Експериментальне обґрунтування створення нових гепатопротекторів на основі ессенціальних фосфоліпідів та поліфенолів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний фармацевтичний університет

УДК 615.322.582.632.1:633.87:616.36-002.001.53

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора фармацевтичних наук

Експериментальне обґрунтування створення нових гепатопротекторів на основі ессенціальних фосфоліпідів та поліфенолів

14.03.05 - фармакологія

Гордієнко Анатолій Дмитрович

Харків 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на базі Державного підприємства "Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції" та Центральної науково-дослідної лабораторії Національного фармацевтичного університету МОЗ України, м. Харків

Науковий консультант: доктор фармацевтичних наук, заслужений діяч науки і техніки України, професор Яковлєва Лариса Василівна, Національний фармацевтичний університет, завідувачка Центральної науково-дослідної лабораторії, завідувачка кафедри фармакоекономіки

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Маслова Наталія Федорівна, Державне підприємство "Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції", завідуюча лабораторією біохімічної фармакології

доктор медичних наук, професор Степанюк Георгій Іванович, Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова, завідуючий кафедрою фармакології

доктор біологічних наук, професор Бєленічев Ігор Федорович, Запорізький державний медичний університет, завідуючий кафедрою фармакології та медичної рецептури

Захист відбудеться “ 16 ” червня 2011 року о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.03 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м.Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м.Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “___”____________2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор фармацевтичних наук, доцент Т.С. Сахарова

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Значна поширеність і тенденція до зростання кількості захворювань печінки, а також збільшення частоти токсичних уражень печінки (Lefkowitch J.H., 2003; Стародуб., та ін., 2008), визначають актуальність проблеми лікування даної патології (Яковенко Э.П., Григорьев П.Я., 2003; Морозов С.Ю., 2009).

Основними причинами росту захворюваності є велика поширеність вірусних гепатитів, погіршення екологічної обстановки, збільшення споживання алкоголю і неконтрольованого використання лікарських засобів, збільшення числа осіб з порушеннями обміну речовин, ожирінням, жовчно-кам'яною хворобою (Bellentani S., 2001; Самарин Д.В., 2008; Денисюк Я.С. и др., 2010).

Ушкодження, що виникають при патологічних процесах у печінці, можуть призводити до серйозних порушень метаболізму: жовчоутворюючої, детоксикаційної та білоксинтетичної функцій (Фадеенко Г.Д., 2003; Євстігнєєв І.В. та ін., 2008).

Фармакотерапія захворювань печінки у теперішній час залишається недостатньо ефективною, у зв'язку з чим особливого значення набуває застосування патогенетичних лікарських засобів (Дегтярева И.И., 2004).

Коло речовин з гепатозахисними властивостями досить велике. Однак у практичній медицині застосовують порівняно невелику групу засобів, які виявляють гепатопротекторні властивості (Яковенко Е.П., Григорьєв П.Я., 2003; Дроговоз С.М., 2008).

Дія гепатопротекторів спрямована на відновлення гомеостазу в печінці, підвищення стійкості органа до впливу патогенних факторів, нормалізацію функціональної активності та стимуляцію репаративно-регенеративних процесів (Яковенко Е.П., Григорьєв П.Я., 2003).

При патологіях печінки пошкоджуються гепатоцити, що призводить до порушення її функцій (Подымова С.Д., 1998).

Основними умовами нормального функціонування печінки є абсолютна цілісність структури клітин, їх органел, що пов'язано перш за все з цілісністю і фізіологічною відповідністю мембранних структур. У регулюванні функції мембран важливу роль відіграє їх проникність і плинність, яка забезпечується есенціальними фосфоліпідами (ЕФЛ). Недостатність останніх в результаті ураження гепатоцитів при токсичних гепатитах, пов'язаних з активацією вільнорадикального окиснення (ВРО) призводить до деструкції клітинних і субклітинних мембран, руйнуванню клітин, а згодом і до їх загибелі.

У зв'язку з вищевикладеним актуальним представляється пошук лікарських препаратів з мембранорепаруючою та антиоксидантною дією, здатних запобігати гіперліпопероксидації та деструкції мембранних структур, підвищувати активність антиоксидантної системи клітин і таким чином відновлювати функції ушкоджених клітин печінки (Гордиенко А.Д., 1990, 2001; Кулагин О.Л. и др., 2007; Гордієнко А.Д. та ін., 2009).

Поліфенольні препарати-гепатопротектори з розторопші та інших рослин з антиоксидантними властивостями пригнічують процеси ВРО, але перервати або значно подавити їх поліфеноли не можуть, оскільки деградують в організмі і не чинять пролонгованої антиоксидантної дії. В зв'язку з цим, поліфеноли лише частково покращують метаболічні процеси в печінці, але не репарують мембрани ушкоджених гепатоцитів, що приводить до вкрай повільного відновлення функції печінки (Гріднєв О.Е., 2005).

Препарати, які містять ЕФЛ із сої з мембранорепаруючим механізмом дії, відновлюють мембрани ушкоджених гепатоцитів при патологіях печінки, але слабо пригнічують активовані процеси ВРО, проте підвищують біодоступність поліфенолів і виконують помітну роль синергістів для антиоксидантів (Арчаков А.И. и др., 2002; Ипатова О.М. и др., 2004).

Більш високоефективним гепатопротектором може бути препарат, який одночасно забезпечує репарацію клітинних мембран, пригнічує активацію ВРО, що відповідно сприяє відновленню функції ушкоджених гепатоцитів. Такі властивості може забезпечити композиція ЕФЛ і рослинних поліфенолів з синергічною фармакологічною дією.

У теперішній час на фармацевтичному ринку немає комплексних гепатопротекторів, які б мали одночасно і антиоксидантну і мембранорепаруючу дію.

З огляду на арсенал гепатозахисних препаратів біофлавоноїдної природи виникає необхідність у розробці високоефективних комплексних гепатопротекторів на основі ЕФЛ і флавоноїдів з більш вираженою антиоксидантною і гепатопротекторною дією. Актуальною є також розробка рослинних препаратів гепатозахисної дії для дитячої практики.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота виконана у рамках програми НДР Державного підприємства "Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції" зі створення та освоєння нових лікарських препаратів, № держреєстрації тем: 0195U015074 - ліпофен, 01890061311 - таблетки силібору, виготовлені за новою технологією, і гранули силібору, 01890061315 - гранули флакуміну, 01890061310 - гранули калефлону, 01900063728 - таблетки канафлазину, 0195U015076 - гіфларин ампули (1% р-н для ін'єкцій). Другий фрагмент виконаний у рамках програми НДР Національного фармацевтичного університету з пошуку і вивчення нових БАР природного походження, альтан та піфламін, № держреєстрації теми 0194U038073, 0198U007008, відповідно.

Мета та завдання дослідження. Мета даної роботи: науково обґрунтувати та експериментально визначити особливості фармакологічної дії нових гепатопротекторів на основі природних БАР - ЕФЛ, поліфенолів та їх комбінації. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Визначити припустимі строки зберігання при температурі +2:+4С і -196С виділених із печінки мітохондрій, мікросом і ізольованих гепатоцитів, при яких ще не змінюється їх функція, і можливість витриманих при вказаних температурах об'єктів використовувати в фармакологічних дослідженнях та у скринінгу БАР на антиоксидантну активність і токсичність в системі in vitro.

2. Експериментально обґрунтувати оптимальний склад комплексного гепатопротектора ліпофену у капсулах на основі ЕФЛ із сої, рослинних флавоноїдів та вітамінів.

3. Вивчити механізм дії та гепатопротекторні властивості препарату «Ліпофен» в порівнянні з класичними фосфоліпідними і поліфенольними гепатопротекторами на моделях токсичних гепатитів, викликаних токсикантами CCl₄ і етанолом.

4. Дослідити фармакокінетику ФХ у складі комплексного гепатопротектора ліпофену.

5. Вивчити виразність і особливості антиоксидантної дії рослинних поліфенолів, ЕФЛ із сої і препаратів на їх основі на моделях ВРО в інтактних і в ушкоджених CCl₄ мікросомах в умовах in vitro.

6. Дослідити можливу токсичну дію об'єктів, що вивчаються, на окиснювальне фосфорилювання в ізольованих мітохондріях і гепатоцитах з печінки інтактних щурів в умовах in vitro.

7. Вивчити механізм антиоксидантної дії та гепатопротекторні властивості поліфенольних препаратів альтану та піфламіну на моделях уражених мітохондрій і мембран ЕР гепатоцитів при гострих токсичних гепатитах, викликаних токсикантами CCl₄ і етанолом.

8. Визначити переваги гепатопротекторної дії таблеток силібору, розроблених за новою технологією.

9. Вивчити ефективність таблеток альтану в порівнянні з таблетками силібору при гострих і хронічних гепатитах (за біохімічними показниками печінки і сироватки крові щурів).

Об'єкт дослідження. Патологічні процеси в ушкодженій печінці та їх лікування гепатопротекторами.

Предмет дослідження. Антиоксидантна та гепатопротекторна активність рослинних поліфенолів та ЕФЛ із сої. Визначення складу та вивчення фармакодинаміки і фармакокінетики нового комплексного препарату ліпофену. Вивчення нових поліфенольних гепатопротекторів альтану і піфламіну.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакологічні, біохімічні, біофізичні, радіоізотопні, гістологічні, токсикологічні методи дослідження і методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично обґрунтовано створення нового гепатопротектора, який пригнічує дію окисного стресу і відновлює структуру мембран і функції ушкоджених гепатоцитів, є комплексним препаратом на основі ЕФЛ, поліфенолів та вітамінів і має назву «Ліпофен».

Вперше вирішена проблема оцінки гепатопротекторних властивостей препаратів з різним механізмом дії, вивчених на інтактних і ушкоджених мікросомах та ізольованих мітохондріях гепатоцитів у системах in vitro і на моделях токсичного ураження печінки.

Вперше розроблений оптимальний склад і створений оригінальний препарат ліпофен у капсулах. Ліпофен за гепатопротекторною активністю перевищує есенціале, поліненасичений ФХ із сої, рослинні гепатопротектори силібор і флакумін, а також нові поліфенольні гепатопротектори альтан і піфламін. Механізм гепатопротекторної дії ліпофену полягає в синергічному ефекті - посиленні поліненасиченим ФХ із сої антиоксидантної дії флавоноїдів флакуміну, що входять до складу препарату, та у мембранорепаруючій дії (вбудовування поліненасиченого ФХ із сої в ушкоджені мембрани мікросом) і відновленні функції мікросом і мітохондрій гепатоцитів при токсичних ураженнях печінки.

Вперше встановлений виражений синергічний антиоксидантний ефект субстанції флакуміну у лікарських препаратах ліпофен і гранулах флакуміну.

Вперше, в модельних системах ферментативного та аскорбатзалежного ПОЛ мікросом з печінки щурів in vitro, доведена найбільш виразна антиоксидантна дія субстанції альтану, дубильних речовин групи елаготанінів, у порівнянні з відомими вивченими флавоноїдними антиоксидантами - гепатопротекторами (силібором, флакуміном, калефлоном, канафлазином, кверцетином, піфламіном). Високі антирадикальні та антиоксидантні властивості елаготанінвміщуючої субстанції альтану обумовлені особливостями хімічної структури їх молекул елаготанінів та більшою кількістю ОН груп в них, у порівнянні з флавоноїдами.

Вперше проведене порівняльне вивчення гепатопротекторних властивостей нових рослинних поліфенольних препаратів альтану і піфламіну, що не поступаються препарату силібору в їх здатності збереження функції мікросом і мітохондрій гепатоцитів при гострих токсичних гепатитах.

Вперше за допомогою розробленого нами полярографічного експрес-методу визначення антиоксидантної активності БАР проведено порівняльне вивчення особливостей антиоксидантної дії рослинних поліфенолів, ЕФЛ із сої та їх композиції. Визначені препарати з найбільшою актиоксидантною активністю, до яких належать ліпофен, альтан і гранули флакуміну. Встановлено, що в складі синергічних композицій істотно знижується концентрація поліфенолів-антиоксидантів. Показано, що всі вивчені препарати не роз'єднують процеси окиснювання і фосфорилювання інтактних мітохондрій і не інгібують та не роз'єднують дихання ізольованих гепатоцитів із печінки щурів у системі in vitro, тобто не чинять токсичної дії.

Вперше використані заморожені до -196С зі швидкістю 300-400С/хв мікросоми і кріоконсервовані за розробленою нами багатоетапною програмою заморожування з 10% ДМСО до -196С ізольовані гепатоцити з печінки щурів (авторське свідоцтво № 902695, 1982 р.) як модельна система у скринінгу нових БАР, одних - на антиоксидантну активність, інших - на токсичність у системі in vitro. Це дозволяє значно скоротити кількість лабораторних тварин в експерименті і застосовувати експериментальний матеріал у зручний для роботи час, що узгоджується з положеннями "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 1985).

Практичне значення одержаних результатів. У роботі вирішена задача розробки і дослідження нового ефективного комплексного гепатопротектора - капсул ліпофену.

У результаті проведених досліджень запропонований, як гепатопротектор, новий антиоксидантний препарат альтан, отриманий на основі дубильних речовин групи елаготанінів (патент України за № 40777 від 27. 04. 2009 р. на "Спосіб фармакотерапії токсичних гепатитів").

Препарат альтан як протизапальний і репаративний засіб для лікування виразкової хвороби шлунка і дванадцятипалої кишки випускається Борщагівським ХФЗ.

Експериментальне вивчення гепатопротекторних властивостей ліпофену і піфламіну послужило обґрунтуванням для їхнього впровадження в медичну практику.

Наявність гепатопротекторної та антиоксидантної дії таблеток силібору за новою технологією, що не поступається за дією таблеткам силібору за діючою технологією, дозволила рекомендувати до випуску препарат, виготовлений за новою більш економічною технологією. Таблетки силібору за новою технологією випускаються ТОВ "Фармацевтична компанія “Здоров'я”.

Отримана нами за оригінальною технологією субстанція поліненасиченого ФХ із сої (Авторське свідоцтво № 1622980, 1991 р.), що має гепатопротекторну активність, є одним із активних компонентів розробленого препарату ліпофен. Дослідження субстанції поліненасиченого ФХ із сої в інших композиціях з антиоксидантами, які виявляють синергічну дію, дозволить використати цей ефект при створенні нових високоефективних лікарських препаратів.

Результати дисертаційної роботи є фрагментами доклінічних досліджень вивчаємих препаратів, які дозволені ДФЦ МОЗ України до медичного застосування: гранули силібору для дітей, протокол №6 від 30.06.94 р; гранули флакуміну для дітей, протокол №3 від 30.03.95 р; таблетки силібору за новою технологією, протокол №10 від 28.12.95 р; гіфларин, 1% р-н для ін'єкцій, протокол №10 від 29.12.95 р; таблетки канафлазину, протокол №4 від 25.04.96 р; ліпофен, капсули, протокол №7 від 25.09.97 р; таблетки піфламіну, протокол №9 від 25.10.2001 р.

Результати наукових досліджень впроваджені у відділі довгострокового зберігання біологічних об'єктів при низьких температурах і кріомікробіології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (Акт впровадження №5 від 12.01.2010 р.).

Дані з фармакології розроблених і впроваджених у виробництво нових гепатопротекторів використовують в навчальному процесі кафедри фармакології Національного фармацевтичного університету (Акт впровадження №7 від 13.05.2010 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведений патентний пошук, аналіз літератури з досліджуваної проблеми, постановка мети та завдань дослідження. Разом з науковим консультантом розроблена програма наукових досліджень, сформульовані висновки та практичні рекомендації. Усі наукові і практичні результати, викладені в дисертації, отримані автором самостійно або ж за його участю як відповідального виконавця досліджень, проведених за держбюджетними і госпдоговірними НДР. Автор є ініціатором і співвиконавцем досліджень по вивченню фармакокінетики ФХ ліпофену, які були проведені у творчому співробітництві з дослідниками НДІ біології Харківського національного державного університету ім. В.Н.Каразіна. Він провів самостійно усі експериментальні дослідження, які увійшли до дисертації, обробив усі отримані результати, здійснив їх аналіз, трактування та узагальнення, а також написав і підготував до друку усі статті та тези доповідей за матеріалами дисертації.

Апробація матеріалів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на ІІІ Всесоюзній конференції “Биоантиоксидант”, м. Москва, 1989 р.; на Всесоюзному симпозиумі “Реконструкция, стабилизация и репарация биологических мембран”, м. Благовєщенськ, 1989 р.; на Всесоюзній науково-технічній конференції “Состояние и перспективы создания новых готовых лекарственных средств и фитохимических препаратов”, м. Харків, 1990 р.; на Республіканській науково-практичній конференції “Сучасні проблеми фармації“, м. Харків, 1994 р.; на І з'їзді Білоруського товариства фітобіологів і біофізиків, м. Мінськ, 1994 р.; на І Національному з'їзді фармакологів України “Сучасні проблеми фармакології”, м. Полтава, 1995 р.; на IV Російському національному конгресі "Человек и лекарство", м. Москва, 1997 р.; на VII Українському біохімічному з'їзді, м. Київ, 1997 р.; на V з'їзді фармацевтів України, м. Харків, 1999 р.; на Міжнародній науково-практичній конференції Національного фармацевтичного університету “Медицина. Біофармація. Біотехнологія ”, м. Харків, 2003 р.;, на науково-практичній конференції "Ліки - людині", м. Харків, 2006 р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 44 роботи, у тому числі 27 статей у наукових журналах (23 статті в наукових спеціалізованих журналах, затверджених ВАК України), отримано та опубліковано 2 авторських свідоцтва, 1 деклараційний патент, 14 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 317 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали та методи дослідження», 3 розділів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, загальних висновків, бібліографії, що включає 373 джерела літератури, з яких 91 - іноземних авторів. Робота проілюстрована 61 таблицею і 26 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. В роботі досліджували 9 нових природних лікарських препаратів: комплексний гепатопротектор ліпофен, який містить поліненасичений ФХ із сої, флавоноїди флакуміну, б-токоферол, тіамінобромід і піридоксину гідрохлорид, фосфоліпідна субстанція - поліненасичений ФХ із сої; 8 препаратів поліфенольної природи: таблетки силібору, виготовлені за новою технологією, таблетки альтану, таблетки піфламіну, гранули силібору для дітей, гранули флакуміну для дітей, гранули калефлону для дітей, таблетки канафлазину і гіфларин (1% р-н для ін'єкцій).

Препарати: ліпофен у капсулах, субстанція поліненасиченого ФХ їз сої та поліфенольні препарати таблетки канафлазину, гранули силібору, гранули флакуміну, гранули калефлону для дітей та препарат гіфларин розроблені і отримані в ДП ДНЦЛЗ.

Таблетки силібору за новою технологією розроблені в ТОВ Фармацевтична компанія “Здоров'я”.

Поліфенольні препарати альтан і піфламін розроблені вченими НФаУ.

Фармакологічні дослідження виконані на 1142 тваринах (на 1028 щурах і 114 мишах), вирощених у розплідниках віварію ДП ДНЦЛЗ і НФаУ відповідно до вимог належної лабораторної практики (GLP), які утримувалися на збалансованому харчуванні згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Стефанов О.В., 2001). Усі втручання та знеживлення тварин проводили з дотриманням принципів "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей" (Страсбург, 1985) та ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2001). Комісією з біоетики НФаУ (протокол № 5 від 19.05.2010 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено.

Виходячи з мети і завдань дисертаційної роботи, експериментальні дослідження видавалося побудувати таким чином: визначити припустимі строки зберігання, виділених з печінки мітохондрій, мембран ЕР (мікросом) і ізольованих гепатоцитів при їх гіпотермічному збереженні при температурі +2:+4С і -196С, при яких ще не змінюється їх функція. Визначити можливість витриманих при вказаних температурах об'єктів використовувати в експериментальних дослідженнях та у скринінгу на антиоксидантну активність і токсичність в системі in vitro. Визначити виразність антиоксидантної дії рослинних поліфенолів та ЕФЛ із сої. Розробити оптимальний склад комплексного гепатопротектора ліпофена, вивчити фармакокінетику ФХ, що у препараті, та гепатопротекторні властивості у порівнянні з новими поліфенольними гепатопротекторами альтаном та піфламіном. Провести поглиблені дослідження гепатопротекторних властивостей альтану на моделях токсичних гепатитів. Дослідити можливу токсичну дію виучуваних препаратів на мітохондріальній тест-системі.

Гепатопротекторну активність і механізм дії нових БАР і препаратів на їх основі вивчали за їх впливом на функцію печінки, з визначенням функціональної активності виділених з печінки субклітинних органел - мітохондрій, мікросом, ізольованих гепатоцитів та за біохімічними показниками печінки.

В роботі використовували білих щурів-самців масою 200-250 г. Мітохондрії з печінки одержували за методом (Мосолова И.М. и др.,1975). Мікросоми з печінки виділяли кальцієвим методом (Kamath S.A., Narayan К.A., 1972), в окремих експериментах - високошвидкісним центрифугуванням за методом (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977).Ізольовані гепатоцити з печінки білих щурів-самців одержували двома методами: за Канаєвою І.П. та ін., (1975) і Кравченко Л.П. та ін., (1989). Вміст білка в мітохондріях, мікросомах і ізольованих гепатоцитах визначали за методом Lowry O.H. et al.(1951).

При вивченні гіпотермічного впливу на модельні об'єкти: мікросоми, мітохондрії та ізольовані гепатоцити, які виділені за методом Канаєвої І.П. та ін., (1975), витримували в холодильнику при температурі +2:+4С. Для вивчення впливу низьких температур мікросоми заморожували до -196С зі швидкістю 300-400С/хв. Кріоконсервування ізольованих клітин печінки, виділених за методом Канаєвої І.П. і співав., (1975) здійснювали за розробленим нами багатоетапним режимом заморожування з 10% ДМСО до -196С, на який отримано авторське свідоцтво № 902695 (Кудокоцева Е.В. и др., 1982). Відігрівання заморожених суспензій мікросом і ізольованих клітин печінки проводили на водяному огрівнику при температурі +37С.

Швидкість споживання кисню мітохондріями, мікросомами та ізольованими гепатоцитами визначали на полярографі ОН-102 (Угорщина) при 30С зі стандартним закритим платиновим електродом типу Кларка.

Субстратом окиснювання мітохондрій і ізольованих гепатоцитів служив сукцинат натрію в концентрації 10 ммоль/мл. АДФ додавали в концентрації 200 мкмоль/мл. За кривими споживання кисню мітохондріями та ізольованими гепатоцитами розраховували швидкість дихання на ендогенних субстратах (V_енд.), на субстраті сукцинату натрію (V_сук.) і активність окиснювального фосфорилювання (ОФ) за показниками (V_АДФ/V_сук.) і (V_ДНФ/V_сук.). 2,4-ДНФ до гепатоцитів додавали у концентрації 10^-4 Моль/мл. Із суспензією мітохондрій, мікросом і ізольованих гепатоцитів працювали не більше 5 годин після їх виділення.

Вміст цитохрому Р-450 у мікросомах визначали за методом Арчакова А.І. та ін., 1968), в ізольованих клітинах печінки за методом (Jones et.al., 1979). Швидкість N-диметилювання ДМА в мікросомах і ізольованих клітинах печінки визначали за кількістю формальдегіду, що утворився, за методом (Карузина И.И., Арчаков А.И., 1971).

Оцінку антиоксидантної активності БАР і препаратів на їх основі проводили за розробленим нами експрес-методом визначення антиоксидантної активності речовин полярографічним методом у системі in vitro в умовах ферментативного та аскорбатзалежного ПОЛ свіжовиділених, гіпотермічно витриманих при (+2ч+4С) і відігрітих після заморожування до -196С мікросом, а також мікросом щурів, отруєних CCl₄ (Гордиенко А.Д. и др., 1992).

Ініціація ферментативного ПОЛ у біомембранах ЕР здійснюється за участю супероксидного аніонрадикалу О?₂, що утворюється при одноелектронному відновленні кисню в ЕР (Svingen et.al., 1979). В умовах CCl₄-залежного ПОЛ у результаті метаболічної активації CCl₄ у мікросомальному електронотранспортному ланцюзі за участю цитохрому P-450 утворюються вільнорадикальні інтермедіати, у тому числі радикали СС₃Оя₂, які здатні ініціювати процеси ПОЛ без участі іонів заліза (II) ( Waller R.L. et.al., 1983). Окиснювання CCl₄ також призводить до утворення супероксидного аніонрадикалу О?₂ (Leibovitz B.E., Siegel B.V., 1980). Система Fe-аскорбат у фракціях мікросом ініціює ПОЛ, що супроводжується генерацією синглетного кисню О¹₂ за механізмом Руссела (Wefers H., 1986).

Антиоксидантну активність поліфенолів досліджували також на моделі Н₂О₂-ініційованого ВРО ліпідів сироватки крові інтактних щурів хемілюмінісцентним методом при +37С у скляній кюветі з постійним перемішуванням на хемілюмінометрі ХЛ-01, оснащеному ФЕУ-51. Реакцію ініціювали додаванням 0,1 мл 3% Н₂О₂. Рівень хемілюмінісценції оцінювали за максимумом спалаху світіння сироватки. Антиоксидантну активність речовин оцінювали за величиною ІD₅₀, що характеризує концентрацію речовини в мкг/мл, яка інгібує ПОЛ мікросом або сироватки на 50%. Чим менше значення ІD₅₀, тим більш активна речовина.

Токсикологічну характеристику досліджуваних БАР і препаратів на їхній основі оцінювали на мітохондріальній тест-системі полярографічним методом за виявлення ефекта роз'єднання процесів окиснювання і фосфорилювання мітохондрій і впливу на ендогенне дихання гепатоцитів та на дихання гепатоцитів на екзогенному субстраті сукцинаті натрію у системі in vitro (Ротенберг Ю.С., 1973).

Фармакологічну активність препаратів досліджували на моделях ураження печінки щурів CCl₄ і етанолом окремо та CCl₄ у комбінації з етанолом. Досліджувані препарати тваринам вводили у вигляді суспензій.

Гепатопротекторну дію досліджуваних препаратів оцінювали за функціональною активністю мікросом печінки щурів в умовах гострого CCl₄-гепатиту (Добрынина О.В. и др., 1987). Ліпофен досліджували у дозах 25, 50, 100 і 200 мг/кг, ФХ із сої, есенціале - в дозах 100 і 200 мг/кг, субстанції флакумін і силібор - у дозі 100 мг/кг, таблетки силібор за діючою технологією - в дозах 130 і 260 мг/кг, таблетки силібор за новою технологією - в дозах 65, 130 і 260 мг/кг, субстанцію альтан у дозі 0,5 мг/кг, таблетки альтан у дозах 0,5 і 1 мг/кг, субстанцію піфламін і таблетки піфламін у дозі 100 мг/кг вводили внутрішньошлунково через 2-3 години після введення CCl₄. Функціональний стан виділених за методом (Kamath S.A., Narayan К.A., 1972) мікросом оцінювали за їх гідроксилазною активністю після введення субстанцій і препаратів тваринам на тлі патології з CCl₄ за швидкістю окиснювального гідроксилювання субстрату амідопірину (V_{амідоп.}/V_НAДФН) полярографічним методом (Чистяков В.В. и др., 1977).

Репаруючий ефект препаратів ліпофен, ФХ із сої та ессенціале оцінювали за вбудовуванням ненасичених фосфоліпідів, що містяться в них, в ушкоджені мембрани мікросом двома способами. Першим - непрямим за відновленням швидкості споживання кисню при ферментативному ПОЛ мікросом після введення досліджуваних препаратів тваринам на тлі CCl₄, і другим - за вмістом вбудованих ненасичених фосфоліпідів препаратів у мембрани ЕР, з визначенням вмісту по фосфору (Fiscke C. H., Subbarow Y., 1925), після введення їх у дозі 100 мг/кг на тлі патології з CCl₄. Швидкість споживання кисню при ферментативному ПОЛ мікросом після введення препаратів тваринам на тлі патології з CCl₄ вивчали, як описано в роботі (Гордиенко А.Д. и др., 1992).

Гепатопротекторну активність ліпофену, есенціале й ФХ із сої вивчали також за біохімічними показниками в умовах гострого CCl₄-гепатиту за такою схемою: CCl₄ щурам уводили підшкірно в дозі 4 мл/кг маси тварини у вигляді 50% олійного розчину чотирикратно через 1 день. Ліпофен уводили щурам внутрішньошлунково в дозах 100 і 250 мг/кг, есенціале і ФХ із сої - у дозі 250 мг/кг маси тварин, починаючи з 2-го дня експерименту щодня протягом 6 днів. У сироватці крові визначали активність фруктозо-1-фосфатальдолази, вміст тригліцеридів, холестерину та б-холестерину (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982). У тканині печінки визначали вміст глікогену (Seifter S., 1950), ВГ (Прохорова М.И., 1982), ТБК-реактивні продукти (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977), білок, загальні ліпіди (Колб В.Г., Камышников В.С., 1976).

Гепатопротекторну активність препаратів за функціональною активністю мітохондрій оцінювали на моделі гострого алкогольного гепатиту, викликаного введенням 50% етилового спирту щурам внутрішньошлунково в дозі 6 г/кг (Cottalasso By D., et al., 1978). Ліпофен, ФХ із сої і есенціале в дозах 250 і 500 мг/кг, субстанцію силібор у дозі 500 мг/кг, субстанцію флакумін у дозах 100, 250 і 500 мг/кг, субстанцію піфламін у дозах 100 і 500 мг/кг, таблетки піфламін у дозі 100 мг/кг, субстанцію альтан у дозах 0,5 і 5 мг/кг, та таблетки альтан у дозі 1 мг/кг уводили тваринам внутрішньошлунково через 30 хв після введення етанолу. Дози гепатопротекторів є оптимальними: вони були підібрані в попередніх експериментах. Контрольні тварини одержували етанол в еквіоб'ємній з гепатопротекторами кількості дистильованої води. Функціональний стан виділених мітохондрій оцінювали в метаболічних станах (V_енд.), (V_сук.) та (V_АДФ/V_сук.).

Гіполіпідемічну активність ліпофену в порівнянні з есенціале вивчали на моделі експериментальної гіперліпідемії у щурів, яку відтворювали введенням 50% розчину етилового спирту внутрішньошлунково в дозі 6 г/кг протягом 3 днів. Ліпофен уводили внутрішньошлунково в дозах 250 і 500 мг/кг, есенціале - у дозі 250 мг/кг. Обидва препарати вводили протягом 3 днів за 20 хв до введення етилового спирту. У печінці і сироватці крові визначали вміст загальних ліпідів з застосуванням діагностичних наборів реактивів (фірма "Лахема", Чехія). Екстракцію ліпідів з печінки здійснювали по Фолчу (Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н., 1985). Вміст глікогену в печінці визначали за методом (Seifter S., 1950).

Гепатопротекторну активність ліпофену досліджували на моделі експериментального хронічного гепатиту у щурів, який відтворювали введенням CCl₄ підшкірно 4 рази на тиждень у дозі 1,5 мл 67% олійного розчину на 1 кг маси тварини протягом 6 тижнів (Солопаева И.М. и др. 1980). Препаратами порівняння були есенціале і флакумін. Ліпофен і есенціале в дозах 250 і 500 мг/кг і субстанцію флакумін у дозі 250 мг/кг уводили всередину 6 разів на тиждень, у тому числі й після кожної ін'єкції CCl₄. Печінка піддавалася морфологічному вивченню, а в одержаній сироватці крові визначали білковозв'язаний оксипролін за різницею загального і вільного оксипроліну.

Дослідження фармакокінетики ФХ ліпофену виконані на базі відділу молекулярної біології і біохімії онтогенезу НДІ Харківського національного державного університету ім.Н.В.Каразіна (зав.відділом. д.б.н., проф.Божков А.І.).

Для дослідження фармакокінетичних параметрів ФХ ліпофену застосовували метод радіоактивних ізотопів, який дозволяє вивчити фармакокінетику мічених екзогенних фосфоліпідів препарату, що вводяться в організм тварин, і є одним з найбільш чутливих методів. Експерименти проводили на щурах-самцях 3 місячного віку лінії Вістар масою 120-140 г.

Для вивчення фармакокінетики ліпофену вибірково вводили ¹⁴С-паль-мітинову кислоту (ТУ 95.7070; питома радіоактивність 560 ГБк на ммоль) у положенні 1ФХ ліпофену. Ліпофен, розчинений у метанолі, обробляли розчином йоду для відщеплення ацильного угрупування (Финдлей Дж., Эванз У., 1990). Утворений при цьому 1-лізофосфатидилхолін (2-ацил-S_nгліцеро-3-фосфохолін) піддавали ферментативному ацилюванню. З цією метою його інкубували з ¹⁴С-пальмітиновою кислотою, коензимом А, АТФ і мікросомальною фракцією печінки (Бергельсон Л.Д. и др. 1981). Мікросомальну фракцію виділяли з печінки за методом (Карузина И.И. и Арчакова А.И., 1977).

Для приготування ліпофену до ФХ (300 мг) додавали 32 мг флакуміну, 6,5 мг вітаміну В₆, 6,5 мг вітаміну В₁, 6 мг вітаміну Е і 87 мг соєвої олії. До цієї суміші компонентів додавали 25 мл 70% етанолу і ретельно перемішували, після чого упарювали до 5 мл і вводили експериментальним тваринам внутрішньошлунково в дозі 6 мг на 100 г маси тварини. Фармакокінетичний профіль зазначеної дози відповідав фармакокінетичному профілю умовнотерапевтичної дози препарату. Після введення препарату тваринам через 0,5, 1, 2, 4, 6, 12 і 24 год збирали сечу. Після забою тварин після вказаних проміжків часу збирали кров, брали наважки печінки, селезінки, нирок, серця, мозку і м'язів. В аліквоті тканини (100-200 мг) визначали радіоактивність міченого ФХ препарату за методом (Озрина Р.Д. и др., 1979). Імпульси у хвилинах переводили в мкг на 1 г тканини або в мкг на 1 мл біологічної рідини по калібровочній кривій, побудованій попередньо. Питому радіоактивність ліпідів у мікросомах визначали в імп / (хв на 100 мг ліпідів) (Озрина Р.Д. и др., 1979). Основні фармакокінетичні параметри розраховували згідно з (Kochak G.M. et.al., 1987).

Для аналізу розподілу міченого ФХ препарату в клітинах печінки виділяли мікросоми, з яких екстрагували ліпіди та аналізували їх методом тонкошарової хроматографії (Божков А.И. и др., 1987).

На наступному етапі вивчали гепатопротекторну активність альтану в умовах гострого і хронічного токсичних гепатитів за функціональними і біохімічними показниками у гомогенаті печінки і у сироватці крові щурів.

Гострий токсичний гепатит відтворювали введенням CCl₄ внутрішньошлунково в дозі 3 мл/кг маси тіла тварини у вигляді 50% олійного розчину протягом 2 днів. Таблетки альтану у дозі 1 мг/кг уводили тваринам внутрішньошлунково через 1 год після введення CCl₄.

Вивчення впливу таблеток альтану на функціонально-біохімічні показники печінки безпородних щурів-самців масою 200-220 г вивчали також в умовах хронічного гепатиту, який викликали шляхом підшкірного введення 50% олійного розчину ССl₄ у дозі 4 мл/кг маси тіла 3 рази на тиждень протягом 30 днів. Паралельно з введенням CCl₄ тварини довільно вживали 5% розчин етилового алкоголю з поїлок (Мансурова И.Д., и др. 1976). Таблетки альтану у дозі 1 мг/кг уводили тваринам внутрішньошлунково щодня. У дні поєднаного введення гепатотоксину і альтану його вводили через 1 год після введення CCl₄. Через 24 год після останнього введення CCl₄ щурів забивали. Як препарат порівняння використовували силібор у дозі 25 мг/кг. Функціонально-біохімічні показники печінки оцінювали за показниками швидкості секреції жовчі, вмісту холестерину і жовчних кислот у жовчі (Мирошниченко В.П., и др., 1978), вмісту глікогену (Seifter S., 1950), ТБК-реактивних продуктів (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) і ВГ (Прохорова М.И., 1982), у тканині печінки та сироватці крові, в якій визначали активність АлАТ, АсАТ, ЛФ, загальний білок (Колб В.Г., Камышников В.С., 1976) і холестерин (Мирошниченко В.П. и др., 1978).

Можливу токсикологічну характеристику нових БАР і препаратів на їх основі вивчали за ефектом роз'єднання ОФ при дії останніх на мітохондрії та ізольовані гепатоцити у системі in vitro (Ротенберг Ю.С., 1973).

Вивчали гостру токсичність за Пастушенко Т. В. та ін., (1985) препарату ліпофен.

Отримані результати опрацьовані методами варіаційної статистики з використанням критерію Стьюдента (Беленький М.Д., 1963; Ребова А.Ю., 2002).

Вплив низьких температур і флавоноїдних субстанцій на метаболічну активність мікросом, мітохондрій та ізольованих гепатоцитів з печінки щурів у системі in vitro.

Виділені з печінки щурів ізольовані гепатоцити, мікросоми і мітохондрії, які перед їх використанням в експерименті як за звичай витримують у гіпотермічних умовах при +2ч+4С, або при глибоких низьких температурах (-196С) чутливі до змін функціональних характеристик і обмежені терміном їх зберігання (Кравченко Л.П. и др., 1989). Визначення припустимих строків зберігання вказаних об'єктів, при яких ще не змінюється їх функція, і можливість витриманих при вказаних температурах об'єктів використовувати в скринінгу на гепатопротекторну, антиоксидантну активність і токсичність в системі in vitro, може значно скоротити кількість тварин у фармакологічному експерименті (Seglen P. 1976).

При аналізі результатів дослідження було встановлено, що витримування вказаних об'єктів при +2ч+4С не більше 5 год не приводить до змін дихання і ОФ в ізольованих мітохондріях і гепатоцитах, а в мікросомах і ізольованих гепатоцитах не змінюється активність ферментативного та аскорбатзалежного ПОЛ, гідроксилазна активність і вміст цитохрому Р-450.

Заморожування мікросом до -196С не приводило до зміни гідроксилазної активності і вмісту цитохрому Р-450 у порівнянні з інтактними (дослідження проводили після їх відігрівання), а в гепатоцитах, кріоконсервованих з 10% ДМСО до -196С і в наступному відігрітих, гідроксилазна активність і вміст цитохрому Р-450 зберігається на рівні 80-100%, ОФ мітохондрій - на рівні 40%, що є достатньо високими показниками функціональної активності органел.

При дослідженні впливу силібору і флакуміну на вивчаємі об'єкти встановлено, що вказані флавоноїди у вивчених дозах не змінюють дихальну активність гіпотермічно витриманих і кріоконсервованих з 10% ДМСО до -196С гепатоцитів, у порівнянні зі свіжовиділеними гепатоцитами (не чинять токсичної дії) і інгібують ПОЛ гіпотермічно витриманих і заморожених до -196С мікросом, в такій же мірі, як і в свіжовиділених мікросомах.

Отже, мікросоми для вивчення антиоксидантних властивостей і ізольовані гепатоцити для вивчення можливих токсичних властивостей, можна використовувати протягом не більше 5 год їх зберігання при +2-+4С, а заморожені мікросоми і кріоконсервовані з 10% ДМСО гепатоцити до -196С і відігріті - в зручний для дослідів час.

Фармакологічне вивчення есенціальних фосфоліпідів із сої та розробка складу і дослідження фармакологічної дії і фармакокінетики нового комплексного гепатопротектора ліпофену.

Основною метою роботи були установлення складу та вивчення фармакологічної дії комплексного гепатопротектора ліпофену.

Оптимальний склад синергічної композиції препарату ліпофен був підібраний на підставі скринінгових досліджень: вивчення антирадикальних, антиоксидантних і антитоксичних властивостей складових препарату - поліненасиченого ФХ із сої, флавоноїду флакуміну, вітамінів, -токоферолу, тіамінброміду і піридоксину гідрохлориду окремо і у композиції.

Фосфоліпідний компонент ліпофену - поліненасичений ФХ із сої, який складає 40-52% 1,2 дилінолеїлфосфатидилхоліну (ДЛФХ) від загальної кількості ФХ препарату, отриманий за оригінальною технологією і захищений авторським свідоцтвом №1622980 (Улесов А.В. и др., 1990). ДЛФХ заповнює наявні дефекти мембрани, зменшує компактність мембрани, збільшує її гнучкість і плинність, активізує мембранозалежні процеси обміну речовин у клітині (Ипатова И.М., и др. 2004). Фосфоліпіди (ФЛ) легко досягають печінки, оскільки вони не руйнуються в шлунку, та добре всмоктуються в ШКТ.

Введення флакуміну, що вміщує флавоноли: кверцетину - 10-15%, мірицитину - 80-85% і кемпферолу - 1-2% обумовлене високими антиоксидантними і гепатопротекторними властивостями, здатністю їх утворювати міцні чисельні комплекси з ФХ препарату і клітинними ФЛ, які блокують точки взаємодії патогенних речовин з ФЛ клітинних мембран (Насибулин Р.С. и др. 2002; Афанасьева Ю.Г. и др. 2007). ФХ у ліпофені має високу спорідненість з мембранами гепатоцитів, різко підвищує біодоступність флакуміну, тим самим підвищує активність препарату.

Введений до ліпофену -токоферол, як антиоксидант стабілізує клітинні мембрани, утворюючи міцні комплекси з ФХ і з продуктами гідролізу ліпідів мембран лізофосфоліпідами і вільними жирними кислотами (Квинн П.Дж., 2004). Тіамінбромід і піридоксингідрохлорид ліпофену є ефективними “гасниками” синглетного кисню, який утворюється при вільнорадикальних патологіях та стимулюють обмінні процеси в гепатоцитах при патології печінки (Гильмиярова Ф.Н., 1997; Дадали В.А., 1999).

Антирадикальні властивості ліпофену досліджували на моделі Fe²⁺АДФ-індукованого НАДФН-залежного ПОЛ інтактних мікросом (при цьому утворюється супероксидний аніонрадикал О?₂) у системі in vitro (Арчаков А.И., 1975). Супероксидний аніонрадикал грає головну роль в активації процесів ПОЛ при ураженні печінки. Антитоксичні - за гідроксилазною активністю мікросом печінки щурів, ураженої CCl₄, після введення поліненасиченого ФХ із сої та його комбінації з флакуміном і вітамінами (Добрынина О.В. и др. 1987). При ураженні печінки гідроксилазна активність мікросом знижується, а при лікуванні гепатопротекторами - відновлюється. В зв'язку з цим рівень гідроксилазної активності може бути показником і величини функціонального ураження печінки, і свідчити про вираженість фармакологічної дії використаного гепатопротектора.

Аналіз результатів досліджень показав, що інгібування ПОЛ інтактних мікросом ліпофеном в системі in vitro значно перевищує суму інгібування індивідуальних компонентів препарату, що свідчить про наявність сумісної дії компонентів - ефекту синергізму (табл.1).

Таблиця 1. Вплив препаратів на Fe²⁺АДФ НАДФН-залежне ПОЛ інтактних мікросом, n=6

№ п/п	Препарати	ID50, мкг/мл
1.	Ліпофен	30,0±3,0
2.	Фосфатидилхолін	9200,0±850,0*
3.	Тіаміну бромід	3600,0±350,0*
4.	Піридоксин гідрохлорид	11500,0±1100,0*
5.	-токоферол	1600,0±150,0*
6.	Флакумін	50,0±4,8*
7.	Есенціале	5400,0±520,0*

Примітка. * - відмінності достовірні в порівнянні з ліпофеном, p<0,05.

На тлі гострого CCl₄-гепатиту ліпофен в оптимальній дозі 100 мг/кг в найбільшій мірі відновлював гідроксилазну активність у порівнянні з ФХ із сої, ФХ+флакумін, ФХ+флакумін+-токоферол і есенціале, уведеними в дозах 100 мг/кг (табл.2).

Таблиця 2. Вплив ФХ і його комбінацій з флакуміном і вітамінами в дозі 100 мг/кг на гідроксилазну активність мікросом пи гострому ураженні печінки щурів CCl₄ in vitro, n=6

№ п/п	Умови досліду	Показник Vамідоп./VНAДФН
1.	інтактний контроль	1,72±0,07
2.	контрольна патологія, CCl4	1,10±0,03* p<0,001
3.	CCl4+ есенціале	1,49±0,10** p<0,01
4.	CCl4+ФХ	1,46±0,02** p<0,001
5.	CCl4+ФХ+ флакумін	1,54±0,05** p<0,001
6.	CCl4+ ФХ +флакумін+-токоферол	1,52±0,09** p<0,01
7.	CCl4+ліпофен	1,60±0,04** p<0,001

Примітки: 1.V_{амідоп.} /V_НAДФН - гідроксилазна активність мікросом; 2. * - відмінності достовірні в порівнянні з інтактним контролем, p<0,05; 3.** - відмінності достовірні в порівнянні з контрольною патологією, p<0,05; 4. n - кількісь тварин у групі.

фармакологічний гепатопротектор фосфоліпід поліфенол

Це обумовлено тим, що ліпофен (комбінація усіх компонентів) у значно більшому ступені, ніж компоненти (окремо) і есенціале має синергічну антирадикальну активність, зв'язує супероксидний аніонрадикал О?₂, що утворюється при ферментативному ПОЛ мікросом (Гордієнко А.Д., 2002).

На наступному етапі досліджували антирадикальні та антиоксидантні властивості ліпофену в порівнянні з фосфоліпідними препаратами - ФХ із сої та есенціале.

Ліпофен у порівнянні з ФХ із сої і есенціале проявляв на 2-3 порядки більш високу антиоксидантну активність при ферментативному і аскорбатзалежному ПОЛ відповідно, як в інтактних так і в ушкоджених CCl₄ мікросомах. Більш виразна антиоксидантна активність ліпофену на моделі CCl₄-ушкоджених мікросом у порівнянні з інтактними, зумовлена зв'язуванням не тільки ліпідних радикалів і АФК, але й можливо проміжних метаболітів CCl₄, що утворюються в ушкоджених мікросомах (табл.3). Виражена антиоксидантна активність ліпофену зумовлена прямою посилюючою антиоксидантною дією флакуміну, поліненасиченим ФХ із сої та зв'язуванням ліпідних радикалів і АФК, що утворюються в мікросомах (Сторожок Н.М. и др., 1994).

Таблиця 3. Вплив ліпофену, ФХ із сої і есенціале на ПОЛ мікросом із печінки щурів у системі in vitro, n=6

	ID50 мкг/мл
Препарати та субстанції	Мікросоми інтактних тварин	Мікросоми тварин, отруєних CCl4
	Ферментативне ПОЛ	Аскорбатзалежне ПОЛ	Ферментативне ПОЛ	Аскорбатзалежне ПОЛ
Ліпофен	30,0±3,0*	25,0±2,3*	20,0±2,0**	13,0±1,2**
Фосфоліпідні:
Фосфатидилхолін із сої	9200,0±900,0	42500,0±4000,0	2900,0±300,0	14500,0±1500,0
Есенціале	5400,0±500,0	91000,0±9000,0	-	-
Іонол	500,050,0	480,045,0	-	-

Примітки: 1. *- вірогідність у порівнянні з субстанцією для інтактних мікросом, p<0,05; 2. ** p<0,05 - вірогідність у порівнянні з субстанцією для отруєних CCl₄ мікросом, p<0,05; 3. n - кількість спостережень.

Вивчення гепатозахисних властивостей ліпофену в порівнянні з фосфоліпідними препаратами - ФХ із сої і есенціале було проведено на моделях гострих токсичних гепатитів, викликаних CCl₄ і етиловим алкоголем.

У проведених експериментах гостра інтоксикація щурів CCl₄ призводила до вірогідного зниження гідроксилазної активності, швидкості ліпопереокиснення при НАДФН-залежному ПОЛ мікросом, вмісту ФЛ мембран мікросом, що узгоджується з даними роботи (Арчаков А.И. и др., 2002) і може бути обумовлено інактивацією та різким зниженням вмісту Р-450 і деструкцією мембран (Добрынина О.В. и др., 1987).

На фоні CCl₄ ліпофен, ФХ із сої і есенціале відновлювали гідроксилазну активність мікросом (табл.4).

Зі збільшенням дози ліпофену до 100 мг/кг на фоні патології з CCl₄ підвищення гідроксилазної активності мікросом корелювало зі збільшенням швидкості поглинання кисню при ферментативному ПОЛ мікросом (табл.4). Інгібуючи процеси ПОЛ ліпофен більшою мірою, ніж поліненасичений ФХ із сої та есенціале збільшував швидкість споживання кисню при ферментативному ПОЛ (табл.4), що є непрямим підтвердженням вбудовування ФЛ в ушкоджені CCl₄ мембрани ЕР і активніше відновлював вміст ФЛ в ушкоджених мембранах ЕР, ніж поліненасичений ФХ із сої (рис.1). Флакумін препарату сприяв посиленню вбудовування поліненасиченого ФХ в ушкоджені CCl₄ мембрани ЕР, про що свідчить більш підвищена швидкість споживання кисню мікросомами при ферментативному ПОЛ і більш підвищений вміст ФЛ у мембранах ЕР під дією ліпофену у порівнянні з поліненасиченим ФХ із сої (табл.4, рис.1).

Таблиця 4. Вплив ліпофену, ФХ із сої і есенціале на окиснювальне гідроксилювання і швидкість поглинання кисню при ПОЛ мікросом в умовах гострого ураження печінки щурів CCl4 (нмоль О2хв^-1мг^-1 білка) in vitro, n(6-8)

Умови експерименту	Vамідоп./VНАД.Ф.Н	ПОЛ
		Ферментативне	Аскорбатзалежне
Контроль, інтактні тварини	1,72±0,07	36,48±2,06	138,43±6,69
CCl4, неліковані тварини	1,10±0,03*	18,50±1,02*	128,62±6,88
CCl4 +ліпофен, 25 мг/кг	1,25±0,05	20,10±1,66	124,07±10,7
CCl4 +ліпофен, 50 мг/кг	1,24±0,04	-	-
CCl4 +ліпофен, 100мг/кг	1,52±0,05**	31,26±5,18**	125,77±4,91
CCl4 +ліпофен, 200мг/кг	1,45±0,06**	-	-
CCl4 +ФХ із сої, 100 мг/кг	1,40±0,02**	28,51±2,35**	108,25±13,18
CCl4 +ФХ із сої, 200 мг/кг	1,40±0,04**	-	-
CCl4 + есенціале, 100 мг/кг	1,50±0,04**	30,12±2,55**	115,29±11,66
CCl4 + есенціале, 200 мг/кг	1,42±0,04**	-	-

Примітки: 1. * - відмінність достовірна в порівнянні з контролем, p<0,05; 2.** - відмінність достовірна в порівнянні з CCl₄ , p<0,05; 3. n - кількість тварин в групі.



Рис.1 Репарація ліпофеном ушкоджених мембран ЕР: 1 - контрольні інтактні мікросоми; 2 - CCl₄ ушкоджені мікросоми; 3 - CCl₄ ушкоджені мікросоми ліпофен; 4 - CCl₄ ушкоджені мікросоми ФХ; 5 - CCl₄ ушкоджені мікросоми альтан; 6 - CCl₄ ушкоджені мікросоми піфламін; 7 - CCl₄ ушкоджені мікросоми флакумін; 8 - CCl₄ ушкоджені мікросоми силібор. По осі ординат - вміст фосфоліпідів, % від контрольного рівня.