Експериментальне обґрунтування створення нових гепатопротекторів на основі ессенціальних фосфоліпідів та поліфенолів

Доза 100 мг/кг для ліпофену є достатньою для заміщення втрачених ФЛ мембранами мікросом, уражених CCl₄, оскільки препарат максимально підвищував гідроксилазну активність і швидкість поглинання кисню при ферментативному ПОЛ мікросом, що узгоджується з даними (Добрыниной О.В. и др., 1987) по відновленню функціональної активності мікросом фосфатидилхоліновими ліпосомами.

У проведених дослідах по ураженню щурів CCl₄ спостерігали також підвищення вмісту ТБК-реактивних продуктів, зниження вмісту глікогену і ВГ у печінці, а у сироватці - підвищення активності ЛФ, АлАТ, гепатоспецифічного ферменту фруктозо-1-фосфатальдолази, вмісту холестерину, білковозв'язаного оксипроліну, зниження швидкості секреції жовчі і вмісту в ній холестерину та жовчних кислот у порівнянні з інтактними тваринами. Зміни зазначених показників також розглядають як найбільш характерні ознаки при токсичних гепатитах (Скакун Н.П., 1995).

На тлі інтоксикації CCl₄ ліпофен як і есенціале в дозі 250 мг/кг протидіють накопиченню ТБК-реактивних продуктів, про що свідчить достовірне в порівнянні з групою контрольної патології зниження майже в 4 рази рівня ТБК- реактивних продуктів у гомогенаті печінки, і значно, практично в однаковій мірі, але невірогідно відновлюють виснажені ресурси ВГ печінки. Ліпофен вірогідно на 60% і краще за ФХ із сої (50%) та ессенціале (44%), відновлює вміст глікогену в печінці.

У сироватці крові ліпофен і есенціале вірогідно по відношенню до контрольної патології нормалізували вміст тригліцеридів на 39% та 31% відповідно, і підвищували знижений вміст загальних ліпідів у печінці, але невірогідно. В однаковій мірі ліпофен і есенціале достовірно в порівнянні з контрольної патології знижували на 64% ферментативну активність фруктозо-1-фосфатальдолази в порівнянні з контрольною патологією, що є непрямим доказом мембранорепаруючих і мембраностабілізуючих властивостей ліпофену, в результаті чого усувається його вихід із клітин.

На наступному етапі проводили дослідження гепатопротекторної дії ліпофену в порівнянні з есенціале і ФХ із сої на моделі гострого отруєння щурів етанолом. Ацетальдегід і нестабільні вільні радикали, що утворюються в процесі метаболізму етанолу, пригнічували ОФ мітохондрій з печінки щурів (Valenаzuela A. et.al., 1985). Алкогольна інтоксикація призводила до зниження вмісту глікогену в печінці і підвищення вмісту загальних ліпідів і тригліцеридів у печінці та сироватці крові тварин, що є характерними показниками для даної патології печінки (Скакун Н.П., 1985; Игнатова О.М., и др., 1998; Пронько П.С. и др., 1999).

Ліпофен, есенціале і ФХ із сої в ефективних дозах (500 мг/кг) повністю відновлювали активність ОФ мітохондрій до рівня інтактних тварин в умовах алкогольної інтоксикації, гепатозахисний ефект яких пов'язаний з їх антиоксидантними властивостями, здатністю виступати в якості безпосередніх “пасток” вільних радикалів, рівень яких у печінці при метаболізмі етанолу збільшується (Valenаzuela A. et.al., 1985; Гордієнко А.Д., 1992) (табл.5).

Таблиця 5. Вплив ліпофену, ФХ із сої і есенціале на дихання і окислювальне фосфорилювання мітохондрій із печінки щурів в умовах гострого гепатиту, викликаного етанолом (нмоль О₂хв^-1мг^-1 білка) in vitro, n=6-8

Примітки: 1.* - відмінність достовірна в порівнянні з інтактним контролем, p<0,05; 2. ** - відмінність достовірна в порівнянні з етанолом, p<0,05; 3. n - кількість тварин в групі.

В умовах гіперліпідемії, викликаної введенням етанолу протягом 3 днів, ліпофен у порівнянні з есенціале ефективніше знижував рівень загальних ліпідів та тригліцеридів у печінці і сироватці крові щурів, а також підвищував вміст глікогену в печінці щурів. Такий ефект ліпофену, можливо, зумовлений посилюючою дією флакуміну, що міститься в препараті, яка виражається в підвищенні під дією флакуміну вмісту -холестерину сироватки крові (антиатерогенного субстрату) і зниженню до рівня контролю (інтактних тварин) вмісту тригліцеридів в умовах патології, і таким способом запобігати розвитку жирової дистрофії печінки (Гордієнко А.Д. та ін., 2007). У цьому випадку поліненасичений ФХ ліпофену можливо також чинить опосередкований антиоксидантний ефект, перешкоджаючи індукції ядерного рецептора CYP2E1, що викликає генерацію ацетальдегіду і вільних радикалів (Арчаков А.И. и др., 2002).

На наступному етапі вивчали гепатозахисні властивості ліпофену в порівнянні з есенціале і флакуміном в умовах хронічного гепатиту, викликаного CCl₄.

Об'єктивним показником інтенсифікації процесів фіброзування в печінці є збільшення білковозв'язаного оксипроліна крові. В оптимальній дозі 500 мг/кг ліпофен і есенціале практично в однаковій мірі достовірно знижували вміст білковозв'язаного оксипроліна в сироватці крові щурів з хронічним гепатитом, викликаним CCl4, що узгоджується з клінічними дослідженнями по зниженню білковозв'язаного оксипроліна в сироватці крові у хворих хронічними гепатитами при лікуванні препаратом есенціале форте Н (Бабак О.Я. та ін., 2001). За морфологічними показниками ліпофен зменшував порушення архітектоніки тканини печінки, некроз клітин, стимулював анізонуклеоз і збільшував кількість двоядерних клітин, що свідчить про інтенсифікацію регенераторних процесів (Сєров В.В., Лапиш К.М., 1989). За виразністю гепатопротекторної дії ліпофен може бути співставлений з есенціале, але як і есенціале поступається при цьому флакуміну.

Дослідження фармакокінетики ФХ ліпофену.

Максимальна концентрація радіоактивно міченого ФХ препарату ліпофен після його внутрішньошлункового введення в сироватці крові через 2 год складала 0,70 мкг/мл, період напіввиведення міченого ФХ препарату з сироватки складав 3,5 год.У печінці максимальна концентрація міченого ФХ ліпофену складала 4,0 мкг/г через 6 год, яка далі повільно знижувалась. Зіставлення кінетичних кривих міченого ФХ препарату ліпофен для сироватки, печінки та інших тканин дозволяє виявити нелінійність фармакокінетики ліпофену (Гордиенко А.Д., Божков А.И., 2001). Найбільш інтенсивно мічений ФХ ліпофену проникав у печінку, нирки і селезінку щурів. Дуже низький вміст міченого ФХ препарату в порівнянні з печінкою і селезінкою спостерігався в серці, мускулах і мозку. В елімінації лікарських речовин беруть участь нирки. Максимальна концентрація міченого ФХ у тканинах нирок дорівнювала 3,7 мкг/г, час досягнення якої відповідав 6 год. Період напіввиведення міченого ФХ препарату з нирок складав 11 год.

Екскреція лікарських речовин здійснюється із сечею, жовчю і фекаліями. Через 2 год після введення препарату екскреція мітки із сечею становила 19 мкг/(млч), тобто близько 30% від кількості введеного міченого ФХ препарату. Через 24 год радіоактивна мітка виявлялася у фекаліях тварин і становила близько 20-30% від введеного препарату.

Фосфоліпідні препарати беруть участь в репарації мембран (Кидд П.М., 1998). Нами установлено, що при включенні міченого ФХ препарату в мембрани ЕР вже через 30 хв після введення препарату в ліпідах мікросом виявлявся невеликий рівень радіоактивної мітки 530 імп/(хв на 100 мг ліпідів), а через 1 год - радіоактивність збільшувалася в 3 рази і залишалася на цьому рівні протягом 2 год, а потім знижувалася за 4 год. Таким чином, радіоактивна мітка ліпофену - ФХ дозволила виявити його в складі ліпідних компонентів мікросом.

Відновлення молекул ліпідів, у тому числі і ФЛ, відбувається частково шляхом заміни окремих компонентів молекул (Четвериков Д.Л. и др., 1977). Виходячи з цього, ФХ ліпофену в мікроcомах печінки (основне місце синтезу) може піддаватися розщепленню, а окремі компоненти - жирні кислоти, гліцериди використовуватися в синтезі нових ліпідних молекул. У зв'язку з цим можна очікувати, що радіоактивна мітка ФХ буде виявлятися і в інших фракціях ліпідів. Розподіл ліпідів на фракції з мікросом печінки щурів, що одержували ліпофен, мічений за ФХ, дозволив виявити через 4 год після введення препарату радіоактивну мітку у ФЛ і неестерифікованих жирних кислотах (ФЛ мали питому радіоактивність 150 імп/хв(мг), а неестерифіковані жирні кислоти - 94 імп /хв(мг). Отже, ФХ, що входить до складу ліпофену, включався в мікросомальні мембрани печінки, де він через кілька годин піддавався розщепленню, окремі його компоненти, схоже, включалися в ресинтез, а частина метаболізувалась, очевидно, до СО₂ і Н₂О і виводилася з організму із сечею, фекаліями і через легені.

Гепатопротекторна активність рослинних поліфенолів і розроблених нових поліфеноловмісних лікарських препаратів - таблеток альтану, таблеток піфламіну, таблеток силібору за новою технологією, таблеток канафлазину, гранул силібору, гранул флакуміну, гранул калефлону, гіфларину (1% р-ну для ін'єкцій).

Наступним етапом було вивчення антирадикальних, антиоксидантних властивостей на моделі ферментативного та аскорбатзалежного ПОЛ інтактних мікросом щурів in vitro та гепатопротекторних властивостей поліфенольних препаратів альтану, піфламіну та референсних на моделях уражених мітохондрій і мембран ЕР гепатоцитів при гострих токсичних гепатитах, викликаних CCl₄ і етанолом. Вивчали також антиоксидантні властивості таблеток силібору, виготовлених за новою технологією, таблеток канафлазину, гранул флакуміну, гранул силібору, гранул калефлону і 1% розчину гіфларину для ін'єкцій, а також їх діючих субстанцій (табл.6).

Дослідження антиоксидантних властивостей поліфенолів.

В таблиці 6 наведені антиоксидантні властивості поліфенолів in vitro.

Таблиця 6. Вплив поліфенолів на ПОЛ мікросом із печінки щурів у системі in vitro, n=6

Примітки:1. * - вірогідність у порівнянні з субстанцією для інтактних мікросом, p<0,05; 2. ** - вірогідність у порівнянні з субстанцією для отруєних CCl₄ мікросом, p<0,05; 3. n - кількість спостережень.

Поліфеноли у порівнянні між собою не в однаковій мірі інгібували ПОЛ мікросом. З усіх поліфенолів найбільшу антиоксидантну активність проявляла субстанція альтану, яка перевершувала за активністю інші рослинні поліфеноли в 2-27 разів, ефект яких знижувався в ряду: альтан > гіфларин > калефлон > канафлазин>флакумін>силібор>піфламін (табл.6).

Низька антиоксидантна активність піфламіну обумовлена невисоким вмістом поліфенолів у субстанції (Яковлева Л.В., Герасимова О.А. и др., 2001). Антиоксиданта активність досліджених гепатопротекторних субстанцій була в 2-50 разів вищою від класичного антиоксиданта іонолу в системі in vitro.

При дослідженні антиоксидантних властивостей поліфенольних препаратів у системі in vitro гранули силібору, гранули флакуміну і таблетки канафлазину у перерахунку на діючі субстанції у порівнянні з їх лікарськими формами в більшій мірі інгібували ПОЛ мікросом (Гордієнко А.Д., 1995). У цьому випадку антиоксидантний ефект проявляли не тільки флавоноїдні субстанції, але й допоміжні речовини-синергісти: органічні кислоти і цукри. Останні регенерують антиоксиданти, що втратили електрони при взаємодії з вільними радикалами і підвищують ефективність дійсних антиоксидантів (Шкарина Е.И. и др., 2001). Найбільш виражений синергічний антиоксидантний ефект показаний для гранул флакуміну, який у 5 разів перевищував антиоксидантну активність субстанції флакуміну в інтактних мікросомах і в 6,5 разів - в ушкоджених CCl₄ мікросомах (табл.6).

Аналіз даних щодо антирадикальної активності альтану і піфламіну, проведений на моделі Н₂О₂-індукованої хемілюмінісценції сироватки інтактних щурів, підтверджує пряму кореляцію їхньої антирадикальної активності, вивченої на моделях ферментативного та аскорбатзалежного ПОЛ інтактних мікросом у порівнянні з флакуміном і силібором, активність яких зменшувалася в ряду: альтан>флакумін>силібор>піфламін. Виражена антирадикальна активність альтану, який містить суму елаготанінів, обумовлена високим вмістом ОН-груп в його молекулах у порівнянні з іншими субстанціями, їх взаємним розташуванням, особливостями структури самих молекул, які і визначають антиоксидантну активність (Гордієнко А.Д., Яковлєва Л.В., 1999). Гідроксильні групи елаготанінів, які взаємодіють з перекисними радикалами ліпідів, ефективно і нгібують ВРО в мікросомах печінки щурів (Takuo Okuda., et.al., 1983).

У порівнянні з усіма вивченими поліфенолами ліпофен виявив найбільшу антиоксидантну активність у тому числі й з субстанцією альтану, що має найвиразнішу антиоксидантну активність серед поліфенолів.

У системі in vitro субстанція флакуміну у поєднанні з поліненасиченим ФХ (капсулами ліпофену), у порівнянні з субстанцією альтану, інгібувала реакції ПОЛ на 50% у концентрації у 5,9 разу меншій (1,7 мкг/мл і 10,0 мкг/мл відповідно) при ферментативному і у 7,8 разу меншій (1,4 мкг/мл і 11,0 мкг/мл відповідно) при аскорбатзалежному ПОЛ мікросом (табл.3, табл.6). Такий ефект обумовлений дією поліненасиченого ФХ, що синергічно підсилює антиоксидантну дію флакуміну.

Таким чином, до найбільш потужних препаратів-антиоксидантів, вивчених у роботі, відносяться ліпофен, альтан і гранули флакуміну.

Дослідження гепатопротекторних властивостей препаратів альтану та піфламіну при гострих токсичних гепатитах.

При гострому токсичному гепатиті, викликаному CCl₄ субстанція альтану у дозі 0,5 мг/кг і таблетки альтану в дозі 1 мг/кг, субстанція піфламіну і таблетки піфламіну в дозі 100 мг/кг, субстанції флакуміну і силібору в дозі 100 мг/кг вірогідно підвищували гідроксилазну активність і не відновлювали швидкість поглинання кисню при ферментативному ПОЛ мікросом і вміст ФЛ мембран мікросом (табл.7, рис.1). Описані результати свідчать про антиоксидантні властивості поліфенолів та відсутність здатності до репаруючої дії на пошкодження мембран.

Таблиця 7. Вплив поліфенолів на окиснювальне гідроксилювання і швидкість поглинання кисню при ПОЛ мікросом в умовах гострого ураження печінки щурів CCl4 (нмоль О2хв^-1мг^-1 білка) in vivo, n (6-8)

Примітки: 1.* - відмінність достовірна в порівнянні з інтактним контролем, p<0,05. 2. ** - відмінність достовірна в порівнянні з етанолом, p<0,05. 3. n - кількість тварин в групі.

Таблетки силібору, виготовлені за новою технологією, на рівні таблеток, виготовлених за діючою технологією, мали антиоксидантні властивості в системі in vitro (табл.6) і відновлювали гідроксилазну активність мікросом печінки щурів в умовах токсичного гепатиту, викликаного CCl₄ (табл.7).

Гепатопротекторний ефект альтану, який містить суму елаготанінів, проявлявся в значно меншій дозі (у 100-500 разів) у порівнянні з поліфенолами піфламіном і традиційними флавоноїдами-гепатопротекторами силібором і флакуміном, обумовлений його високою антирадикальною та антиоксидантною активністю. Елаготаніни альтану, взаємодіючи зі структурними компонентами клітинних мембран, стабілізують їх і виконують при цьому функцію антиоксидантного захисту. Це створює умови для відновлення клітиною власних захисних механізмів. У той же час слід зазначити, що альтан як найбільш сильний антиоксидант, як і інші поліфеноли, не запобігав втратам ФЛ мембранами ЕР при гострому отруєнні щурів CCl₄. Це, очевидно, пов'язане з тим, що альтан як і інші поліфеноли, не репарують мембрани ушкоджених клітин і в недостатній мірі ефективно зв'язують ліпідні радикали і АФК, які утворюються при метаболізмі CCl₄ в умовах даної патології, що не дозволяє повністю запобігти деградації фосфоліпідів у мембранах.

Таким чином, гепатопротекторний ефект альтану в умовнотерапевтичній дозі 1 мг/кг обумовлений дією елаготанінів - (антиоксидантною, мембраностабілізуючою), а піфламіну в дозі 100 мг/кг - синергічним ефектом БАР піфламіну - флавоноїдів (антиоксидантним, мембраностабілізуючим), амінокислот, полісахаридів, макро- і мікроелементів (енергізуючими метаболічними властивостями).

Усі досліджені препарати альтан, піфламін, силібор, флакумін, поліненасичений ФХ із сої і препарат ліпофен гальмують ушкоджуючу дію токсикантів етанолу і CCl₄.

Разом з тим антиоксидантна і мембранорепаруюча активність ліпофену була вищою, ніж у фосфоліпідовмісних препаратах - поліненасиченого ФХ із сої та есенціале, а також у поліфеноловмісних препаратах - альтану, піфламіну, флакуміну і силібору (табл.4, табл.7, рис.1).

Гепатопротекторна дія ліпофену реалізується, з одного боку, інгібуванням флавоноїдами флакуміну ВРО і зменшенням дегенеративних наслідків гіперліпопероксидації мембран гепатоцитів, а з іншого боку, пов'язана зі здатністю поліненасиченого ФХ ліпофену репарувати ушкоджені мембрани гепатоцитів ( Саратиков А.С. и др., 1999). Крім того, ФЛ як основний клас мембранних ліпідів відіграють важливу роль у системі біологічної комунікації мембран, беручи участь у трансдукції сигналу в клітинних мембранах, у запуску реплікації, проліферації та диференціації клітин, які вкрай важливі для життєзабезпечення гепатоцитів (Ипатова О.М., 2004).

Таким чином, розроблений і створений комплексний гепатопротектор ліпофен добре всмоктується в ШКТ, поглинається печінкою і метаболізується в ній, а також зв'язує ліпідні радикали і АФК, відновлює обмінні процеси, біоенергетичну функцію мітохондрій та гідроксилазну функцію ЕР гепатоцитів, пригнічує фіброгенез, сприяє стимуляції регенерації печінки.

Вказане характеризує ліпофен як препарат, найбільш прийнятний до медичного застосування в порівнянні з усіма вивченими гепатопротекторами.

Дослідження гепатопротекторних властивостей таблеток альтану в порівнянні з таблетками силібору при гострому і хронічному гепатитах (за біохімічними показниками печінки і сироватки крові щурів).

З огляду на виразні антиоксидантні властивості альтану в порівнянні з іншими поліфенолами і на дані літератури щодо гепатопротекторних властивостей антиоксидантів, у роботі досліджений характер дії альтану на функціонально-біохімічні показники печінки щурів в умовах гострого гепатиту, викликаного CCl₄ і хронічного гепатиту, викликаного CCl₄ у комбінації з етанолом.

Альтану таблетки у дозі 1 мг/кг чинили виражену гепатопротекторну дію на тлі гострої патології з CCl₄, що характеризувалося відновленням біохімічних і функціональних показників печінки спостерігалося попередження запального процесу (зниження активності ЛФ), цитолітичного процесу (зниження активності АлАТ) і тенденцією до підвищення вмісту глікогену в печінці. Під впливом таблеток альтану покращилися показники жовчоутворення: вірогідно підвищувалися швидкість секреції жовчі і вміст у ній жовчних кислот.

Альтану таблетки у дозі 1 мг/кг в умовах 1-місячної хронічної патології, викликаної ССl₄ у комбінації з етанолом, обмежували прояви гепатотоксичності зазначених токсикантів.

Альтану таблетки у дозі 1мг/кг і силібору таблетки, введені тваринам усередину в дозі 25 мг/кг на тлі патології з CCl₄ і етанолом, вірогідно знижували активність АлАТ і вірогідно підвищували швидкість секреції жовчі і рівень в ній холестерину. Слід зазначити, що силібору таблетки в дозі 25 мг/кг вірогідно підвищували активність ЛФ на тлі патології. Альтану таблетки також підвищували активність ЛФ, але статистично не достовірно.

Таким чином, проведені дослідження показали, що альтану таблетки у дозі 1 мг/кг мають гепатопротекторні властивості, які вивчені на моделях гострого гепатиту, викликаного CСl₄ і хронічного гепатиту, викликаного CСl₄ у сполученні з етиловим алкоголем і не поступаються препарату силібор у дозі 25 мг/кг.

Дослідження можливих токсичних властивостей поліфенолів, ЕФЛ і препаратів на їх основі на мітохондріях і ізольованих гепатоцитах з печінки інтактних щурів в системі in vitro.

Вивчення токсикологічної характеристики нових БАР і препаратів на їх основі проводять з використанням ізольованих мітохондрій у системі in vitro і судять по ефекту роз'єднання окиснювання і фосфорилювання при дії останніх на мітохондрії (Ротенберг Ю.С., 1973).

Комплексний гепатопротектор ліпофен у капсулах і поліфенольні препарати (таблетки альтану, піфламіну, силібору, отримані за новою технологією, канафлазину, гранули флакуміну, силібору, калефлону, і 1% р-н гіфларину для ін'єкцій), а також їх діючі субстанції, на відміну від есенціале, не роз'єднували окиснювання і фосфорилювання при додаванні їх до вказаних органел в системі in vitro, що свідчить про нетоксичність діючих субстанцій і допоміжних речовин, які входять до складу лікарських препаратів.

Досліджувані субстанції і препарати на їх основі у вивчених нами дозах не пригнічують дихання інтактних гепатоцитів на сукцинаті натрію і не роз'єднують процеси окиснювання і фосфорилювання, що також свідчить про їх нетоксичність (Гордієнко А.Д., 1994).

Встановлено, що препарат ліпофен in vivo, за класифікацією токсичності речовин Сидорова К.К. належить до групи "малотоксичних речовин", при одноразовому внутрішньошлунковому введенні (ЛД₅₀ = 10000 мг/кг).

Висновки

У дисертаційній роботі науково обґрунтовані та експериментально розроблені нові ефективні природні гепатопротекторні засоби на основі ЕФЛ із сої та рослинних поліфенолів, вивчені особливості їхньої фармакологічної дії. Уперше вирішена проблема по створенню теоретичних передумов оцінки гепатопротекторних властивостей препаратів з різним механізмом дії, вивчених на ізольованих інтактних і ушкоджених мікросомах і мітохондріях гепатоцитів у системах in vitro та in vivo.

1. Мітохондрії, мікросоми і ізольовані гепатоцити, виділені з печінки щурів, можно зберігати при +2-+4С і використовувати в експерименті протягом не більше 5 год, а заморожені мікросоми і ізольовані гепатоцити з 10% ДМСО до -196С можно довгостроково зберігати при вказаній температурі без зміни функціональних характеристик і використовувати їх після відігрівання у зручний для роботи час. Показана можливість використання заморожених до -196С мікросом для скринінгу БАР на антиоксидантну активність і кріоконсервованих з 10% ДМСО до -196С ізольованих гепатоцитів - на токсичність.

2. Запропоновано концепцію створення ефективного комплексного гепатопротектора ліпофену та визначений його оптимальний склад, який представляє синергічну композицію ЕФЛ із сої, флавоноїдів флакуміну і вітамінів, що одночасно запобігає ушкодженню клітинних мембран і активації ВРО при токсичних ураженнях печінки. Механізм дії ліпофену полягає в синергічному ефекті поліненасиченого ФХ із сої та антиоксиданту флакуміну, що сприяє посиленню їх антиоксидантної активності і мембранорепаруючих властивостей.

3. Ліпофен відновлює біоенергетичну функцію мітохондрій і гідроксилазну мембран ЕР гепатоцитів, нормалізує ліпідний і вуглеводний обміни при гострих токсичних гепатитах, пригнічує фіброзування і стимулює регенераційні процеси в печінці при хронічному гепатиті. За антиоксидантною і гіполіпідемічною активністю ліпофен ефективніший за препарат порівняння - есенціале.

4. Фармакокінетика ліпофену, міченого за ФХ, носить нелінійний характер. Найбільша кількість міченого ФХ препарату накопичується в печінці і селезінці, низька - у серці, м'язах і мозку. Виділення продуктів метаболізму препарату здійснюється із сечею і фекаліями. ФХ ліпофену включається до складу мікросомальних мембран печінки, де через кілька годин метаболізується.

5. Визначені особливості антиоксидантної дії поліфенолів, ЕФЛ із сої і препаратів на їх основі на моделях ферментативного та аскорбатзалежного ПОЛ мікросом із печінки щурів полярографічним методом in vitro. Поліфеноли на три порядки більш сильні антиоксиданти, ніж фосфоліпіди. Встановлено, що в складі синергічних композицій істотно знижується концентрація поліфенолів-антиоксидантів. До найбільш потужних антиоксидантів відносяться ліпофен, альтан і гранули флакуміну. Виражену синергічну антиоксидантну дію проявляє субстанція флакуміну в ліпофені і гранулах у порівнянні з іншими поліфенольними субстанціями у всіх вивчених препаратах.

6. На мітохондріальній тест-системі з печінки щурів in vitro уперше вивчена токсикологічна характеристика поліфенольних і фосфоліпідних гепатопротекторів. Відсутність роз'єднувальної дії окиснювання і фосфорилювання в ізольованих мітохондріях і гепатоцитах при дії досліджених препаратів та їх субстанцій свідчить про нетоксичність діючих субстанцій і допоміжних речовин, що входять до їх складу.

7. Вперше визначений механізм антиоксидантної дії альтану і піфламіну, що включає антирадикальну активність стосовно ліпідних радикалів, радикалів кисню і нерадикальних похідних кисню. Встановлений позитивний інгібуючий вплив альтану і піфламіну на ПОЛ інтактних мікросом і перекисініційовану хемілюмінесценцію сироватки щурів та здатність відновлювати процеси гідроксилювання мікросом при гострому CCl₄-гепатиті і запобігати роз'єднанню процесів окиснювання і фосфорилювання в мітохондріях при гострому етанольному гепатиті у щурів.

8. Альтан у дозі 1 мг/кг при гострому CCl₄-гепатиті та хронічному гепатиті, викликаному CСl₄ в комбінації з етиловим алкоголем проявляє гепатопротекторні властивості (за біохімічними показниками печінки і сироватки крові щурів) не поступаючись препарату силібор у дозі 25 мг/кг.

9. Силібору таблетки, отримані за новою більш прогресивною технологією, на відміну від діючої, проявляють виражену гепатопротекторну дію, яка порівнювана з дією таблеток силібору, виготовлених за діючою технологією.

10. Експериментально показана перспективність використання у практичній медицині потенційних гепатопротекторів - препаратів ліпофену, альтану і піфламіну.

Список наукових праць за темою дисертації

1. Экспресс-метод определения антиоксидантной активности фенольних соединений / А.Д. Гордиенко, Н.Ф. Комиссаренко, В.В. Левченко, Я.И. Хаджай // Хим-фармац.журн. - 1988. - № 1. - С. 121-123. (Особистий внесок здобувача: розробка експрес-методу визначення антиоксидантної активності, проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

2. Гордиенко А.Д. Гепатопротекторный механизм действия флавоноидов. Обзор литературы / А.Д. Гордиенко // Фармация. - 1990. - Т. 39, № 3. - С. 75-78.

3. Гордиенко А.Д. Фармакологические и биохимические эффекты ненасыщенных фосфолипидов. Обзор литературы / А.Д. Гордиенко // Фармакология и токсикология. - 1990. - Т. 53, № 5. - С. 78-81.

4. Гордиенко А.Д. Влияние гепатопротекторов на функциональную активность митохондрий гепатоцитов в системах in vitro и in vivo / А.Д. Гордиенко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1992. - № 4. - С. 18-19.

5. Вплив флавоноїдів та ненасичених фосфоліпідів на функціональну активність мікросом печінки щурів при ССl₄ - гепатиті / А.Д. Гордієнко, В.В. Левченко О.В. Кудокоцева, І.Ф. Макаревич // Вісник фармації. - 1995. - № 1-2. - С. 105-107. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

6. Гордієнко А.Д. Модельне дослідження впливу гранульованих дитячих лікарських форм препаратів на субклітинні структури та ізольовані гепатоцити з печінки щурів / А.Д. Гордієнко // Вісник фармації. - 1995. - № 3. - С. 116-118.

7. Гордієнко А.Д. Вплив ненасичених фосфоліпідів та флавоноїдів на функціональну активність ізольованих мітохондрій та гепатоцитів із печінки щурів в системі in vitro / А.Д. Гордієнко, О.В. Улєсов // Фармац. журн. - 1996. - № 3. - С. 102-104. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, підготовка статті).

8. Гордієнко А.Д. Вплив таблеток силібору, одержаних за новою технологією на функціональну активність мікросом / А.Д. Гордієнко // Вісник фармації. - 1997. - № 1. - С.109-111.

9. Гордієнко А.Д. Вплив піфлацину на функцію мітохондрій із печінки щурів в умовах експериментального гепатиту / А.Д. Гордієнко // Вісник фармації. - 1997. - № 1. - С. 118-119.

10. Вплив піфлацину на функціональну активність мікросом з печінки щурів / А.Д. Гордієнко, Л.В. Яковлєва, А.М. Ковальова, О.В. Кудокоцева // Фармац. журн. - 1997. - № 6. - С. 76-78. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

11. Гордиенко А.Д. Влияние альтана на функциональную активность митохондрий и микросом из печени крыс при токсических гепатитах / А.Д. Гордиенко, Л.В. Яковлева // Эксперим. и клин. фармакология. - 1999. - Т.62, №4. - С.59-61. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

12. Гордієнко А.Д. Вплив нового вітчизняного фосфоліпідного гепатопротектора ліпофена на обмін ліпідів в печінці і сироватці крові щурів в умовах експериментальноі гіперліпідеміі / А.Д. Гордієнко, В.В. Левченко, О.В. Кудокоцева // Вісник фармації. - 2000. - №1(21). - С.57-58. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

13. Гордієнко А.Д. Ефективність рослинного поліфенольного препарата таблеток піфламін при експериментальних токсичних ураженнях печінки / А.Д. Гордієнко, О.О. Герасимова // Ліки. - 2000. - №3-4. - С.48-50. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

14. Гордієнко А.Д. Вплив таблеток альтан на перекисне окислення ліпідів та гідроксилазну активність мікросом із печінки щурів при ССІ4 -гепатиті / А.Д. Гордієнко, Л.В. Яковлєва // Експериментальна та клінічна медицина. -2000. - №4. - С.16-17. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

15. Гордиенко А.Д. Фармакокинетика липофена - нового комбинированного фосфолипидного гепатопротектора природного происхождения / А.Д. Гордиенко, А.И. Божков // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2001. - №.1. - С.66-67. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

16. Гордиенко А.Д. Гепатозащитное действие липофена - нового комбинированного фосфолипидного препарата природного происхождения /А.Д. Гордієнко // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2001. - Т.64, №3. - С.45-47.

17. Івахненко О.К. Вивчення антиоксидантної дії елагової кислоти при експериментальному тетрахлорметановому гепатиті / О.К. Івахненко, Т.С. Сахарова, А.Д. Гордієнко // Одеський медичний журнал. - 2002. - №2. - С.8-11.(Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

18. Гордієнко А.Д. Добір оптимального складу нового комбінованого фосфоліпідного гепатопротектора ліпофену на моделях функціональної активності мікросом із печінки щурів у системах in vitro і in vivo / А.Д. Гордієнко // Одеський медичний журнал. - 2002. - №3. - С.12-13.

19. Гордієнко А.Д. Вплив флавоноїдних субстанцій силібору і флакуміну на ліпідний обмін в сироватці крові щурів при гострому ССL4-гепатиті / А.Д. Гордієнко, В.В. Левченко, Л.В. Яковлєва // Фітотерапія. Науково-практичний часопис. - 2007. - №3. - С.22-24.(Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

20. Гордієнко А.Д. Порівняльне дослідження антиоксидантної активності флавоноїдів на нативних і заморожених до - 196 С мікросомах / А.Д. Гордієнко, Л.В. Яковлєва, О.В. Кудокоцева // Медична хімія. - 2007. - №3. - С.103-105. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

21. Гордієнко А.Д. Вплив препарату гіпоазотемічної дії канафлазину на ПОЛ мікросом з печінки щурів в системі in vitro / А.Д. Гордієнко, Л.В. Яковлєва // Фітотерапія. Науково-практичний часопис. - 2007. - №4. - С.34-36. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

22. Гордієнко А.Д. Інгібування Н₂О₂-індукованої люмінолзалежної хемілюмінісценції сироватки крові щурів новими рослинними поліфенолами / А.Д. Гордієнко, Л.В. Яковлєва // Медична хімія. - 2008. - Т.10, №1. - С.80-83. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

23. Гордієнко А.Д. Порівняльна гепатопротекторна активність нового комплексного препарату "Ліпофен" і есенціалє в умовах гострого CCl₄-гепатиту у щурів/ А.Д. Гордієнко, В.В., Левченко, Л.В. Яковлєва // Вісник фармації. - 2008. - Т.54, №2. - С.75-77. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

24. Гордієнко А.Д. Дослідження антиоксидантної активності препарату гіпоазотемічної дії "Гіфларин" на моделі ПОЛ мікросом з печінки щурів в системі in vitro / А.Д. Гордієнко, Л.В. Яковлєва // Фармац. журн. - 2008. - №4. - С.63-65. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

25. Гордієнко А.Д. Вплив флавоноїдної субстанції силібору на перебіг гострого ССl₄ - гепатиту / А.Д. Гордієнко, Л.В. Яковлєва // Фармац. журн. - 2008. - №5. - С.108-110. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

26. Гордієнко А.Д. Вплив нового комплексного гепатопротектора ліпофену на вміст ОП в сироватці крові щурів при хронічному тетрахлорметановому гепатиті / А.Д. Гордієнко, В.В. Левченко, О.В.Кудокоцева // Фітотерапія. Науково- практичний часопис. - 2008. - №4. - С.28-30. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

27. Гордієнко А.Д. Включення міченого фосфатидилхоліну із сої препарату ліпофен в мембрани ЕР печінки щурів / А.Д. Гордієнко, А.І. Божков, О.В. Кудокоцева // Медична хімія. - 2009. - Т. 11, №1. - С.138-140. (Особистий внесок здобувача: проведені експериментальні дослідження, аналіз даних, оформлення статті).

28. А. с. №902695 СССР, МКИ А 01 N 1/ 02 Способ консервирования гепатоцитов / Е.В.Кудокоцева, А.Д.Гордиенко, А.М.Белоус (СССР). -№2786967/28-13 заявл. 29.06.79 опубл.07.02.82, Бюл. № 5. (Особистий внесок здобувача: здійснення патентного пошуку, виконання експериментальних досліджень, оформлення патенту).

29. А. с. № 1622980 СССР, МКИ 5 С 07 F 9/10 ДСП. Способ получения соевого лецитина / А.В.Улесов, И.Ф.Макаревич, М.В. Мокроуз, Ю.М.Краснопольский, Я.И.Хаджай, В.П.Георгиевский, А.Д.Гордиенко, В.В.Левченко, А.Ф.Башура, А.И.Гризодуб, В.П. Милько (СССР). - № 4637499. заявл. 12.01.89; опубл. 22.09.90, Бюл.№ 12. (Особистий внесок здобувача: планування та проведення експериментальних досліджень, оформлення формули винаходу, опису до патенту).

30. Пат.40777, Україна, МПК А61Р 1/00 Спосіб фармакотерапії токсичних гепатитів / Яковлєва Л.В, Гордієнко А.Д, Сахарова Т.С, Леницька О.Б.; заявник Національний фармацевтичний університет. -№ 40777, заявл. 17.11.08; опубл. 27.04.09. - Бюл. №8. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментальних досліджень, оформлення патенту).

31. Ингибирование ферментативного перекисного окисления липидов микросом печени природными фенолами / А.Д. Гордиенко, В.В. Левченко, О.Н. Вертяева, Я.И.Хаджай // Биоантиоксидант: тез.докл. III Всесоюзной конференции, 27-29 июля 1989 г. - Москва, 1989.- Т. 1.- С. 77.

32. Левченко В.В. Гепатопротекторное действие "Эссенциале" у крыс с острым токсическим гепатитом / В.В. Левченко, А.Д. Гордиенко, О.Н. Вертяева // Реконструкция, стабилизация и репарация биологических мембран: тез. докл. Всесоюзного симпозиума. - Благовещенск, 1989. - С. 130.

33. Гордиенко А.Д. Влияние гепатопротекторов на функциональную активность микросом печени крыс в условиях острого токсического гепатита / А.Д. Гордиенко, В.В. Левченко, Я.И. Хаджай // Состояние и перспективы создания новых готовых лекарственных средств и фитохимических препаратов: тез.докл. Всесоюзной научно-технической конференции, 3-5 октября 1990 г. -Х, 1990. - С. 217.

34. Гордієнко А.Д. Коррекція флавоноїдами та фосфоліпідами патологічних змін мембран гепатоцитів // Сучасні проблеми фармації: тези доповідей республіканської науково- практичної конференції. Харків. - 1994. - С. 237.

35. Гордієнко А.Д., Яковлєва Л.В. Інгібування ферментативного та аскорбатзалежного ПОЛ мікросом рослинними фенолами in vitro // Сучасні проблеми фармації: тези доповідей республіканської науково-практичної конференції. - Х, 1994. - С. 238.

36. Гордиенко А.Д. Влияние флавоноидов на функциональную активность митохондрий и микросом из печени крыс в системах in vitro и in vivo / А.Д. Гордиенко // Тезисы докладов І-го съезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков, 22-23 ноября 1994 г. - Минск, 1994. - С. 34.

37. Гордієнко А.Д. Вплив гранульованих дитячих лікарських форм препаратів на мітохондрії та мікросоми із печінки щурів в системі in vitro / А.Д. Гордієнко // Тези доповідей I-го Національного зїзду фармакологів України, 27-29 вересня 1995 р. - Полтава, 1995. - С. 42.

38. Изучение гепатозащитной активности пифлацина - нового препарата из травы гороха посевного / Л.В. Яковлева, Л.М. Ковалева, А.Д. Гордиенко, В.В. Чикиткина, И.И. Авдеева // Тезисы докладов IV Российского национального конгресса "Человек и лекарство", 8-12 апреля 1997 г.- Москва, 1997. - С. 306.

39. Гордієнко А.Д. Гепатозахисна активність альтану при токсичних гепатитах / А.Д. Гордієнко, Л.В. Яковлева, В.В. Чікіткіна // Тез.доп. VII Україн.біохім.зїзду. Ч. ІІІ., вересень 1997р. - К, 1997. - С. 21-22.

40. Гордієнко А.Д. Ліпофен - новий вітчизняний фосфоліпідний гепатопротектор природного походження / А.Д. Гордієнко // Тез. доп. V Нац. з'їзду фармацевтів України, 6-10 вересня 1999 р. - Х, 1999. - С. 566.

41. Фармакокінетика ліпофена - нового вітчизняного фосфоліпідного гепатопротектора природного походження / А.Д. Гордієнко, А.І. Божков, В.В. Левченко, О.В. Кудокоцева // Тез. доп. V Нац. зїзду фармацевтів України, 6-10 вересня 1999 р. - Х, 1999. - С. 567.

42. Гордієнко А.Д. Гепатопротекторна активність фосфоліпідних препаратів / А.Д. Гордієнко, П.А. Гордієнко // Наука і соціальні проблеми суспільства: Медицина, фармація, біотехнологія: тез. доп. 3 Міжнар. наук.-практ. конф. ч.1., 21-23 травня 2003. - Х, 2003. - С. 82.

43. Гордієнко А.Д. Використання перекисіндукованої люмінолзалежної хемілюмінісценції в визначенні антиоксидантної активності лікарських препаратів / А.Д. Гордієнко, С.А. Гращенкова, П.А. Гордієнко // Наука і соціальні проблеми суспільства: Медицина, фармація, біотехнологія: тез. доп. 3 Міжнар. наук.-практ. конф. ч.1., 21-23 травня 2003. - Х, 2003. - С.83.

44. Гордієнко А.Д. Ефективність нових рослинних гепатопротекторних субстанцій при токсичних гепатитах / А.Д. Гордієнко, О.В. Кудокоцева // Наука і соціальні проблеми суспільства: Медицина, фармація, біотехнологія: тез. доп. 3 Міжнар. наук.- практ. конф. ч.1., 21-23 травня 2003. - Х, 2003. - С.84.

Анотація

Гордієнко А.Д. Експериментальне обгрунтування створення нових гепатопротекторів на основі есенціальних фосфоліпідів та поліфенолів.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора фармацевтичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2011.

Теоретично та практично обґрунтовано створення нового гепатопротектора, який пригнічує дію окисного стресу і відновлює структуру мембран і функції ушкоджених гепатоцитів, і є комплексним препаратом на основі ЕФЛ із сої, поліфенолів та вітамінів і має назву «Ліпофен».

Розроблений склад, вивчена фармакокінетика, механізм дії та гепатозахисні властивості ліпофену в порівнянні з фосфоліпідними препаратами - поліненасиченим ФХ з сої і есенціале та новими поліфенольними - альтаном та піфламіном і традиційними рослинними гепатопротекторами силібором та флакуміном. Механізм гепатопротекторної дії ліпофену полягає в синергічному ефекті - посиленні поліненасиченим ФХ із сої антиоксидантної дії флавоноїдів флакуміну, а також у мембранорегенеруючій дії препарату, за якими ліпофен перевершує вивчені гепатопротектори.

Альтан і піфламін відновлюють процеси гідроксилювання мікросом при гострому CCl₄-гепатиті і окиснювальне фосфорилювання в мітохондріях при гострому етанольному гепатиті у щурів. Альтан проявляє гепатопротекторну активність, порівнювану з активністю силібору.

Ліпофен як комплексний гепатопротекторний препарат, що по'єднує в собі мембранорепаруючий і мембранорегенеруючий ефекти поліненасиченого ФХ, антиоксидантну і стабілізуючу дію флакуміну і вітамінів рекомендується при лікуванні гепатитів, а також ряду інших захворювань печінки, пов'язаних з ушкодженням мембран і активацією ВРО в гепатоцитах. Їх підібране поєднання у препараті забезпечує його високу ефективність і в більш ранній термін відновлювати функції ушкоджених гепатоцитів і печінки, ніж препарати, що містять ЕФЛ і поліфеноли окремо.

Ключові слова: антиоксидантна активність, гепатопротекторна активність, мітохондрії, мікросоми, фосфатидилхолін, ліпофен, альтан, піфламін, силібор, флакумін.

Аннотация

Гордиенко А.Д. Экспериментальное обоснование создания новых

гепатопротекторов на основе эссенциальных фосфолипидов и полифенолов.- Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора фармацевтических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2011.

Проведены теоретические и экспериментальные исследования, результаты которых являются значительным обоснованием в создании нового гепатопротектора, угнетающего действие окислительного стресса и восстанавливающего мембраны и функцию поврежденных гепатоцитов, который является комплексным препаратом на основе ЭФЛ из сои, растительных полифенолов и витаминов и имеет название «Липофен».

Разработан состав, изучена фармакокинетика, механизм действия и гепатозащитные свойства липофена в сравнении с фосфолипидными препаратами - полиненасыщенным ФХ из сои и эссенциале, новыми полифенольными - альтаном и пифламином, традиционными растительными гепатопротекторами силибором и флакумином.

Механизм гепатозащитного действия липофена лежит в проявлении синергического эффекта - усилении полиненасыщенным ФХ из сои антиоксидантного действия флавоноидов флакумина, а также в мембранорегенерирующих свойствах препарата, по выраженности которых липофен превосходит изученные гепатопротекторы.

Липофен как комплексный гепатопротектор, действующий за счет мембранорепарирующего эффекта ЭФЛ, антиоксидантного действия полифенолов и витаминов, рекомендується при лечении гепатитов, а также ряда других заболеваний печени, связанных с повреждением мембран и активацией СРО в гепатоцитах.

Полифенольные препараты альтан и пифламин восстанавливают процессы гидроксилирования микросом при остром CCl₄-гепатите и ОФ в митохондриях при остром этанольном гепатите у крыс. Гепатопротекторный эффект альтана в дозе 1 мг/кг обусловлен наличием эллаготанинов, а пифламина в дозе 100 мг/кг - флавоноидов, аминокислот, полисахаридов, макро- и микроэлементов.

Исследования особенностей антиоксидантного действия разных гепатопротекторов на моделях ПОЛ микросом из печени крыс полярографическим методом в системе in vitro позволило установить, что антиоксидантная активность определяется природой, особенностями химической структуры, концентрацией и взаимодействием в лекарственной форме. Полифенолы на три порядка более сильные антиоксиданты, чем фосфолипиды. К наиболее сильным антиоксидантам относится липофен, альтан и гранулы флакумина. Выраженное синергическое антиоксидантное действие проявляет субстанция флакумин в липофене и гранулах флакумина в сравнении с другими полифенольными субстанциями во всех изученных препаратах и в большей степени на модели поврежденных CCl₄ мембранах микросом, в сравнении с интактными.

При изучении токсикологической характеристики исследуемых гепатопротекторов на митохондриальной тест-системе печени крыс in vitro установлено отсутствие разобщающего действия окисления и фосфорилирования в изолированных митохондриях и гепатоцитах при действии липофена в капсулах и полифенольных препаратов: таблеток альтана, пифламина, силибора по новой технологии и канафлазина, гранул силибора, флакумина и калефлона и 1% раствора гифларина и их субстанций. Это свидетельствует о нетоксичности действующих субстанций и вспомогательных веществ, которые входят в их состав.