Біохімічні аспекти формування тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну гомоцистеїну та цистеїну

Таблиця 4. Активність ензимів тромбоцитів щурів за експериментальних порушень обміну сірковмісних амінокислот (n=10-15, M±m)

Тривала ГГЦ та гіперцистеїнемія індукували зміну морфофізіологічних параметрів тромбоцитів - збільшувався середній об'єм (MPV) та з'являлись ознаки анізоцитозу. Найбільш сильно MPV зростав при введенні високих доз тіолактону ГЦ (200 мг/кг протягом 14 діб): з 7,00±0,11 фл до 8,26±0,20 фл, P<0,001. MPV достовірно корелював з рівнем ГЦ, маркерами гіпометилування та ліпопероксидації, ступенем спонтанної та ADР-індукованої агрегації (r=0,67-0,79). Існують дані, що високий MPV є фактором ризику тромбозів [Tavil Y. et al., 2007] і асоціюється зі змінами фосфоліпідного складу мембран тромбоцитів [Li D. et al., 2002] та посиленням експресії адгезивних глікопротеїнів GP IIIa [Pathansali R. et al., 2001]. Отже, ГГЦ та гіперцистеїнемія спричиняють зміну фенотипу тромбоцитів, що детермінує гіперреактивність останніх.

На моделях ГГЦ та гіперцистеїнемії було встановлено, що зниження вмісту H₂S корелює з маркерами активації системи зсідання крові. Причетність H₂S до регуляції стану системи гемостазу підтверджено в дослідах з введенням Na₂S•9H₂O (донору H₂S) та пропаргілгліцину (інгібітору цистатіонін-г-ліази). Збільшення вмісту H₂S в плазмі крові (на 24%) викликало подовження (на 31,6 та 19,5%) ПЧ і АЧТЧ, зменшення (на 20-21%) активності фактору Ха. Зниження (на 37-38%) вмісту H₂S, навпаки, супроводжувалось скороченням ПЧ, АЧТЧ, посиленням агрегації тромбоцитів. Отже, надлишок та дефіцит H₂S в плазмі крові справляють протилежний ефект на систему гемостазу. Не виключено, що підтримка певного рівня H₂S в крові є одним із чинників, що забезпечує тромборезистентність ендотелію, адже цей метаболіт утворюється в стінках судин [Siebert N. et al., 2008; Shibuya N. et al., 2009].

В дослідах на кролях було доведено, що за проагрегантною та прокоагулянтною дією гіперцистеїнемія поступається ГГЦ. Так, через 60 хв після в/в ведення тіолактону ГЦ достовірно підвищилась чутливість тромбоцитів до дії агоністів: вдвічі зростав ступінь та швидкість ADP-індукованої агрегації, скорочувалась лаг-фаза та зростав ступінь колаген-індукованої агрегації, виникали ознаки активації системи зсідання крові. Введення цистеїну помірно посилювало ADP-індуковану агрегацію тромбоцитів і практично не впливало на інші показники.

Таким чином, порушення тіол-дисульфідного обміну, дефіцит вазоактивних молекул (H₂S, NO, аденозину), гіпометилування, зміна біохімічного профілю тромбоцитів є метаболічним патерном формування тромбофілій, асоційованих з ГГЦ та гіперцистеїнемією.

Вплив сірковмісних амінокислот та їхніх метаболітів на стан системи гемостазу в дослідах in vitro. Як відомо, кількість вільного ГЦ та цистеїну в плазмі крові є значно меншою, ніж їх дисульфідних та протеїнзв'язаних форм [Пентюк О.О. та ін., 2003]. Виникає питання, в якій формі - тіоловій, дисульфідній чи тіоефірній - реалізується вплив ГЦ та цистеїну на тромбоцити та систему гемостазу. Не встановлено і вплив на систему гемостазу неорганічних сірковмісних метаболітів ГЦ та цистеїну.

Одержані результати показали, що in vitro здатність впливати на процеси агрегації тромбоцитів та зсідання крові проявляють ГЦ, тіолактон ГЦ, цистеїн та гідросульфід-аніон (HS^-), в той час як гомоцистин, цистатіонін, аніони SO₃^2-, S₂O₃^2-_, SO₄^2- її позбавлені. ГЦ, тіолактон ГЦ та цистеїн дозозалежно посилювали спонтанну агрегацію тромбоцитів та збільшували початкову швидкість та ступінь ADP-індукованої агрегації (рис. 4). Найвищий проагрегантний ефект проявлявся у тіолактону ГЦ - його дія починалась з концентрації 10 мкМ, в той час як у ГЦ - з концентрації 100 мкМ, а цистеїну - 1000 мкМ. ГЦ та тіолактон ГЦ, на відміну від цистеїну, також посилювали колаген- та адреналін-індуковану агрегацію. HS^- (100 та 1000 мкМ) достовірно зменшував початкову швидкість та ступінь ADP-індукованої агрегації (IC₃₀=955±26 мкМ), збільшував лаг-фазу та зменшував ступінь колаген-індукованої агрегації, при цьому практично не впливав на спонтанну та адреналін-індуковану агрегацію.

Оскільки ГЦ, тіолактон ГЦ, цистеїн та H₂S переважно впливають на початкові етапи ADP-індукованої агрегації, можна припустити, що ймовірною мішенню для цих метаболітів є пуринові рецептори P_2Y1 (G_q-спряжені рецептори), відповідальні за зміну форми тромбоцитів, мобілізацію кальцію, активацію фосфоліпази С та первинну агрегацію. Промотувати активаційні процеси в тромбоцитах при порушеннях обміну ГЦ та цистеїну буде і накопичення РФМК в плазмі крові: в присутності розчинного фібрину ступінь спонтанної та індукованої агрегації тромбоцитів зростає в 1,3-1,5 рази (Р<0,05).

Рис. 4. Вплив сірковмісних сполук на ADP-індуковану агрегацію тромбоцитів людини: А - дозозалежність ефекту (n=8-15, M±m), Б - посилення агрегації тромбоцитів (індуктор - 0,625 мкМ ADP) в присутності тіолактону ГЦ 1000 мкМ, В - інгібування агрегації тромбоцитів (індуктор - 2,5 мкМ ADP) в присутності НS^- 1000 мкМ (типові досліди, t=37^оС, рН 7,4, агрегометр АР 2110).

ГЦ, тіолактон ГЦ (100 та 1000 мкМ) та цистеїн (1000 мкМ) прискорювали процес активації протромбіну, індукований тромбопластином, збільшували активність фактора Ха в 1,2-2,5 рази, тромбіну - в 1,2-1,3 рази (рис. 5), зменшували активність антитромбіну ІІІ. HS^- (100 та 1000 мкМ) достовірно сповільнював процес активації протромбіну та значно зменшував амідолітичну активність тромбіну (ІС₅₀ = 65,3±3,76 мкМ). HS^- не порушував активність антитромбіну ІІІ, а в концентрації 1000 мкМ підвищував активність протеїну Са. Здатність ГЦ, тіолактону ГЦ та цистеїну прискорювати і HS^-, навпаки, сповільнювати процес зсідання крові підтвердилась і в хронометричних коагуляційних тестах (ПЧ, АЧТЧ).

Рис. 5. Швидкість гідролізу хромогенного субстрату S2238 тромбіном в присутності ГЦ (1), тіолактону ГЦ (2), цистеїну (3) при t=37^оС, рН 7,4, л=405 нм (n=3, M±m). * - Р <0,05 відносно контролю (0).

Отже, in vitro у ГЦ, тіолактону ГЦ та цистеїну превалюючим був проагрегантний та прокоагулянтний ефект, в той час, як у H₂S - антиагрегантний та антикоагулянтний. За збільшенням проагрегантного та прокоагулянтного ефекту сірковмісні амінокислоти можна розташувати так: цистеїн < ГЦ ? тіолактон ГЦ.

Корекція порушень метаболізму сірковмісних амінокислот ВМК та бетаїном як спосіб профілактики тромбофілій. Вагомість метаболічних розладів в патогенезі тромбофілій, асоційованих з ГГЦ та гіперцистеїнемією, підтвердили результати їх корекції ВМК та бетаїном. Бетаїн виступає донором метильних груп в реакції реметилування ГЦ за участі бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази, має властивості цитопротектора та антиоксиданта [Olthof M.R. et al., 2005; Ganesan В. et al., 2007]. ВМК містить в своєму складі вітаміни В₉, В₁₂, В₆, потрібні для ензимів метилування та транссульфування, а також іони Zn²⁺, Cr³⁺, V⁵⁺, що мають антиоксиданті та цитопротекторні властивості. Також іони Zn²⁺ є активаторами метіонінсинтетази та бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази.

На моделі гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ було показано, що введення бетаїну активувало цикл метилування: збільшилась активність бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази (на 50-60%), метіонінаденозилтрансферази та S-аденозилгомоцистеїнгідролази. На цьому тлі зменшився (в 4,8 рази) ступінь ГГЦ, зменшились ознаки гіпометилування та оксидативного стресу, проте значної динаміки в інших метаболічних ланках не спостерігалось. Бетаїн зменшував прояви гіперреактивності тромбоцитів, сприяв нормалізації MPV та зниженню вмісту РФМК, однак більшість порушень в системі гемостазу зберігалась і ризик тромбозів залишався високим. В той же час, введення ВМК нормалізувало рівень ГЦ та цистеїну, ліквідувало дефіцит H₂S та NO, викликало регрес інших біохімічних порушень в плазмі крові, відновило баланс в шляхах обміну сірковмісних амінокислот та аденозину, нормалізувало активність NADPH-оксидази та тіоредоксинредуктази. ВМК практично нівелював ГГЦ-індуковані зміни в системі гемостазу: нормалізувався ПЧ та АЧТЧ, зменшився (на 31-92%) вміст фібриногену, РФМК, ПАІ-1, збільшилась (на 32-43%) активність антикоагулянтів, знизився MPV (з 8,01±0,21 до 7,34±0,26 фл, Р<0,05) та зменшились прояви гіперреактивності тромбоцитів.

На моделях тіолактон ГЦ-індукованої ГГЦ, її поєдання з введенням L-NAME та гіперцистеїнемії було показано, що збагачення дієти ВМК запобігає розвитку порушень метаболізму ГЦ, цистеїну та аденозину, підвищує опірність організму до дії прооксидантів та стабілізує тіол-дисульфідний обмін, прискорює елімінацію надлишку сірковмісних амінокислот з плазми крові, запобігає змінам фенотипу тромбоцитів та розвитку порушень в інших ланках системи гемостазу (рис. 6).

Рис. 6. Вплив ВМК на показники тромбоцитів та вміст ПАІ-1 в плазмі крові щурів з тіолактон ГЦ-індукованою ГГЦ (n=10, M±m).

Отже, для ефективної корекції тромбофілій, асоційованих з ГГЦ та гіперцистеїнемією, потрібно забезпечити фізіологічну рівновагу в різних метаболічних ланках (метилування, транссульфування та синтезу H₂S, обміну цистеїну, аденозину), нівелювати диспропорцію між про- та антиоксидантними процесами. Цю здатність проявив ВМК, а дія бетаїну реалізувалась у більш вузькому діапазоні і його «антитромбофілічний» потенціал виявився меншим.

Універсальність ВМК як коректора можна пояснити тим, що вітаміни та мікроелементи в його складі потрібні не лише для обміну ГЦ, а й для широкого кола інших процесів. Так, вітамін В₆ використовується в цистеїнсульфінатному шляху, вітаміни В₉ та В₁₂ регулюють гемопоєз, синтез нуклеїнових кислот, Zn²⁺ є активатором нуклеотидаз та інших ензимів [Davis C.D. et al., 2000; Frassinetti S. et al., 2006], входить до складу протеїну S [Heeb M.J. et al., 2009].

Вміст ГЦ, цистеїну та H₂S у пацієнтів з ТГВ: зв'язок з мутацією С677Т в гені MTHFR. Поширеність порушень обміну сірковмісних амінокислот та протромботичних детермінант вивчено у 148 пацієнтів з ТГВ та 82 практично здорових осіб (мешканців Вінницької області). Встановлено, що серед пацієнтів з ТГВ накопичувались особи з генетичними аномаліями. Так, в контролі поширеність гетерозиготного варіанту мутацій FV Leiden та FІІ G20210А становила 2,4 та 1,2%, а в групі пацієнтів з ТГВ частка таких осіб зростала до 16,2 та 6,8%. За поширеністю мутації MTHFR С677Т контрольна та основна групи достовірно не відрізнялись: частка гетерозигот СТ становила 35,4 та 35,1%, гомозигот ТТ - 11,0 та 12,2%, а частота Т-алелю була 28,7 та 29,7%. На відміну від контролю, серед пацієнтів з ТГВ зареєстровано 7,4% (11 осіб) з комбінуванням мутацій, серед них у 8 осіб мутація FV Leiden поєднувалась з генотипом СТ MTHFR. Серед пацієнтів з рецидивами ТГВ поширеність протромботичних генотипів була вищою (в 2-4 рази), ніж серед пацієнтів з одним тромбозом.

Вміст ГЦ, цистеїну та H₂S вивчено у 79 осіб контрольної групи та 113 пацієнтів з ТГВ, які не були носіями мутації FV Leiden та FІІ G20210А. Ранжування рівнів ГЦ та цистеїну проведено за критеріями [Андрушко І.І., 2008; Jacobsen D.W., 1998]: рівні ГЦ < 10 мкМ розцюнювали як нормальні, 10-15 мкМ - високі нормальні, > 15 мкМ - ГГЦ (до 25 мкМ - легка, 26-50 мкМ - середня, >50 мкМ - важка); рівні загального цистеїну < 300 мкМ - нормальні, 300-350 мкМ - високі нормальні, > 350 мкМ - високі.

Встановлено, що у пацієнтів з ТГВ середні рівні ГЦ та цистеїну були на 40,1 та 17,6% вище, ніж в контролі: 13,8±0,56 та 332±3,46 мкМ проти 9,83±0,29 та 282±3,31 мкМ (Р<0,001). Це зумовлено тим, що поширеність ГГЦ та гіперцистеїнемії серед пацієнтів з ТГВ була в 4 рази більше, ніж в контролі - 38-40% проти 10-12% (рис. 7).

Рис. 7. Ранжування рівнів ГЦ (А) та цистеїну (Б) у пацієнтів з ТГВ (* - Р<0,001 відносно контролю, # - Р<0,01 відносно пацієнтів з 1 тромбозом).

На відміну від контролю серед пацієнтів з ТГВ виявлялись особи з середньою та важкою ГГЦ (13,6%), а поєднання ГГЦ з гіперцистеїнемією виявлено у 7,6% осіб контрольної групи та 30% пацієнтів з ТГВ. ГГЦ та гіперцистеїнемія вдвічі частіше виявлялись у осіб з рецидивами тромбозів, а середні рівні ГЦ та цистеїну в цій групі пацієнтів були вищими на 50,8 та 8,7% порівняно з осібами з одним ТГВ (Р<0,05).

Аналіз вмісту H₂S в плазмі крові показав, що у 80% осіб в контролі цей показник знаходиться в межах 65-94 мкМ (10-90 персентиль) і в середньому становить 81,5±1,21 мкМ, в той час як у 80% пацієнтів з ТГВ - в межах 46-79 мкМ і в середньому - 60,8±1,15 мкМ. Отже, рівень H₂S у пацієнтів з ТГВ був на 25-26% нижчим, ніж в контролі (Р<0,001), а у пацієнтів з рецидивами тромбозів - на 19-20% меншим, ніж у осіб з одним епізодом (Р<0,001). Зниження рівня H₂S в плазмі крові асоціювалось з високим рівнем ГЦ (r=-0,49, Р<0,001).

У гомозигот ТТ MTHFR середні рівні ГЦ та цистеїну були вищими на 15-20%, а вміст H₂S нижчим на 11-13% порівняно з гомозиготами СС. Це пояснюється накопиченням серед осіб з генотипом ТТ індивідів з ГГЦ та гіперцистеїнемією. Генотип ТТ асоціювався з підвищенням чутливості тромбоцитів до ADР та високою часткою осіб (33-61%) з гіперреактивністю тромбоцитів. Зазначені відмінності були більш виразними у пацієнтів з ТГВ.

Визначити прогностичну цінність маркерів порушень обміну сірковмісних амінокислот дозволили показники відносного ризику (OR). Так, гетерозиготне носійство мутації FV G1691A Leiden збільшувало ймовірність розвитку ТГВ в 6-7 разів (OR=6,85, 95% CI: 1,82-25,8), а мутації FІІ G20210А - в 4-5 разів (OR=4,51, 95% CI: 0,81-25,3). Водночас значення генотипу ТТ MTHFR як самостійного чинника тромбозів виявилось меншим (OR=1,48; 95% CI: 0,61-3,58), ніж асоційованих з ним метаболічних розладів. Зокрема, підвищення рівня ГЦ вище 15 мкМ збільшує ризик ТГВ в 3 рази (OR=3,43, 95% CI: 1,60-7,37), рівня цистеїну вище 350 мкМ - в 2 рази (OR=2,42, 95% CI: 0,81-7,26), а при поєднанні ГГЦ з гіперцистеїнемією ймовірність тромбозів зростає в 5-6 разів (OR=5,88; 95% CI: 2,26-15,2).

Виникає питання стосовно інтерпретації змін вмісту H₂S в плазмі крові. На основі ROC-аналізу з'ясовано, що оптимальна «точка відсікання», обрана за критерієм максимального балансу між чутливістю і специфічністю, відповідає рівню H₂S 60-61 мкМ (чутливість - 0,85, специфічність - 0,76). Отже, базальний рівень H₂S в плазмі крові нижчий за 60 мкМ вказує на високий ризик тромбозів, особливо на тлі ГГЦ та гіперцистеїнемії. Таким чином, в клінічних умовах підтверджено асоціацію між ГГЦ, гіперцистеїнемією, дефіцитом H₂S та схильністю до тромбозів, а також виявлено зв'язок зазначених метаболічних порушень з гомозиготним варіантом мутації С677Т гена MTHFR.

На основі даних літератури та власних досліджень запропонована схема формування тромбофілій при порушеннях обміну ГЦ та цистеїну (рис. 8).

Рис. 8. Метаболічні основи формування тромбофілій при порушеннях обміну гомоцистеїну та цистеїну (пунктир - ймовірний зв'язок, MPV - середній об'єм тромбоцитів, РФМК - розчинні фібрин-мономерні комплекси, ПАІ-1 - інгібітор активатора плазміногену 1).

ВИСНОВКИ

У дисертації теоретично узагальнено та встановлено нові біохімічні механізми формування тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну гомоцистеїну та цистеїну: з'ясовано патогенетичне значення розладів процесів метилування, транссульфування, синтезу гідроген сульфіду (H₂S), обміну цистеїну та аденозину, генетичних чинників в дестабілізації системи гемостазу та розвитку гіперреактивності тромбоцитів. На цій основі розроблено підходи до корекції вказаного виду тромбофілій модуляторами обміну сірковмісних амінокислот та запропоновано метаболічні критерії оцінки ризику тромбозів.

1. Експериментальна гіпергомоцистеїнемія (ГГЦ) супроводжується порушеннями активності ензимів метаболізму гомоцистеїну, цистеїну, H₂S та аденозину в печінці, а характер відхилень залежить від тривалості та виразності ГГЦ. За гострої ГГЦ підвищується (на 18-47%) активність метіонінаденозилтрансферази, ензимів транссульфування та синтезу H₂S (цистатіонін-в-синтази, цистатіонін-г-ліази, цистеїнамінотрансферази, тіосульфатдитіолсульфідтрансферази), ензимів цистеїнсульфінатного шляху (цистеїндіоксигенази, сульфітоксидази). За тривалої ГГЦ активність вказаних ензимів, навпаки, зменшується і при введенні L-NAME негативна динаміка посилюється. Як за гострої, так і за тривалої ГГЦ знижується (на 23-50%) активність ензимів циклу метилування (бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази, S-аденозилгомоцистеїнгідролази), тіол-дисульфідного обміну (г-глутамілцистеїнсинтетази, тіоредоксинредуктази); порушується обмін нуклеотидів (зменшується активність апірази, 5-нуклеотидази, зростає активність аденозиндезамінази); зростає (в 1,5-3 рази) активність NADPH-оксидази.

2. Тривале введення цистеїну (250 мг/кг в/шл 28 діб) викликає розвиток гіперцистеїнемії у щурів (рівень загального цистеїну збільшився з 125±4,77 до 170±6,76 мкМ), яка супроводжується зниженням (на 14-50%) активності ензимів циклу метилування (метіонінаденозилтрансферази, бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази, S-аденозилгомоцистеїнгідролази), дисбаласом процесів транссульфування, обміну H₂S, цистеїну та аденозину, зростанням (на 33%) активності NADPH-оксидази в печінці. Гіперцистеїнемія, на відміну від ГГЦ, не спричиняє зниження активності тіоредоксинредуктази та г-глутамілцистеїнсинтетази.

3. Синдроми ГГЦ та гіперцистеїнемії мають ряд спільних ознак: змінюються відношення між фракціями непротеїнового та протеїнзв'язаного цистеїну в плазмі крові; зменшується (в 1,3-1,6 рази) вміст SH-груп протеїнів; формується дефіцит (30-50%) вазодилятаторів (H₂S, NO); сповільнюється деградація екстрацелюлярних нуклеотидів ADP та AMP, прискорюється утилізація аденозину; порушуються співвідношення між фракціями фосфоліпідів (зменшується вміст фосфатидилхоліну, зростає вміст фосфатидилетаноламіну та лізофосфатидилхоліну, зменшуються відношення фосфатидилхолін / фосфатидилетаноламін та фосфатидилхолін/ лізофосфатидилхолін); зростає вміст (на 30-50%) продуктів пероксидації протеїнів та ліпідів. Ці зміни корелюють з підвищеними рівнями гомоцистеїну та цистеїну в плазмі крові (r=0,60 та більше).

4. ГГЦ та гіперцистеїнемія індукують дисбаланс в системі гемостазу, що проявляється активацією системи зсідання крові (скороченням протромбінового часу, активованого часткового тромбопластинового часу, тромбінемією, гіперфібриногенемією), зниженням активності інгібіторів зсідання крові (протеїну С, антитромбіну ІІІ), зменшенням фібринолітичного потенціалу (підвищення вмісту ПАІ-1), гіперреактивністю тромбоцитів. Метаболічний патерн формування тромбофілій, асоційованих з ГГЦ та гіперцистеїнемією, включає гіпометилування, дефіцит вазодилятаторів та антиагрегантів (H₂S, NO, аденозину), окисну модифікацію протеїнів плазми крові, порушення тіол-дисульфідного обміну, що підтверджують достовірні кореляційні зв'язки між біохімічними маркерами та показниками системи гемостазу. За протромботичним ефектом гіперцистеїнемія поступається ГГЦ як за умов тривалого досліду (щурі), так і при короткочасному підвищенні вмісту гомоцистеїну та цистеїну в плазмі крові (кролі).

5. Гіперреактивність тромбоцитів при експериментальних порушеннях обміну гомоцистеїну та цистеїну проявляється збільшенням чутливості цих клітин до стимулюючої дії ADP, посиленням здатності до спонтанної та індукованої агрегації, що асоціюється з порушеннями морфофункціональних параметрів тромбоцитів - збільшенням середнього об'єму (MPV), зниженням активності тромбоцитарних екто-ензимів (апірази, 5-нуклеотидази), підвищенням активності PGH-синтази (r=0,67-0,79). Між змінами морфофункціональних параметрів тромбоцитів з одного боку та вмістом гомоцистеїну, H₂S, маркерами гіпометилування, оксидативного стресу з іншого боку існують достовірні залежності (r=0,47- 0,77).

6. На основі дослідження змін в системі гемостазу у щурів, індукованих введенням донору H₂S - Na₂S•9H₂O (3,36 мг/кг) та інгібітору його синтезу D,L-пропаргілгліцину (50 мг/кг) протягом 7 діб, з'ясована роль дефіциту H₂S в плазмі крові як незалежного чинника формування тромбофілій. Зниження вмісту H₂S в плазмі крові (на 38%) супроводжувалось активацією системи зсідання крові, збільшенням ступеню та швидкості ADP-індукованої агрегації тромбоцитів, в той час, як збільшення вмісту H₂S (на 24%) викликало подовження часу зсідання крові в загальних коагуляційних тестах (на 20-30%) та зменшення активності фактору Ха (на 20%).

7. В модельних системах in vitro встановлено, що гомоцистеїн, тіолактон гомоцистеїну, цистеїн та H₂S дозозалежно впливають на агрегацію тромбоцитів, процеси зсідання та протизсідання крові (в концентраціях 100-1000 мкМ) на відміну від гомоцистину, цистатіоніну, сульфітів, сульфатів, тіосульфатів. Ефект сірковмісних амінокислот і H₂S є протилежним: гомоцистеїн, його тіолактон і цистеїн діють як протромбогенні чинники, а у H₂S домінує антиагрегантний та антикоагулянтний ефект. Гомоцистеїн, його тіолактон та цистеїн посилюють спонтанну і ADP-індуковану агрегацію тромбоцитів, прискорюють утворення та збільшують активність тромбіну, підвищують активність фактора Ха, зменшують активність антитромбіну ІІІ. H₂S інгібує агрегацію тромбоцитів, індуковану ADP та колагеном, і дозозалежно зменшує амідолітичну активність тромбіну по відношенню до S2238 (ІС₅₀ = 65,3±3,76 мкМ).

8. На моделях ГГЦ та гіперцистеїнемії доведено, що вітамінно-мікроелементний комплекс (вітаміни В₆, В₉, В₁₂, мікроелементи цинк, хром, ванадій) відновлює баланс в шляхах метаболізму сірковмісних амінокислот, H₂S, аденозину та тіол-дисульфідному обміні, сприяє нормалізації біохімічного складу плазми крові і ефективно стримує розвиток тромбофілій (зменшує прояви гіперреактивності тромбоцитів, гіперкоагуляції та дефіциту інгібіторів зсідання крові, знижує рівень ПАІ-1). Бетаїн проявляє гіпогомоцистеїнемічний ефект та коригує процеси метилування, але його дія практично не торкається процесів транссульфування, деградації цистеїну та обміну аденілових нуклеотидів, що обмежує можливості використання цього засобу для корекції тромбофілій, асоційованих з порушеннями обміну гомоцистеїну та цистеїну.

9. Серед практично здорових мешканців Вінницької області частота мутацій в генах фактора V G1691A Leiden та протромбіну G20210А становить 2,4 та 1,2%, а серед пацієнтів з тромбозами глибоких вен нижніх кінцівок сягає 16,2 та 6,8%. Розподіл частот поліморфізму гена метилентетрагідрофолатредуктази - C677Т MTHFR в контролі та у пацієнтів з тромбозами глибоких вен є співставним і становить: генотип СТ - 35,4 та 35,1%, генотип ТТ - 11,0 та 12,2%, частота Т-алелю - 28,7 та 29,7%. У 7,4% пацієнтів з тромбозами виявлялось поєднання генетичних аномалій (на відміну від контролю), з них у 5,4% осіб мутація Leiden поєднувалась з гетерозиготним носійством Т-алелю MTHFR. Поширеність протромботичних генотипів була вище (в 2-4 рази) серед пацієнтів з рецидивами тромбозів.

10. ГГЦ (рівень гомоцистеїну > 15 мкМ), як і гіперцистеїнемія (рівень загального цистеїну > 350 мкМ), виявляється у 38-40% пацієнтів з тромбозами глибоких вен, що в 4 рази вище, ніж серед практично здорових осіб. Поєднання ГГЦ та гіперцистеїнемії зафіксовано у 7,6% осіб контрольної групи та 30,0% пацієнтів з тромбозами. У пацієнтів з тромбозами глибоких вен реєструється зниження вмісту (на 25,4%) H₂S в плазмі крові порівняно з групою контролю. ГГЦ, гіперцистеїнемія та дефіцит H₂S в 32-33% випадків асоціюється з генотипом ТТ MTHFR. У 32% пацієнтів з тромбозами виявляється гіперреактивність тромбоцитів, а серед пацієнтів з генотипом ТТ MTHFR частка таких індивідів сягає 60%. ГГЦ та гіперцистеїнемія є вагомими факторами ризику тромбозів глибоких вен (ОR=3,43 та 2,42), але більш небезпечним є поєднання ГГЦ та гіперцистеїнемії (ОR=5,88).

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. В клініко-лабораторній практиці слід враховувати, що підвищення вмісту гомоцистеїну в плазмі крові вище 15 мкМ, загального цистеїну вище 350 мкМ і зменшення вмісту H₂S нижче 60-61 мкМ суттєво збільшує ризик виникнення тромбофілій та їх клінічних маніфестацій. Прогностично найбільш несприятливою є комбінація гіпергомоцистеїнемії з гіперцистеїнемією - за цих умов можливість виникнення тромбозів зростає в 5-6 разів.

2. Для раннього виявлення осіб з високим ризиком тромбозів до лабораторно-діагностичного комплексу доцільно включити показники обміну сірковмісних амінокислот (визначення рівнів гомоцистеїну, цистеїну та H₂S в плазмі крові) та дослідження агрегації тромбоцитів з використанням в якості індуктору ADP (в концентраціях 0,625 - 2,5 мкМ).

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Заічко Н. В. Вплив тіольних сполук та їх дисульфідних форм на агрегацію тромбоцитів людини / Н. В. Заічко, О. О. Пентюк // Медична хімія. - 2006. - Т.8, №3. - С.45-47. (Здобувачем особисто проведений опис літературних даних, виконані всі експериментальні дослідження, проведено статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів, написання статті, оформлення матеріалів до друку).

2. Заічко Н. В. Вплив розчинного фібрину на процеси зсідання крові та агрегації тромбоцитів / Н. В. Заічко, Т. М. Чернишенко, Т. М. Платонова, Г. Л. Волков // Укр.біохім. журнал. - 2006. - Т.78, №3. - С.118-123. (Здобувачем особисто досліджено вплив розчинного фібрину на процес агрегації тромбоцитів, проведено статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів, участь в написанні статті та оформленні її до друку).

3. Заічко Н. В. Вплив гомоцистеїну, цистеїну та їхніх похідних на тромбоцитарну ланку системи гемостазу / Н. В. Заічко, О. О. Пентюк, В. Л. Карбовський // Укр. біохім.журнал. - 2007. - Т.79, №5. - С.122-132. (Здобувачем особисто проведений опис літературних даних, виконані всі дослідження по впливу сірковмісних сполук на агрегацію тромбоцитів, проведено статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів, написання статті та оформлення її до друку).

4. Заічко Н. В. Вплив глутатіону та його дисульфіду на стан тромбоцитарної ланки системи гемостазу / Н. В. Заічко // Медична хімія. - 2008. - Т.10, №1. - С.97-101.

5. Заічко Н. В. Асоціація середнього об'єму тромбоцитів з рівнем гомоцистеїну та гідроген сульфіду в крові щурів з гіпергомоцистеїнемією / Н. В. Заічко // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 2. - С. 54-58.

6. Заічко Н. В. Поширеність мутацій по фактору V Лейден, протромбіну G20210A та метилентетрагідрофолатредуктазі C677T у здорових осіб та у пацієнтів з венозними тромбозами Подільського регіону / Н. В. Заічко / В кн. «Збірник наукових праць співробітників НМАПО імені П. Л. Шупика». Випуск 17, кн.3. - Київ, 2008. - С. 169-177.

7. Патогенетичні аспекти гіпергомоцистеїнемії та перспективи створення лікарських засобів для лікування патології, асоційованої з порушеннями обміну гомоцистеїну / O.О. Пентюк, М.Б. Луцюк, Н. В. Заічко, О. І. Штатько, І. І. Андрушко // Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2008. - №10. - С.297-303. (Здобувачем особисто проведений аналіз та узагальнення літературних даних, результатів власних досліджень, написання статті).

8. Заічко Н.В. Вплив аніонів гідросульфіду, дитіоніту, сульфіту, тіосульфату та сульфату на агрегацію тромбоцитів людини / Н. В. Заічко, О. О. Пентюк, // Укр.біохім. журнал. - 2009. - Т.81, №1. - С.105-113. (Здобувачем особисто проведений опис літературних даних, належить ідея роботи, виконані всі експериментальні дослідження, проведена статистична обробка та аналіз результатів, написання статті).

9. Заічко Н. В. Вплив тіолактону гомоцистеїну, цистеїну та гідроген сульфіду на систему гемостазу кролів / Н. В. Заічко // Медична хімія. - 2009. - Т.11, №2. - С.51-56.

10. Визначення вмісту гідроген сульфіду в сироватці крові / Н. В. Заічко, Н. О. Пентюк, Л. О. Пентюк, А. В. Мельник, І. І. Андрушко // Вісник наукових досліджень. - 2009. - №1. - С.29-32. (Здобувачем особисто проведений опис літературних даних, розробка метода та його апробація в сироватці крові експериментальних тварин, аналіз та узагальнення результатів, написання статті, оформлення матеріалів до друку).

11. Вплив гострої метіонінової гіпергомоцистеїнемії на утворення гідроген сульфіду в органах щурів та його корекція комплексом вітамінів В₆, В_9, В₁₂ / Н. В. Заічко, І. І. Андрушко, А. В. Мельник, О. І. Штатько // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2009. - №4 - С.29-35. (Здобувачем особисто проведено опис літературних даних, визначення вмісту метаболітів в плазмі крові та активності ензимів в печінці, статистична обробка матеріалу, написання та оформлення статті до друку).

12. Утворення гідроген сульфіду в органах щурів / Н. В. Заічко, Н. О. Пентюк, А. В. Мельник, О. І. Штатько, І. І. Андрушко // Медична хімія. - 2009. - Т.11, №4. - С.7-13. (Здобувачем особисто проведено аналіз та узагальнення літературних даних, розробка та апробація методів дослідження активності ензимів синтезу гідроген сульфіду в органах тварин, статистична обробка матеріалу, написання та оформлення статті до друку).

13. Синдром гіпергомоцистеїнемії: етіопатогенез та фармакологічні аспекти (огляд літератури) / К. П. Постовітенко, М. А. Артемчук, Р. В. Харковенко, Н. В. Заічко, О. О. Пентюк, М. Б. Луцюк, О. В. Тертишна, Г. З. Личик, Д. О. Некрут // Ультразвукова перинатальна діагностика. - 2009. - №27-28. - С.282-296. (Здобувачем особисто проведено аналіз та узагальнення літературних даних і написання частини статті, що стосується механізмів патогенетичної дії гіпергомоцистеїнемії).

14. Заічко Н. В. Вплив сірковмісних амінокислот та їхніх похідних на плазмові фактори та інгібітори зсідання крові / Н. В. Заічко, Т. М. Платонова, Т. М. Чернишенко // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2010. - №1. - С.67-74. (Здобувачем особисто проведено опис літературних даних, сформульована ідея роботи, участь у виконанні експериментальних досліджень, проведено узагальнення результатів, написання статті, оформлення матеріалів до друку).

15. Вплив гідроген сульфіду на систему гемостазу щурів / Н. В. Заічко, Т. М. Платонова, Т. М. Чернишенко, Т. В. Гриненко, О. І. Юсова // Медичні перспективи. - 2010. - Т.ХV, №1. - С.15-20. (Здобувачем особисто проведено опис літературних даних, сформульована ідея роботи, створення моделі на тваринах, збір матеріалу, виконання біохімічних та частини гемостазіологічних досліджень, узагальнення результатів, написання статті, оформлення матеріалів до друку).

16. Заічко Н. В. Біохімічні механізми формування тромбофілії, індукованої хронічним навантаженням тіолактоном гомоцистеїну та його комбінацією з L-NAME. Корекція вітамінно-мікроелементним комплексом / Н. В. Заічко // Вісник проблем біології та медицини. - 2010. - №1.- С.126-132.

17. Заічко Н. В. Порушення в системі гемостазу щурів, індуковані навантаженням метіоніном, та профілактична дія вітамінів В₆, В₉, В₁₂ / Н. В. Заічко // Одеський медичний журнал. - 2010. - №1.- С.24-28.

18. Заічко Н. В. Процеси метилування, транссульфування, метаболізму цистеїну та аденозину в печінці щурів за гострої метіонінової гіпергомоцистеїнемії та її корекції комплексом вітамінів В₆, В_9, В₁₂ / Н. В. Заічко // Вісник проблем біології та медицини. - 2010. - №2. - С.73-78.

19. Заічко Н. В. Вплив хронічного наватаження тіолактоном гомоцистеїну та його комбінації з L-NAME на ензими метаболізму сірковмісних амінокислот в печінці щурів. Корекція вітамінно-мікроелементним комплексом / Н. В. Заічко // Вісник наукових досліджень. - 2010. - №2. - С.61-65.

20. Заічко Н. В. Вплив хронічного навантаження тіолактоном гомоцистеїну на обмін аденозину у щурів: зв'язок з гіперреактивністю тромбоцитів, корекція вітамінно-мікроелементним комплексом / Н. В. Заічко // Український біохімічний журнал. - 2010. - № 2. - С.59-66.

21. Вплив навантаження цистеїном на ферментні системи метаболізму сірковмісних амінокислот в печінці, нирках та мозку щурів / Н. В. Заічко, О. О. Пентюк, А. В. Мельник, О. І. Штатько // Медична хімія. - 2010. - №2. - С.43-49. (Здобувачем особисто проведено аналіз літературних даних, дослідження біохімічних показників в плазмі крові та активності ензимів в печінці експериментальних тварин, статистична обробка матеріалу, узагальнення результатів дослідження, написання та оформлення статті).

22. Заічко Н. В. Вплив вітамінно-мікроелементного комплексу та бетаїну на метаболізм сірковмісних амінокислот в печінці щурів за гіповітамінозно-метіонінової гіпергомоцистеїнемії / Н. В. Заічко, М.А. Артемчук // Вісник морфології. - 2010. - Т.16, №3. - С. 570-575. (Здобувачем особисто проведено опис літературних даних, сплановано експеримент, проведені всі біохімічні дослідження, статистична обробка матеріалу, аналіз та узагальнення результатів дослідження, написання статті).

23. Заічко Н. В. Біохімічні аспекти формування тромбофілії при хронічній гіперцистеїнемії у щурів / Н. В. Заічко // Медичні перспективи. - 2010. - Т.ХV, №3. - С. 12-17.

24. Заічко Н. В. Вплив вітамінно-мікроелементного комплексу та бетаїну на стан системи гемостазу в щурів з гіповітамінозно-метіоніновою гіпергомоцистеїнемією / Н. В. Заічко, М.А. Артемчук // Медична хімія. - 2010. - Т.12, №4. - С. 72-78. (Здобувачем особисто проведено опис літературних даних, сплановано експеримент, проведені всі біохімічні та гемостазіологічні дослідження, статистична обробка матеріалу, аналіз та узагальнення результатів дослідження, написання статті).

25. Заічко Н. В. Рівні гомоцистеїну, цистеїну та гідрогенсульфіду в плазмі крові пацієнтів з тромбозами глибоких вен нижніх кінцівок: зв'язок з поліморфізмом С677Т в гені метилентетрагідрофолатредуктази / Н. В. Заічко // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2010. - №4. - С.35-41.

26. Оценка информативности и прогностической значимости традиционных скрининговых и дополнительных лабораторных тестов для диагностики тромбофилий / Т. Н. Платонова, Н. В. Заичко, Т. М. Чернышенко, О. В. Горницкая, В.И. Грищук // Лабораторная диагностика. - 2010. - №4. - С. 3-10. (Здобувачем особисто виконана частина роботи, що присвячена вивченню агрегації тромбоцитів у пацієнтів з тромбофіліями, проведена статистична обробка, аналіз та узагальнення одержаних результатів, участь в аналізі літературних даних та написанні статті).

27. Пат. України на корисну модель № 45018 U МПК (2009) G01N 33/00. Спосіб визначення продукції гідроген сульфіду в органах тварин / Заічко Н. В., Пентюк Н. О., Мельник А. В., Штатько О. І.; заявник та патентовласник НДІ реабілітації інвалідів Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. - № u 200904434; заявл. 05.05.2009; опубл. 26.10.2009; Бюл. № 20. - 2 с.

28. Пат. України на корисну модель № 45019 U МПК (2009) G01N 33/00. Спосіб діагностики гіперреактивності тромбоцитів, асоційованої з порушеннями обміну сірковмісних амінокислот, як предиктора тромбофілії /

Заічко Н. В.; заявник та патентовласник НДІ реабілітації інвалідів Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. - № u 200904436; заявл. 05.05.2009; опубл. 26.10.2009; Бюл. № 20. - 2 с.

29. Пат. України на корисну модель №52136 U МПК (2009) G01N 33/68. Спосіб визначення вмісту гідроген сульфіду в плазмі крові / Заічко Н. В., Пентюк Н. О., Мельник А. В.; заявник та патентовласник НДІ реабілітації інвалідів Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. - № u 201003158; заявл. 19.03.2010; опубл. 10.08.2010; Бюл. № 15. - 2 с.

30. Заічко Н. В. Розчинний фібрин - маркер розвитку внутрішньосудинного мікрозсідання крові. Використання тромбіноподібних ферментів в діагностичних лабораторних тестах для виявлення тромбофілії / Н. В. Заічко, Т. М. Платонова, Т. М. Чернишенко // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю «Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії», 18-20 травня 2005 р., Чернівці. - Буковинський медичний вісник. - 2005. - Т.9, №2. - С.101-102.

31. Андрушко І. І. Можлива роль підвищеного рівня цистеїну в патогенезі судинних уражень / І. І. Андрушко, Н. В. Заічко, О. В. Тертишна // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду, 24-27 жовтня 2006 р., Харків. - Укр.біохім. журнал. - 2006. - Т.2. - С.25.

32. Заічко Н. В. Пошук предикторів тромботичних ускладнень у хворих з ураженнями периферійних судин - актуальна проблема сучасної експертної діагностики // Н. В. Заічко / Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції «Сучасні проблеми реабілітації інвалідів» 20-21 вересня 2007 р., Вінниця. - 2007. - С.220-224.

33. Ферментні системи, що продукують гідроген сульфід в органах щурів / А. В. Мельник, О. О. Пентюк, Н. В. Заічко, О. І. Штатько, Н. О. Пентюк, І. І. Андрушко // Матеріали другої міжнародної конференції «Біологія: від молекули до біосфери», 20-22 листопада 2007 р., Харків. - С.46-47.

34. Заічко Н. В. Вплив навантаження метіоніном на систему гемостазу щурів та його корекція комплексом вітамінів В₆, В₉, В₁₂ / Н. В. Заічко // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції «Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії», 8-9 жовтня 2009 р., Тернопіль. - Медична хімія. - 2009. - Т.11, №3. - С.162.

35. Нові аспекти фізіологічної дії продуктів транcсульфування сірковмісних амінокислот / Н.О. Пентюк, Н.В. Заічко, А.В. Мельник, І.І. Андрушко, О.І. Штатько // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції «Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії», 8-9 жовтня 2009 р., Тернопіль. - Медична хімія. - 2009. - Т.11, №4. - С.164.

36. Заічко Н. В. Вплив сірковмісних амінокислот та їхніх похідних на фактори системи зсідання крові / Н. В. Заічко, Т. М. Платонова, Т. М. Чернишенко // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції «Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії», 8-9 жовтня 2009 р., Тернопіль. - Медична хімія. - 2009. - Т.11, №3. - С.154.

37. Заічко Н. В. Генетичний поліморфізм по метилентетрагідрофолатредуктазі та гіперреактивність тромбоцитів у хворих з посттромбофлебітичним синдромом / Н. В. Заічко // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції «Актуальні проблеми реабілітації інвалідів», 24-25 вересня 2009 р., Вінниця. - С.174-178.

38. Заичко Н. В. Факторы риска тромбофилии у пациентов с сосудистой патологией / Н. В. Заичко, Ю. А. Бессмертный // Медико-социальная экспертиза и реабилитация: сб. науч. ст. / под ред. В.Б. Смычка. - Минск : НИИ МЭ и Р, 2009, Вып. 11. - С.247-251.

39. Заічко Н. В. Патогенетичні аспекти гіперцистеїнемії, можливості корекції вітамінно-мікроелементним комплексом / Н. В. Заічко, М. Б. Луцюк // Матеріали Х Українського біохімічного з'їзду 13-17 вересня 2010 р., Одеса. - Український біохімічний журнал. - Т.82, №4 (додаток 2). - С.15.

40. До механізмів виникнення та патогенетичної дії гіпергомоцистеїнемії / М. Б. Луцюк, Н. В. Заічко, А. В. Мельник, М. А. Артемчук, М. Р. Ліпко // Матеріали ХІІІ конгресу Світової федерації українських лікарських товариств «100 років Українському лікарському товариству» 30 вересня - 3 жовтня 2010 р., Львів-Київ-Чікаго. - С.235 -236.

41. Заічко Н. В. Метаболічні та гемокоагуляційні порушення за умов гіповітамінозно-метіонінової гіпергомоцистеїнемії: корекція бетаїном та вітамінно-мікроелементним комплексом / Н. В. Заічко // Матеріали VI Всеукраїнській науково-практичної конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології «Клінічна та експериментальна фармакологія метаболічних коректорів, органопротекція, доказова медицина», 10-11 листопада 2010 р., Вінниця. - С. 214-216.

42. Доклінічні дослідження гіпогомоцистеїнемічної дії потенційних лікарських засобів / [О. О. Пентюк, М. Б. Луцюк, М. А. Артемчук, К.П. Постовітенко, І.І. Андрушко, Н.В. Заічко, Г.І. Степанюк, О.І. Штатько, Н.О. Пентюк, Г.С. Григор'єва, Н.Ф. Конахович, О.В. Сергієнко] - К.: ДФЦ МОЗ України, 2007. - 30 с.

43. Клініко-лабораторна діагностика тромбофілій. Методичні рекомендації / Н. В. Заічко, Ю. О. Безсмертний, Т. М. Платонова, Т. М. Чернишенко. - Вінниця: НДІ РІ ВНМУ ім. М.І. Пирогова, 2009. - 32 с.

44. Заічко Н. В. Нововведення «Спосіб діагностики гіперреактивності тромбоцитів», реєстр № 112/28/08 / Н. В. Заічко // Реєстр галузевих нововведень Українського Центру наукової медичної інформації і патентно-ліцензійної роботи МОЗ України. - 2008. - Випуск 28-29. - С.78.

Размещено на Allbest.ru