ та гіперцистеїнемії. Сірковмісні амінокислоти потрібні для синтезу протеїнів, є джерелом біологічно-активних речовин (H₂S, глутатіону, таурину), забезпечують роботу циклу метилування та спряжене з ним утворення аденозину, тіол-дисульфідний обмін та редокс-регуляцію. Не виключено, що порушення цих процесів лежить в основі протромбогенної дії високих рівнів ГЦ та цистеїну, разом з тим, детальних досліджень у вказаному напрямку раніше не проводилось.

Відтворюваність моделей була підтверджена змінами вмісту сірковмісних амінокислот в плазмі крові. Так, одноразове введення L-метіоніну підвищило вміст ГЦ в плазмі крові в 4,8 рази, за гіповітамінозно-метіонінової моделі виникала важка ГГЦ, при навантаженні тіолактоном ГЦ - помірна ГГЦ, яка посилювалась при введенні L-NAME (табл. 1). Стан гіповітамінозу засвідчило зниження екскреції 4-піридоксилової кислоти (на 60%), зростання екскреції метилмалонової кислоти (в 3,6 рази) з сечею, зниження вмісту фолату в плазмі крові (на 38%). Двотижневе позбавлення дієти тварин вітамінів В₆, В₉, В₁₂ (контроль на гіповітаміноз) викликало недостовірне підвищення вмісту ГЦ в плазмі крові. 4-тижневе введення L-цистеїну спричиняло гіперцистеїнемію: вміст загального цистеїну збільшився з 125±4,77 до 170±6,76 мкМ (Р<0,01).

Таблиця 1. Вміст ГЦ в плазмі крові тварин з моделями ГГЦ (n=10-15, M±m)

Примітка. Тут і далі * - Р<0,05 відносно контролю; # - Р<0,05 відносно попередньої групи.

Результати досліджень показали (табл. 2), що гостра і тривала ГГЦ відрізняються за спрямованістю змін активності ензимів обміну ГЦ в печінці. Так, за гострої метіонінової ГГЦ підвищувалась активність ключового ензиму обміну метіоніну метіонінаденозилтрансферази (на 22-46%) та ензимів транссульфування - цистатіонін-в-синтази (в реакції конденсації ГЦ з серином) та цистатіонін-г-ліази (в реакції гідролізу цистатіоніну), що спрямовано на утилізацію надлишку метіоніну та ГЦ. В той же час активність ензимів циклу метилування - бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази та S-аденозилгомоцистеїнгідролази (в реакції гідролізу S-аденозилгомоцистеїну до ГЦ та аденозину) зменшувалась. За тривалої ГГЦ вектор розладів у вказаних ензимних системах змінювався в протилежному напрямку: за гіповітамінозно-метіонінової та тіолактон ГЦ-індукованої ГГЦ активність метіонінаденозилтрансферази та ензимів транссульфування зменшувалась (на 32-48%), а зниження активності бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази, S-аденозилгомоцистеїнгідролази та ензимів транссульфування ставало більш виразним. Між вмістом ГЦ в плазмі крові та активністю бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази, S-аденозилгомоцистеїнгідролази, цистатіонін-в-синтази та цистатіонін-г-ліази виявлялись достовірні обернені кореляційні зв'язки (r=-0,70-79).

Таблиця 2. Активність ензимів метилування та транссульфування в печінці щурів з експериментальними порушеннями обміну сірковмісних амінокислот (n=10-15, M±m)

Примітка. МАТ - метіонінаденозилтрансфераза, БГМТ - бетаїнгомоцистеїн-метилтрансфераза, S-АГЦГ - S-аденозилгомоцистеїнгідролаза, ЦБС - цистатіонін-в-синтаза, ЦГЛ - цистатіонін-г-ліаза.

В умовах гіповітамінозу спостерігалось достовірне, але менш значне, ніж за ГГЦ, зниження активності цистатіонін-в-синтази та цистатіонін-г-ліази, які є піридоксальфосфатзалежними ензимами. Інгібування синтезу NO на тлі ГГЦ поглиблювало негативні зміни в активності вказаних ензимів, що узгоджується з більш високим рівнем ГЦ в плазмі крові за цих умов.

Тривале введення цистеїну спричиняло зниження активності ензимів циклу метилування, хоча і менш виразне, ніж за ГГЦ, а також дискоординувало процеси транссульфування - активність цистатіонін-в-синтази збільшувалась, а активність цистатіонін-г-ліази зменшувалась.

Синтез H₂S в печінці забезпечують ензими транссульфування - цистатіонін-в-синтаза (в реакції конденсації ГЦ з цистеїном), цистатіонін-г-ліаза (в реакції десульфурування цистеїну), а також цистеїнамінотрансфераза (в реакції трансамінування цистеїну до 3-меркаптопірувату, з якого вивільняється H₂S) та тіосульфатдитіолсульфідтрансфераза (в реакції відновлення тіосульфат-аніону). З'ясувалось, що за гострої ГГЦ збільшувалась десульфуразна активність цистатіонін-в-синтази та цистатіонін-г-ліази (табл. 3). На противагу цьому, за гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ активність ензимів транссульфування в реакціях синтезу H₂S значно знижувалась (на 35-40%), зменшувалась і активність цистеїнамінотрансферази та тіосульфатдитіолсульфідтрансферази. Негативна динаміка активності ензимів синтезу H₂S виявлялась за тіолактон ГЦ-індукованої ГГЦ, при чому введення L-NAME її достовірно посилювало. Введення цистеїну також викликало зниження активності цистатіонін-г-ліази та тіосульфатдитіолсульфідтрансферази.

Таблиця 3. Активність ензимів синтезу H₂S в печінці щурів з експериментальними порушеннями обміну сірковмісних амінокислот (n=10-15, M±m)

Примітка. ЦБС - цистатіонін-в-синтаза, ЦГЛ - цистатіонін-г-ліаза, ЦАТ -цистеїнамінотрансфераза, ТСТ - тіосульфатдитіолсульфідтрансфераза.

Одним із пояснень зниження десульфуразної активності ензимів транссульфування може бути зниження вмісту S-аденозилметіоніну в клітинах внаслідок блокування циклу метилування. Можливість такого механізму регуляції синтезу H₂S обговорюється в літературі [Wang R., 2002; Wagner F. et al., 2009]. Зниження рівня забезпеченості вітаміном В₆ також причетно до зменшення активності цистатіонін-в-синтази, цистатіонін-г-ліази та цистеїнамінотрансферази в реакціях синтезу H₂S (r=-0,56-0,68). Однак, більш сильною негативною детермінантою активності досліджених H₂S-синтезуючих ензимів виявився високий рівень ГЦ (r=-0,72-0,89).

Гостра та тривала ГГЦ відрізнялись за змінами активності ензимів катаболізму цистеїну. За гострої ГГЦ підвищувалась (на 14,1 та 18,9%) активність ензимів цистеїнсульфінатного шляху (цистеїндіоксигенази та сульфітоксидази) і зменшувалась (на 49-50%) активність г-глутамілцистеїнсинтетази. За гіповітамінозно-метіонінової та тіолактон ГЦ-індукованої ГГЦ зменшувалась активність всіх вказаних ензимів, а виразність виявлених порушень залежала від вмісту ГЦ в плазмі крові (r=-0,65-0,74). Гіперцистеїнемія характеризувалась збільшенням (на 50-75%) активності цистеїндіоксигенази та г-глутамілцистеїнсинтетази і зменшенням активності (на 36%) сульфітоксидази. За всіх моделей ГГЦ виникав дисбаланс в нуклеотидному обміні: зменшувалась активність апірази та 5'-нуклеотидази, підвищувалась активність аденозиндезамінази. ГГЦ спричиняла значне зростання (в 2-3 рази) активності головного продуценту супероксид-аніону - NADPH-оксидази та зниження (на 20-50%) активності ключового ензиму системи тіоредоксину - тіоредоксинредуктази, що регулює тіол-дисульфідний обмін, синтез нуклеотидів, апоптоз та інші процеси [Губский Ю.И. и др., 2008; Arner E. et al., 2000]. Гіперцистеїнемія викликала аналогічні за спрямованістю, хоча і менш виразні зміни з боку активності вказаних ензимів (за винятком тіоредоксинредуктази, активатором якої вважається цистеїн). Стан гіповітамінозу не спричиняв вірогідних змін в активності зазначених ензимів.

Таким чином, спільним патерном ГГЦ та гіперцистеїнемії є пригнічення активності ензимів метилування та транссульфування, синтезу H₂S, розлади обміну цистеїну та аденозину, оксидативний стрес.

Біохімічні маркери метаболічних порушень в плазмі крові щурів за ГГЦ та гіперцистеїнемії. Масштабність порушень метаболічних процесів на рівні цілісного організму за ГГЦ та гіперцистеїнемії віддзеркалили зміни біохімічних маркерів в плазмі крові. Надлишкове введення в організм тварин метіоніну (гостра метіонінова, гіповітамінозно-метіонінова ГГЦ) асоціювалось з розвитком гіперцистеїнемії (збільшення вмісту загального цистеїну до 20-25%), в той час як за тривалого введення тіолактону ГЦ вміст цистеїну в плазмі крові знижався (рис. 1А). За ГГЦ та гіперцистеїнемії порушувались нормальні пропорції між фракціями протеїнзв'язаного та непротеїнового цистеїну.

Накопичення в плазмі крові ГЦ та цистеїну викликало зниження (на 30-40%) вмісту Н₂S (рис. 1Б). В умовах гіповітамінозу достовірних змін вмісту Н₂S ще не реєструвалось. Виразність негативної асоціації між надлишком ГЦ та цистеїну в плазмі крові та рівнем Н₂S віддзеркалили відношення ГЦ/ Н₂S та цистеїн / Н₂S. Так, в контролі відношення ГЦ/ Н₂S становило 0,08-0,09, за гострої метіонінової ГГЦ воно зростало на порядок (0,71±0,08, Р<0,0001), а за гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ сягало 3,55±0,87 (Р<0,0001). Між вмістом Н₂S та ГЦ виявлявся достовірний обернений зв'язок (r=-0,63-0,77). За гіперцистеїнемії відношення цистеїн/ Н₂S зростало вдвічі. Вірогідними причинами зниження базального рівня H₂S в плазмі крові за ГГЦ та гіперцистеїнемії може бути зниження активності H₂S-синтезуючих ензимів в печінці, а також порушення його продукції в судинному руслі. Про таку можливість свідчить співставне зниження базального рівня стабільних метаболітів NO в плазмі крові, а також достовірний зв'язок вмісту нітратів та нітритів з рівнем H₂S (r=0,63). Дефіцит H₂S може бути і наслідком посиленої деградації цієї короткоживучої молекули, яка взаємодіє з активними формами кисню та азоту [Whiteman M. et al., 2004; Mitsuhashi H. et al., 2005].

Рис. 1. Вміст цистеїну (А) та вазоактивних молекул (Б) в плазмі крові щурів за умов гострої метіонінової (1), гіповітамінозно-метіонінової (2), тіолактон ГЦ-індукованої (3) ГГЦ та гіперцистеїнемії (4) та в контролі (К).

ГГЦ та гіперцистеїнемія викликали накопичення окисно-модифікованих протеїнів та ліпідів в плазмі крові, про що свідчить зменшення (в 1,2-1,6 рази) вмісту SH-груп та збільшення вмісту карбонільних груп протеїнів (в 1,4-2,0 рази), зростання вмісту МДА та лізофосфатидилхоліну (в 1,3-1,5 рази). Реєструвались і інші порушення фосфоліпідного спектру: знижувалась частка фосфатидилхоліну, зростала частка фосфатидилетаноламіну, зменшувалось (на 33-58%) відношення фосфатидилхолін/ фосфатидилетаноламін, що є чутливим індикатором гіпометилування [Андрушко І.І., 2003; Noga A.A. et al., 2003]. За ГГЦ та гіперцистеїнемії сповільнювався (на 30-39%) гідроліз циркулюючих нуклеотидів (ADP та АМР), збільшувалась активність аденозиндезамінази.

Таким чином, ГГЦ та гіперцистеїнемія істотно порушували умови, в яких функціонують клітини та молекули системи гемостазу. Наступний етап роботи був присвячений ідентифікації ланок системи гемостазу, найбільш чутливих до розладів обміну сірковмісних амінокислот та асоційованих з ним процесів.

Стан системи гемостазу за експериментальної гіпергомоцистеїнемії та гіперцистеїнемії: зв'язок з порушеннями метаболічних процесів. Встановлено, що навіть короткочасне підвищення вмісту ГЦ (гостра метіонінова ГГЦ) в плазмі крові спричиняло активацію системи гемостазу: скорочувався ПЧ та АЧТЧ (рис. 2А), зменшувалась активність інгібіторів зсідання крові (рис. 2Б). Важка гіповітамінозно-метіонінова ГГЦ індукувала глибокий дисбаланс в системі гемостазу: скорочувались ПЧ, АЧТЧ, ТЧ (на 20-21%), виникала гіперфібриногенемія, накопичувались РФМК (маркер тромбінемії), зменшилась (на 25-30%) активність антитромбіну ІІІ та протеїну С, зростав час лізису еуглобулінів та вміст ПАІ-1.

Аналогічні за спрямованістю, хоча і менш інтенсивні зміни спостерігались за тіолактон ГЦ-індукованої ГГЦ, які поглиблювались (на 10-15%) при введенні L-NAME. Гіперцистеїнемія спричиняла більш м'які порушення: ПЧ та АЧТЧ скоротились на 9,0 та 11,9%, не спостерігалось гіперфібриногенемії, активність антитромбіну ІІІ та протеїну С зменшилась на 10,6 та 11,3%, вміст ПАІ-1 підвищився на 43,2%. Кореляційний аналіз засвідчив, що за ГГЦ та гіперцистеїнемії між показниками системи гемостазу та вмістом сірковмісних метаболітів (ГЦ, H₂S), відношеннями ГЦ/ H₂S, та цистеїн/ H₂S, маркерами окисної модифікації протеїнів, гіпометилування та рівнем фолату існують достовірні залежності (r=0,40-0,71).

Рис. 2. Динаміка показників системи зсідання (А) та протизсідання крові (Б) у щурів за умов гострої метіонінової (1), гіповітамінозно-метіонінової (2), тіолактон ГЦ-індукованої (3) ГГЦ та гіперцистеїнемії (4). Контроль (К) - 100%.

Найбільш чутливою до надлишку ГЦ та цистеїну в плазмі крові виявилась тромбоцитарна ланка. Вже за гострої ГГЦ посилювалась спонтанна агрегація тромбоцитів (на 56,0%), зростав ступінь та початкова швидкість ADP-індукованої агрегації (на 62,8 та 31,8%). За гіповітамінозно-метіонінової та тіолактон ГЦ-індукованої ГГЦ в комбінації з інгібуванням синтезу NO прояви гіперреактивності тромбоцитів були максимальним, достовірно знижувався поріг чутливості тромбоцитів до ADP (рис. 3). Так, концентрація ADP, яка викликала повну агрегацію тромбоцитів (з первинною та вторинною хвилею) в контролі становила 9,40±0,92 мкМ, у щурів з тіолактон ГЦ-індукованою ГГЦ - 5,45±0,59 мкМ, а за її поєднання з введенням L-NAME - 2,65±0,43 мкМ (Р<0,001). Максимальні відмінності в параметрах агрегації тромбоцитів в нормі та за ГГЦ виявлялись за низьких концентрацій ADP. Гіперцистеїнемія також посилювала спонтанну та ADP-індуковану агрегацію тромбоцитів.