Гетерогенність глікозилювання плазмового та клітинного a1-кислого глікопротеїну при порушеннях гемостазу

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

14.01.32 - медична біохімія

УДК 577.112.85:57.015.3:616-005.3

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ГЕТЕРОГЕННІСТЬ ГЛІКОЗИЛЮВАННЯ ПЛАЗМОВОГО ТА КЛІТИННОГО б1-КИСЛОГО ГЛІКОПРОТЕЇНУ ПРИ ПОРУШЕННЯХ ГЕМОСТАЗУ

МАШЕЙКО ІВАН

ВОЛОДИМИРОВИЧ

Луганськ - 2011

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор БРАЗАЛУК Олександр Захарович Дніпропетровська державна медична академія завідувач кафедри біологічної, медичної та фармацевтичної хімії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук Клімочкіна Олена Михайлівна Луганський національний університет ім. Тараса Шевченка проректор з науково-педагогічної роботи;

доктор біологічних наук, професор Орлова Олена Анатоліївна Луганський державний медичний університет завідувач кафедри фармацевтичної хімії.

Захист відбудеться “_18_” _березня_ 2011 року о _14_ год. 00_ хв. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.03 Луганського державного медичного університету (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1г)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ЛДМУ (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1г)

Автореферат розісланий “_15_”_лютого__ 2011 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, доцент Вишницька І.А.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Приєднання вуглеводних структур до поліпептидного ланцюга є найбільш поширеною посттрансляційною модифікацією: більша частина білків організму людини є глікопротеїнами [Lauc G., Zoldoљ V., 2010]. Згідно з сучасними даними, розвиток багатьох патологічних станів супроводжується порушеннями процесів глікозилювання протеїнів [Ohtsubo K., Marth J., 2006].

Одним з таких високоглікозильованих білків плазми крові є 1-кислий глікопротеїн (АГП, орозомукоїд) - білок гострої фази, який є гетерогенним глікопротеїном плазми крові з молекулярною масою від 35-37 кДa до 41-43 кДa [Fournier T. et al., 2000] та має широкий спектр біологічної активності. Структурно-функціональною особливістю АГП є значний ступінь глікозильованості Ї п'ять N-гліканів комплексного типу, що приєднані до залишків аспарагіну та складають 41-45% від загальної молекулярної маси [Hochepied T. et al., 2003].

Загальновідомо, що в основі розвитку багатьох патологічних станів лежать порушення системи гемостазу [Hamsten A. еt al., 2005; Булатова И.А., 2008]. Система гемостазу - це еволюційно сформована багатокомпонентна збалансована система, яка забезпечує процеси утворення фібринового згустку й підтримки крові в рідкому агрегатному стані [Папаян Л.П., 2003]. Стан системи гемостазу є віддзеркаленням гомеостазу всього організму. Безпосередню участь у регуляції системи гемостазу приймають як клітинні, так і плазмові фактори. Альфа-1-кислий глікопротеїн відіграє важливу роль у стабілізації системи гемостазу завдяки зниженню адгезивних властивостей [Макаров Е.В. и др., 2003] та агрегаційної здатності тромбоцитів [Costello M. et al., 1979] і є важливим гомеостатичним фактором організму [Макаров Е.В., Кривохижина Л.В., 2005]. Також цей глікопротеїн підвищує активність інгібітору активатору плазміногену (PAI-I), завдяки чому відбувається пригнічення системи фібринолізу та стабілізація тромбів [Boncela J. et al., 2001]. Тому викликає здивування той факт, що зв'язок концентрації та глікозильованості АГП плазми крові з показниками гемокоагуляції при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями гемостазу, до теперішнього часу не вивчався.

Є дані щодо локалізації АГП у білих клітинах крові за норми [Rahman M. et al., 2008]. Показано, що даний глікопротеїн сприяє проліферації лімфоцитів та їх інфільтраційній здатності [Pukhal'skii A.L. et al., 2001]. При генералізованих інфекціях та системній запальній відповіді виявлено, що поліморфно-ядерні нейтрофіли синтезують АГП, який залишається асоційованим з мембраною і може виступати в ролі прекурсору для біологічно-активних медіаторів [Poland D.C. et al., 2005]. На сьогоднішній день залишається нез'ясованим як змінюється кількість клітин, що мають мембрано-зв'язаний та внутрішньоклітинний АГП при різних патологічних станах.

Аналіз літературних джерел дозволяє припустити, що розподіл лейкоцитів за мембрано-асоційованим та внутрішньоклітинним АГП, концентрація і співвідношення глікоформ цього глікопротеїну в плазмі крові залежать від джерел синтезу і можуть відображати характер патологічного процесу. Таким чином, визначення мікрогетерогенності АГП в біологічних рідинах, оцінка його розподілу в клітинах крові можуть бути корисними у пошуках неінвазивних маркерів патологічних станів та в подальшому використовуватись в якості додаткових критеріїв при їх діагностиці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідної роботи кафедри біологічної, медичної та фармацевтичної хімії Дніпропетровської державної медичної академії «Структурно-функціональні зміни глікокон'югатів в онтогенезі та при патологічних станах» (№ державної реєстрації 0104U0010389, 2005-2010 рр.).

Мета і задачі дослідження.

Метою роботи було встановлення загальних закономірностей розподілу альфа-1-кислого глікопротеїну у популяціях лейкоцитів, змін його концентрації та структури олігосахаридного компоненту у біологічних рідинах при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями гемостазу.

Для реалізації поставленої мети передбачалося вирішити такі завдання:

1. Визначити концентрацію АГП в плазмі крові та сечі за норми і при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями гемостазу.

2. Провести порівняльний аналіз вмісту АГП, загального білка та альбуміна за норми та при зазначених вище патологічних станах.

3. Провести кореляційний аналіз між рівнем АГП в біологічних рідинах і показниками судинно-тромбоцитарного, коагуляційного, антикоагуляційного гемостазу та системи фібринолізу.

4. Отримати деглікозильовані антитіла до АГП, оцінити їх авідність та розробити на їх основі лектин-ферментний аналіз для кількісної та якісної оцінки вуглеводного компонента АГП.

5.Дослідити мікрогетерогенність АГП у нормі та при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями гемостазу і оцінити ступінь сіальованості, фукозильованості та розгалуженість N-гліканів у складі цього білка.

6. Дослідити розподіл популяцій лейкоцитів за наявністю зв'язаного з поверхнею та внутрішньоклітинного АГП у нормі та при захворюваннях, що супроводжуються порушеннями системи гемостазу.

7. Провести кореляційний аналіз між рівнем АГП у плазмі крові та розподілом популяцій лейкоцитів за локалізацією АГП в нормі та при порушеннях системи гемостазу.

8. Розробити методичні підходи до використання АГП як додаткового інформаційного критерію у діагностиці інфекційних захворюваннь печінки, онкогематологічної та серцево-судинної патології.

Об'єктом дослідження є глікозилювання та біологічна активність б1-кислого глікопротеїну за норми та при патології.

Предмет дослідження: концентрація, гетерогенність глікозилювання та характер розподілу у популяціях лейкоцитів б1-кислого глікопротеїну при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями гемостазу.

Методи дослідження: імунохімічний аналіз (імуноелектрофорез, імуноблотинг, імунодот), афінна хроматографія, електрофорез у поліакриламідному гелі, ферментативне деглікозилювання антитіл, кон'югація лектинів з пероксидазою кореня хрону, лектин-ферментний аналіз, лектиноблот, протокова цитофлуориметрія.

Наукова новизна одержаних результатів. Робота містить нові дані відносно метаболічних та структурно-функціональних змін АГП людини при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями гемостазу.

Встановлено, що концентрація АГП в плазмі крові залежить від типу патологічного процесу і досягає найбільш високих значень при запальних процесах вірусної етіології.

В ході роботи показано, що деглікозилювання антитіл до АГП не призводить до суттєвих змін їх антигензв'язуючої активності, що відкриває нові перспективи в розробці методів дослідження глікокон'югатів з використанням лектинів різної специфічності.

Доведено, що патологічний процес призводить до відповідних змін у посттрансляційному глікозилюванні АГП. За допомогою розробленого методу лектин-ферментного аналізу встановлено загальні закономірності зміни ступеню та характеру глікозильованості N-гліканів АГП при вірусних гепатитах, цирозі печінки, хронічних мієлолейкозах та серцево-судинній патології, що можуть у певній мірі відображати ступінь ураження паренхіматозних органів та системи кровотворення за цієї патології.

У виконаній роботі вперше встановлено кореляційний взаємозв'язок між рівнем альфа-1-кислого глікопротеїну та показниками судинно-тромбоцитарного, коагуляційного, антикоагуляційного гемостазу та системи фібринолізу. Показана активація системи гемостазу та негативний кореляційний зв'язок середньої сили з показниками АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів при хронічній серцевій недостатності. Вперше встановлений факт асоційованої з мікроальбумінурією секреції АГП через нирковий бар'єр, що супроводжується появою у сечі фракції димеру АГП з молекулярною масою 84 кДa. Вперше визначено наявність термінальної фукози у складі N-гліканів АГП у нормі та при патології. Вперше встановлено, що ступінь зв'язування лектинів з вуглеводними детермінантами АГП при хронічному мієлоїдному лейкозі та істинній поліцитемії знижується, що свідчить про значне зменшення N-гліканових структур у складі АГП за даної патології. Встановлено, що при гострому та хронічному вірусних гепатитах, сублейкемічному мієлозі підвищується ступінь звязування з MAA-II, SNA-1 та WGA, що свідчить про підвищення ступеню сіальованості та наявність розгалужених N-гліканів; а при цирозі печінки - змінюється характер фукозильованості N-гліканів АГП. Показано підвищення кількості лімфоцитів з поверхневою та внутрішньоклітинною локалізацією АГП при досліджуваних патологічних станах, що може впливати на функціональну активність цих клітин. Виявлений тісний зв'язок між рівнем б1-кислого глікопротеїну в плазмі крові та кількістю лейкоцитів, що експресують АГП на поверхні та всередині клітини.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів.

Розроблені методичні підходи для проведення скринінгових досліджень вуглеводних детермінант АГП методом лектин-ферментного аналізу з використанням деглікозильованих антитіл (Пат. №53176 Україна, МПК7(2009) A61B 5/145. Спосіб визначення ступеню сіальованості альфа-1-кислого глікопротеїну / Стєклєньова Н.І., Шевцова А.І., Бразалук О.З., Машейко І.В.; заявник і патентовласник Дніпропетровська державна медична академія.-
№ заявки: u 2010 03808; заявл. 02.04.2010; опубл. 27.09.2010, Бюл. №18.).

Отримані у роботі дані можуть бути використані для діагностики та прогнозування перебігу захворювань печінки та проліферативних захворювань системи крові. Встановлено нові критерії зміни рівня АГП, що дозволяють в подальшому використовувати цей показник як маркер трансформації істинної поліцитемії та хронічного мієлоїдного лейкозу у сублейкемічний мієлоз; гострого вірусного гепатиту у хронічний та цироз печінки. Значне підвищення сіальованості АГП, що відмічено при гострому та хронічному вірусних гепатитах дозволяє рекомендувати цей показник як додатковий інформаційний критерій прогнозу та моніторингу відповідних патологічних станів. Знайдено діагностично значущі співвідношення розподілу АГП у популяціях лейкоцитів, що можуть бути використані у розробці неінвазивних методів лабораторної діагностики.

У подальшому отримані дані рекомендовано до впровадження у навчальний та науковий процеси на кафедрах біологічної хімії, гематології, інфекційних хвороб, онкології, в роботу науково-дослідних лабораторій, а також використовувати при експериментальних та клінічних дослідженнях.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, встановлення мети та задач, обговорення результатів дослідження проведено спільно з науковим керівником - д.б.н., професором Бразалуком О.З. Дисертант самостійно провів патентний пошук і проаналізував теоретичні та експериментальні дані науково-дослідних робіт вітчизняних та зарубіжних вчених за темою дисертації. В ході роботи автор самостійно виконав всі експериментальні дослідження на базі кафедри біохімії, медичної та фармацевтичної хімії Дніпропетровської державної медичної академії. Дисертантом розроблено програму вирішення поставлених задач, інтерпретовано отримані результати, сформульовано основні висновки, проведено статистичну обробку одержаних даних та аналіз результатів, підготовані до друку основні матеріали за результатами дисертаційної роботи. У вивченні глікозильованості та розподілу альфа-1-кислого глікопротеїну допомагали Шевцова А.І., Письменецька І.Ю. та Кулініч А.О. В обговоренні отриманих результатів приймали участь: Шевцова А.І., Курята О.В., Письменецька І.Ю., Маслак Г.С.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на: IV Міжнародній науковій конференціі студентів і аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2008 р.), III Международной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы.» (Харьков, 2008 г.), V Міжнародній науковій конференції «Молодь та поступ біології» (Львів, 2009 р.), VII Міжнародній науковій конференції Парнас (Parnas conference, Ялта, 2009 р.), IV International Young Scientists conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» (Odessa, 2009), III Международный молодёжный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009» (Санкт-Петербург, 2009 г.), V Львівсько-люблінській конференції «Сучасні аспекти експериментальної та клінічної біохімії» (Люблін, 2010 р.), Х Українському біохімічному з'їзді (Одеса, 2010 р.), VI Міжнародній науковій конференції «Молодь та поступ біології» (Львів, 2010 р.), XI Національному конгресі кардіологів України (Київ, 2010 р.).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 4 статтях, серед яких 3 опубліковано у фахових виданнях, які затверджені ВАК України, та у 9 тезах, що опубліковані у матеріалах конференцій та з'їздів, отримано 1 патент на корисну модель.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури, що містить 183 посилань на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів. Роботу викладено на 133 сторінках друкованого тексту та проілюстровано в 11 таблицях та 37 рисунках.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Для досліджень використовували плазму, сечу та цільну кров людини. Дослідження проводили у хворих із порушеннями гемостазу, серед яких 69 хворих на гепатит В і С та цироз печінки вірусного ґенезу, із мієлопроліферативними захворюваннями (48), з серцево-судинною патологією (86). Для контролю використовували зразки крові 50 умовно здорових донорів. Матеріал для досліджень був люб'язно наданий співробітниками кафедр інфекційних хвороб та госпітальної терапії №1 Дніпропетровської державної медичної академії, відділення гематології міської клінічної лікарні №4 згідно договорам про спільне наукове співробітництво.

Концентрацію АГП визначали методом імунодот-аналізу [Nezlin R., Mozes E., 1995] із використанням поліклональних кролячих антил до АГП, отриманих в нашій лабораторії, та вторинних антитіл, що кон'юговані з пероксидазою хрону (Bio-Rad, США). Результати аналізу обчислювали за допомогою програми GelProAnalyser 3.1.

Фракції АГП у сечі визначали за допомогою електрофорезу у градієнті 5-17,5% поліакріламідного гелю у присутності додецилсульфату натрію за методом Леммлі [Laemmli U.K., 1970] з подальшим вестерн-блот аналізом [Towbin H., 1979].

Мікрогетерогенність АГП визначали методом лектин-ферментного аналізу, що був розроблений у нашій лабораторії, із використанням деглікозильованих за допомогою N-Glycosidase F (US Biological, США) антитіл до цього білку. Відсутність вуглеводів у складі деглікозильованих імуноглобулінів, їх афінність та специфічність перевіряли лектин- та імунодот-аналізом. Лектин-зв'язуючу активність оцінювали як відсоток зв'язування відповідного лектину з АГП плазми відносно норми у перерахунку на 1 мкг даного білка.

Розподіл клітин крові за локалізацією АГП визначали методом протокової цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл до плазмового АГП (Lifespan Biosciences, США) та вторинних антитіл до імуноглобулінів миші, що кон'юговані з фікоеритрином (Santa Cruz, Швеція). Пермеабілізацію клітин проводили розчином 0,025% дігітоніну (Fluka, Швеція). Аналіз проводили на протоковому цитометрі Coulter Epics XL (Beckmann Coulter, США).

Статистичну обробку результатів дослідження виконували методами варіаційної статистики з вираховуванням M±m, t, r, P. Використовували прикладні програми Statistica 6.0 for Windows XP. Перед застосуванням параметричних критеріїв проводилася перевірка гіпотези про нормальний закон розподілу випадкових величин. Відмінності вважали статистично достовірними при рівні p<0,05 [Носков В.Н., 1990]. У роботі використовували три рівні достовірності: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Концентрація б1-кислого глікопротеїну у плазмі крові при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями гемостазу.

Згідно наших досліджень, вміст АГП достовірно знижується порівняно з нормою при: гострому вірусному гепатиті В з гострою печінковою недостатністю, цирозі печінки, істинній поліцитемії, хронічному сублейкемічному мієлозі, облітеруючому ендартеріїті.

У ході досліджень було з'ясовано те, що вміст АГП при гострій печінковій недостатності значно знижується не тільки відносно групи контролю (p<0,01), але й порівняно з неускладненим вірусним гепатитом (p<0,01). Це може бути слідством загибелі значного числа гепатоцитів внаслідок прямої цитопатогенної дії вірусу і наростанні процесів декомпенсації [Майер К.П., 1999]. При цирозі печінки, обумовленим вірусним гепатитом, вміст АГП знижувався у 2 рази (р<0,001) вже на ранній стадії захворювання, порівняно з контрольною групою. Відомо, що хронічні гепатити часто призводять до розвитку фіброзу, який за несприятливого перебігу може завершитись цирозом печінки [Павлов Ч.С. и др., 2005]. Цироз характеризується переважанням процесів фіброзу паренхіми печінки з поступовим зниженням синтетичної активності гепатоцитів, що й обумовлює зниження рівню АГП у плазмі крові [Montazeri G. at al., 2005]. Таким чином, значне зниження концентрації цього глікопротеїну є несприятливим прогностичним показником перебігу вірусних гепатитів.

Оцінка концентрації АГП у плазмі крові досліджуваних з хронічними мієлолейкозами показала, що рівень цього глікопротеїну достовірно знижується при істинній поліцитемії (p<0,01) та хронічному мієлоїдному лейкозі (p<0,01). Таку картину можна пояснити тим, що в умовах довготривалого хронічного перебігу за мієлопроліферації, відбувається поступове зниження продукції гепатоцитами АГП. Зниження рівню АГП сприяє пригніченню проліферації клітин у осередках пухлинного росту шляхом підвищення ефективності дії інгібітору тирозинкінази [Gambacorti-Passerini C. et al., 2000].

Рівень цього глікопротеїну достовірно знижується при облітеруючому ендартеріїті і становить 0,63±0,09 г/л (p<0,01), що є характерним для хронічних запальних процесів [Higai K. et al., 2005].

Згідно наших досліджень, вміст АГП достовірно підвищується порівняно з нормою при: гострому вірусному гепатиті В, хронічному вірусному гепатиті С, хронічній серцевій недостатності II-III ФК та гострому інфаркті міокарду.

Оцінка концентрації АГП у плазмі крові хворих на вірусні гепатити показала, що рівень цього глікопротеїну достовірно збільшується при гострому вірусному гепатиті В (p<0,001) та хронічному вірусному гепатиті С (p<0,01). Привертає увагу той факт, що при гострих неускладнених вірусних гепатитах показники вмісту АГП значно перевищують як показники норми (p<0,001), так і показники при хронічних вірусних гепатитах (p<0,05). Ці дані підтверджують давно існуючу думку, що під впливом гострого запалення відбуваються адаптивні зміни у вигляді інтенсифікації метаболічних процесів у гепатоцитах, які яскравіше проявляються при ураженні інтактної печінки [Майер К.П., 1999]. Значне підвищення рівню АГП пояснюється його гепатопротекторними властивостями завдяки знешкодженню продуктів тканинного розпаду [Makarov E.V. et al., 2005] та пригніченню апоптозу гепатоцитів [Daemen M.A. et al., 2000].

При гострому інфаркті міокарду у першу добу відмічено незначне зростання рівню АГП відносно групи контролю (p<0,01), що можна пояснити тим, що пік підвищення рівню АГП за даної патології припадає на 2-3 добу від початку захворювання [Van Dijk W. еt al., 1998]. Концентрація АГП у плазмі крові досліджуваних груп з ХСН дещо підвищена відносно контролю, але достовірна різниця встановлена тільки у групі хворих з серцевою недостатністю III ФК (p<0,05).

У ході досліджень було з'ясовано те, що вміст АГП при облітеруючому ендартеріїті значно знижується не тільки відносно групи контролю, але й порівняно з хронічною серцевою недостатністю II-III ФК (p<0,001) та гострим інфарктом міокарду (p<0,001). Привертає увагу той факт, що відсутня достовірна різниця у рівні АГП у хворих з хронічною серцевою недостатністю III ФК та з гострим інфарктом міокарду у першу добу спостереження, що унеможливлює диференційну діагностику цих станів за рівнем АГП.

Згідно наших досліджень, вміст АГП перебуває у межах норми при сублейкемічному мієлозі (рис.1). Це може бути наслідком переходу захворювання у активну фазу, що супроводжується залученням до онкопроліферації лейкоцитарного ростку кровотворення. Як відомо, АГП синтезується поліморфноядерними нейтрофілами [Poland D.C., 2002], міститься у вторинних гранулах [Theilgaard-Mцnch K. et al., 2005] та секретується у відповідь на їх стимуляцію [Rahman M. et al., 2008]. Тому при субмієлозі відбувається збільшення кількості осередків пухлинного росту, у яких синтезується АГП. Таким чином, нормалізація рівню АГП при сублейкемічному мієлозі, свідчить не про стабілізацію процесу, а про подальше прогресування та поступову мієлоїдну метаплазію кісткового мозку та паренхіматозних органів.

Взаємозв'язок рівню АГП та показників системи гемостазу.

Альфа-1-кислий глікопротеїн -- один з малодосліджених компонентів системи гемостазу, який має допоміжне значення у механізмі згортання крові. Він є одним з найбільш гетерогенних глікопротеїнів плазми крові з молекулярною масою від 35-37 до 41-43 кДa, що залежить від структури вуглеводного компоненту та місця синтезу [Van Dijk W. et al., 1998]. Підвищення рівню АГП асоційовано з розвитком гострого інфаркту міокарда [Dennis C.W. et al., 2005], інсульту й поразкою периферичних артеріальних судин [Irmak S. et al., 2009], що дає змогу використовувати його у якості прогностичного маркеру розвитку серцево-судинної патології [Engstrцm G. et al., 2003]. Тому викликає здивування той факт, що взаємозв'язок концентрації АГП плазми крові з показниками гемостазу при різноманітних патологічних станах до теперішнього часу не вивчався.

У ході наших досліджень було показано, що між рівнем АГП плазми та показниками АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів існує негативний кореляційний взаємозв'язок середньої сили у всіх досліджуваних групах крім хворих на облітеруючий ендартеріїт. Цей факт збігається з даними [Макаров Е.В. и др., 2005] і свідчить про те, що АГП є важливим фактором судинно-тромбоцитарного гемостазу (табл.1). Даний вплив реалізується завдяки здатності АГП зв'язуватись з рецепторними білками поверхні тромбоцитів, а саме з глікопротеїнами Ic-ІІа, із наступним зниженням їх функціональної активності [Parise L.V. et al., 2006].

Особливої уваги заслуговує той факт, що у хворих на хронічну серцеву недостатність та у контрольній групі встановлено негативний кореляційний зв'язок між рівнем АГП плазми крові та швидкістю XII фактор-залежного фібринолізу. Ініціація коагуляції за внутрішнім шляхом відбувається завдяки активації фактору Хагемана (XII фактор) на фосфоліпідній мембрані тромбоцитів [Папаян Л.П., 2003]. Parise L.V. et al. вказують на те, що зниження активності ІІа рецепторів поверхні тромбоцитів під впливом АГП [Макаров Е.В. и др., 2003] призводить до перешкоджання процесу активації коагуляційних факторів на їх поверхні. Згідно з нашими даними подібна тенденція простежується у хворих на серцеву недостатність та у контрольній групі. Для хворих з облітеруючим артеріїтом дана тенденція не є характерною, що наводить на думку про порушення регуляції первинного судинно-тромбоцитарного гемостазу за цієї патології (табл.1).

Таблиця 2 Характер змін вуглеводного компоненту б1-кислого глікопротеїну в нормі та при патології

	Клінічні групи	Група контролю	Хворі ХІХС СН ІІ NYHA	Хворі ХІХС СН ІІI NYHA	Облітеруючий ендартеріїт
Судинно-тромбоцитарний гемостаз
	Кількість тромбоцитів (x109/л)	0,184	0,172	-0,052	0,109
	Нативна агрегація тромбоцитів (%)	0,103	0,026	0,101	0,008
	АДФ-індукована (10 мкг/мл) агрегація тромбоцитів (%)	-0,582*	-0,505*	-0,474*	-0,239
	Ристоміцин-індукована агрегація тромбоцитів (%)	-0,241	-0,283	-0,158	-0,374
Плазмова ланка системи гемостазу
	Протромбіновий індекс (%)	0,169	-0,187	0,261	-0,198
	Активований частковий тромбопластиновий час (с)	-0,074	0,349	0,064	-0,003
	Тромбіновий час (с)	0,122	-0,074	0,126	-0,234
	Фібриноген (г/л)	-0,104	0,048	-0,062	-0,207
Антикоагуляційний гемостаз
	Антитромбін ІІІ - активність (%)	0,145	0,259	0,348	0,574*
	XIII фактор - активність (%)	0,331	0,327	0,166	0,147
Фібринолітична система
	Розчинні фібрин-мономерні комплекси (мг/100 мл)	-0,317	-0,155	-0,221	-0,306
	XII фактор - залежний фібриноліз (хв)	-0,551*	-0,483*	-0,452*	-0,124
Примітка: *** - p<0,001; ** - p<0,01; * - p<0,05

Крім того, встановлено позитивний кореляційний взаємозв'язок між активністю антитромбіну III та концентрацією АГП у хворих на облітеруючий ендартеріїт (p<0,05), що потребує подальшого різнобічного дослідження.

Фракції АГП у сечі за норми та при патологічних станах.

Оцінка фракцій АГП сечі проводилась за методом SDS-електрофорезу у поліакріламідному гелі у присутності додецилсульфата натрію та наступним імуноблотингом з використанням антисироватки до АГП (рис.2). За результатами імуноблотингу встановлено, що у сечі хворих всіх досліджуваних груп превалювали фракції АГП з молекулярною масою 42 кДа; у хворих на ХСН III ФК та з облітеруючим ендартеріїтом виявлено додаткову фракцію з молекулярною масою 84 кДа. В літературі не знайдено даних щодо наявності високомолекулярних фракцій АГП у сечі [Magid E. еt al., 2005]. Лише у роботах [Rahman M. et al., 2008] було показано, що молекулярна маса АГП, синтезованого поліморфноядерними нейтрофілами (PMN-АГП) становить 50-60 кДа, у той час як плазмовий АГП, синтезований гепатоцитами, має молекулярну масу 42-45 кДа [Van Dijk W. еt al., 1998]. Обидві ізоформи АГП є продуктами експресії одного й того ж гену та відрізняються за характером посттрансляційних модифікацій. PMN-АГП є гіперсіальованою глікоформою АГП, що міститься у вторинних гранулах нейтрофілів та секретується у відповідь на їх стимуляцію [Poland D.C., 2002; Theilgaard-Mцnch K. et al., 2005].

Виходячи з того, що ні за яких інших умов високомолекулярні зони АГП нами не були виявлені, можна припустити, що вони утворюються за рахунок агрегації двох й більше молекул АГП. Враховуючи здатність АГП взаємодіяти з гідрофобними лігандами, у тому числі й з лікарськими засобами [Johnson D.A., Smith K.D., 2006], вірогідним, на наш погляд, є утворення таких форм під час лікування цими препаратами. Як це впливає на фармакологічні властивості останніх - питання майбутніх досліджень.

Зіставлення отриманих нами даних щодо фракцій АГП та концентрації у сечі загального білку, альбуміну й АГП свідчить про те, що поява у сечі білків з молекулярною масою меншою за 84 кДа є загальною ознакою порушення ниркового бар'єру. Комплексне дослідження даних показників дозволяє оцінити ступінь ураження нирок при хронічній серцевій недостатності.

Лектин-зв'язуюча активність N-гліканів АГП при патологічних станах.

Рівень АГП у плазмі крові залежить від багатьох факторів, а тому не відображає у повній мірі характер патологічного процесу. Тому, на наш погляд, більш інформативним є вивчення змін структури його вуглеводного компоненту. глікопротеїн кров патологічний гемостаз

Для дослідження лектин-зв'язуючої активності АГП були обрані наступні лектини: СоnА, що реагує з коровою манозою біантенних гліканів; LCA, що за специфічністю схожий з СоnА, але має більшу спорідненість до N-гліканів з коровою фукозою та фукозоспецифічні лектини AAL і LABA, чутливі до різних типів зв'язку між фукозою та глюкозаміном чи фукозою та галактозою; сіалоспецифічні лектини SNA-1 та MAA-ІІ, а також лектин WGA, що може зв'язуватись з кінцевими сіаловими кислотами та полі-N-ацетиллактозамінними залишками розгалужених N-гліканів.

В ході досліджень було встановлено, що ступінь зв'язування АГП плазми з СоnА при захворюваннях печінки, сублейкемічному мієлозі, хронічній серцевій недостатності, облітеруючому ендартеріїті знаходиться у межах норми та достовірно підвищується при гострому інфаркті міокарду (p<0,01). Враховуючи специфічність даного лектину [Антонюк В.О., 2005], можна стверджувати, що відносний вміст біантенних гліканів підвищується тільки при гострому інфаркті міокарду (табл.2).

Нами показано, що при хронічному мієлоїдному лейкозі та істинній поліцитемії достовірно знижується ступінь зв'язування вуглеводного компоненту АГП з усіма лектинами, що свідчить про зниження глікозильованості цього глікопротеїну за даної патології (табл.2).

Зв'язування АГП із лектином сочевиці (LCA) підвищувалось при цирозі печінки, гострому інфаркті міокарду та сублейкемічному мієлозі. Приймаючи до уваги значне посилення афінності цього лектину до корового триманозиду в присутності б(1>6)-фукози [Tamano K., 2005], можна припустити, що фукозилювання кору зростає при даних патологічних станах. Порівняння ступеню зв'язування АГП з лектинами LCA та AAL виявило, що перший лектин мав меншу афінність до АГП ніж AAL при цирозі печінки, сублейкемічному мієлозі та хронічному вірусному гепатиті С. Відомо, що лектин алеврії оранжевої має специфічність до фукози, зв'язаної не тільки б(1>6), а й б(1>3)-глікозидними зв'язками [Matsumura K., 2007], посилення взаємодії AAL з АГП може бути пов'язане з появою б(1>3)-фукози у складі олігосахаридних ланцюгів АГП.

Досить несподіваним було зниження взаємодії АГП з AAL порівняно з LCA при гострому інфаркті міокарду та сублейкемічному мієлозі. Беручи до уваги здатність LCA реагувати N-гліканами високоманозного типу, можна припустити, що при ГІМ підвищується вміст біантенних олігосахаридних структур у складі АГП, що містять корову б(1>6) фукозу.

Наші дослідження взаємодії АГП з LABA вперше дозволяють припустити, що N-глікани цього глікопротеїну зазнають термінального б(1>2) фукозилювання. За отриманими в роботі даними, ступінь звязування АГП з LABA підвищується при сублейкемічному мієлозі. У інших групах цей показник майже не відрізняється від норми. Враховуючи, що лектин кори золотого дощу звичайного реагує переважно з б(1>2)-зв'язаною фукозою N-гліканів [Пискарев В.Е., 2007], можна стверджувати, що АГП містить N-глікани з кінцевими залишками фукози і за норми, i при патології причому, ступінь фукозильованостi залежить від типу патологічного процесу. Отже, визначення взаємодії АГП з LABA може бути додатковим критерієм у діагностиці проліферативних захворювань крові.

Ступінь зв'язування АГП із сіалоспецифічним лектином SNA-1 достовірно підвищувалась при ГВГВ, сублейкемічному мієлозі та ГІМ; знижувалась - при ХВГС, цирозі печінки та облітеруючому ендартеріїті. Цей лектин взаємодіє із б(1>6)-сіаловими кислотами біантенних N-гліканів [Sherwani A.F., 2003], тому наші результати дозволяють зробити висновок про збільшення вмісту біантенних гліканів з кінцевою N-ацетилнейраміновою кислотою при ГВГВ та ГІМ. Цей висновок узгоджуться з результатами взаємодії АГП з іншим сіалоспецифічним лектином - МАА-ІІ, що має афінітет до сіалових кислот поліантенних гліканів зв'язаних б(2>3)-глікозидними зв'язками [D'Souza Y.B., 2009]. За нашими даними зв'язування з МАА-ІІ підвищувалось при ГВГВ, сублейкемічному мієлозі; знижувалось - при істинній поліцитемії та ХМЛ.

Зовсім інша картина спостерігалась при взаємодії АГП з WGA, який також володіє специфічністю до N-ацетилнейрамінової кислоти. Підвищення взаємодії виявлено у групах хворих з сублейкемічним мієлозом, гострим вірусним гепатитом В та гострим інфарктом міокарду. Враховуючи, що лектин зародків пшениці може зв'язуватись з поліантенними структурами [D'Souza Y.B., 2009], збільшення ступеню зв'язування даного лектину з вуглеводним компонентом АГП відносно SNА-1 вказує на підвищення вмісту саме поліантенних гліканів у складі даного глікопротеїну. При порівнянні зв'язування АГП з СоnА та WGA, виявлено зниження взаємодії з СоnА при сублейкемічному мієлозі, що підтверджує збільшення кількості розгалужених N-гліканів у складі цього глікопротеїну за даної патології. В нормі АГП плазми має незначну кількість таких структур, здебільшого вони притаманні для фетального б1-кислого глікопротеїну [Orczyk-Pawiіowicz M. еt al., 2006] та виявляються при злоякісній трансформації клітин [Handerson T. еt al., 2003], тож їх поява може слугувати додатковим маркером у діагностиці мієлопроліферативних захворювань крові.

Розподіл білих клітин крові за локалізацією б1-кислого глікопротеїну в нормі та при патологічних станах.

Аналіз розподілу популяцій лейкоцитів за локалізацією АГП проводився у здорових донорів (група контролю, n=20), хворих на інфаркт міокарду (n=10), гострий гепатит В (n=10), хронічний гепатит С (n=8), цироз печінки (n=10), істинну поліцитемію (n=12).

У ході досліджень було встановлено, що при досліджуваних патологічних станах зміни перерозподілу клітин, що містять АГП на поверхні та всередині, характерні для популяції лімфоцитів, тоді як серед моноцитів та гранулоцитів достовірні зміни відмічено при істинній поліцитемії та цирозі печінки. Отримані дані наведені в табл.3.

Таблиця 3 Розподіл білих клітин крові за локалізацією б1-кислого глікопротеїну в нормі та при патології

Досліджувана група	Гранулоцити	Моноцити	Лімфоцити
	На поверхні	Всередині	На поверхні	Всередині	На поверхні	Всередині
Істинна поліцитемія	v***	v**	v**	v***	v***	-
Цироз печінки	v*	N	N	v**	N	^*
Хронічний вірусний гепатит С	N	N	^*	N	^**	^***
Гострий вірусний гепатит В	N	N	N	N	^***	^***
Інфаркт міокарду	N	N	^*	N	^***	^***

Примітка:

*** - p<0,001; ** - p<0,01; * - p<0,05 (достовірна різниця у порівнянні з групою контролю)

v - зниження, ^ - підвищення, N - не встановлено достовірної різниці у порівнянні з показниками контрольної групи.

Приймаючи до уваги те, що б1-кислий глікопротеїн лейкоцитів може бути ендогенного [Осиков М.В. и др., 2007] та екзогенного [Rahman M. et al., 2008] походження ми провели аналіз залежності між рівнем АГП у плазмі крові та кількістю клітин, що експресують АГП.

Аналізуючи кореляційні взаємовідносини між кількістю гранулоцитів з поверхнево-зв'язаним АГП та його концентрацію у плазмі крові було встановлено достовірні негативні кореляційні зв'язки середньої сили у хворих на істинну поліцитемію, хронічний вірусний гепатит С та у контрольній групі. Стосовно розподілу гранулоцитів за внутрішньоклітинним АГП, позитивний кореляцій зв'язок відмічено у хворих на істинну поліцитемію (p<0,01) та негативний - при інфаркті міокарду (p<0,05) (табл.4).

Таблиця 4 - Типи кореляційних зв'язків між рівнем б1-кислого глікопротеїну в плазмі крові та кількістю лейкоцитів, що експресують АГП на поверхні та всередині клітини

Досліджувана група	Гранулоцити	Моноцити	Лімфоцити
	На поверхні	Всередині	На поверхні	Всередині	На поверхні	Всередині
Група контролю	-*				+**
Істинна поліцитемія	-**	+**	+*
Цироз печінки				+**
Хронічний вірусний гепатит С	-*				+**	+*
Гострий вірусний гепатит В			+*		+***	+*
Інфаркт міокарду		-*	+*	+*	+***	+*

Примітка:

*** - p<0,001; ** - p<0,01; * - p<0,05 (статистична значимість коефіцієнту кореляції)

«+» - позитивний кореляційний зв'язок, «-» - негативний кореляційний зв'язок.

Кількість моноцитів з поверхнево-асоційованим АГП мала позитивний кореляційний зв'язок середньої сили з його рівнем у плазмі крові у групах хворих на істинну поліцитемію, інфаркт міокарду та з гострим вірусним гепатитом В. Позитивний кореляційний зв'язок спостерігався між концентрацією АГП та кількістю моноцитів із внутрішньоклітинною локалізацією досліджуваного глікопротеїну у хворих з цирозом печінки (p<0,01) та при інфаркті міокарду (p<0,05) (табл.4).

Найбільш показовим виявилось встановлення кореляційних взаємовідносин у популяції лімфоцитів. Нами відмічено позитивний кореційний зв'язок між кількістю лімфоцитів із поверхневою локалізацією АГП та його рівнем у плазмі крові при вірусних гепатитах, інфаркті міокарду та у групі контролю. Позитивний кореляційний зв'язок між кількістю лімфоцитів із внутрішньоклітинною локалізацією АГП та його концентрацією простежувався лише при вірусних гепатитах та інфаркті міокарду (табл.4).

Кореляційний аналіз концентрації даного глікопротеїну в крові та кількості клітин, що розподіляються за локалізацією АГП показав наявність позитивних та негативних зв'язків між зазначеними показниками в залежності від типу клітин та патології.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і запропоновано нове вирішення наукової задачі, що полягає у розкритті структурних змін олігосахаридного компоненту б1-кислого глікопротеїну плазми крові та встановленні загальних закономірностей розподілу популяцій лейкоцитів за локалізацією цього глікопротеїну при патологічних станах, що супроводжуються порушеннями гемостазу з метою удосконалення діагностики та прогнозування перебігу цих захворювань.

1. Встановлено, що при гострому вірусному гепатиті В, хронічному вірусному гепатиті С, хронічній серцевій недостатності II-III функціональних класів (за NYHA) та інфаркті міокарду концентрація АГП у плазмі крові достовірно підвищується, а при гострій печінковій недостатності та цирозі печінки знижується у 1,5-2 рази відносно контрольної групи.

2. Доведено, що поява у сечі білків з молекулярною масою меншою за 84 кДа є загальною ознакою порушення ниркового бар'єру, тому комплексне дослідження концентрації у сечі загального білку, альбуміну й АГП дає змогу оцінити ступінь ураження нирок при хронічній серцевій недостатності.

3. Виявлено кореляційні зв'язки між рівнем АГП у плазмі крові та показниками судинно-тромбоцитарного, коагуляційного, антикоагуляційного гемостазу і системи фібринолізу. Показано, що між рівнем АГП плазми та показниками АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів існує негативний кореляційний зв'язок середньої сили у всіх досліджуваних групах, крім хворих на облітеруючий ендартеріїт. У хворих на хронічну серцеву недостатність та групі контролю встановлено негативний кореляційний зв'язок між рівнем плазмового АГП та швидкістю XII фактор-залежного фібринолізу.

4. Показана гетерогенність глікозилювання АГП в залежності від типу патології: при гострому інфаркті міокарду підвищується вміст біантенних гліканів, що містять корову б(1>6) фукозу, а при сублейкемічному мієлозі підвищується кількість розгалужених N-гліканів АГП.

5. З'ясовано, що АГП містить N-глікани з кінцевими залишками б(1>2) фукози у нормі і при патології, причому ступінь фукозильованості N-гліканів залежить від характеру патологічного процесу і може слугувати додатковим критерієм у діагностиці проліферативних захворювань крові та патології печінки.

6. Встановлено різноспрямованість змін сіальованості N-гліканів АГП в залежності від типу патологічного процесу: при гострому вірусному гепатиті В та гострому інфаркті міокарду спостерігається підвищення ступеню сіальованості за б(2>6) залишками N-ацетилнейрамінової кислоти, а при сублейкемічному мієлозі ступень сіальованості підвищується за б(2>6) та б(2>3) залишками N-ацетилнейрамінової кислоти.

7. Встановлена зміна кількості лейкоцитів з поверхневою та внутрішньоклітинною локалізацією АГП при захворюваннях з порушеннями гемостазу. При істинній поліцитемії спостерігається зниження кількості лейкоцитів з поверхнево-асоційованим та внутрішньоклітинним АГП. Значне збільшення кількості лімфоцитів з поверхневою та внутрішньоклітинною локалізацією АГП спостерігається при вірусних гепатитах та інфаркті міокарду.

8. Показано наявність кореляційних зв'язків між концентрацією АГП у плазмі крові та характером розподілу популяцій лейкоцитів за мембрано-асоційованим та внутрішньоклітинним АГП, що залежить від типу патології. Виявлений тісний зв'язок між кількістю лімфоцитів з мембранним АГП та його концентрацією у плазмі крові при інфаркті міокарду та гострому вірусному гепатиті В.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Stekleneva N. Alterations of human serum and urine orosomucoid concentration in inflammation diseases and leukemia / N. Stekleneva, A. Shevtsova, O. Brazaluk, I. Mashejko // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska.- 2008.- Vol.XXI, №1.- P.231-233. (Машейко І.В. провів дослідження рівню б1-кислого глікопротеїну в сечі хворих, статистичний аналіз отриманих даних.)

2. Машейко І.В. Рівень б1-кислого глікопротеїну та фрагментів АГП в сечі та крові хворих із хронічною серцевою недостатністю / І.В. Машейко, О.З. Бразалук, А.О. Мірошниченко, О.В. Курята, А.А. Кулініч // Медична хімія.- 2009.- Т.11., №3.- С.57-59. (Машейко І.В. провів дослідження рівню б1-кислого глікопротеїну в плазмі та сечі хворих, статистичну обробку даних.)

3. Машейко І.В. Діагностична цінність визначення концентрації та фукозильованості альфа-1-кислого глікопротеїну при хронічних мієлолейкозах / І.В. Машейко, О.З. Бразалук // Медичні перспективи.- 2010.- Т.XV, №3.- С.17-21. (Машейко І.В. провів дослідження характеру глікозильованості вуглеводного компоненту б1-кислого глікопротеїну, статистичний аналіз отриманих даних.)

4. Маслак Г.С. Експресія б-1-кислого глікопротеїну та АГП на білих клітинах крові при еритремії / Г.С. Маслак, І.В. Машейко, А.О. Кулініч, Т.П. Ніколаєнко-Камишова, О.З. Бразалук, А.І. Шевцова // Одеський медичний журнал.- 2010.- Т.XXI, №6.- С.21-25. (Машейко І.В. провів дослідження розподілу б1-кислого глікопротеїну у популяціях лейкоцитів, статистичний аналіз отриманих даних.)

5. Пат. №53176 Україна, МПК7(2009) A61B 5/145. Спосіб визначення ступеню сіальованості альфа-1-кислого глікопротеїну / Стєклєньова Н.І., Шевцова А.І., Бразалук О.З., Машейко І.В.; заявник і патентовласник Дніпропетровська державна медична академія.- № заявки: u 2010 03808; заявл. 02.04.2010; опубл. 27.09.2010, Бюл. №18.

6. Стєклєньова Н.І. Порівняльна характеристика лектин-зв'язуючої здатності
б1-кислого глікопротеїну у зразках плазми та сечі хворих на лейкемію. / Н.І. Стєклєньова, І.В. Машейко // IV Міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів «Молодь та поступ біології» Львів, 7-10 квітня 2008 року.- С.62.

7. Машейко И.В. Новые подходы к оценке функционального состояния почек больных хронической сердечной недостаточностью. / И.В. Машейко, А.А. Кулинич, А.А. Мирошниченко, А.В. Курята, А.З. Бразалук // Материалы III Международной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы».- Харьков: СПД ФО Михайлов Г.Г.- 2008.- С.51-52.

8. Машейко І.В. Зміни концентрації та глікозильованості б1-кислого глікопротеїну у плазмі крові при порушеннях гемокоагуляції / І.В. Машейко, Н.І. Стєклєньова // V Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» Львів, 12-15 травня 2009 року.- С.56-57.

9. Brazaluk A. General alterations of glycoconjugates in cancer and inflammation / A. Brazaluk, A. Shevtsova, I. Pismenetskaya, A. Maslak, N. Stekleneva, A. Kulinich, I. Mashejko // Український біохімічний журнал.- 2009.- Т.81., №4.- С.184.

10. Mashejko I.V. Obtaining and prospects of usage of deglycosylated antibodies in clinical diagnostics / I.V. Mashejko, A.A. Kulinich, A.S. Maslak, N.I. Stekleneva // Materials of IV International Young Scientists conference «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» Odessa, 16-19 september 2009.- P.159.

11. Стекленёва Н.И. Сиалированность альфа-1-кислого гликопротеина в плазме крови при воспалительных процессах и онкотрансформации / Н.И. Стекленёва, И.В. Машейко // III Международный молодёжный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009» Санкт-Петербург, 2-4 декабря 2009 года.- С.161.

12. Машейко І.В. Клініко-діагностичне значення характеру розподілу б1-кислого глікопротеїну на поверхні і всередині лейкоцитів за вірусних гепатитів та цирозах / І.В. Машейко, О.З. Бразалук, Г.С. Маслак, О.П. Шевченко // Український біохімічний журнал.- 2010.- Т.82., №4.- С.129.

13. Машейко І.В. Розподіл гранулоцитів, моноцитів і лімфоцитів за експресією альфа-1-кислого глікопротеїну при хронічних мієлолейкозах / І.В. Машейко, А.М. Домащенко // VI Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» Львів, 21-24 вересня 2010 року.- С.36.

14. Курята А.В. Изменения концентрации б1-кислого гликопротеина и фибронектина у пациентов с СН, обусловленной ИБС в сочетании с гипертонической болезнью, и эффективность медикаментозной терапии / А.В. Курята, А.А. Мирошниченко, И.В. Машейко, А.А. Кулинич, А.З. Бразалук // Матеріали XI Національного конгресу кардіологів України, Київ, 28-30 вересня 2010 року.- С.147.

АНОТАЦІЯ

Машейко І.В. Гетерогенність глікозилювання плазмового та клітинного б1-кислого глікопротеїну при порушеннях гемостазу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.32 - медична біохімія. - Луганський державний медичний університет. - Луганськ, 2010.

В дисертаційній роботі досліджено концентрацію, гетерогенність глікозилювання, та розподіл лейкоцитів за мембрано-асоційованим та внутрішньоклітинним б1-кислим глікопротеїном у хворих на гепатит В і С та цироз печінки вірусного походження, із мієлопроліферативними захворюваннями та з серцево-судинною патологією.

Встановлено, що концентрація АГП в плазмі крові залежить від типу патологічного процесу і досягає найбільш високих значень при запальних процесах вірусної етіології.

В ході роботи показано, що деглікозилювання антитіл до АГП не призводить до суттєвих змін їх антигензв'язуючої активності, що відкриває нові перспективи в розробці методів дослідження глікокон'югатів з використанням лектинів різної специфічності.

За допомогою розробленого методу лектин-ферментного аналізу встановлено загальні закономірності зміни ступеню та характеру глікозильованості N-гліканів АГП при вірусних гепатитах, цирозі печінки, хронічних мієлолейкозах та серцево-судинній патології. Вперше визначено наявність термінальної фукози у складі N-гліканів АГП у нормі та при патології. Вперше встановлено, що ступінь зв'язування лектинів з вуглеводними детермінантами АГП при хронічному мієлоїдному лейкозі та істинній поліцитемії знижується, що свідчить про значне зменшення кількості N-гліканових структур у складі АГП за даної патології. Встановлено, що при гострому та хронічному вірусних гепатитах, сублейкемічному мієлозі підвищується ступінь звязування з MAA-II, SNA-1 та WGA, що свідчить про підвищення ступеню сіальованості та наявність розгалужених N-гліканів; а при цирозі - змінюється характер фукозилювання N-гліканів АГП.

У виконаній роботі вперше встановлено кореляційний взаємозв'язок між рівнем альфа-1-кислого глікопротеїну та показниками судинно-тромбоцитарного, коагуляційного, антикоагуляційного гемостазу та системи фібринолізу. Показана активація системи гемостазу та негативний кореляційний зв'язок середньої сили з показниками АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів при хронічній серцевій недостатності.

Вперше встановлений факт асоційованої з мікроальбумінурією секреції АГП через нирковий бар'єр, що супроводжується появою у сечі фракції димеру АГП з молекулярною масою 84 кДa.

Показано підвищення кількості лімфоцитів з поверхневою та внутрішньоклітинною локалізацією АГП при досліджуваних патологічних станах. Встановлено тісний зв'язок між рівнем б1-кислого глікопротеїну в плазмі крові та кількістю лейкоцитів, що експресують АГП на поверхні та всередині клітини.