Вплив паклітакселю на апоптозні і метаболічні процеси в пухлинах надниркових залоз людини
Дослідження індукованого паклітакселем підвищення інтенсивності термінальної стадії апоптозу гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз людини. Пригнічення метаболічних процесів, стероїдогенезу та синтезу білків при використанні паклітакселю.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 30.07.2015 |
| Размер файла | 475,1 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН ім. В. П. КОМІСАРЕНКА НАМН УКРАЇНИ»
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
ВПЛИВ ПАКЛІТАКСЕЛЮ НА АПОПТОЗНІ І МЕТАБОЛІЧНІ ПРОЦЕСИ В ПУХЛИНАХ НАДНИРКОВИХ ЗАЛОЗ ЛЮДИНИ
14.01.14 - ендокринологія
ЛЕВЧУК Наталія Іванівна
Київ 2011
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Державній установі «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України»
Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Пушкарьов Володимир Михайлович, Державна установа «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України», завідувач лабораторії патофізіології радіаційних уражень ендокринної системи
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Хомінська Зінаїда Борисівна, Державна установа "Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України", завідувач лабораторії ендокринології
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Сидоренко Світлана Павлівна, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник відділу регуляторних механізмів клітини
Захист відбудеться 24 травня 2011 р. о 13 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.558.01 з ендокринології в Державній установі «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України» (04114, м. Київ-114, вул. Вишгородська, 69)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України» (м. Київ-114, вул. Вишгородська, 69)
Автореферат розісланий: 21 квітня 2011 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук Калинська Л.М.
АНОТАЦІЯ
Левчук Н.І. Вплив паклітакселю на апоптозні і метаболічні процеси в пухлинах надниркових залоз людини. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.14. - ендокринологія. - Державна установа «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України», Київ, 2011.
В дисертаційній роботі досліджено вплив паклітакселю на апоптозні і метаболічні процеси в позапухлинній тканині та тканинах пухлин надниркових залоз людини in vitro. Встановлено, що індуковане паклітакселем підвищення інтенсивності термінальної стадії апоптозу - фрагментації ДНК в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз людини пов'язане з активацією мітохондріального шляху розвитку апоптозних процесів (збільшення експресії Вах, активації каспази-3, розщепленням PARP) та, напевно, опосередковується через р38МАРК-залежний сигнальний каскад. Показано, що паклітаксель у зазначених тканинах пригнічує метаболічні процеси, зокрема, стероїдогенез та синтез білків.
Ключові слова: пухлини надниркових залоз, паклітаксель, апоптоз, фрагментація ДНК, Вах, каспаза-3, PARP, МАРК, стероїдогенез.
АННОТАЦИЯ
Левчук Н. И. Влияние паклитакселя на апоптические и метаболические процессы в опухолях надпочечников человека. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.14. - эндокринология. - Государственное учреждение «Інститут эндокринологии и обмена веществ им. В. П. Комиссаренко АМН Украины», Киев, 2011.
В диссертационной работе исследовано влияние противоопухолевого препарата паклитакселя на апоптические и метаболические процессы во внеопухолевой ткани и ткани опухолей надпочечников человека in vitro.
Изучена межнуклеосомная фрагментация ДНК, которую выделяли из внеопухолевой ткани от больных с гормонально активными и гормонально неактивными опухолями, ткани гормонально активных и гормонально неактивных опухолей, а также гиперплазированной ткани коры надпочечников больных с болезнью Иценко-Кушинга. Установлено, что в ткани гормонально неактивных опухолей интенсивность фрагментации ДНК была ниже по сравнению с тканью, окружающей эти опухоли. Во внеопухолевой ткани от больных с гормонально активными опухолями, в гиперплазированной ткани и в ткани альдостером, кортикостером и феохромоцитом отмечено увеличение количества олигонуклеосом размеров до 200-800 п.о. Полученные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии гормонов коры и мозгового слоя надпочечников на апоптические процессы как в клетках внеопухолевой ткани надпочечников, так и в клетках опухолей, которые секретируют избыточные количества гормонов.
Исследовано влияние различных концентраций паклитакселя на интенсивность межнуклеосомной фрагментации ДНК во внеопухолевой ткани и в ткани опухолей надпочечников человека. Показано, что паклитаксель не влиял на интенсивность межнуклеосомной фрагментации ДНК во внеопухолевой ткани коры надпочечников больных с гормонально активными и гормонально неактивными опухолями, а также в гиперплазированной ткани коры надпочечников больных с болезнью Иценка-Кушинга, но оказывал стимулирующий эффект на фрагментацию ДНК в ткани феохромоцитом и гормонально неактивных опухолей коры надпочечников человека. В ткани гормонально активных опухолей (кортикостерома и андростерома) наблюдали тенденцию к увеличению содержанию фрагментов ДНК размером 800 п. о. Последний эффект может быть связан со специфичностью действия различных эндонуклеаз, которые принимают участие в расщеплении больших фрагментов ДНК, при этом активность ферментов может модулироватся некоторыми гормонами.
Показано, что усиление паклитакселем интенсивности фрагментации ДНК в ткани гормонально неактивных опухолей было связано с активацией митохондриального пути развития апоптических процессов (увеличение экспрессии Вах, активация каспазы-3 и, как следствие, расщепление субстрата каспазы-3 - PARP). Уменьшение количества фрагмента PARP c массой 89 кДа может свидетельствовать об его дальнейшей деградации. Изменения уровня экспрессии Вах, активации каспазы-3 и интенсивности расщепления PARP при инкубации ткани с различными концентрациями паклитакселя может быть связано с тем, что паклитаксель воздействует в клетке на несколько процессов, участие которых в апоптозе может иметь различный характер.
В ткани гормонально неактивных опухолей исследовано влияние паклитакселя на уровень экспрессии МАР-киназ ? ERK1/2 та р38МАРК. Показано усиление экспрессии обеих киназ. Предполагается, что в ткани гормонально неактивных опухолей надпочечников человека апоптоз, индуцированный паклитакселем, опосредуется активацией р38МАРК. В то же время увеличение уровня экспрессии ERK1/2 при действии препарата, возможно, связано с развитием антиапоптозных механизмов.
Инкубация ткани с паклитакселем приводила к уменьшению содержания цАМФ и ингибированию стероидогенеза, возможно вследствие снижения активности протеинкиназы А (ПКА), которая регулирует этот процесс и активность которой зависит от содержания цАМФ.
При исследовании влияния паклитакселя на синтез ДНК, РНК и белков было показано, что он ингибирует включение меченых предшественников в ДНК, РНК и белки во внеопухолевой ткани и ткани гормонально неактивных опухолей. В ткани гормонально неактивных опухолей особенно чувствительным к паклитакселю оказался процес трансляции.
Ключевые слова: опухоли надпочечников, паклитаксель, апоптоз, фрагментация ДНК, Вах, каспаза-3, PARP, МАРК, стероидогенез.
гормональний пухлина наднирковий залоза
SUMMARY
Levchuk N. I. Effect of paclitaxel on apoptotic and metabolic processes in tumors of the human adrenal cortex. - A manuscript.
Thesis for a candidate of biological sciences degree in specialty 14.01.14 - endocrinology. State Institution “V. P. Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism, Academy of Medical Sciences of Ukraine”, Kyiv, 2010.
The thesis is dedicated to the study of paclitaxel in vitro effect on apoptotic and metabolic processes in the extratumoral and tumor tissue of the human adrenal cortex. It has been shoun that induced by paclitaxel an increase in the intensity of apoptosis terminal stage - an internucleosomal fragmentation of DNA in the tissue of hormonally inactive tumors of the human adrenal cortex was connected with an activation of mitochondrial pathway of apoptosis (increase in Bax expression, caspase-3 activation, PARP cleavage) and could be mediated through p38MAPK. It was shown that the metabolic processes, namely, steroidogenesis and protein synthesis were inhibited by paclitaxel in mentioned tissues.
Key words: adrenal tumors, paclitaxel, apoptosis, DNA fragmentation, Bax, caspase-3, PARP, MAPK, steroidogenesis.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Ключову роль у розвитку пухлин відіграють процеси, що пов'язані зі змінами регуляції клітинного циклу, диференціювання клітин, їх міграції, порушенням співвідношення між проліферацією та апоптозом у трансформованих клітинах, а також модуляцією інших базових механізмів життєдіяльності клітини [Фільченков О. О., Стойка Р. С., 2006]. Тому вивчення особливостей контролю цих процесів у пухлинах різної локалізації і гістогенезу є важливим як для розуміння механізмів злоякісної трансформації клітин, так і для розробки нових фармакологічних препаратів, які, впливаючи, на різні ланки апоптозу, будуть ефективними у терапії онкозахворювань [Call J. et al., 2008]. Це повною мірою стосується пухлин надниркових залоз, у тому числі гормонально неактивних, які за останні 15-20 років все частіше діагностуються у пацієнтів, завдяки впровадженню в діагностичну практику новітніх методів [Комиссаренко И. В. и др., 2004; Кваченюк А. Н., 2004].
Дослідження дії протипухлинних препаратів, разом із з'ясуванням їх хіміотерапевтичних властивостей, дозволяє отримати також інформацію щодо механізмів канцерогенезу. Серед них інтенсивно вивчаються препарати рослинного походження, зокрема, паклітаксель, який екстрагують з деревини деяких видів тису. Поряд із його дією на функцію мікротрубочок та здатністю зупиняти клітинний цикл у фазі G2/M, доведена його здатність індукувати апоптоз у пухлинних клітинах [Rowinsky E. K., 1995; Wang T. H. et al., 2000; Тронько М. Д., Пушкарьов В. М., 2003]. Встановлено, що паклітаксель в різних тканинах призводить до морфологічних і функціональних змін, які притаманні апоптозу: він викликає інверсію фосфатидилсерину на плазматичній мембрані, індукує вивільнення цитохрому с з мітохондрій, активацію каспаз, деградацію субстратів каспаз, таких як полі(АДФ-рибозо) полімераза (PARP), фрагментацію ДНК [Rowinsky E. K., 1997]. Подібні дослідження щодо тканини надниркових залоз не проводились.
Паклітаксель успішно застосовують при лікуванні деяких видів раку (молочної залози, яєчника, легені), як окремо, так і у комбінації з іншими препаратами. Дані про можливість використання паклітакселю для лікування злоякісних пухлин ендокринного походження нечисельні. Так, дослідження in vivo і in vitro показали досить високу ефективність цієї сполуки при її дії на клітини анапластичної карциноми щитоподібної залози [Ain K. B. et al., 2000; Pushkarev V. M. et al., 2004]. Щодо пухлин надниркових залоз інформація практично відсутня. В той же час, у клініцистів залишається не визначеною тактика лікування діагностованих доброякісних пухлин надниркових залоз, які, за даними ряду авторів, з часом набувають ознак злоякісності [Комиссаренко И. В. и др., 2004; Кваченюк А. Н., 2004; Schalin-Jantti C., 2010]. У зв'язку з цим, поряд із спостереженням динаміки розвитку пухлин, постає питання про необхідність розробки протоколів консервативної терапії таких новоутворень.
Актуальність проблеми полягає в необхідності вивчення механізмів дії паклітакселю на апоптозні і метаболічні процеси як в пухлинах різного типу кори надниркових залоз, так і в позапухлинній тканині.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась в межах науково-дослідних тем: № 440 «Пострецепторна регуляція функції надниркових залоз різними модуляторами в умовах норми та патології» 2005-2007 рр. (№ держреєстрації 0105U000732), № 460 «Вивчення механізмів трансдукції сигналів гормонів, що регулюють процеси мітозу та апоптозу в надниркових залозах у фізіологічних та патологічних умовах» 2008-2010 рр. (№ держреєстрації 0107U012348).
Мета дослідження: вивчити вплив паклітакселю на механізми, що забезпечують регуляцію та реалізацію апоптозу клітин, а також на основні метаболічні і функціональні процеси в позапухлинній та пухлинній тканині кори надниркових залоз людини.
Завдання дослідження:
1. Визначити інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК у позапухлинній тканині та тканині різних типів пухлин надниркових залоз хворих.
2. Дослідити у позапухлинній тканині та тканині гормонально неактивних пухлин вплив in vitro різних концентрацій паклітакселю на:
· міжнуклеосомну фрагментацію ДНК;
· рівень експресії Bax, активацію каспази-3 та розщеплення PARP;
· інтенсивність стероїдогенезу;
· включення мічених попередників у ДНК, РНК і білки;
· вміст циклічного нуклеотиду - цАМФ;
· рівень експресії протеїнкіназ, що активуються мітогенами (МАРК) ? ERK1/2 і р38МАРК.
Об'єкт дослідження: апоптозні і метаболічні процеси в надниркових залозах.
Предмет дослідження: міжнуклеосомна фрагментація ДНК, експресія Вах, р38МАРК, ERK1/2, активація каспази-3, розщеплення PARP, вміст кортикостероїдів і цАМФ, включення мічених попередників у ДНК, РНК і білки при дії паклітакселю.
Методи дослідження: для досягнення мети та виконання завдань, поставлених у роботі, були використані такі методи: екстракція, очищення та електрофорез ДНК в агарозному гелі, розділення білків в поліакриламідному гелі, Вестерн-блотинг, спектрофлуориметричні методи, радіоімунологічний та радіоізотопний методи, статистичні методи аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше при вивченні апоптозу і метаболічних процесів в позапухлинній тканині та пухлинах надниркових залоз хворих встановлено, що паклітаксель in vitro посилює програмовану загибель пухлинних клітин в гормонально неактивних пухлинах.
Вперше показано, що ефект паклітакселю на процеси апоптозу в пухлинах надниркових залоз залежить від їх типу та гормонального статусу.
З'ясовано, що вплив паклітакселю в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз може опосередковуватись через р38МАРК-сигнальний шлях та пов'язаний з активацією мітохондріальних та постмітохондріальних етапів апоптозу: підвищення рівня експресії проапоптозного білка Вах, активацією ефекторної каспази-3, і як наслідок, підвищенням розщеплення її субстрату - PARP та інтенсивності міжнуклеосомної фрагментації ДНК.
Вперше показано, що активація апоптозних процесів у тканині гормонально неактивних пухлин під впливом паклітакселю супроводжується гальмуванням стероїдогенезу, синтезу білків, а також зменшенням вмісту цАМФ. Різна спрямованість змін експресії та вмісту проапоптозних білків в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз при дії різних концентрацій паклітакселю свідчить, як про дозозалежність його дії, так і про формування певної резистентності пухлинних клітин до проапоптозних впливів.
Обґрунтованість і достовірність наукових положень, висновків і рекомендацій. Для виявлення і дослідження клітин, які знаходяться в стані апоптозу, розроблено багато методів, що базуються на різних принципах реєстрації. На данний час серед методів виявлення апоптозу in vitro найбільше поширення отримали електрофорез ДНК в агарозному гелі, метод Вестерн-блотингу, проточної цитофлуориметрії, методи мікроскопії (флуоресцентна, електронна, конфокальна) та спектроскопії (спектрофотометрія, магнітно-резонансна, інфрачервона). Для отримання вірогідних результатів в роботі було використано методи, які дозволяють оцінити стан механізмів апоптозу при дії паклітакселю: характеристика інтенсивності міжнуклеосомної фрагментації ДНК та визначення експресії проапоптозних чинників методом Вестерн-блотингу, який широко застосовується в молекулярно-біологічних дослідженнях. Щодо першого, то гель-електрофорез є високочутливим методом визначення ниткових розривів ДНК, а аналіз електрофоретичної рухливості очищеної ДНК, внесеної в агарозний гель, дозволяє розрізнити апоптозні і некротичні клітини. В той же час, використовувати цей підхід для доказу апоптозу необхідно з обережністю, оскільки фрагментація ДНК у деяких клітинах властива не лише апоптозним клітинам, але і некротичним. Для виявлення апоптозних змін у клітинах було обрано також визначення активації ефекторної каспази-3, рівень експресії проапоптозного білка Вах, а також кіназ р38МАРК і ERK1/2 методом Вестерн-блотингу. Останній базується на використанні специфічних антитіл для виявлення досліджуваного білка. Важливим та показовим процесом, що характеризує динаміку апоптозу у клітині, є розщеплення PARP - одного з субстратів каспази-3. Для оцінки функціонального стану клітин надниркових залоз був використаний біохімічний метод визначення рівня кортикостероїдів у середовищі інкубації зрізів тканини, а для дослідження інтенсивності синтетичних процесів (синтез ДНК, РНК і білків) - методи визначення включення мічених їх попередників. В даній роботі було використано 74 зразка тканини надниркових залоз людини, одержаних з хірургічного відділу ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України». Кількість незалежних дослідів для кожного типу експерименту становила не менше трьох. Отримані результати проаналізовані та обговорені з урахуванням сучасних даних літератури, які отримані при вивченні дії паклітакселю та подібних йому за механізмом дії речовин на пухлини іншої локалізації чи різні лінії пухлинних клітин у дослідах in vitro. Висновки цілком базуються на даних дослідження.
Наукове значення роботи. Результати виконаних досліджень свідчать, що гормони, які секретуються пухлинами надниркових залоз, впливають на інтенсивність апоптозних процесів як в клітинах власне пухлин, так і клітинах тканини, що їх оточує. Проте, підвищення інтенсивності апоптозу клітин гормонально активних пухлин порівняно з позапухлинною тканиною не спроможне збалансувати активацію проліферативних процесів в надниркових залозах за умов розвитку пухлинної патології. Показано, що паклітаксель у гормонально неактивних пухлинах, в клітинах яких спостерігається невисокий рівень фонового апоптозу, викликає посилення апоптозних процесів, модулюючи їх на мітохондріальних і постмітохондріальних етапах.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дають уявлення про механізми дії паклітакселю в тканині пухлин надниркових залоз людини. Дані про вплив паклітакселю можуть стати підгрунттям для розробки нових підходів при лікуванні гормонально неактивних пухлин надниркових залоз людини та злоякісних пухлин, які можуть з них утворюватись шляхом малігнізації.
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провела патентно-інформаційний пошук, збір та аналіз літературних джерел за темою дисертації, визначила актуальність проблеми, сформулювала мету і завдання дослідження, власноруч виконала всі експерименти, здійснила статистичний аналіз одержаних даних, написала всі розділи дисертації. Висновки та наукові положення сформульовані разом з науковим керівником дисертаційної роботи. Всі результати отримано здобувачом особисто, співучасть співробітників відділу патофізіології ендокринної системи у виконанні роботи відображена у спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені та обговорені на конкурсі молодих вчених, присвяченім 100-річчю від дня народження В. О. Беліцера «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006», Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (Київ, 6-7 червня 2006 року), II з'їзді українського товариства клітинної біології, Київський національний університет ім. Т. Г. Шевченка (Київ, 23-26 жовтня 2007 року), X українському біохімічному з'їзді, присвяченім до 125-річчя від дня народження О. В. Палладіна (Одеса, 13-17 вересня 2010 року).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт: 5 статей у фахових наукових журналах, які рекомендовані ВАК України, 3 - у матеріалах з'їздів і конференцій.
Структура дисертації. Дисертація викладена державною мовою на 119 сторінках друкованого тексту. Рукопис складається зі вступу, огляду літератури, розділу, в якому викладені матеріал і методи досліджень, 2-х розділів результатів власних досліджень, заключення, висновків і списку використаних джерел, який налічує 151 джерело (з них 41 - кирилицею). Робота ілюстрована 15 таблицями і 23 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ
Матеріали та методи досліджень
Експерименти виконані in vitro на тканині, що була отримана під час операцій на надниркових залозах хворих, які проходили лікування у хірургічному відділенні ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка НАМН України» (керівник - член-кореспондент НАМН України, д.м.н., професор І. В. Комісаренко). Хворі були поінформовані про мету досліджень і дали згоду на використання видалених надниркових залоз в наукових експериментах. На проведення досліджень був одержаний дозвіл від комісії Інституту з питань біоетики. В роботі було використано 74 зразки позапухлинної та пухлинної тканин надниркових залоз. Верифікація типу пухлин проводилась у лабораторії патоморфології клініки інституту.
Умови попередньої обробки тканини та її інкубації. Надниркові залози після видалення переносили на лід, очищали від сполучної і жирової тканин, відділяли тканину пухлини від позапухлинної тканини. Наважку тканини поділяли на зрізи завтовшки ? 0,5 мм та інкубували в середовищі, що відповідало методам дослідження.
При дослідженні міжнуклеосомної фрагментації ДНК наважку зрізів тканини масою 200 мг інкубували при 37 оС в буфері, який містив: 10 ммоль/л Na2HPO4, 1 ммоль/л NaH2PO4, 130 ммоль/л NaCl, 1,27 ммоль/л MgSO4, 2 ммоль/л CaCl2, 20 ммоль/л HEPES (pH 7,4), 2 мг/мл БСА. Після закінчення інкубації середовище інкубації видаляли, проби охолоджували, тканину гомогенізували та проводили процедури по виділенню ДНК.
При дослідженні інтенсивності стероїдогенезу зрізи тканини (масою 20 мг) інкубували в 500 мкл живильного середовища 199 (Державний експериментальний завод медичних препаратів, Україна). Інкубаційне середовище також містило 10 ммоль/л НЕРЕS (рН 7,4) та 2 мг/мл БСА.
Для визначення вмісту цАМФ, рівня експресії Вах, p38MARK, ERK1/2, активації каспази-3 та розщеплення PARP зрізи тканини (масою 100 мг) інкубували в 1 мл живильного середовища 199, яке містило 2 мг/мл БСА та 10 ммоль/л HEPES (рН 7,4).
У дослідні проби перед початком інкубації додавали розчин паклітакселю («Wako», Японія) в диметилсульфоксиді («Sigma», США) у кінцевій концентрації 10-7 моль/л, 10-6 моль/л та
10-5 моль/л. В контрольні проби додавали розчинник, концентрація якого не перевищувала 1 %.
В зазначених експериментах тривалість інкубації становила 3 год при 37 оС.
Одержання диспергованих клітин з позапухлинної тканини та тканин пухлин кори надниркових залоз людини. Зрізи позапухлинної тканини та тканини пухлин надниркових залоз інкубували при 37 оС впродовж 40 хв в середовищі Ігла, що містило 10 ммоль/л HEPES (pH 7,4) («Calbiochem», США), 2 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (БСА) («Serva», Німеччина), 0,125 мг/мл колагенази («Fluka», Швейцарія). Після інкубації тканину дезагрегували за допомогою піпетки з розширеним та оплавленим носиком. Інкубат фільтрували через нейлон. Тканину надниркових залоз, що залишалась на фільтрі, переносили у нову порцію живильного середовища з колагеназою та продовжували інкубувати за тих же умов впродовж 20 хв. Процедуру повторювали 2-3 рази. Фільтрати об'єднували та осаджували при 900 g (центрифуга «РС-6», СРСР) впродовж 10 хв. Суспензію клітин розводили в 1 мл середовища Ігла, що містило 10 ммоль/л HEPES та 2 мг/мл БСА, і розділяли в ступінчатому градієнті перколу («Sigma», США): 10 % (0,3 мл перкол + 2,7 мл середовища Хенкса - NaCl) та 40 % (0,8 мл перкол + 1,2 мл середовища Хенкса). На верхній шар градієнту наносили клітинну суспензію і центрифугували впродовж 40 хв при 900 g. Після центрифугування клітини, які розміщені в перколі на межі шарів 10 % та 40 %, відбирали піпеткою. Клітини відмивали від розчину перколу центрифугуванням при 900 g впродовж 20 хв та підраховували їх кількість в камері Горяєва. Для оцінки життєздатності клітин використовували їх забарвлення трипановим синім (концентрація 3 мг/мл). Для розрахунку кількості клітин, які потрібно внести в інкубаційне середовище для визначення включення [3Н]-тимідину у ДНК, [3Н]-уридину у РНК і [3Н]-лейцину у білки, визначали кількість мертвих клітин та розраховували вміст живих у відсотках по відношенню до загальної кількості клітин.
Визначення включення мічених попередників синтезу білка, РНК, і ДНК в позапухлинній тканині та тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз людини. Дослідження проводили на диспергованих клітинах, отриманих з позапухлинної та пухлинної тканини. Суспензію клітин розливали у пробірки по ~200 тис. клітин в 1 мл середовища RPMI-1640 («Sigma», США), що містило 5 % сироватки великої рогатої худоби («Sigma», США) та антибіотики (100 од/мл пеніциліну та 100 од/мл стрептоміцину) («Sigma», США). До досліджуваних проб додавали розчин паклітакселю у кінцевих концентраціях, які зазначені вище. У проби також додавали попередники, відповідно, синтезу білка ([3Н]-лейцин, 0,2 МБк/мл), РНК ([3Н]-уридин, 0,04 МБк/мл), ДНК ([3Н]-тимідин, 0,04 МБк/мл) та інкубували на водяній бані при повільному струшуванні впродовж відповідно, 0,5; 3 та 18 год при 37 оС. Після закінчення інкубації клітини осаджували 7 % розчином ТХО (трихлороцтова кислота), осад переносили на фільтри GF/C («Whatman», Велика Британія), промивали двічі 5 % розчином ТХО та 96 % етиловим спиртом. Фільтри підсушували при кімнатній температурі, переносили у флакони зі сцинтиляційною рідиною ЖС-8 («Реахим», Україна) та вимірювали радіоактивність в лічильнику LS 5000TA («Beckman-Coulter», Австрія). Ефект паклітакселю оцінювали у відсотках по відношенню до контрольної проби.
Визначення концентрації кортикостероїдів у інкубаційному середовищі. Концентрацію 11-ОКС визначали за флуориметричним методом De Moore у модифікації Ю. Г. Балашова [Балашов Ю. Г., 1990].
Виділення та електрофорез ДНК в агарозному гелі. Зрізи позапухлинної тканини та тканин пухлин після попередньої інкубації гомогенізували на холоді в скляному гомогенізаторі і виділяли ДНК. Розділення фрагментів ДНК проводили в 1,7 % агарозному гелі (Agarоse Serva Сremium, «Serva», Німеччина) приготованому на ТЕ-буфері, що містив 10 ммоль/л Трис і 10 ммоль/л EДТА (рН 8,0). Тривалість електрофорезу становила 1,5-2 год при напрузі 100 мВ. Після електрофорезу гелі фотографували цифровою відеокамерою в трансілюмінаторі, сканували за допомогою програм «Photo Capt Mw» та «Gel Pro Analyzer» і, за допомогою останніх, визначали інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК.
Радіоімунологічний метод визначення цАМФ в гомогенатах тканини пухлин кори надниркових залоз людини. Після попередньої інкубації зрізи позапухлинної тканини та тканини пухлин гомогенізували в 1 мл буферу наступного складу: 25 ммоль/л Трис-НCl (рН 7,4), 250 ммоль/л сахароза та 4 ммоль/л EДTA. Гомогенати тканин кип'ятили впродовж 3 хв для коагуляції білків, після чого переносили на холод та центрифугували при 11 700 g (центрифуга «Мicro 22R», Німеччина). Надосадову рідину заморожували при мінус 60 оС і зберігали до визначення вмісту цАМФ. Кількісний вміст цАМФ визначали використовуючи радіоімунологічний набір згідно рекомендацій виробника («Immunotech», Чехія).
Концентрацію цАМФ (нмоль/л) розраховували методом інтерполяції за калібрувальною кривою, ефект паклітакселю виражали у відсотках по відношенню до вмісту в пробі без паклітакселю.
Визначення кількості білка. Кількість білка у гомогенаті, визначали за методом Бредфорд [Bradford М. М., 1976].
Електрофорез в поліакриламідному гелі. Розділення суміші білків проводили за методом Леммлі [Laemmli U. K., 1970] у приладі для вертикального електрофорезу в 7-22 % градієнтному поліакриламідному гелі товщиною 1 мм у присутності додецилсульфату натрію.
Метод Вестерн-блотинг. При проведенні Вестерн-блотингу використовували наступні моноклональні антитіла: до Bax, каспази-3, PARP, р38МАРК та ERК1/2 («Сеll Signalling», США).
Комплекси білків з антитілами візуалізували за допомогою розчину ECL (кумарова кислота - 0,06 мг/мл, люмінол - 0,44 мг/мл, перекис водню 0,03 %, 0,1 моль/л Трис-HCl, рН 8,7). Після денситометричного визначення інтенсивності засвічення рентгенівської плівки результати обробляли у програмі «Gel Pro Analyzer».
Статистична обробка результатів. Статистичну обробку одержаних даних проводили за загальноприйнятими методами з використанням t критерію Стьюдента [Рокицкий П. Ф., 1973] та U критерію Вілкоксона-Манна-Уїтні [Гублер Е. В., 1969]. При Р ? 0,05 різницю між досліджувальними величинами вважали вірогідною.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Міжнуклеосомна фрагментація ДНК у позапухлинній тканині та тканині пухлин кори надниркових залоз людини. На першому етапі досліджень була визначена інтенсивність термінальної стадії апоптозу в тканині різних пухлин надниркових залоз - гормонально неактивних чи гормонально активних пухлин кори надниркових залоз та пухлин мозкового шару останніх. Відомо, що у позапухлинній тканині кори надниркових залоз хворих з гормонально неактивними пухлинами зберігається нормальний рівень стероїдсинтетичних процесів, активність
цитохромів (Р450с17б, Р450с21, Р450с11в, Р450с18, Р450альдо) та вміст стероїдів [Morioka M, 1997]. Зважаючи на це, в наших дослідженнях позапухлинна тканина кори надниркових залоз хворих з гормонально неактивними пухлинами склала групу порівняння.
Показано, що інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз суттєво не відрізнялася від інтенсивності фрагментації у тканині, яка оточує такі пухлини, відмічено лише зниження частки мононуклеосом (табл. 1). Відомо, що більш значна доля фрагментів ДНК розміром ? 200 п.о. утворюється при тривалій діяльності ендонуклеаз і, отже, зменшення кількості мононуклеосом може свідчити про зниження чутливості специфічних ділянок хроматину до ферментів, що, в свою чергу, може бути пов'язано зі змінами конформації нуклеосом за рахунок порушення зв'язку молекули ДНК з гістонами [Збарский И. Б., 1988]. Відомо також, що у трансформованих клітинах може спостерігатися зниження активності ендонуклеаз [Ткачева Т. И. и др., 1990; Сухих Г. Т. и др., 2000], яке автори розглядають, навіть, як біологічний маркер гальмування апоптозу. Отже, невисокий фоновий рівень апоптозу в тканині гормонально неактивних пухлин сприяє прогресії пухлинного процесу, не забезпечуючи достатню та адекватну елімінацію трансформованих клітин.
Інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК у тканині гормонально активних пухлин у порівнянні з такою у позапухлинній тканині кори надниркових залоз хворих з гормонально неактивними пухлинами була вищою. Вірогідно значуще збільшення було встановлено для тринуклеосом, тетрануклеосом та суми фрагментів ДНК. При цьому не відмічено суттєвої кількісної різниці у інтенсивності фрагментації ДНК в тканині пухлин, які секретують різні гормони (кортикостероми, альдостероми, андростероми) (табл. 1). Збільшеною була також інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК у тканині феохромоцитом та в позапухлинній тканині кори надниркових залоз хворих з гормонально активними пухлинами, тобто в тканині, яка тривалий час знаходиться під впливом підвищеного рівня гормонів. Відомо, що за дії гормонів у хроматині з'являються додаткові ділянки, для яких характерна підвищена чутливість до ендонуклеаз [Збарский И. Б., 1988]. Так, для тиреоїдних гормонів була показана індукція ними гіперчутливості до ДНКази-І певних ділянок у хроматині клітин селезінки, печінки та пухлин гіпофізу щурів [Nyborg J., 1986]. Вплив стероїдів на зміни чутливості лінкерних ділянок ДНК до ДНКази у пухлинах не досліджено.
Спостерігали також тенденцію (0,1 > P > 0,05) до підвищення інтенсивності фрагментації ДНК у гіперплазованій тканині кори надниркових залоз хворих з хворобою Іценко-Кушинга у порівнянні з позапухлинною тканиною кори надниркових залоз хворих з гормонально неактивними пухлинами. Вірогідно значуще збільшення було встановлено для частки три- та тетраолігонуклеосом.
Таким чином, отримані дані свідчать, що гормони, які секретуються пухлинами кори та мозкового шару надниркових залоз, можуть модулювати апоптозні процеси, що підтверджується посиленням міжнуклеосомної фрагментації ДНК. Певне зниження інтенсивності апоптозу в тканині гормонально неактивних пухлин може сприяти прогресії пухлинного росту, а підвищення апоптозних процесів в гормонально активних пухлинах не спроможне збалансувати інтенсивність проліферативних процесів в надниркових залозах за умов розвитку пухлин.
Вплив паклітакселю на міжнуклеосомну фрагментацію ДНК у позапухлинній тканині та тканині доброякісних пухлин надниркових залоз людини. Наступним етапом роботи було дослідження впливу різних концентрацій паклітакселю на інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК в позапухлинній тканині та тканині пухлин надниркових залоз хворих.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Таблиця 1. Кількість олігонуклеосом (%) у препаратах ДНК, виділених з позапухлинної тканини та тканини пухлин надниркових залоз людини (М±m)
|
Тканина |
n |
Розмір фрагментів ДНК, п. о. |
|||||
|
200 |
400 |
600 |
800 |
? 200-800 |
|||
|
Позапухлинна від хворих з гормонально неактивними пухлинами |
3 |
8,86 ± 1,37 |
9,10 ± 0,77 |
7,90 ± 0,14 |
7,20 ± 0,45 |
33,05 ± 1,87 |
|
|
Гормонально неактивних пухлин |
6 |
4,41 ± 1,30 * |
7,36 ± 1,89 |
8,15 ± 1,20 |
8,54 ± 1,50 |
28,46 ± 4,31 |
|
|
Позапухлинна від хворих з гормонально активними пухлинами |
7 |
8,40 ± 1,81 |
10,44 ± 1,18 |
11,61 ± 1,32 * |
13,04 ± 1,43 * |
44,24 ± 4,20 * |
|
|
Гормонально активних пухлин, у т.ч.: |
20 |
8,66 ± 1,49 |
10,88 ± 1,28 |
11,83 ± 1,21 * |
12,52 ± 1,12 * |
43,89 ± 4,38 * |
|
|
альдостером |
9 |
9,40 ± 2,82 |
11,64 ± 2,21 |
12,19 ± 1,99 * |
12,37 ± 1,81 * |
45,60 ± 7,36 |
|
|
андростером |
6 |
8,05 ± 1,99 |
10,65 ± 2,64 |
12,10 ± 2,81 |
13,39 ± 2,64 |
44,19 ± 9,35 |
|
|
кортикостером |
5 |
8,06 ± 2,71 |
9,80 ± 1,61 |
10,84 ± 1,14 * |
11,74 ± 1,05 * |
40,44 ± 5,83 |
|
|
Феохромоцитом |
3 |
12,10 ± 2,09 |
11,73 ± 0,96 |
11,82 ± 0,77 * |
11,85 ± 0,98 * |
47,49 ± 3,00 * |
|
|
Гіперплазована |
8 |
7,58 ± 1,79 |
9,36 ± 1,71 |
11,65 ± 1,34 * |
12,81 ± 1,39 * |
43,38 ± 5,91 |
Примітка. * - Р ? 0,05 у порівнянні зі змінами у позапухлинній тканині надниркових залоз хворих з гормонально неактивною пухлиною.
Паклітаксель in vitro не змінював інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК у позапухлинній тканині кори надниркових залоз хворих з гормонально активними пухлинами та у гіперплазованій тканині кори надниркових залоз хворих з хворобою Іценка-Кушинга (табл.2), що, можливо, пояснюється негативним впливом стероїдів на індукцію паклітакселем програмованої загибелі клітин. Відомо, що в цілому ряді солідних пухлин, в тому числі в клітинах раку молочної залози та яєчника, стероїди суттєво пригнічують, або навіть зупиняють ініційований паклітакселем апоптоз [Fan W., 1999]. Причиною такого гальмування може бути зупинка під дією гормонів клітинного циклу на стадії G0/G1. Відомо, що необхідною умовою індукції паклітакселем апоптозу є здатність клітин до нормального проходження клітинного циклу [Henley D. et al. 2007; Pushkarev V. M., 2008] і арешт циклу на будь-якій стадії чи то за рахунок надекспресії природних інгібіторів (р21WAF1, р27KIP1, р14-р18INK), чи в результаті гено- або хемотоксичного стресу може призвести до зупинки апоптозу і ініціації репараційних процесів [Garner E., Raj К. 2008]. Іншими механізмами гальмування апоптозу може бути активація стероїдами ядерного стероїдного ксенобіотичного рецептора SXR, який посилює експресію цитохромів Р-450, що метаболізують паклітаксель, а також активація експресії продукта гена Mdr. Останній відповідає за виведення фармакологічних препаратів з клітини [Schuetz E., Strom S., 2001]. Відсутність ефекту паклітакселя на інтенсивність фрагментації ДНК в гіперплазованій тканині кори надниркових залоз хворих з хворобою Іценка-Кушинга можна пояснити антиапоптозним ефектом кортикотропіну [Ковзун О. І. та ін., 2007]. І хоча інкубація тканини з паклітакселем відбувалася за відсутності впливу кортикотропіну, вже ініційовані цим гормоном процеси можуть пригнічувати дію паклітакселю в гіперплазованій тканині кори надниркових залоз. В той же час, у тканині власне гормонально активних пухлин (альдостерома, андростерома, кортикостерома) не відмічено вірогідних змін моно-, ди-, три-, і сумарної частки олігонуклеосом при дії паклітакселю, проте мало місце збільшення частки тетраолігонуклеосом при дії певних концентрацій препарату. Так підвищення відсотка тетраолігонуклеосом в тканині кортикостероми спостерігали при всіх досліджених концентраціях паклітакселю, в той час, як в тканині андростероми лише при дії цієї сполуки в концентрації 10-6 моль/л (табл. 2). Це може свідчити про певну специфічність модулюючого впливу різних стероїдних гормонів щодо міжнуклеосомної фрагментації ДНК у присутності паклітакселю в тканині гормонально активних пухлин кори надниркових залоз людини. В тканині альдостероми вірогідних змін частки олігонуклеосом при дії паклітакселю у всіх зазначених концентрацій не спостерігали.
Відсутність значних змін інтенсивності міжнуклеосомної фрагментації ДНК у клітинах гормонально активних пухлин кори надниркових залоз у присутності паклітакселю може бути пов'язана з тим, що в присутності сполуки в клітині активуються не тільки проапоптозні механізми, але й сигнальні каскади, які захищають клітину від апоптозу. В першу чергу, це МАРК-, РІ3К- та NFкB-залежні каскади [Pushkarev V. M. et al., 2004; Pushkarev V. M. et al., 2008]. Зокрема, в результаті індукції паклітакселем останнього сигнального ланцюга посилюється експресія білків-інгібіторів апоптозу XIAP, cIAP1-2, сурвайвіну [Pushkarev V. M. et al., 2004; Pushkarev V. M. et al., 2008], які пригнічують активність каспаз [Wang C. Y. et al., 1998]. На тлі блокади стероїдами паклітаксель-індукованого апоптозу, активовані препаратом захисні механізми можуть пригнічувати навіть фоновий рівень апоптозу, який має місце у будь-якій тканині.
Таблиця 2. Вплив різних концентрацій паклітакселю (±Д % відносно до вихідного рівня) частку олігонуклеосом у препаратах ДНК, виділених з позапухлинної тканини, гіперплазованої тканини та тканини гормонально активних пухлин надниркових залоз людини (М ± m)
|
Тканина |
n |
Концентрація паклітакселю (моль/л) |
Розмір фрагментів ДНК, п.о. |
|||||
|
200 |
400 |
600 |
800 |
200-800 |
||||
|
Позапухлинна від хворих з гормонально активними пухлинами |
3 |
10-7 |
-0,87 ± 2,64 |
0,42 ± 1,60 |
1,32 ± 0,80 |
1,51 ± 0,83 |
2,37 ± 4,95 |
|
|
10-6 |
-2,01 ± 2,34 |
-1,18 ± 1,38 |
-0,16 ± 1,47 |
0,51 ± 2,05 |
-2,85 ± 5,62 |
|||
|
10-5 |
-2,91 ± 1,91 |
-0,93 ± 1,44 |
-0,73 ± 1,96 |
0,01 ± 2,43 |
-4,55 ± 6,59 |
|||
|
Кортикостером |
3 |
10-7 |
-0,67 ± 0,01 |
-0,17 ± 0,13 |
-0,08 ± 0,03 |
0,99 ± 0,14 * |
0,07 ± 0,02 |
|
|
10-6 |
-0,48 ± 0,09 |
-0,21 ± 0,26 |
0,16 ± 0,07 |
0,34 ± 0,07 * |
-0,19 ± 0,48 |
|||
|
10-5 |
-0,28 ± 0,84 |
-0,04 ± 0,66 |
1,07 ± 0,30 |
4,27 ± 0,27 * |
5,00 ± 1,54 |
|||
|
Андростером |
3 |
10-7 |
-0,21 ± 1,09 |
-0,43 ± 1,39 |
0,13 ± 1,56 |
1,28 ± 0,75 |
0,78 ± 4,11 |
|
|
10-6 |
0,27 ± 1,02 |
0,81 ± 1,02 |
2,22 ± 1,26 |
2,82 ± 0,64 * |
6,11 ± 3,85 |
|||
|
10-5 |
-0,72 ± 2,57 |
1,84 ± 3,63 |
4,06 ± 3,26 |
5,57 ± 3,14 |
10,75 ± 12,41 |
|||
|
Альдостером |
5 |
10-7 |
-0,94 ± 1,43 |
-1,09 ± 0,78 |
-0,48 ± 0,76 |
0,16± 0,81 |
-2,35 ± 2,77 |
|
|
10-6 |
-0,88 ± 1,59 |
0,47 ± 0,61 |
0,18 ± 0,80 |
0,94 ± 0,90 |
0,70 ± 2,04 |
|||
|
10-5 |
-1,32 ± 1,77 |
-0,49 ± 0,50 |
-0,24 ± 0,47 |
0,68 ± 0,38 |
-1,38 ± 1,71 |
|||
|
Феохромоцитом |
3 |
10-7 |
5,69 ± 1,82 |
3,53 ± 0,77 * |
2,06 ± 0,91 |
1,88 ± 1,74 |
13,57 ± 5,30 |
|
|
10-6 |
-0,02 ± 0,31 |
1,09 ± 1,01 |
0,55 ± 0,64 |
0,19 ± 0,26 |
1,82 ± 1,57 + |
|||
|
10-5 |
-1,81 ± 2,07 |
0,23 ± 1,58 |
-0,12 ± 1,25 |
-0,21 ± 1,50 |
-1,91 ± 6,33 + |
|||
|
Гіперплазована |
5 |
10-7 |
0,65 ± 1,02 |
1,61 ± 0,72 |
0,46 ± 0,74 |
0,29 ± 0,68 |
3,02 ± 2,85 |
|
|
10-6 |
0,29 ± 0,58 |
0,14 ± 0,67 |
-0,84 ± 0,48 |
-0,74 ± 0,69 |
-1,15 ± 2,01 |
|||
|
10-5 |
0,38 ± 0,47 |
0,48 ± 0,50 |
-1,26 ± 0,78 |
-1,11 ± 0,68 |
-1,44 ± 1,87 |
Примітки: * - Р ? 0,05 у порівнянні з пробою без паклітакселю, + ? Р ? 0,05 у порівнянні з ефектом паклітакселю при концентрації 10-7 моль/л, ?Р ? 0,05 у порівнянні зі змінами у позапухлинній тканині.
В тканині феохромоцитом препарат у найнижчій з досліджених концентрацій підвищував інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК, що відображалося у збільшенні частки мононуклеосом. З підвищенням концентрації паклітакселю в інкубаційному середовищі його ефект щодо фрагментації ДНК в тканині феохромоцитоми дещо послаблювався (табл. 2).
Враховуючи отримані результати та дані літератури щодо гормональної модуляції стероїдами апоптозних процесів та відсутність значного ефекту на цьому тлі паклітакселю, подальші дослідження впливу препарату на апоптозні та метаболічні процеси були проведені на тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз хворих.
З'ясовано, що паклітаксель підвищував інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК в тканині гормонально неактивних пухлин (рис. 1 і 2), проте ефект його був відмічено лише за найвищої концентрації препарату, що може свідчити про меншу чутливість пухлин кори надниркових залоз у порівнянні з пухлинами хромафінної тканини. В той же час, інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК, що була виділена з тканини, яка оточує гормонально неактивну пухлину, не змінювалася під впливом паклітакселю при всіх досліджених концентраціях.
Отже, паклітаксель in vitro не впливав на інтенсивність міжнуклеосомної фрагментації ДНК у позапухлинній тканині кори надниркових залоз хворих з гормонально активними і гормонально неактивними пухлинами, а також у гіперплазованій тканині кори надниркових залоз хворих з хворобою Іценка-Кушинга, але виявляв стимулюючий ефект на фрагментацію ДНК у тканині феохромоцитом та гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз. В тканині гормонально активних пухлин (кортикостерома і андростерома) спостерігали збільшення частки фрагментів розміром 800 п.о., що, певно, пов'язано зі специфічністю дії різних ендонуклеаз, які приймають участь в розщепленні великих фрагментів ДНК, активність яких може модулюватися деякими гормонами.
Рис. 1 Вплив різних концентрацій паклітакселю (± ? % щодо базального рівня) на кількість олігонуклеосом розміром 200-800 п. о. у позапухлинній тканині (А) та тканині гормонально неактивних пухлин (Б) надниркових залоз хворих.
1 - 10-7 моль/л,
2 - 10-6 моль/л,
3 - 10-5 моль/л паклітакселю,
* - Р ? 0,05 у порівнянні з пробою без паклітакселю,
# - Р ? 0,05 у порівнянні зі змінами у позапухлинній тканині; n=3.
М 1 2
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
Рис. 2 Електрофореграма (А) та сканограма (Б), які були одержані при розділенні ДНК з тканини гормонально неактивної пухлини.
М - маркер,
1 - контроль,
2 - 10-5 моль/л паклітакселю.
Вплив паклітакселю на рівень експресії Bax, активацію каспази-3 та розщеплення полі(АДФ-рибозо) полімерази в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз людини. Участь однієї з центральних ефекторних каспаз - каспази-3 в процесах апоптозу на рівні деструкції клітинних компонентів, таких як фодрін, PARP, ламіни, визнається більшістю дослідників [Фильченков А. А., 2003].
Активація цього фермента значною мірою обумовлена виходом з мітохондрій проапоптозних факторів, що регулюється, зокрема, білками родини Bcl-2, до складу якої входять фактори як проапоптозної, так і антиапоптозної спрямованості [Бра М. и др., 2005]. Тому для з'ясування механізмів дії паклітакселю досліджували рівень експресії проапоптозного білка Вах, активацію каспази-3 та інтенсивність розщеплення PARP. Досліди проведені на тканині гормонально неактивних пухлин, де був виявлений ефект паклітакселю щодо інтенсивності міжнуклеосомної фрагментації ДНК.
Результати проведених досліджень показали, що інкубація тканини гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз з паклітакселем призводила до активації каспази-3 лише при низькій концентрації препарату (10-7 моль/л). При цьому не спостерігали збільшення рівня Вах та розщеплення PARP. Можна припустити, що активація каспази-3 при концентрації таксолу 10-7 моль/л може відбуватися не за класичною схемою апоптозу (через активацію каспази-8, каспази-9 чи каспази-10), а при дії деяких інших протеолітичних ферментів, таких як кальпаїни, катепсини чи серинові протеази [Бакай Т. С. и. др., 2005]. При збільшенні концентрації паклітакселю в інкубаційному середовищі до 10-6 моль/л, в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз спостерігали розщеплення PARP, проте, без помітної активації каспази-3 та рівня Вах. Ця невідповідність змін рівня розщеплення PARP, експресії Вах та активації каспази-3 може бути обумовлена неоднаковим впливом різних доз паклітакселю на різні етапи реалізації апоптозу, що узгоджується з даними літератури, за якими ефект препарату часто залежить від застосованої дози [Pushkarev V. M., 2004]. Крім того, відомі дані, що в ефекторній фазі апоптозу дія паклітакселю може бути опосередкована активацією не тільки каспази-3, але і каспази-6 та каспази-7 [Kottke T. J. et al., 2002; Okano J., Rustgi O. K., 2001], для яких PARP також є субстратом. Збільшення рівня експресії Вах при концентрації паклітакселю 10-5 моль/л може свідчити про залучення у реалізацію апоптозу мітохондріального шляху.
Кількісна оцінка ефекту паклітакселю на: вміст активованої каспази-3 (Г), рівень експресії Вах (Д) та розщеплення PARP (Е-інтактний PARP, Є-фрагмент PARP з мол. м. 89 кДа) (у % до проби без паклітакселю).
Позаяк ефект паклітакселю раніше вивчали виключно стосовно його дії на клітини злоякісних пухлин, важко оцінити отримані дані щодо ефекту препарату в клітинах доброякісних пухлин надниркових залоз. Слід відмітити, що паклітаксель майже не впливає на апоптозні процеси в нормальних клітинах, зокрема, в тироцитах [Pushkarev V. M., 2004]. Таким чином, ефект паклітакселю може різнитися в залежності від стану (нормального чи патологічного) тканини.
Отже, на основі проведених досліджень був зроблений висновок, що індукований паклітакселем апоптоз в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз людини може бути пов'язаний як з активацією мітохондріальних, так і постмітохондріальних механізмів програмованої загибелі клітин.
Вплив паклітакселю на рівень експресії МАР-кіназ в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз людини. Відомо, що МАРК відіграють важливу роль в індукованому паклітакселем апоптозі в різних типах пухлинних клітин [Хu R. et al., 2009]. Тому наступним завданням роботи було з'ясування впливу паклітакселю на рівень експресії в пухлинах кори надниркових залоз МАР-кіназ двох сигнальних каскадів ? ERK1/2 та р38МАРК.
В тканинах гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз паклітаксель в усіх досліджених концентраціях підвищував рівень р38МАРК, в той час як рівень експресії ERK1/2 підвищувався лише при концентрації 10-5 моль/л. Враховуючи дані літератури, можна припустити, що р38МАРК відіграє важливу роль у трансдукції сигналу паклітакселю в тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз. Збільшення рівня експресії ERK1/2, можливо, відбиває факт активації захисних, антиапоптозних механізмів пухлинної клітини, про що свідчать і дані інших авторів [Siedman R., 2001], хоча з'ясування значення останьої в цих процесах потребує подальших досліджень.
Вплив паклітакселю на інтенсивність стероїдогенезу в позапухлинній тканині та тканині гормонально неактивних пухлин кори надниркових залоз людини. Поряд з індукцією апоптозу важливо було з'ясувати питання щодо впливу паклітакселю на інші метаболічні процеси у позапухлинній тканині та тканині пухлин кори надниркових залоз, насамперед, на інтенсивність стероїдогенезу, як основної функції кори та на деякі механізми, пов'язані з синтезом гормонів. Показано, що інкубація зрізів тканин гормонально неактивних пухлин у присутності паклітакселю в концентрації 10-6 моль/л призводить до вірогідного пригнічення синтезу та секреції кортикостероїдів (табл. 3). Ефект препарату в позапухлинній тканині кори надниркових залоз хворих з гормонально неактивними пухлинами достовірно не змінювався при всіх досліджених концентраціях паклітакселю.
Конкретні механізми гальмування стероїдогенезу у пристуності паклітакселю поки що невідомі. Вважають, що однією із причин пригнічення синтезу гормонів є порушення цілісності та динаміки функціонування цитоскелету у присутності цитотоксичних сполук [Yvon A.-M., 1999; Denkova R. et al., 1992; Shibaya M. et al., 2005]. Цитоскелет відіграє значну роль у регуляції процесу стероїдогенезу в надниркових залозах. Встановлено, що порушення функції мікротрубочок у присутності колхіцину пригнічує утворення альдостерону, напевно, за рахунок їх деполімеризації [Тронько М. Д., Пушкарьов В. М., 2003]. Такі ж дані були одержані й іншими дослідниками [Carnegie J. A. et al., 1988; Asakuma J. et al., 2003; Guo C., 2009]. Припускають, що мікротрубочки беруть участь у транспорті холестерину до мітохондрій.
Отже, можна вважати, що для процесів синтезу стероїдів важливим є не стільки збереження структури мікротрубочок, скільки їх динаміка, яка полягає в циклічній полімеризації-деполімеризації, бо і колхіцин, який деполімеризує мікротрубочки, і паклітаксель, який їх гіперполімеризує, викликають однаковий ефект - пригнічують стероїдогенез.
Подобные документы
Хірургічне захворювання надниркових залоз як стан, що загрожує життю хворого. Клінічний перебіг і гормональні характеристики злоякісних пухлин надниркових залоз, методи діагностики і лікування. Різниця у діагностиці злоякісних та доброякісних пухлин.
автореферат [87,4 K], добавлен 06.04.2009Регуляція синтезу кортикостероїдів в корі надниркових залоз модуляторами адренокортикальної функції: кортикотропіном, естрогенами, дофаміном, N-ацильованими похідними етаноламінів, іонами калію. Можливість перенесення сигналу естрадіолу негеномним шляхом.
автореферат [739,9 K], добавлен 11.04.2009Ендокринні залози і гормональна регуляція. Причини та механізми розладів ендокринної регуляції. Захворювання щитоподібної залози. Дифузний токсичний зоб. Хронічна недостатність кори надниркових залоз (хвороба Аддісона). Характеристика цукрового діабету.
реферат [39,1 K], добавлен 24.11.2009Поняття стресу, класифікація та стадії розвитку. Роль нейроендокринних механізмів при звичайних і стресових станах. Аналіз роботи гіпоталамо-гіпофізарної системи, надниркових залоз. Реакція на стрес, його профілактика засобами фізичної реабілітації.
курсовая работа [1,3 M], добавлен 27.09.2020Функції і типи слинних залоз, діагностика ряду захворювань. Методи дослідження секреторної функції. Цитологічне дослідження мазків слини. Контрастне рентгенологічне дослідження слинних залоз (сіалографія). Морфологічні методи, комп`ютерна томографія.
реферат [27,2 K], добавлен 12.01.2011Рівень секреторної активності слинних залоз у пацієнтів до і після протезування знімними зубними протезами. Деякі показники гомеостазу ротової порожнини в людей з зниженою функціональною активністю слинних залоз. Рецептура гелю, що коригує слиновиділення.
автореферат [49,2 K], добавлен 18.03.2009Залози внутрішньої секреції, що виробляють біологічно активні речовини. Гормони: хімічний склад, рецептори, схема дії, вплив на діяльність органів. Анатомічна будова і функції гіпоталамуса, гіпофіза, наднирника, щитоподібної та підшлункової залоз.
презентация [4,1 M], добавлен 10.04.2015Епізоотологія і епізоотологічні особливості ураження людей і тварин злоякісними пухлинами. Частота злоякісних пухлин у собак і котів різних порід. Клінічні прояви пухлин молочних залоз у домашніх тварин. Морфологічний прояв пухлин молочної залози.
дипломная работа [70,1 K], добавлен 19.08.2011Висока частота дисгормональних захворювань молочних залоз (ДЗМЗ) у жіночого населення. Фізіологічні процеси, що відбуваються в молочних залозах. Нова концепція репродуктивного здоров'я. Запобігання й лікування ракових захворювань на початкових стадіях.
автореферат [74,3 K], добавлен 12.03.2009Мікротопографічні дослідження медулоцервікальних інтрамедулярних пухлин, диференційована хірургічна тактика лікування. Визначення обсягу оперативного втручання і проведення ад’ювантних методів терапії при пухлинах різної гістологічної структури.
автореферат [55,5 K], добавлен 14.03.2009
