Размещено на http://www.allbest.ru/

Академія Медичних Наук України

ДУ "Інститут гематології та трансфузіології АМН України"

УДК: 576.312.36+616.155.392.8

14.01.31 - гематологія та трансфузіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Характеристика спектру первинної та додаткових цитогенетичних аномалій на різних стадіях хронічної мієлоїдної лейкемії

Лук'янова Анна Сергіївна

Київ - 2011

Робота виконана в ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України", м. Львів

Науковий керівник доктор медичних наук, Масляк Звенислава Володимирівна, ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України", завідувач відділення гематології

Офіційні опоненти доктор біологічних наук, професор Мінченко Жанна Миколаївна, ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України", завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології та трансплантології;

доктор медичних наук, професор Глузман Данило Фішелевич, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу імуноцитохімії

Захист дисертації відбудеться 30 червня 2011 р. о 14 год. 00 хв. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 ДУ "Інститут гематології та трансфузіології АМН України" за адресою: 04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ "Інститут гематології та трансфузіології АМН України" за адресою: 04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12.

Автореферат розісланий 23 травня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Гащук Г.П.

Анотації

Лук'янова А.С. Характеристика спектру первинної та додаткових цитогенетичних аномалій на різних стадіях хронічної мієлоїдної лейкемії. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.31 - гематологія та трансфузіологія. - Державна установа "Інститут гематології та трансфузіології АМН України", Київ, 2011.

У дисертації представлено результати дослідження частоти, спектру, діагностичного та прогностичного значення різних типів первинної цитогенетичної зміни і додаткових хромосомних аномалій при хронічній мієлоїдній лейкемії. Виявлено існування різних шляхів утворення химерного гена BCR/ABL - типової транслокації, комплексних транслокацій та субмікроскопічних інсерцій. Встановлено ідентичність похідної хромосоми 22 та гена BCR/ABL, утворених шляхом простої чи комплексної транслокації, та можливість утворення гена BCR/ABL без зміни морфології хромосом 9 i 22 внаслідок інсерцій. Розроблено алгоритм діагностики Ph-негативної BCR/ABL-позитивної хронічної мієлоїдної лейкемії. Встановлено частоту і спектр субмікроскопічних делецій в гені ABL/BCR у похідній хромосоми 9. Показано, що клональна еволюція у Ph-позитивних клітинах переважно проявляється у вигляді комплексних каріотипів. Виявлено, що додаткові аномалії найчастіше були представлені дуплікацією Ph-хромосоми та трисомією хромосоми 8. Встановлено однакову частоту ранньої повної цитогенетичної відповіді на іматиніб у хворих з різними шляхами утворення гена BCR/ABL. Доведено, що характер первинної аномалії не змінюється в процесі лікування. Показано, що виявлення додаткових аномалій каріотипу у Ph-позитивних клітинах в процесі терапії є об'єктивним критерієм прогресії хвороби. Досліджено частоту і спектр вторинних змін у Ph-негативних клітинах на фоні цитогенетичної відповіді при лікуванні іматинібом. Такі зміни виникали de novo i були представлені транзиторною трисомією 8.

Ключові слова: хронічна мієлоїдна лейкемія, цитогенетичні зміни, філадельфійська хромосома, комплексна транслокація, ген BCR/ABL, делеція, цитогенетична відповідь, прогноз.

Лукьянова А.С. Характеристика спектра первичной и дополнительных цитогенетических аномалий на различных стадиях хронического миелолейкоза. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.31 - гематология и трансфузиология. - Государственное учреждение "Институт гематологии и трансфузиологии АМН Украины", Киев, 2011. цитогенетичний лейкемія мієлоїдний

Диссертация посвящена изучению частоты, спектра, диагностического и прогностического значения различных типов первичной цитогенетической аномалии и дополнительных хромосомных аберраций при хроническом миелолейкозе (ХМЛ). У 170 больных с подозрением ХМЛ проведена диагностика с использованием классического цитогенетического метода (кариотипирование) и флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). На основании обнаружения Ph-хромосомы и/или химерного гена BCR/ABL диагноз ХМЛ был подтвержден у 84% больных. Разработан алгоритм использования методов классической и молекулярной цитогенетики в диагностике хронических миелопролиферативных заболеваний.

В группе из 142 больных с ХМЛ проведено исследование характера первичной аномалии, приводившей к образованию гена BCR/ABL. Типичная транслокация t(9;22)(q34;q11) встречалась в 89% случаев, комплексные транслокации с участием дополнительных хромосом - в 9% случаев, субмикроскопические инсерции - в 2% случаев. Показана идентичность морфологии производной хромосомы 22, образованной вследствие как типичной, так и комплексных транслокаций. Установлена возможность образования химерного гена BCR/ABL без изменения морфологии хромосом 9 и 22 путем субмикроскопических инсерций. Изучены частота (12%) и спектр дополнительных аберраций в Ph-позитивных клетках. Наиболее частыми дополнительными аберрациями были дупликация Ph-хромосомы и трисомия 8. Клональная эволюция в Ph-позитивных клетках в 44% случаев проявлялась в виде комплексных кариотипов. Исследована частота (16%) и спектр делеций в гене ABL/BCR в производной хромосомы 9. Наиболее часто выявлялась полная делеция гена ABL/BCR, реже - делеции фрагментов генов ABL и BCR.

Сравнительный анализ частоты достижения раннего полного цитогенетического ответа на лечение иматинибом у пациентов с различными типами первичной аномалии показал отсутствие достоверной взаимосвязи между характером первичной аномалии и частотой достижения раннего полного цитогенетического ответа. У пациентов с дополнительными аберрациями частота достижения полного цитогенетического ответа была достоверно низшей, а смертность достоверно высшей, чем у пациентов с изолированной первичной аномалией. Вторичные аномалии в Ph-негативных клетках выявлены у 8% больных с полным или частичным цитогенетическим ответом. Такие аномалии появлялись de novo, были представлены транзиторной трисомией 8 и не ассоциировались с прогрессией заболевания.

Ключевые слова: хронический миелолейкоз, цитогенетические аномалии, филадельфийская хромосома, комплексная транслокация, ген BCR/ABL, делеция, цитогенетический ответ, прогноз.

Lukyanova A.S. Characteristics of the spectrum of primary and additional cytogenetic rearrangements on different stages of chronic myeloid leukemia. - Manuscript.

PhD thesis in biology, specialty 14.01.31 - Hematology and Transfusiology. State institution "Institute of Haematology and Transfusiology, Academy of Medical Sciences of Ukraine", Kyiv, 2011.

The PhD dissertation presents results of the study investigating the incidence, spectrum, diagnostic and prognostic significance of different types of primary cytogenetic rearrangement and additional chromosomal abnormalities in chronic myeloid leukemia. The different ways of chimeric BCR/ABL gene formation such as typical or complex translocation and submicroscopic insertions are shown. The identity of derivative chromosome 22 and BCR/ABL gene formed by either typical or complex translocation and the possibility of BCR/ABL gene formation without changing chromosomes 9 and 22 morphology as a result of insertions are established. There was created an algorithm for diagnostics of Ph-negative BCR/ABL-positive CML. An incidence and spectrum of submicroscopic deletion in the ABL/BCR gene in the derivative chromosome 9 was clarified. It was shown that clonal evolution in Ph-positive cells is generally characterized by complex karyotypes formation. The additional chromosomal changes most often were presented by duplication of the Ph chromosome and trisomy 8. There was established the same incidence of early complete cytogenetic response on imatinib in patients with different ways of BCR/ABL gene formation. The identity of primary cytogenetic abnormality was shown not to change during imatinib therapy. Identification of additional cytogenetic changes occurrence in Ph-positive cells during therapy is a sign of disease progression. The incidence and spectrum of secondary changes in Ph-negative cells during imatinib therapy were researched. These changes appeared de novo and were presented by transient trisomy 8.

Key words: chronic myeloid leukemia, cytogenetic abnormalities, Philadelphia chromosome, complex translocation, BCR/ABL gene, deletion, cytogenetic response, prognosis.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Сучасні методи лікування хронічної мієлоїдної лейкемії (ХМЛ) із застосуванням препаратів цільової дії мають за мету максимальну елімінацію лейкемічного клону з відновленням нормального гемопоезу і тривале утримання повної цитогенетичної та молекулярної відповіді [Третяк, 2007; M. Baccarani et al., 2009]. Тому, як на етапі діагностики, так і протягом всього періоду лікування обов'язковими методами моніторингу хвороби є цитогенетичне та молекулярно-генетичне дослідження гемопоетичних клітин.

Значення цитогенетичних методів у діагностиці ХМЛ відоме давно [P. Nowell et al., 1960; J. Rowley, 1973; S. Heim et al., 1997]; різними авторами досить активно досліджувались аномалії каріотипу на різних стадіях хвороби [F. Mitelman, 1993; B. Johansson, 2002]. Однак певні обмеження, пов'язані з особливостями класичного цитогенетичного дослідження, не дозволяли глибше зрозуміти процеси становлення та еволюції захворювання. З появою молекулярно-цитогенетичних та молекулярно-генетичних методів дослідження стало зрозуміло, що Ph-позитивна популяція клітин при ХМЛ від початку неоднорідна за своїми генетичними характеристиками [P. Fialkow et al., 1997; A.B. Skotnicki et al, 1999; G. Dewald et al., 1999; I.F. Loncarevic et al., 2002; S. Naumann et al., 2003]. В Україні відсутні дослідження, які висвітлювали б шляхи утворення химерного онкогена BCR/ABL і взаємозв'язок різних типів первинної цитогенетичної зміни та перебігу хвороби. Потребують вдосконалення підходи до діагностики та моніторингу лікування ХМЛ, особливо у випадках відсутності Ph-хромосоми в каріотипі (т.зв. Ph-негативна ХМЛ). Неоднозначною залишається оцінка комплексних транслокацій, оскільки невідомо, чи є вони одним із шляхів утворення первинної цитогенетичної зміни, чи можуть з'являтися в процесі перебігу хвороби і бути аналогом клональної еволюції [S. Naumann et al., 2003; M. Gorusu et al., 2007]. Застосування інгібіторів тирозинкінази вимагає перегляду прогностичного значення змін, які раніше вважались несприятливими, зокрема, делецій в ділянці гена ABL/BCR в похідній хромосоми 9, патогенетичну роль яких також вивчено недостатньо [B.J.P Huntly, 2001, 2003; A. Quintas-Cardama et al., 2005]. Активно обговорюються причини появи та значення вторинних аномалій, які з'являються у Ph-негативних клітинах на фоні цитогенетичної відповіді при застосуванні інгібіторів тирозинкінази [C. Terre et al., 2004; J.V. Perel et al., 2005]. Таким чином, дослідження цитогенетичних характеристик субстратних клітин при ХМЛ з метою оптимізації діагностичної та лікувальної тактики має важливе наукове і практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану наукових досліджень ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України" і безпосередньо пов'язана з НДР, виконавцем яких була здобувач: "Епідеміологічний моніторинг гемобластозів і ефективність впровадження стандартних програм діагностики та лікування у гематологічних хворих" (№ Державної реєстрації 0101U000854); "Дослідити біологічні ефекти рекомбінантних препаратів інтерферону альфа та інгібітору сигнальної трансдукції іматинібу в умовах сучасної терапії хронічної мієлоїдної лейкемії" (№ Державної реєстрації 0104U010832).

Мета дослідження. Визначити частоту, спектр, діагностичне та прогностичне значення первинної цитогенетичної зміни та додаткових хромосомних аномалій при хронічній мієлоїдній лейкемії та розробити алгоритм цитогенетичного та молекулярно-цитогенетичного обстеження хворих для диференційної діагностики хронічних мієлопроліферативних процесів.

Основні завдання дослідження:

1. Вивчити морфологічну та субмікроскопічну гетерогенність первинної цитогенетичної зміни з точками розриву в 9q34 і 22q11.

2. Дослідити частоту, спектр та комбінації додаткових цитогенетичних змін у Ph-позитивних клітинах.

3. З'ясувати прогностичне значення різних цитогенетичних характеристик Ph-позитивних клітин та їх вплив на перебіг хвороби.

4. Встановити характер, частоту та значення вторинних змін у Ph-негативних клітинах під час цитогенетичної відповіді на лікування іматинібом.

5. Розробити алгоритм цитогенетичної та молекулярно-цитогенетичної діагностики ХМЛ.

Об'єкт дослідження - клітини кісткового мозку та периферичної крові хворих на хронічну мієлоїдну лейкемію та інші мієлопроліферативні процеси.

Предмет дослідження - цитогенетичні та молекулярно-цитогенетичні зміни субстратних клітин.

Методи дослідження. Стандартне цитогенетичне дослідження (каріотипування клітин кісткового мозку та периферичної крові), молекулярно-цитогенетичні методи (флуоресцентна in situ гібридизація - FISH), гематологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі представлено нове вирішення наукової задачі щодо оцінки спектру і поширеності хромосомних аномалій до початку і в процесі специфічного лікування ХМЛ. Доведено існування різних шляхів утворення химерного гена BCR/ABL та встановлено їх частоту: типової транслокації - у 89% випадків, комплексних транслокацій - у 9%, субмікроскопічних інсерцій - у 2%. Вперше отримано дані відносно ступеня участі різних хромосом в комплексних транслокаціях. Найчастіше (77% випадків) встановлено залучення однієї додаткової хромосоми, рідше - двох або трьох додаткових хромосом (по 8% випадків). Виявлено, що в комплексних транслокаціях можуть брати участь всі хромосоми з будь-якими точками розриву, проте найчастіше - хромосоми 2 та 1. Показано ідентичність похідної хромосоми 22 та гена BCR/ABL, утворених шляхом простої чи комплексної транслокації. Підтверджено можливість утворення гена BCR/ABL без зміни морфології хромосоми 22 внаслідок субмікроскопічних інсерцій.

Представлено частоту (16%) і структуру випадків делецій в похідній хромосоми 9: генів ABL/BCR (53% випадків з делеціями), ABL (29%) та BCR (18%). Встановлено однорідність делецій у BCR/ABL-позитивних клітинах кожного хворого на початку та протягом перебігу хвороби.

Показано, що клональна еволюція у Ph-позитивних клітинах переважно проявляється у вигляді комплексних каріотипів. Виявлено, що додаткові аномалії найчастіше були представлені дуплікацією Ph-хромосоми (61%) та трисомією хромосоми 8 (44%). Одержано пріоритетні дані про наявність у хворих на ХМЛ раніше не описаних додаткових аномалій, які виявлялись у фазі акселерації або бластної кризи. Вперше виявлено можливість збільшення кількості копій Ph-хромосоми шляхом залучення обох копій хромосом 9 і 22 у відповідну транслокацію.

Визначено однакову частоту ранньої повної цитогенетичної відповіді на іматиніб у хворих з різними шляхами утворення гена BCR/ABL. Доведено, що характер первинної аномалії не змінюється в процесі лікування. Виявлено негативний вплив додаткових аномалій у Ph-позитивних клітинах на цитогенетичну відповідь та виживання хворих при лікуванні іматинібом. Вперше досліджено частоту і спектр вторинних змін у Ph-негативних клітинах на фоні цитогенетичної відповіді при лікуванні іматинібом. Виявлено, що такі зміни траплялися з частотою 8%, у всіх випадках виникали de novo i були представлені транзиторною трисомією 8.

Практичне значення одержаних результатів. Дисертаційна робота спрямована на вдосконалення діагностики мієлопроліферативних процесів, насамперед ХМЛ, а також на підвищення якості прогнозування і моніторингу лікування ХМЛ при застосуванні інгібіторів тирозинкінази.

На основі проведених досліджень обґрунтовано та запропоновано алгоритм цитогенетичного та молекулярно-цитогенетичного обстеження хворих в диференційній діагностиці хронічних мієлопроліферативних процесів. Запропоновано для використання в клінічній лабораторній практиці спосіб діагностики Ph-негативної BCR/ABL-позитивної ХМЛ. Рекомендовано одночасне використання методів каріотипування та FISH, що дозволяє виявити первинну цитогенетичну зміну і визначити шлях її утворення. Доведено, що результати цитогенетичного моніторингу цільової терапії ХМЛ є основними критеріями оцінки відповіді на лікування та його своєчасної корекції. Встановлено необхідність визначення шляху утворення гена BCR/ABL для вибору інформативного методу оцінки цитогенетичної відповіді, оскільки у випадках субмікроскопічних інсерцій результат стандартного цитогенетичного аналізу буде псевдонегативним. Показано, що виявлення додаткових аномалій каріотипу, які з'являються в процесі терапії, є об'єктивним критерієм прогресії хвороби.

Результати роботи обґрунтовують доцільність впровадження у практику гематологічних відділень цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичних досліджень для покращання діагностики ХМЛ, виділення прогностичних груп та оптимізації тактики лікування хворих.

Основні результати досліджень та положення роботи впроваджено у практику консультативної поліклініки та відділення гематології ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України"; гематологічного відділення та денного стаціонару 5 комунальної міської клінічної лікарні м. Львова; гематологічного відділення Львівської обласної дитячої спеціалізованої клінічної лікарні; гематологічних відділень Ужгородської, Рівненської, Волинської, Тернопільської, Івано-Франківської, Хмельницької, Одеської обласних клінічних лікарень.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто відібрала і проаналізувала літературні джерела на тему дослідження, обґрунтувала його актуальність, сформулювала мету і задачі, розробила план вирішення поставлених задач, опрацювала методики досліджень. При виконанні лабораторної частини роботи самостійно провела цитогенетичні та молекулярно-цитогенетичні дослідження. Автор проаналізувала, узагальнила та інтерпретувала отримані результати, підготувала до публікації основні матеріали, написала всі розділи дисертації, сформулювала висновки і практичні рекомендації.

Діагностика захворювання, визначення стану та лікування хворих проводилися у відділеннях та підрозділах ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України" (зав.: д.мед.н. З.В. Масляк, к.мед.н. Ю.В. Войціцький) і відділенні гематології 5 комунальної міської клінічної лікарні м. Львова (зав. І.Л. Гумен). Цитогенетичні та молекулярно-цитогенетичні дослідження проводились у лабораторії імуноцитології і генетики пухлин крові (зав. д.мед.н., проф. В.Є. Логінський) та лабораторії цитогенетики Онкологічного центру - Інституту ім. Марії Склодовської-Кюрі (Варшава, Польща) (зав. Барбара Пєньковска-Ґреля, МD), працівники яких стали співавторами наукових публікацій здобувача.

При аналізі результатів досліджень автор користувалась консультаціями д.мед.н., проф. В.Є. Логінського та завідувача лабораторії цитогенетики Онкологічного центру - Інституту ім. Марії Склодовської-Кюрі (Варшава, Польща) Барбари Пєньковскої-Ґрелі, МD.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались і обговорювались на: VI Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2002); III з'їзді медичних генетиків України (Львів, 2002); VIІ Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2003); науковій конференції "Gliwice Scientific Meetings" (Gliwice, Польща, 2003), V Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам'яті акад. В.В. Фролькіса (Київ, 2004); V Міжнародній конференції студентів і молодих вчених "Молодь-медицині майбутнього" (Дніпропетровськ, 2004); VІІ Науково-практичній конференції Польського товариства гематологів і трансфузіологів "Chronic myeloid and lymphoid malignancies" (Lublin, Польща, 2005); Науково-практичній конференції, присвяченій 65-річчю заснування Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України (Львів, 2005); Всеукраїнській науково-практичній конференції "Сучасні методичні підходи до аналізу стану здоров'я" (Луганськ, 2007); V з'їзді гематологів та трансфузіологів України з міжнародною участю "Підсумки та перспективи розвитку гематології та трансфузіології України" (Вінниця, 2008); IV з'їзді медичних генетиків України з міжнародною участю (Львів, 2008); Всеросійській науково-практичній конференції з міжнародною участю "Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов" (Санкт-Петербург, Росія, 2009); 14-ому конгресі Європейської асоціації гематологів (ЕНА; Берлін, Німеччина, 2009); Всеросійській науково-практичній конференції "Актуальные вопросы диагностики и лечения опухолевых заболеваний крови и лимфатической ткани" (Санкт-Петербург, Росія, 2010); Ювілейній науково-практичній конференції за участю міжнародних спеціалістів "Актуальні проблеми гематології та трансфузійної медицини" (Львів, 2010); 15-ому конгресі Європейської асоціації гематологів (ЕНА; Барселона, Іспанія, 2010); ІІІ Польському конгресі генетики (Люблін, Польща, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 22 наукові праці, з них 3 статті у провідних фахових журналах, 2 статті в збірниках наукових праць, рекомендованих ВАК України, та 17 праць у матеріалах конгресів, з'їздів, конференцій.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 186 сторінках машинопису; складається з вступу, огляду літератури, загальної методики і основних методів досліджень, шести розділів власних досліджень, висновків, списку використаної літератури, який включає 166 джерел вітчизняних та зарубіжних авторів (19 сторінок тексту). Робота ілюстрована 26 таблицями та 58 рисунками (17 сторінок тексту).

Основний зміст роботи

Огляд літератури. Представлено сучасні погляди на біологію та патогенез хронічної мієлоїдної лейкемії, а також підходи до її діагностики, лікування та оцінки ефективності цільової терапії. Проведено аналіз літературних даних про первинну та додаткові цитогенетичні та молекулярно-генетичні зміни при ХМЛ, шляхи їх утворення та прогностичне значення. Обґрунтовано актуальність наукової задачі дисертації, спрямованої на удосконалення діагностики, прогнозування перебігу та моніторингу лікування ХМЛ.

Загальна методика і методи досліджень. Цитогенетичні та молекулярно-цитогенетичні дослідження проведено у 170 хворих із змінами мієлограми та периферичної крові, які давали підставу запідозрити хронічну мієлоїдну лейкемію. Діагноз встановлювали у клінічних підрозділах на основі результатів клінічного обстеження, лабораторних гематологічних, біохімічних і морфологічних досліджень у необхідному об'ємі відповідно до загальноприйнятих критеріїв. Обстежена група налічувала 81 чоловіка та 89 жінок віком від 14 до 83 років.

Матеріалом служили субстратні клітини кісткового мозку або периферичної крові. Стандартне цитогенетичне дослідження проводили за загальноприйнятими методиками [M.J. Barch et al., 1997; Т.Е. Зерова-Любимова и соавт., 2003; B. Pieсkowska-Grela i wsp., 2004; С.В. Андреєва і співавт., 2007]. Частину клітин піддавали безпосередній обробці, решту культивували in vitro протягом 24 годин при температурі 37 єС. Культиваційна суміш складалась із середовища RPMI 1640 та телячої ембріональної сироватки. Клітинний цикл зупиняли розчином колхіцину, після чого додавали гіпотонічний розчин (0,55 М KCl). Фіксацію проводили трикратно сумішшю 96% метанолу з оцтовою кислотою у співвідношенні 3:1. Препарати метафазних хромосом готували за стандартною методикою із наступним диференційним фарбуванням [H.C. Wang et al., 1972].

Забарвлені препарати аналізували при збільшенні Ч1000 під світловим мікроскопом Olympus BX41 (у лабораторії імуноцитології та генетики пухлин крові ДУ ІПКТМ АМНУ; зав. лабораторії - д.мед.н., проф. В.Є. Логінський, свідоцтво про атестацію лабораторії № РЛ 1074/07) з використанням системи для хромосомного аналізу CytoVision та на мікроскопі Axioskop при збільшенні Ч1000 за допомогою системи для аналізу каріотипу Ikaros 3 (у лабораторії цитогенетики Онкологічного центру - Інституту ім. М. Склодовської-Кюрі, Варшава, Польща; керівник - Барбара Пєньковска-Ґреля, МD). Проводили аналіз не менше 20 метафазних пластинок. Роздільна здатність аналізу становила 200-500 сегментів на гаплоїдний набір. При аналізі та описі каріотипу дотримувались критеріїв ISCN 2009 [L.S. Shaffer et al., 2009].

Дослідження методом FISH (fluorescence in situ hybridization) з локус-специфічними мітками та мітками до цілих хромосом проводили за описаною методикою [D. Pinkel et al., 1995]. Зафіксовану суспензію клітин кісткового мозку або периферичної крові наносили на знежирене предметне скло і додавали мітку, попередньо нагріту до температури 37 єС. Коденатурацію ДНК субстратних клітин і мітки проводили при температурі 72 єС. Препарати піддавали гібридизації в термостаті при температурі 37 єС протягом 20 годин. Наступного дня проводили відмивання та зневоднення препаратів. Далі препарати висушували, фарбували DAPI і накривали покривним склом. Препарати, які були піддані попередньому аналізу каріотипу, знебарвлювали у фіксаторі і зневоднювали в батареї спиртів. Після висушування процедуру FISH проводили вищеописаним методом. Препарати, на яких вже була проведена гібридизація, у деяких випадках були піддані наступним дослідженням FISH. Після зняття покривного скла препарати зневоднювали і проводили гібридизацію, як описано вище. Зневоднення і повторна денатурація усували попередньо застосовані мітки.

Для детекції химерного гена BCR/ABL використано мітку LSI BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe. Додатково використано локус-специфічні мітки LSI ASS Spectrum Aqua Probe, 1p36 Microdeletion Region Probe - LSI p58 (1p36) (Spectrum Orange)/TelVysion 1p (Spectrum Green)/LSI 1q25 (Spectrum Aqua), LSI D13S319 (13q14.3) Spectrum Orange/LSI 13q34 Spectrum Green Probe, LSI D20S108 (20q12) Spectrum Orange Probe, СЕР 1 (D1Z5) Spectrum Orange Probe, CEP 8 (D8Z2) Spectrum Green Probe, CEP 9 Spectrum Orange Probe, iso 17q Probe, а також наступні мітки до цілих хромосом: WCP1 SpectrumOrange, WCP2 SpectrumGreen, PCP2p SpectrumOrange, WCP3 SpectrumOrange, WCP7 SpectrumOrange, WCP8 SpectrumOrange, WCP8 SpectrumGreen, WCP9 SpectrumOrange, WCP10 SpectrumGreen, WCP11 SpectrumAqua, WCP17 SpectrumGreen, WCP18 SpectrumOrange, WCP19 SpectrumGreen, WCP20 SpectrumOrange (Vysis, США).

Аналіз препаратів та мікрофотографування проводилися на флуоресцентному мікроскопі Axioskop 40 з відповідним набором світлофільтрів при збільшенні Ч1000 за допомогою системи для аналізу Isis. Для підрахунку відсотка клітин з досліджуваною зміною оцінювали не менше 200 інтерфазних ядер, у випадку повної цитогенетичної відповіді (мітка BCR/ABL DC DF) - не менше 600 інтерфазних ядер. При аналізі помічених метафазних пластинок досліджували від 3 до 10 метафаз. Всі дослідження методом FISH виконано в лабораторії цитогенетики Онкологічного центру - Інституту ім. М. Склодовської-Кюрі (Варшава, Польща), за винятком 6 досліджень, проведених с.н.с., к.б.н. Ж.А. Мішаріною в лабораторії імуногенетики ДУ "НЦРМ АМНУ".

В загальному виконано 490 досліджень каріотипу, з яких успішними були 407 (83%) досліджень, та 189 досліджень методом флуоресцентної in situ гібридизації (FISH).

Статистичну обробку матеріалу виконали за допомогою пакетів прикладних програм STATISTICA for Windows 5,0 (Statsoft, USA). Для порівняння якісних характеристик (таблиці частот) застосовували критерій ч2 і точний критерій Фішера при малому об'ємі сукупності (<30 випадків) у разі таблиць 2Ч2. Вірогідність отриманих результатів оцінювали на рівні достовірності не менше 95% (р<0,05).

Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення.

Діагностика ХМЛ на підставі результатів цитогенетичних досліджень. Цитогенетичні дослідження проведено у 170 хворих, у яких на підставі клініко-гематологічних обстежень запідозрено або встановлено діагноз ХМЛ. В 101 випадку застосовано класичний цитогенетичний метод та метод FISH), у 53 випадках - тільки аналіз каріотипу, у 16 випадках - тільки метод FISH (у зв'язку з відсутністю метафазних пластинок). Метою досліджень було виявлення в субстратних клітинах Ph-хромосоми та/або гена BCR/ABL.

Серед пацієнтів, у яких було проведено паралельні дослідження методом каріотипування та FISH, у 93 із 101 випадку виявлено t(9;22)(q34q11) та ген BCR/ABL, в 2 випадках - тільки ген BCR/ABL без наявності Ph-хромосоми в каріотипі. У хворих, обстежених за допомогою тільки аналізу каріотипу, зміну t(9;22)(q34q11) ідентифіковано у 34 із 53 пацієнтів. Серед тих пацієнтів, яким діагностика здійснювалась на підставі виключно методу FISH, ген BCR/ABL виявлено у 13 із 16 випадків. Виявлення Ph-хромосоми та/або гена BCR/ABL було підставою для встановлення діагнозу ХМЛ у 142 випадках. У 28 пацієнтів на підставі результатів цитогенетичного дослідження та сукупності клініко-гематологічних даних діагностовано інші мієлопроліферативні захворювання, а саме: остеомієлофіброз, ессенціальну тромбоцитемію, гіпереозинофільний синдром, хронічну еозинофільну лейкемію, хронічну мієломоноцитарну лейкемію, гостру мієлоїдну лейкемію і лейкемоїдну реакцію нейтрофільного типу. Перераховані випадки були виключені з групи, яка підлягала подальшим дослідженням. Пацієнти, яким остаточно було встановлено діагноз ХМЛ, стали об'єктом подальших цитогенетичних досліджень даної роботи.

Отже, в результаті цитогенетичного аналізу для подальших досліджень відібрано 142 пацієнтів з клінічно та цитогенетично підтвердженим діагнозом ХМЛ із 170 хворих (84% від вихідної групи).

В процесі виконання роботи було розроблено алгоритм застосування цитогенетичних методів (стандартного цитогенетичного дослідження та FISH) у діагностиці хронічних мієлопроліферативних процесів (рис. 1).

Рис. 1 Схема застосування цитогенетичних методів при диференційній діагностиці ХМЛ

Виявлення змін каріотипу в лейкемічних клітинах у хворих на ХМЛ. Із 142 пацієнтів, у яких діагноз ХМЛ було підтверджено, каріотип був проаналізований у 138 випадках. У 122 (88%) хворих виявлено тільки ізольовану первинну зміну з точками розриву в 9q34 i 22q11, у 16 (12%) - додаткові аномалії каріотипу. Серед 122 хворих з ізольованою первинною зміною у 109 встановлено наявність типової транслокації t(9;22)(q34;q11), у 11 - комплексних транслокацій (КТ) і у 2 - прихованих змін. Серед 16 хворих з додатковими змінами у 14 випадках первинною зміною була типова транслокація t(9;22)(q34;q11), у 2 випадках - комплексна транслокація. Частота виявлення додаткових аномалій у всіх хворих з типовою t(9;22)(q34;q11) становила 11%, у всіх хворих з комплексними транслокаціями - 15%. Статистичний аналіз методом ч2 не виявив статистично достовірної різниці в частоті додаткових аномалій між хворими з типовою та комплексною первинною зміною (ч2=0,001, р>0,05), отже, можна вважати, що характер первинної зміни не пов'язаний з підвищеним ризиком клональної еволюції. Загальна частота типової транслокації в обстеженій групі становила 89%, комплексних транслокацій - 9%, прихованих змін - 2%, що відповідає даним літератури [S. Naumann et al., 2003; M. Gorusu et al., 2007].

Склад виявлених нами ізольованих комплексних транслокацій представлено в таблиці 1.

Таблиця 1 Випадки з ізольованими комплексними транслокаціями t(9;22;V)

Встановлено, що до складу КТ хромосома 2 була залучена найчастіше (23% випадків) (рис. 2), хромосома 1 - дещо рідше (15%), хромосоми 3, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16 і 17 - однократно. В комплексних транслокаціях брали участь локуси 1p36, 1q32, 2p23, 2q13, 2q36, 3р 21, 8q24, 9q22, 10q24, 11q13, 12q22, 14q24, 16q23, 17q23, отже, повторюваних точок розриву у додаткових хромосомах-учасниках не виявлено. КТ з участю більш ніж однієї додаткової хромосоми виявлено у 15% випадків. Отримані результати узгоджуються з даними інших дослідників [M. Gorusu et al., 2007; K. Ikuta et al., 2008; T.S. Park et al., 2009]. У всіх випадках КТ призводили до появи такої ж der(22), як і при типовій Ph-хромосомі, і точки розриву в 9 і 22 хромосомах були типовими для ХМЛ (9q34 і 22q11). За даними літератури, морфологія похідної хромосоми 22 при КТ у більшості випадків не змінюється, хоча описано випадки комплексних перебудов, внаслідок яких похідна хромосоми 22 виглядала морфологічно нормальною [S.R. Bakshi, 2009].

А. Б.

Рис. 2 Каріотипи пацієнтів з комплексними транслокаціями t(9;22;2)(q34;q11;q3?6) (А) та t(9;22;2)(q34;q11;q13) (Б)

У 2 випадках прихованих змін встановлено їх утворення шляхом субмікроскопічних інсерцій ins(22;9)(q11;q34q34) та ins(9;22)(q34;q11q11) без зміни морфології хромосом. В першому випадку ген BCR/ABL був локалізований на хромосомі 22, в другому - на хромосомі 9.

Виявлені нами додаткові зміни, які супроводжували первинну аберацію (типову або комплексну транслокацію), були як структурними, так і кількісними (табл.2). Структурні аберації виявлено в 9 випадках, кількісні - в 12 випадках, у 7 випадках в каріотипі поєднувались зміни обох цих типів. У 6 пацієнтів (37% від підгрупи з додатковими аномаліями) ідентифіковано тільки одну додаткову зміну, у 3 (19%) - дві додаткові аберації, у 7 (44%) в каріотипі були наявні 3 і більше додаткових аномалій. Виявлено аномалії основного шляху (major route) і мінорного (minor route), а також в деяких випадках нехарактерні для ХМЛ аберації.

Таблиця 2 Випадки з додатковими цитогенетичними змінами

Найчастішою додатковою зміною було збільшення кількості копій Ph-хромосоми (extra Ph) (56% випадків додаткових аберацій). Ця зміна була єдиною додатковою аномалією в 1 випадку і супроводжувалась іншими додатковими абераціями у 8 випадках. У 6 пацієнтів extra Ph була наявною в одній копії, у 1 - в двох копіях і у 1 - в 3 копіях. В 1 випадку додаткова копія der(22) була наслідком транслокації з участю других копій хромосом 9 і 22 (рис. 3). Другою за частотою додатковою аберацією каріотипу була трисомія 8 (44%). У 2 хворих вона була ізольованою додатковою зміною, у 5 входила до складу комплексних каріотипів. Делецію довгого плеча хромосоми 6, яка не входить до переліку характерних для ХМЛ додаткових аномалій, було виявлено з частотою 25%. В трьох випадках ця зміна була єдиною вторинною аномалією і тільки в одному супроводжувалась іншими додатковими змінами. Крім перерахованих аномалій, із типових для ХМЛ додаткових змін двічі знайдено трисомію 21 (частота 13%) та однократно трисомію 17, трисомію 19 та ізохромосому довгих плечей хромосоми 17 (частоти цих трьох аномалій - по 6%).

Рис. 3 Каріотип пацієнтки з множинними додатковими змінами та участю двох копій хромосом 9 і 22 у транслокації: 50~57,XX,+2,+5,+6,+7,+8,t(9;22)(q34;q11)Ч2,+10,+12,+15,+19,+21

Молекулярно-цитогенетичний аналіз первинної зміни у хворих на ХМЛ. Дослідження методом FISH з міткою LSI BCR/ABL DC DF проведено у 108 пацієнтів. Результати цих досліджень виявили відмінності в кількості та пропорційному стосунку флуоресцентних сигналів, в зв'язку з чим зразки було розділено на групи з типовою та атиповою картиною FISH. Аналіз помічених інтерфазних ядер виявив у 73 (68%) випадках типову для даної мітки картину гібридизації з наявністю двох колокалізаційних сигналів жовтого кольору (2Y), одного сигналу червоного кольору (1R), та одного сигналу зеленого кольору (1G). Жовті сигнали при типовій гібридизації, яка описується 2Y1R1G, знаходяться на змінених хромосомах 9 і 22 (химерні гени ABL/BCR і BCR/ABL, відповідно), червоний - на нормальній хромосомі 9 (ген ABL), зелений - на нормальній хромосомі 22 (ген BCR). Відхилення картини гібридизації від типової, які проявлялись у зміні кількості та пропорцій сигналів, спостерігали у 35 (32%) випадках. Для встановлення причин атипового набору сигналів проведено аналіз помічених метафазних пластинок та співставлення отриманої інформації з результатами аналізу каріотипу (табл. 3).

Серед зразків з атиповим набором сигналів у 17 випадках встановлено наявність повних або часткових делецій в гені ABL/BCR (9 - з делецією гена ABL/BCR, 5 - з делецією фрагменту гена ABL і 3 - з делецією фрагменту гена BCR). В 1 випадку делеції ABL/BCR було виявлено другу лінію клітин з типовим набором сигналів, причиною якого було подвоєння Ph-хромосоми в клітинах з делецією. Загальна частота делецій в гені ABL/BCR становила 16% і співпадає з даними літератури [B. Pieсkowska-Grela et al., 2008]. У 2 зразках було виявлено інсерції ins(9;22)(q34;q11q11) та ins(22;9)(q11;q34q34), хоча набір сигналів був таким же, як при делеціях генів ABL або BCR. Розділення другого змішаного сигналу, яке свідчило про наявність комплексних транслокацій, виявлено у 8 випадках. В одному з цих випадків комплексна транслокація супроводжувалась інсерцією фрагменту гена ABL в іншу хромосому. У 2 зразках співіснували клітини з комплексною та типовою транслокацією, що могло свідчити про вторинність виникнення КТ. В 7 випадках виявлено ампліфікацію змішаних сигналів, яка свідчила про збільшення кількості копій Ph-хромосоми. В одному зразку було виявлено лінію клітин тільки з чотирма змішаними сигналами, що було наслідком взаємної транслокації обох копій хромосом 9 і 22.

Таблиця 3 Причини атипового набору сигналів за результатами аналізу метафазних пластинок

Детальний молекулярно-цитогенетичний аналіз делецій гена ABL. У всіх 14 випадках делецій фрагменту гена ABL (9 - з делецією гена ABL/BCR і 5 - тільки фрагменту гена ABL) паралельно проведено додаткові дослідження FISH з мітками CEP 9 та LSI ASS. Ген ASS знаходиться в локусі 9q34 вище від гена ABL і завжди втрачається разом з ним при делеціях. У всіх випадках, в яких застосування мітки LSI BCR/ABL DC DF показало наявність делеції гена ABL/BCR або ABL, було виявлено 1 копію гена ASS. Зразок, в якому було виявлено дві лінії клітин з набором сигналів 1Y1R1G та 2Y1R1G, показав наявність тільки однієї копії гена ASS у клітинах як з одним, так і з двома змішаними жовтими сигналами, що підтвердило наявність у всіх клітинах делеції гена ABL/BCR. Каріотипування та аналіз помічених метафазних пластинок з двома змішаними сигналами показали, що другий жовтий сигнал знаходився не на der(9), а на другій копії Ph-хромосоми. Отже, виявлена картина гібридизації підтвердила наявність делецій в гені ABL/BCR у всіх досліджених зразках. Відсоток клітин з делеціями, підрахований при аналізі результатів гібридизації в обох дослідженнях, співпадав з точністю до 1-2%, що не виходить за межі похибки методу. Не виявлено випадків з одночасним існуванням популяцій клітин з типовою гібридизацією та делецією або популяцій клітин з делеціями різного характеру. Результати наших досліджень підтверджують гіпотезу більшості авторів про первинність виникнення делецій та однорідність їх типу у всіх BCR/ABL-позитивних клітинах [E. Kolomietz et al., 2001].

Динаміка цитогенетичних змін в процесі лікування ХМЛ препаратом іматиніб. В динаміці під час лікування іматинібом було обстежено 76 хворих. На підставі вихідних результатів каріотипування та FISH пацієнтів було розподілено на підгрупи за цитогенетичними критеріями: шлях утворення Ph-хромосоми (типова чи комплексна транслокація), наявність/відсутність делецій в ділянці гена ABL/BCR, наявність/відсутність додаткових аномалій каріотипу. При контрольних цитогенетичних дослідженнях оцінювали наявність цитогенетичної відповіді за загальноприйнятими критеріями [M. Baccarani et al., 2009]. Також досліджували цитогенетичну прогресію (появу нових додаткових змін у Ph-позитивних клітинах та динаміку попередньо виявлених додаткових аномалій) та наявність цитогенетичних змін у Ph-негативних клітинах. Контрольні цитогенетичні дослідження проводили через 6, 12, 24, 48 та 60 місяців лікування. Підгрупу 1 складали 49 хворих (у 48 типова t(9;22)(q34;q11) була ізольованою зміною каріотипу, у 1 пацієнта Ph-хромосома в каріотипі була відсутня, а ген BCR/ABL був утворений шляхом субмікроскопічної інсерції і це також була єдина цитогенетична зміна). Повну цитогенетичну відповідь (ПЦВ) виявлено у 49% хворих цієї підгрупи. До підгрупи 2 було віднесено 10 пацієнтів з типовою ізольованою t(9;22)(q34;q11) та одночасними делеціями в гені ABL/BCR. ПЦВ отримано у 50% хворих цієї підгрупи. До підгрупи 3 належало 7 хворих з ізольованими комплексними транслокаціями, у яких ПЦВ була наявна у 43% випадків. Підгрупа 4 складалась із 7 випадків, в яких було виявлено типову t(9;22)(q34;q11) та додаткові хромосомні зміни. У пацієнтів підгрупи 5 (3 хворих) було виявлено одночасно мінімум 2 цитогенетичні зміни, характерні для попередніх підгруп. ПЦВ у хворих підгруп 4 і 5 була відсутня. Загалом, із 76 хворих, обстежених в динаміці під час лікування іматинібом, ПЦВ виявлено у 32 випадках (42%). Втрату ПЦВ виявлено у 5 випадках (16% хворих з ПЦВ). Часткову цитогенетичну відповідь (ЧЦВ) виявлено у 7 випадках (9%), малу або мінімальну - у 7 (9%). Цитогенетична відповідь була відсутня у 30 хворих (40%). Прогресія цитогенетичних змін була наявна в 11 випадках (14%), кількість летальних випадків становила 15 (20%). При контрольних дослідженнях методом FISH на фоні лікування іматинібом картина гібридизації у всіх BCR/ABL-позитивних клітинах відповідала тій, що була виявлена при вихідних дослідженнях (за винятком випадків ампліфікації Ph-хромосоми). Не виявлено випадків появи делецій de novo у зразках з типовим набором сигналів при попередніх дослідженнях. У зразках з комплексними транслокаціями не було виявлено зміни складу комплексних транслокацій або заміни клітин з комплексною транслокацією на клітини з типовою t(9;22)(q34;q11). Отже, характер первинної цитогенетичної аномалії не змінювався в процесі лікування.

З метою оцінки прогностичного значення різних цитогенетичних характеристик при лікуванні іматинібом проведено порівняння досягнення ПЦВ у хворих різних цитогенетичних підгруп. Аналіз проводився тільки у хворих, які отримали іматиніб в якості першої лінії терапії або після попереднього лікування препаратами рекомбінантного інтерферону. Підставою для такого відбору пацієнтів були наші результати та висновки інших дослідників, які свідчать про негативний вплив попереднього тривалого лікування цитостатичними препаратами на ефективність терапії іматинібом [K. Kotlyarchuk et al., 2010; А.Ю. Зарицкий и соавт., 2010]. Для оцінки прогностичного значення різних типів первинної зміни (наявність/відсутність делецій в гені ABL/BCR і шлях утворення Ph-хромосоми) проведено статистичний аналіз частоти досягнення ранньої ПЦВ та співвідношення шансів (odds ratio - OR) досягнути ПЦВ в 3 цитогенетичних підгрупах з ізольованою первинною зміною. Виявлені нами співвідношення шансів були статистично недостовірні, очевидно, внаслідок невеликої кількості пацієнтів, первинно пролікованих іматинібом. Аналіз за допомогою точного тесту Фішера не показав достовірної різниці частоти ПЦВ між підгрупами 1 та 2 (р=0,356) і між підгрупами 1 та 3 (р=0,443). Для оцінки прогностичного значення додаткових цитогенетичних аномалій проведено порівняння частоти досягнення ПЦВ та смертності між всіма хворими цитогенетичних підгруп 1, 2 і 3 (ізольована первинна зміна) незалежно від попереднього лікування та всіма хворими цитогенетичних підгруп 4 і 5 (наявність додаткових аномалій). Статистичний аналіз методом ч2 виявив статистично достовірну різницю між хворими без додаткових цитогенетичних аномалій та з додатковими цитогенетичними аномаліями в досягненні ПЦВ (ч2=6,919, р<0,01) та смертності (ч2=14,89, p<0,01).

В обстеженій групі додаткові цитогенетичні зміни у Ph-позитивних клітинах було виявлено у 18 хворих (24%). У 9 випадках (50%) поява додаткових змін була зафіксована під час контрольних цитогенетичних досліджень, у 9 випадках (50%) додаткові аберації були наявні до початку лікування іматинібом. Загалом, додаткові цитогенетичні аберації, виявлені в процесі лікування, у більшості випадків були типовими для ХМЛ (+der(22), +8, i(17q), +19, +21, -Y). Найчастіше виявляли дуплікацію Ph-хромосоми (61% випадків з додатковими аномаліями) та трисомію 8 (44% випадків). Наступними за частотою виявлення були ізохромосома 17q та трисомія 21 (по 22% випадків). Рідше виявляли трисомії хромосом 6 та 19 (по 11% випадків). Всі інші зміни були наявні однократно (по 6% випадків). При цитогенетичній прогресії в процесі лікування найчастіше спостерігали комплексний каріотип з трьома і більше додатковими абераціями (44% випадків), дещо рідше - ізольовані цитогенетичні зміни (39%) і найрідше - каріотип з двома додатковими змінами (17%). Трисомії різних хромосом було виявлено у 33% випадків, моносомії - в 11%. Із структурних перебудов частіше траплялися делеції (33%), дещо рідше - транслокації (17%), однократно виявляли маркерну хромосому та додавання хромосомного матеріалу. Серед випадків з ізольованими цитогенетичними змінами найчастіше траплялася трисомія 8 (43%), всі інші зміни були наявні однократно. Всі комплексні каріотипи, за винятком одного (88%) характеризувались збільшенням кількості копій окремих хромосом (48 - 56 хромосом в каріотипі).

Цитогенетичні зміни у Ph-негативних клітинах було виявлено у 3 із 39 хворих з повною та частковою цитогенетичною відповіддю (8%), що співпадає з більшістю літературних даних [Terre et al., 2004; J. Besalduch et al., 2007]. У 2 пацієнток типова Ph-хромосома була ізольованою первинною зміною (цитогенетична підгрупа 1), у 1 пацієнтки наявність ізольованої типової Ph-хромосоми супроводжувалась одночасною повною делецією гена ABL/BCR (цитогенетична підгрупа 2). У всіх 3 випадках зміна являла собою додаткову копію хромосоми 8. У 2 випадках наявність аберації було встановлено на фоні ПЦВ, в 1 випадку - на фоні ЧЦВ. Появу аномалій у Ph? клітинах зафіксовано через 16, 48 і 58 місяців після виявлення ХМЛ та через 12, 24 і 37 місяців від початку прийому іматинібу. Трисомія 8 у всіх випадках була транзиторною і не асоціювалась із прогресією хвороби. У всіх 3 описаних випадках ретроспективно проведене на вихідному матеріалі (взятому до початку лікування) дослідження FISH з міткою СЕР 8 виявило відсутність додаткових копій хромосоми 8 у всіх проаналізованих інтерфазних ядрах. Наявність цієї зміни до початку лікування іматинібом не перевіряли. Отже, аномалія була набута в процесі лікування, проте не можна стверджувати, що вона не була наявна перед початком лікування іматинібом.

При аналізі та узагальненні результатів роботи основну увагу було зосереджено на використанні цитогенетичних та молекулярно-цитогенетичних методів у діагностиці ХМЛ та прогностичному значенні характеру первинної цитогенетичної зміни і вторинних аномалій у Ph-позитивних та Ph-негативних клітинах. Комплексне застосування різних цитогенетичних методів у вивченні хромосомних та молекулярно-цитогенетичних змін необхідне для пізнання патогенезу та еволюції ХМЛ. Підсумовуючи результати проведених нами досліджень, треба відзначити, що виявлення цитогенетичних аномалій при ХМЛ (філадельфійської хромосоми та/або гена BCR/ABL і додаткових змін) обов'язкове для діагностики і важливе для прогнозування перебігу хвороби та оцінки відповіді на лікування.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, яка полягає у з'ясуванні спектру цитогенетичних аберацій патологічних клітин при хронічній мієлоїдній лейкемії та їх взаємозв'язку з перебігом хвороби і відповіддю на лікування. За допомогою каріотипування та FISH встановлено гетерогенність BCR/ABL-позитивних клітин за шляхом утворення первинної цитогенетичної зміни, наявністю супутніх делецій в гені ABL/BCR та додаткових змін каріотипу.