Морфофункціональна характеристика кісткового регенерату в умовах дегідратаційних порушень водно-сольового обміну

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 616.71-008.81-06:[577.128+613.3](043.3)

14.03.01 - нормальна анатомія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА КІСТКОВОГО РЕГЕНЕРАТУ В УМОВАХ ДЕГІДРАТАЦІЙНИХ ПОРУШЕНЬ ВОДНО-СОЛЬОВОГО ОБМІНУ

Бумейстер Валентина Іванівна

Луганськ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Сумському державному університеті МОН України.

Науковий консультант доктор медичних наук, професор Сікора Віталій Зіновійович, Медичний інститут Сумського державного університету МОН України, завідувач кафедри анатомії людини

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Тимошенко Ольга Павлівна, Луганський національний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, завідувач кафедри внутрішніх хвороб тварин;

доктор біологічних наук, професор Родіонова Наталія Василівна, Інститут зоології ім. І.І. Шмальгаузена АН України, завідувач відділу цитології та гістогенезу;

доктор біологічних наук, професор Піскун Раїса Петрівна, Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри медичної біології.

Захист відбудеться 25 березня 2010 р.

На засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.04 при Луганському державному медичному університеті МОЗ України (91045, м. Луганськ, квартал 50-річчя Оборони Луганська, 1).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Луганського державного медичного університету МОЗ України (91045, м. Луганськ, квартал 50-річчя Оборони Луганська, 1).

Автореферат розісланий

Вчений секретар спеціалізованої вченої радиЯ.А. Ушко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

дегідратаційний сольовий порушення

Актуальність теми. Реактивність і регенерація тканин і органів, розроблення питань оптимізуючого впливу на процеси загоєння ран - актуальна проблема сучасної морфології та медицини [Дедух Н.В. и др., 1999, Лузін В.І., 2000; Гололобов В.Г., 2001; Пикалюк В.С., 2002; Gosan A., DiPietro L.A., 2004; Ковешніков В.Г., 2005]. Травми опорно-рухової системи, незважаючи на всі досягнення сучасної медицини, залишаються одним з найголовніших факторів інвалідизації населення [Коструб О.О. та ін.,1999; Корж М.О. та ін., 2000; Корж М.О., 2006]. Вони стійко займають третє місце у структурі причин смертності після захворювань серцево-судинної системи і онкологічних захворювань.

На сьогодні чітко проявляються прикладні аспекти медицини природних і антропогенних катастроф, локальних озброєних конфліктів і терористичних актів із застосуванням високотехнологічних видів зброї, що призвело до різкого підвищення травматизму опорно-рухового апарату людини в мирний час [Шаповалов В.М., 1999; Дулаев А.К. и др., 2000].

Проблема травматичних ушкоджень кісток скелета є однією з актуальних в експериментальній і клінічній травматології та ортопедії. Незважаючи на те що при репаративному остеогенезі є передумови до повного відновлення кісткових структур замість втрачених, відсоток ускладнень після травматичних ушкоджень залишається досить високим. Це викликає необхідність розроблення нових експериментально-теоретичних підходів до питань регенерації кістки, які передбачають з'ясування біологічних механізмів, що лежать в основі процесу хемотаксису і диференціювання клітин у ділянці травматичного ушкодження, вивчення формування складних клітинних і тканинних компонентів регенерату, умов, за яких це відбувається, і факторів, які керують остеорепарацією [Бруско А.Т., Омельчук В.П., 1999; Гайко Г.В. та ін., 2001].

Уявлення і трактування даних регенераційного остеогістогенезу неодмінно пов'язані з ключовими питаннями походження остеогенних клітин, їх проліферації, диференціювання і специфічної функції [Родіонова Н.В., 2006]. Про складність і дискусійність цього питання свідчать різноманітні елементи, що зазначаються в роботах, які визначаються різними авторами як похідні для формування регенерату при ушкодженні кістки. У зв'язку з цим слід відмітити дослідження, які сприяють ідентифікації стовбурових стромальних і остеогенних клітин у кістковому мозку [Lodie T.A. et al., 2002; S.-K. Tae et al., 2006]. При великому обсязі фактичних даних щодо загоєння механічних переломів є дуже суперечливі думки вчених з приводу позначень і гістогенетичної природи тканин, які утворюються в зоні дефекту, а також припускається можливість метаплазії одних тканин в інші [Корж Н.А. и др., 2006].

Експериментальні дослідження останніх років, присвячені вивченню особливостей репаративного остеогенезу, дозволили з'ясувати його закономірності, а в ряді випадків по-новому підійти до можливостей регуляції процесів регенерації кісток при переломах [Гололобов В.Г., 2001; Нагорнов М.Н., 2001; T. Albrektsson, C.Johansson, 2001; Н.П.Омельяненко, О.А.Малах, 2002; Ирьянов Ю.М., Ирьянова Т.Ю., 2003; Дедух Н.В. и др., 2004]. Зокрема, доведено, що за допомогою різних фармакологічних і фізичних факторів можна цілеспрямовано впливати на процес регенерації кістки за рахунок створення оптимальних умов перебігу відновлювальних процесів [Лузін В.І., 2000; M.Marxer, M.Kessler, 2001; Никитин И.Г., 2001; Гололобов В.Г. и др., 2003; Hernigou P., Bahrami T., 2003; Иорданишвили А.К. и др., 2002]. Вивчення цих умов наштовхується, в першу чергу, на стан організму, який зазнав ушкодження.

Порушення водно-електролітного балансу супроводжує багато патологічних станів організму, а також може мати місце внаслідок водної депривації. У медичній практиці воно часто трапляється при інфекційних захворюваннях, коматозних і термінальних станах, після значної крововтрати, шоку, хірургічних втручань, як наслідок захворювань шлунково-кишкового тракту, нирок і серця, при пухлинах головного мозку, туберкульозному менінгіті, нецукровому діабеті. Дегідратацію також викликають посилені тривалі фізичні навантаження, трудова діяльність у гарячих цехах, глибоких шахтах. Яскраво виражений ексикоз трапляється в умовах відсутності питної води у регіонах із спекотливим кліматом.

Сьогодні, коли напруженість дії різноманітних зовнішніх факторів невпинно зростає, проблема пристосувально-компенсаторних та деструктивних процесів у тканинах і органах в умовах порушення водно-сольового обміну є особливо актуальною [Багров Я.Ю., 2001; Drakeley A.J. et al., 2002; Петросян Э.А. и др., 2005].

Питанням зневоднення присвятили свої праці морфологи, які вивчали зміни у скелеті та деяких внутрішніх органах в умовах змодельованих дегідратаційних порушень водного обміну організму [Сікора В.З., 1992; Флекей П.П., 1997; Бензар І.М., 2000; Киричок О.М., 2001; Творко В.М., 2002; Н.В. Шовдра., 2002; Федонюк Я.І., 2005; Білик А.Л., 2007 та ін.]. Але вплив зневоднення організму на перебіг репаративного остеогенезу залишається досі не вивченим.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану наукових досліджень Сумського державного університету і є складовою частиною науково-дослідної теми Медичного інституту Сумського державного університету «Вивчення стану здоров'я дитячого та дорослого населення Сумської області в умовах впливу несприятливих соціальних, економічних та екологічних чинників» (№ держреєстрації 0101U00298) та складовою частиною науково-дослідної теми кафедри анатомії людини «Морфофункціональні особливості перебудови скелета та внутрішніх органів в умовах порушення гомеостазу» (№ держреєстрації 010U001287).

Мета і завдання дослідження. Мета дослідження - визначення загально біологічних особливостей репаративної регенерації довгої кістки щурів за умов дегідратаційних порушень водно-сольового обміну організму і вживання коригувального засобу.

Для досягнення поставленої мети були визначені такі завдання:

1. На експериментальній моделі виявити морфологічні закономірності репаративного остеогенезу великогомілкової кістки контрольних тварин для проведення порівняльного аналізу отриманих даних і встановлення взаємозв'язків між структурними показниками.

2. Визначити морфофункціональні особливості формування регенерату великогомілкової кістки в умовах загальної, клітинної і позаклітинної дегідратації організму.

3. Дослідити зміни біохімічних показників крові для визначення загальної реакції організму на травму і зневоднення.

4. Вивчити мінеральний стан регенерату великогомілкової кістки щурів і її тривкісні властивості за умов різних ступенів та видів зневоднення організму.

5. Дати порівняльну характеристику репаративного остеогенезу залежно від ступеня та виду зневоднення та встановити кореляційні зв'язки між структурними показниками.

6. Встановити можливість корекції несприятливого впливу дегідратації важкого ступеня на регенерацію великогомілкової кісток скелета препаратом тималін.

Об'єкт дослідження - репаративна регенерація великогомілкової кістки білих лабораторних щурів-самців за умов дегідратаційних порушень водно-сольового обміну організму.

Предмет дослідження - морфофункціональна характеристика репаративного остеогенезу великогомілкової кістки щурів за умов зневоднення.

Методи дослідження:

остеометрія - вивчення темпів росту та формоутворення травмованих кісток; гістоморфометричні - для вивчення структури регенерату довгих кісток на світлооптичному рівні; електронна мікроскопія - для визначення функціонального стану остеобластів кісткового мозоля; спектрофотометричний - для визначення хімічного складу регенерату кістки; растрова електронна мікроскопія з мікроаналізом - для визначення елементного складу поверхні травмованої кістки; біохімічний аналіз крові - для визначення реакції організму на ушкоджувальні чинники; біомеханічний - для визначення тривкісних властивостей ушкоджених довгих кісток; статистичний - для об'єктивного визначення відмінностей отриманих кількісних даних, оцінки їх взаємозв'язків та виявлення факту і ступеня впливу контрольованих факторів.

Наукова новизна одержаних результатів. У цьому дослідженні застосований принципово новий підхід у вивченні функціональної морфології репаративної регенерації довгих кісток скелета. На достатньому експериментальному матеріалі вперше за допомогою комплексу морфологічних методів дослідження розкриті основні закономірності відновлення структури травмованої великогомілкової кістки щурів за умов дегідратаційних порушень водно-сольового обміну організму.

Вперше встановлено порушення перебігу регенераторних процесів вже на запально-проліферативній стадії, яке проявляється зменшенням кількості макрофагів та фібробластів, що свідчить про затримку процесів диференціювання клітин фібробластичного і остеобластичного диферонів. Вперше доведено, що зневоднення призводить до гальмування процесів реорганізації посттравматичної гематоми, що викликає сповільнення утворення кісткових тканин на подальших стадіях організації кісткового мозоля. Встановлена ключова роль у формуванні регенерату початкової стадії репаративного остеогенезу.

Вперше встановлений діапазон ультрамікроскопічних змін остеобластів посттравматичного регенерату, які наростають від дистрофічних - при легкому, до вогнещеводеструктивних - при важкому ступені зневоднення.

Новими є дані щодо вивчення мікроаналізу поверхні регенерату, які свідчать про уповільнення процесів ремоделювання ушкодженої кістки в умовах дегідратації організму.

Новизною вирізняється визначення зниження механічних властивостей травмованої кістки, які є найбільш суттєвим показником її подальшого функціонування.

У роботі набуло подальшого розвитку експериментальне моделювання загальної, клітинної і позаклітинної дегідратації організму, і отримані нові дані стосовно структурних і метаболічних змін репаративного остеогенезу під впливом зневоднення.

Визначена залежність структурних змін кісткового мозоля від ступеня та виду зневоднення. Виявлена можливість корекції негативних наслідків впливу дегідратаційних порушень на процеси репарації довгих кісток препаратом тималін.

Практичне значення одержаних результатів. Дане дослідження дозволило детально визначити механізми впливу дегідратації на формування посттравматичного регенерату кістки в умовах цілісного організму. Отримані нові експериментальні дані про дію зневоднення організму є морфологічною основою для прогнозування змін у скелеті, що може бути використано у функціональній анатомії кісткової системи, травматології, ортопедії, терапії тощо, як теоретичне підґрунтя для оптимальної розробки лікувальних заходів та профілактики травматичних ушкоджень скелету.

Результати експериментальних досліджень впроваджені у навчальний процес на кафедрі анатомії людини, топографічної анатомії та оперативної хірургії Буковинського державного медичного університету, кафедрах анатомії людини Запорізького державного медичного університету, Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова, Луганського державного медичного університету, Дніпропетровського державного медичного університету, Буковинського державного медичного університету, Кримського державного медичного університету ім.С.І. Георгієвського, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, Української медичної стоматологічної академії, на кафедрі анатомії людини, гістології, цитології та ембріології Ужгородського національного університету, на кафедрі гістології, цитології та ембріології Івано-Франківського медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснені патентно-інформаційний пошук та аналіз літературних джерел. Автор оволоділа методами дослідження, які використовувалися під час проведення наукової роботи, провела постановку експерименту, забір матеріалу та морфофункціональні дослідження, здійснила аналіз та статистичну обробку отриманих результатів. Дисертантом написані всі розділи роботи, здійснено узагальнення, сформульовані висновки, підготовлені наукові матеріали до публікацій та виступів на конференціях.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертації повідомлені й обговорені на Міжнародному конгресі “Розвиток в морфологічних, експериментальних та клінічних дослідженнях положень вчення В.М. Шевкуненка про індивідуальну мінливість будови тіла людини» (Полтава, 23-24 травня 2003р.), V Міжнародному конгресі інтегративної антропології, Пироговських читаннях (Вінниця, 3-4 червня 2004 року), Всеукраїнській науковій конференції «Актуальні питання клінічної анатомії та оперативної хірургії» (Чернівці, 11-13 жовтня 2004р.), симпозіумі «Біологія опорно-рухового апарату» (Сімферополь-Ялта, 3-5 листопада 2004р.), II Всеукраїнській науково-практичній конференції «Актуальні проблеми біомінералогії» (Луганськ, 12-14 квітня 2006р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції «Сучасні методи в дослідженні структурної організації органів і тканин» (Судак, 25-28 квітня 2006р.), Всеукраїнській конференції «Сучасні проблеми морфології» (Полтава, 18-20 травня 2006р.), Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів» (Тернопіль, 30-31 травня 2006р.), IV Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Сімферополь, 21-23 вересня 2006р.), Науково-практичній конференції «Досвід і проблеми застосування сучасних морфологічних методів дослідження органів і тканин у нормі при діагностиці патологічних процесів» (Тернопіль, 24-25 травня 2007р.), VI науково-практичній конференції «Морфогенез і патологія кісткової системи в умовах промислового регіону» (Луганськ, 11-12 квітня 2007р.), VI Міжнародному конгресі з інтегративної антропології (Вінниця, 4-5 жовтня 2007р.), Всеукраїнській науковій конференції "Актуальні проблеми сучасної морфології" (Луганськ, 10-11 квітня 2008 р.), Міжнародній науково-практичній конференції "Сучасні досягнення теоретичної та практичної медицини" (Суми, 24-25 квітня 2008р.), симпозіумі «Морфогенез органів і тканин під впливом екзогенних факторів» (Сімферополь-Алушта, 2-4 жовтня 2008р.), Міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні питання теоретичної медицини" (Суми, 23-24 квітня 2009 р.), Науково-практичній конференції "Прикладні аспекти морфології" (Вінниця, 20-21 травня 2009 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції «Морфологічний стан тканин і органів систем організму в нормі та патології» (Тернопіль, 10-11 червня 2009 р.), Науково-практичній конференції «Актуальні проблеми функціональної морфології» (Полтава, 10-12 вересня 2009р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 41 наукову працю (одноосібних - 10), з них 23 статті у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України для біологічних наук, 8 статей у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України для медичних наук, 10 праць - у матеріалах з'їздів, конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 375 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, семи розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який налічує 461 найменування (246 робот - кирилицею, 215 - латиницею) і додатків. Дисертаційна робота ілюстрована 38 таблицями та 158 рисунками. Бібліографічний опис літературних джерел, ілюстрації та додатки викладені на 117 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. З метою вивчення репаративної регенерації кісток в умовах дегідратаційних порушень обміну організму проведено експериментальні дослідження на 408 білих лабораторних щурах-самцях з масою тіла 180-200г.

Тварини всіх серій до початку дослідження знаходилися на звичайному харчовому раціоні та утриманні, яке здійснювали відповідно до “Санітарних правил створення, обладнання та утримання експериментально-біологічних клінік (віваріїв)” від 06.04.73 р. та доповнень від 04.12.78 р. до наказу МОЗ СРСР № 163 від 10.03.66 р. “Про добові норми харчування тварин та продуценти”. Дослідження проводили в однакових для всіх серій експериментів умовах. Досліди на тваринах виконували відповідно до правил «Європейської конвенції захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях», "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», прийнятих Першим національним конгресом з біоетики (Київ, 2001), Гельсинської декларації Генеральної асамблеї Всесвітньої медичної асоціації (2000).

Для постановки експерименту ми користувалися класифікацією порушення водного гомеостазу, яку застосовували на кафедрі реаніматології I МОЛМІ ім. І.Сеченова (1979) і Сікора В.З. (1992), де дегідратація поділяється на загальну, клітинну і позаклітинну. За показником водного дефіциту розрізняють три ступені дегідратації: легкий (дефіцит води досягає 2-5%), середній (5-10%) і важкий (більше 10%).

Відповідно до експериментальної моделі тварини були розподілені на такі серії та групи:

I серія (30 щурів) - контрольна: в умовах стерильної операційної під наркотановим інгаляційним наркозом наносився дірчастий дефект обох великогомілкових кісток стоматологічним бором діаметром 2 мм на межі проксимальної та центральної третин медіальної поверхні діафіза. Місце нанесення травми підібране з урахуванням найменшого травматизму м'язів та магістральних судин, які відсутні в зазначеній ділянці. Операційну рану закривали шкіряним швом, тварин виводили з наркозу й утримували в стаціонарних умовах віварію. Щурі знаходилися на загальному раціоні віварію і були розподілені за терміном дослідження.

II серія (90 щурів) - щурі з дірчастим дефектом великогомілкових кісток, яким моделювалася загальна дегідратація за А.Д.Соболєвою (1975) шляхом утримання тварин на повністю безводній дієті. Як їжу вони отримували гранульований комбікорм. Цю серію розбили на 3 групи. У першій групі моделювався легкий ступінь зневоднення, якого досягали за три дні. У другій групі моделювався середній ступінь дегідратації, коли водний дефіцит, визначений за різницею висушеної тушки, становив стосовно до контролю 6-10% і досягався протягом 6-7 днів експерименту. Третя група, де моделювався важкий (сублетальний) ступінь зневоднення і коли різниця у вмісті загальної вологи у дослідної та інтактної груп становила вище 10%. Цей ступінь дегідратації досягався протягом 10-12 днів експерименту.

III серія (96 щурів) - тварини з дірчастим дефектом великогомілкових кісток, яким моделювалося клітинне зневоднення. Щурі отримували як пиття 1,5% гіпертонічний розчин кухонної солі, а як їжу - гранульований комбікорм. Тварини цієї серії також були поділені на три групи. У першій групі моделювалася клітинна дегідратація легкого ступеня. Тваринам за дві години до забою вводили внутрішньоочеревинно 3% розчин радонату натрію і визначали в крові за Є.Б.Берхіним та Ю.І.Івановим воду позаклітинного сектору. Потім тушку висушували в сушильній шафі при t=105⁰С до сталої маси і вираховували загальну вологість. За різницею між показниками загальної та позаклітинної вологи вираховували клітинну воду. В цій групі дефіцит клітинної води стосовно до контролю становив 2-5% - легкий ступінь зневоднення (досягається протягом 7-10 днів). Друга група щурів - коли протягом 16-20 днів досягався 5-10% дефіцит клітинної вологи, тобто середній ступінь даного зневоднення. Третя група - моделювання важкого ступеня клітинної дегідратації, коли дефіцит клітинної води стосовно до контролю становив вище 10%. Сублетальний ступінь клітинного зневоднення досягався за 28-30 днів досліду.

IV серія (102 щурі) - щурі з дірчастим дефектом великогомілкових кісток, яким проводився експеримент із позаклітинною дегідратацією. Тварини цієї серії також розбиті на 3 групи. У першій групі моделювався легкий ступінь зневоднення, коли кількість позаклітинної рідини на 2-5% менша від контрольних показників. Цей ступінь позаклітинної дегідратації досягався протягом місяця таким чином: тваринам давали бідистильовану воду з розчиненим у ній діуретиком (лазикс), а харчовий раціон складався із знесоленої (вивареної) маломінералізованої їжі. У другій групі моделювалося позаклітинне зневоднення середнього ступеня протягом двох місяців експерименту (дефіцит позаклітинної рідини за радонатом натрія 6-10%). У третій групі - позаклітинне зневоднення важкого ступеню досягалося протягом трьох місяців експерименту (дефіцит позаклітинної води вище 10% стосовно до контролю).

V серія (90 щурів) - корекція репаративного остеогенезу тварин з дірчастим дефектом великогомілкових кісток в умовах дегідратації важкого ступеню. Тварини цієї серії розподілялися на 3 групи залежно від виду зневоднення. Тварини отримували препарат тималін для корекції репаративного остеогенезу: перша група - при загальній дегідратації важкого ступеня; друга група - при клітинній дегідратації важкого ступеня, третя група - при позаклітинній дегідратації важкого ступеня.

Перед застосуванням вміст ампули тималіну розчиняли в 2 мл ізотонічного розчину натрію хлориду і вводили внутрішньом'язово в дозі 2 мг/кг один раз на добу протягом усього терміну експерименту.

Розрахунок дози проводили з урахуванням рекомендацій Р.С. та Ю.Р. Риболовлевих. Формула розрахунку має такий вигляд:

Доза для щура = rЧДоза для людини / R,

де r - коефіцієнт видової витривалості для щура = 3,62;

R - коефіцієнт видової витривалості для людини = 0,57.

Вибір використаного в роботі препарату не випадковий: тималін - широко застосовується в клінічній практиці. Одними із показань до його застосування є порушення регенераторних процесів при переломах кісток, гострі й хронічні гнійно-запальні захворювання кісток і м'яких тканин, а також пригнічення імунітету і кровотворення після проведеної променевої терапії або хіміотерапії. Роботами Ткача Г.Ф. (2005) доведено позитивний вплив тималіну на регенераторні процеси в довгих кістках в умовах комбінованого впливу іонізуючого опромінення і солей важких металів.

В експерименті використаний препарат, що випускається Київським державним підприємством з виробництва бактерійних препаратів "Біофарма", затверджений наказом Міністерства охорони здоров`я України від 04.04.2000 №67 з реєстраційним свідоцтвом № Р 04.00/01599.

Тваринам усіх експериментальних серій завдавали травму обох великогомілкових кісток по досягненню відповідного ступеня зневоднення і переводили на звичайний питний раціон.

По завершенні терміну досліду декапітацію щурів проводили під ефірним наркозом через 3, 10, 15 та 24 доби після операції відповідно до стадій репаративного остеогенезу [Корж Н.А., Дедух Н.В., 2006]. У зв'язку із затриманням репаративних процесів виконувалося дослідження репаративного остеогенезу на 45-ту добу у тварин другої серії, яким моделювалося клітинне зневоднення важкого ступеня, та третьої серії - у тварин з позаклітинним зневодненням середнього та важкого ступенів. Після виведення щурів з досліду у них забирали великогомілкові кістки.

Структурно-метаболічні прояви репаративного остеогенезу вивчали за допомогою таких методів дослідження:

1. Остеометричний. Остеометричне дослідження великогомілкових кісток щурів проводили лише в останній термін спостереження, щоб виявити загальні зміни росту та формоутворення травмованих кісток. Остеометрія довгих трубчастих кісток містила такі показники: найбільша довжина кістки, найбільша ширина проксимального та дистального епіфізів, найбільша ширина та передньозадній розмір середини діафіза.

2. Гістологічне дослідження ділянки дефекту. Готували гістологічні зрізи кісткового мозоля за загальноприйнятою методикою та забарвлювали їх гематоксилін-еозином і за Романовським-Гімзе. Отримані препарати вивчали за допомогою світлового мікроскопа “OLIMPUS”.

3. Морфометрія гістологічних препаратів. Морфометричні дослідження проводили за допомогою комп'ютерних програм "Відео Тест 5,0" та "Відео розмір 5,0". Через 3 дні після нанесення дефекту вивчався клітинний склад регенерату у вигляді відсотка окремих популяцій клітин від їх загальної кількості в ділянці дефекту. Проводився підрахунок фібробластів, макрофагів, лімфоцитів, плазмоцитів, нейтрофілів та малодиференційованих клітин.

У гістологічних препаратах, отриманих у подальші терміни репаративного остеогенезу, проводилося визначення відсоткового вмісту грануляційної, фіброретикулярної, грубоволокнистої та пластинчастої кісткової тканин. Здійснювалося вимірювання товщини кісткових трабекул на периферії та у центральній ділянці дефекту, а також загальної площи судин у регенераті та середнього діаметра судин регенерату.

4. Ультрамікроскопія регенерату. Під час проведення електронно-мікроскопічного дослідження вивчалися остеобласти регенерату на 10, 15, 24 та 45-ту (у відповідних групах) добу.

Ультратонкі зрізи виготовляли на вдосконаленому ультрамікротомі УМТП-6, вмонтовували на електролітичні сіточки, які після контрастування цитратом свинцю вивчали під електронним мікроскопом ЕМВ-100БР при прискорювальній напрузі 75 кВ. Збільшення підбиралося адекватно до мети дослідження і коливалося в межах 20000-60000 крат.

5. Растрова електронна мікроскопія з мікроаналізом поверхні кістки. Для аналізу розподілу кальцію та фосфору на поверхні травмованої кістки виділяли великогомілкові кістки та проводили видалення всіх м'яких тканин. Зважаючи на структуру кісткової тканини, що містить велику кількість мінеральних речовин, та необхідність дослідження взятих зразків методом атомної абсорбційної спектрофотометрії, ми не проводили спеціальної обробки органа. Після видалення кістки відбувалось її висушування на повітрі до повної втрати вологи, що є необхідною умовою для дослідження зразка методом РЕММА. Після остаточного висушування кістки проводили вивчення морфологічних особливостей регенерату і кількісного вмісту кальцію та фосфору за допомогою растрового електронного мікроскопа РЕММА-102 при збільшенні від 10 до 2500 разів.

Визначення вмісту кальцію та фосфору на РЕММА проводили в 3 точках, що попередньо були визначені за допомогою PIXE: безпосередньо в дефекті, на поверхні материнської кістки біля регенерату та на відстані 10 мм від дефекту.

6. Визначення хімічного складу. Виділяли ділянку дефекту з прилеглою кісткою і висушували до сталої ваги при температурі 105°С у сушильній шафі. За різницею у вазі вологої і сухої кісток визначали її вологість. Потім висушену тканину спалювали в порцелянових тиглях у муфельній печі при температурі 450^°С упродовж 48 годин. Шляхом зважування попелу вираховували загальну кількість мінеральних речовин на сухий залишок. На атомному абсорбційному спектрофотометрі С-115М1 за загальноприйнятою методикою визначали кількість кальцію (довжина хвилі - 422,7 нм), калію (довжина хвилі - 766,5 нм), натрію (довжина хвилі - 589,5 нм), магнію (довжина хвилі - 285,2 нм), міді (довжина хвилі - 324,7 нм), цинку (довжина хвилі - 213,9 нм), заліза (довжина хвилі - 248,3 нм) і марганцю (довжина хвилі - 279,5 нм), а також вміст фосфору колориметрично за Бригсом на електрофотоколориметрі.

7. Вивчення тривкісних (міцнісних) властивостей кісток. Для вивчення фізико-механічних тривкісних властивостей виділяли великогомілкову кістку з дефектом і проводили визначення її міцності на розрив та стискання. Визначення механічних властивостей кісток проводили тільки в останній термін спостереження. Для визначення залежності між силою тривкості на розтягнення та на стиснення використовували спеціальний пристрій, за допомогою якого ми змогли визначити поздовжні сили кісток (Р, кгс) через дію на них зовнішніх сил.

Остаточні розрахунки тривкості виражаються у таких параметрах: поздовжня руйнівна сила зразка (кгс), межа міцності (кгс/мм²), модуль Юнга (Па) та жорсткість поперечного перерізу (Н).

У зв'язку з тим що визначення тривкості кісток передбачає велику кількість матеріалу в останній термін спостереження використовували вдвічі більше тварин.

8. Визначення мікротвердості кістки. Вивчення мікротвердості проводили за допомогою приладу ПМТ-3. Перед проведенням дослідження поверхню кістки зашліфовували та фіксували зразок на металевому столику за допомогою епоксидних смол. Визначення числа твердості проводили в місці травми та на поверхні материнської кістки на відстані 10 мм від місця травми. Для визначення мікротвердості в досліджуваний зразок під дією навантаження Р удавлювалась алмазна піраміда. У наших дослідах величина навантаження становила 0,1 кгс. Після дії навантаження на поверхні зразка залишається відбиток у вигляді піраміди з квадратною основою. Для визначення числа твердості Н, кгс/мм², навантаження Р ділять на умовну площу бічної поверхні відбитка

Н = 1,8544(Р/d²),

де Р - навантаження на піраміду;

d - діагональ відбитка.

9. Дослідження крові. Матеріалом для дослідження була венозна кров піддослідних тварин, яку центрифугували при 3000 об/хв протягом 15 хвилин. У отриманій сиворотці визначалися вміст білка, загального кальцію та активність лужної фосфатази [Корячкин В.А., 2001].

Усі отримані цифрові дані оброблялися статистично на персональному комп'ютері з використанням пакета прикладних статистичних комп'ютерних програм для Windows і Exsel [Автандилов Г.Г., 2002, Лапач С.Н., 2000]. Достовірність розбіжності експериментальних і контрольних даних оцінювали з використанням критерію Стьюдента, вірогідною вважали ймовірність похибки менше 5% (р?0,05). Також був проведений кореляційний аналіз із метою кількісної оцінки ступеня взаємозв'язків показників х і у та розрахований коефіцієнт кореляції r_x/y. Показником х були кількість кальцію та фосфору на 3-тю, 10-ту, 15-ту та 24-ту добу; показником у - площа грубоволокнистої та пластинчастої кісткових тканин на 15-ту та 24-ту добу, межа тривкості та модуль Юнга при стисканні та розтягуванні, число твердості в ділянці регенерату та на відстані. Якщо r_x/y досягав значення від ±0,30, силу зв'язку між досліджуваними ознаками вважали слабкою, від ±0,31 до ±0,69 - середньою і від ±0,70 до ±0,99 - сильною. З метою виявлення факту й ступеня впливу контрольованих факторів (ступінь, вид зневоднення і їх взаємодія) на результуючі ознаки провели двофакторний дисперсійний аналіз [Васильев А.Н., 2004; Макарова Н.В., Трофимец В.Я., 2002]. Результуючими ознаками були показники гістоморфометрії, біохімії крові, мікроаналізу поверхні регенерату, хімічного складу регенерату, тривкісних властивостей ушкоджених кісток.

Результати дослідження та їх обговорення. Мікроскопічна характеристика регенерату великогомілкової кістки (ВГК) контрольних щурів на першій стадії репаративного остеогенезу (3-тя доба) характеризується мозаїчною картиною стану клітинних і тканинних елементів, гематома фрагментується на ділянки, заселені нейтрофільними гранулоцитами. Підсилюється васкуляризація періостальної частини кістки, яка обумовлена активним ростом і новоутворенням судин. У періостальній фіброретикулярній тканині починається формування кісткових балочок. Клітини, які складають проліферат окістя, мають частково фібробластоподібний, частково остеобластоподібний вигляд. В ендостальній зоні порівнянно з періостальною виявляється більш тонкий шар проліферуючих клітинних елементів, який також дещо потовщений у напрямку лінії ушкодження без видимої міжклітинної речовини.

У зоні ушкодження великогомілкової кістки щурів, яким моделювався легкий ступінь різних видів зневоднення, у перший термін дослідження теж спостерігалися залишки гематоми, площа якої при загальному і клітинному зневодненні аналогічна контрольній групі тварин. При позаклітинному зневодненні кров'яний згусток має більші розміри і менше піддається реорганізації. Ділянка дефекту заповнена клітинами, серед яких переважають фібробласти. Їх найбільше при загальній дегідратації (30,84±0,27%), а найменше - при позаклітинному зневодненні (27,52±0,26%). Фібробласти перебувають у стадії активного синтезу міжклітинної речовини, яка формує прошарки фіброретикулярної тканини. Найбільш суттєві зміни відбуваються з нейтрофілами, що свідчить про інтенсивність фагоцитарного процесу після ушкодження тканини. Кількість нейтрофілів зростає від 9,07% (р<0,05) - при загальній дегідратації до 53,80% (p<0,001) - при позаклітинному зневодненні (рис. 1). По периферії дефекту починають формуватися капіляри синусоїдного типу з великою кількістю периваскулоцитів та фібробластів навколо.

У цей самий час в умовах впливу середнього ступеня зневоднення більша частина дефекту теж виповнена кров'яним згустком. Молода грануляційна тканина, площа якої зменшена в порівнянні з контролем при всіх видах дегідратації, містить велику кількість клітин, які якісним складом не відрізняються від контролю. Зміни відбуваються лише в кількісному вираженні.

При важкому ступені зневоднення в першій стадії регенерації спостерігаються більш суттєві зміни. Відбувається уповільнення процесу резорбції посттравматичної гематоми і формування грануляційної тканини. Зменшується кількість секретуючих фібробластів, що веде до затримки розвитку фіброретикулярної тканини.

А В

Рис. 1. Відсоткове співвідношення клітинного складу регенерату великогомілкової кістки контрольних щурів (А) та за умов важкого ступеня позаклітинного зневоднення (В) через 3 дні після нанесення дефекту.

Проведений двофакторний дисперсійний аналіз морфометричних показників клітинного складу регенерату свідчить про найбільший вплив на результуючі ознаки 3-ї доби експерименту фактора ступеня дегідратації. Найменший вплив ступінь зневоднення має на вміст нейтрофілів - 66,15%. Інший контрольований фактор - вид дегідратації має в перший термін спостереження незначний, але достовірний вплив на відсотковий вміст клітин, який становить від 20,87% до 27,90%. Подібний розподіл ступеня впливу контрольованих факторів на результуючі можна пояснити високою чутливістю клітинних компонентів регенерату даної стадії саме до ступеня зневоднення.

Через 10 днів дослідження в регенераті ВГК експериментальної групи тварин спостерігалися залишки гематоми, що не характерно для даної стадії репарації у контрольних щурів. У дефекті переважають молода фіброретикулярна та грануляційна тканини, площа яких при всіх видах дегідратації збільшена порівняно з контрольною групою. Це свідчить про затримку формування грубоволокнистої тканини, об'єм якої нижче за контрольні показники. Ця тканина, що більше розміщена по периферії регенерату, представлена кістковими трабекулами. Характерною ознакою її в цей термін є неоднорідне забарвлення, що свідчить про різний ступінь кальцифікації. При легкому ступені загального зневоднення спостерігається велика кількість секретуючих остеобластів на поверхні трабекул, вміст яких зменшується з наростанням ступеня зневоднення. На поверхні таких остеобластів, а також між клітинами помітні перші порції міжклітинної речовини. Новоутворена кісткова тканина при загальній дегідратації тісно спаяна з периферичними шарами кортикальної пластинки материнської кістки, яка втрачає свою компактність. При клітинному та позаклітинному зневодненні між регенератом та материнською кісткою спостерігаються щілиноподібні розриви. Усе це свідчить про уповільнення процесів репаративного остеогенезу вже на другій стадії формування кісткового мозоля у експериментальних щурів.

На 15-ту добу (III стадія) після травми ВГК зона дефекту представлена здебільшого фіброретикулярною та грубоволокнистою кістковими тканинами, на поверхні яких знижена кількість остеобластів. Останні утворюють великопетлясті кісткові трабекули, які заповнюють зону дефекту. Забарвлюються новоутворені трабекули менш інтенсивно, ніж материнська кістка, та нерівномірно, що свідчить про початок осифікації та її гетеротопічність. Товщина і зрілість кісткових балок порівняно з контролем зменшені. Відсоток витончення трабекул збільшується з наростанням ступеня зневоднення і більш виражений у центральних ділянках регенерату, що свідчить про порушення васкуляризації цих відділів та зменшення активності остеогенних клітин.

Проведений двофакторний дисперсійний аналіз вмісту в регенераті фіброретикулярної тканини свідчить про найбільший вплив на її площу як на 10-ту, так і на 15-ту добу експерименту фактора ступеня дегідратації (69,23% і 64,54% відповідно). Найменший вплив у II стадії остеогенезу на площу фіброретикулярної тканини має вид зневоднення (0,77%), тоді як у III стадії - взаємодія факторів (5,43%).

Через 24 доби (IV стадія) після перелому кістковий мозоль ВГК експериментальних тварин при легкому ступені дегідратації майже не відрізняється від контролю. Основним морфологічним субстратом кортикальної пластинки є вже пластинчаста кісткова тканина, хоча її значно менше порівняно з контролем. Від материнської кістки вона відрізняється більшою кількістю судинних та остеоцитарних лакун. Кількість пластинок, що формують останні, зменшується, а їх діаметр дещо більший від контролю.

У цей термін при важкому ступені клітинного зневоднення та середньому і важкому ступенях позаклітинної дегідратації спостерігається затримка процесів репарації, які морфологічно подібні до передостаннього (третього) терміну остеогенезу контрольної групи тварин. У міжуламковій зоні знаходяться залишки фіброретикулярної тканини, кістковий мозоль майже не сформований і має вигляд абсолютно незрілого. Кількість остеогенних клітин на поверхні трабекул менша за контроль, забарвлення їх неоднорідне. Кортикальний шар представлений трабекулярною сіткою, але місцями помітне формування пластинчастої тканини. На межі з материнською кісткою помітні місця розривів, місточки з кісткових трабекул неоднорідної товщини.

Двофакторний дисперсний аналіз вмісту грубоволокнистої тканини свідчить про найбільший вплив на її площу з 10-ї по 24-ту добу спостереження фактора ступеня дегідратації. Але на 15-ту добу вплив ступеня зневоднення зменшується від 67,58% (на 10-ту добу) до 56,68% (на 15-ту добу), у той час як вплив фактора виду зневоднення в ці самі терміни зростає від 24,42% до 33,82%. Найбільший вплив на вміст пластинчастої тканини має фактор ступеня зневоднення (73,77% - на 15-ту добу і 71,30% - на 24-ту добу).

На середній діаметр судини найбільший вплив на 10-ту добу має вид зневоднення (45,33%), на 15-ту добу вплив усіх контрольованих факторів суттєво знижується, і найбільший відсоток впливу спричиняє ступінь дегідратації (12,67%), а вплив виду зневоднення та взаємодії факторів перебувають майже на одному рівні (5,88% і 4,95% відповідно). На 24-ту добу вплив усіх контрольованих факторів підвищується, але найвищим залишається ступінь зневоднення (47,68%).

Кореляційний аналіз між клітинним складом регенерату на 3-тю добу виявив середньої сили взаємодію із вмістом тканин на 15-ту та 24-ту добу. Так, відсоток фібробластів має прямий кореляційний зв'язок середньої сили із вмістом грубоволокнистої та пластинчастої кісткової тканин. Коефіцієнт кореляції на 15-ту добу становив відповідно 0,525 та 0,491, на 24-ту - 0,502 та 0,538. У той самий час вміст макрофагів має негативний кореляційний зв'язок з рівнем грануляційної тканини на 10-ту добу (r=-0,452) та позитивний зв'язок - із вмістом грубоволокнистої кісткової тканини (r =0,793). Натомість вміст нейтрофілів має позитивну кореляцію із вмістом фіброретикулярної тканини на 10-ту (r=0,478) та 15-ту добу (r=0,602), але негативний зв'язок із відсотком пластинчастої тканини на 24-ту добу (r=-0,852). Проведення кореляційного аналізу між відсотком інших клітин регенерату на 3-тю добу та площею тканин в інші терміни спостереження показали відсутність достовірних зв`язків та зв'язки слабкої сили. Високий ступінь кореляції між клітинним складом регенерату на 3-тю добу та об`ємом тканин, що формуються в більш пізні терміни, підтверджує думку більшості дослідників про ключову роль саме першої стадії регенерації у процесах загоєння перелому.

Тільки на 45-ту добу при важкому ступені клітинної та позаклітинної дегідратації спостерігається підвищення кісткоутворювальних процесів. Дефект повністю заповнюється новоутвореною кістковою тканиною, але навіть у цей термін зберігається підвищення вмісту грубоволокнистої тканини. Пластинчаста кісткова тканина з розширеними каналами остеонів все ще займає значно менші ділянки регенерату.

Починаючи з перших термінів спостереження, у експериментальних тварин відбуваються зміни усіх досліджуваних біохімічних показників крові. Так, вміст кальцію на 3-тю добу після перелому при легкому ступені при загальній дегідратації зменшується від 5,01% (p>0,05) до 11,37% (p<0,01) при позаклітинній. Подібна тенденція відбувається в усі терміни і при всіх ступенях зневоднення. Ці показники свідчать про уповільнення мобілізації кальцію та зменшення інтенсивності ремоделювання кісткової тканини. Подібна картина відбувається і з вмістом у крові лужної фосфатази, що є маркером ремоделювання кісткової тканини. Так, на 10-ту добу активність лужної фосфатази при середньому ступені зменшується від 3273,92±61,07 нмоль/с*л (p<0,05) при загальному до 3131,60±46,28 нмоль/с*л (p<0,001) при клітинному та до 3012,24±49,73 нмоль/с*л (p<0,001) при позаклітинному зневодненні. Найбільше збільшення білка при усіх видах та ступенях дегідратації відбувається на 15-ту добу. При важкому ступені загального зневоднення на 15-ту добу кількість білка вища за контрольні показники на 14,72% (р<0,01), клітинного - на 26,52% (p<0,01), позаклітинного - на 28,17% (p<0,001).

Двофакторний дисперсний аналіз показників крові свідчить про найбільший вплив на результуючі ознаки на всіх стадіях регенерації фактора ступеня дегідратації. На 3-тю добу експерименту вплив ступеня дегідратації на вміст кальцію у крові становить 67,27% і поступово підвищується на 15-ту добу до 71,20%, а на 24-ту добу знижується до 64,80%. У той час як вплив виду дегідратації на 3-тю добу становить 27,49%, потім до 10-ї доби майже не змінюється, а на 15-ту добу, на відміну від кальцію, знижується до 24,10%, а до 24-ї доби поступово збільшується до 28,20%. Аналогічна картина відбувається і з впливом контрольованих факторів на вміст білка крові, тобто на 24-ту добу знижується відсоток впливу ступеня дегідратації (із 69,66% до 54,89%), а вплив виду дегідратації збільшується від 24,68% до 32,25%. Інша картина з впливом контрольованих факторів відбувається на вміст лужної фосфатази. На 3-тю добу експерименту вплив усіх факторів (ступеня та виду дегідратації, взаємодії факторів) перебуває майже на одному рівні з невеликим переважанням впливу взаємодії факторів. На 10-ту добу картина змінюється таким чином: найбільше впливає на результуючі ознаки експерименту фактор ступеня дегідратації (71,88%), а найменше - взаємодія факторів (1,55%). У наступні терміни зберігається аналогічна картина.

Хіміко-аналітичний аналіз вмісту неорганічних речовин у регенераті ВГК свідчить про затримку репаративного остеогенезу в умовах дегідратаційних порушень водно-сольового обміну організму. Наша увага була привернута до таких макроелементів, як кальцій, фосфор, натрій, калій, магній, які визначають мінеральну насиченість кістки та вміст води. Визначали також вміст марганцю, міді, цинку і заліза, які є остеотропними мікроелементами і беруть активну участь в обмінних процесах кістки.

На 3-тю добу експерименту при легкому ступені зневоднення відбувається зниження кількості кальцію від незначних величин (0,75%) при загальній до 14,81% (p<0,001) при позаклітинній дегідратації. При середньому ступені зневоднення ці цифри зростають від 8,36% (p<0,05) при загальному зневодненні до 26,75% (p<0,001) при позаклітинному. Найбільш суттєві зміни відбуваються при важкому ступені зневоднення, і відсотковий інтервал змін порівняно з контролем перебуває у межах 18,76% - 32,00% (p<0,001).

Проведений двофакторний дисперсійний аналіз вмісту кальцію у регенераті ВГК свідчить про найбільший вплив в усі терміни спостереження фактора ступеня дегідратації, відсоток якого незмінний в усі терміни експерименту.

Рівень фосфору при легкому ступені загального та клітинного зневоднення порівняно з відповідним контролем зменшується несуттєво, а при позаклітинній дегідратації відсоток змін підвищується до рівня 15,42% (p>0,05) на 3-тю добу, до 12,65% (p<0,01) - на 24-ту добу. При середньому ступені зневоднення вміст фосфору на 3-тю добу зменшується на 8,22% (p>0,05) при загальній дегідратації, на 20,08% (p>0,05) при клітинній і на 26,19% (p<0,05) при позаклітинній дегідратації. На 10-ту добу кількість фосфору знижується від 2,09±0,07% при загальному зневодненні до 1,86±0,06% при клітинному і до 1,77±0,05% при позаклітинному. При важкому ступені зневоднення кількість фосфору при загальній дегідратації зменшується майже на 25% (p>0,05), при клітинній доходить до 30% (p<0,05) і при позаклітинній долає 30% (p<0,05) межу.

Рис. 2. Результати двофакторного дисперсійного аналізу впливу контролюючих факторів на вміст фосфору в регенератах ВГК щурів у різні терміни репаративного остеогенезу.

При проведенні двофакторного дисперсійного аналізу спостерігається цікава картина (рис. 2). На 3-тю добу спостереження серед контрольованих факторів переважає ступінь дегідратацій (63,89%), а найменший вплив здійснює взаємодія факторів (5,05%), тоді як на 10-ту добу відбуваються протилежні зміни. Найбільший вплив має взаємодія факторів (44,88%), а фактор ступеня дегідратації знижується до 16,20% і знаходиться нижче рівня впливу виду дегідратації (18,7%). На 15-ту добу відновлюється картина, яка спостерігалася на 3-тю добу, і найбільшим фактором виступає ступінь зневоднення (72,10%), до 24-ї доби залишається ця сама динаміка.

Проведений аналіз вмісту у кістковому мозолі ВГК щурів гідрофільного елемента натрію свідчить про зменшення його кількості в усі терміни репаративного остеогенезу при усіх ступенях і видах дегідратації. Найбільші зміни відбуваються при важкому ступені зневоднення: на 24-ту добу експерименту вміст натрію зменшується на 27,21% (p<0,001), 29,93% (p<0,001) і 54,76% (p<0,001) при загальній, клітинній та позаклітинній дегідратації відповідно.

Кількість калію у регенераті ВГК при легкому ступені загального та клітинного зневоднення зменшується порівняно з контролем несуттєво, тоді як при позаклітинній дегідратації відсоток змін у середньому становить 17% (р<0,01). При середньому ступені загального зневоднення вміст калію достовірно нижчий за контрольні показники приблизно на 10% (р<0,05), при клітинному - на 12% (р<0,05) і при позаклітинному - на 26% (р<0,01).

Двофакторний дисперсійний аналіз вмісту калію та натрію виявив найбільший вплив на результуючі ознаки експерименту фактора ступеня дегідратації. Найбільший інтервал між впливом виду та ступеня дегідратації (24,6%) на вміст натрію у регенераті спостерігається на 3-тю, а найменший (19,61%) - на 24-ту добу.

Протягом усіх термінів спостереження у всіх експериментальних групах відбувається підвищення порівняно з контролем кількості магнію, але ці зміни незначні та не перевищують 5,40%. Аналогічні коливання відбуваються і з вмістом цинку від 0,90% (p>0,05) - на 3 добу при легкому ступені загального до 5,87% (p>0,05) на 3-тю добу при важкому ступені позаклітинного зневоднення. Також несуттєві відсоткові зміни порівняно з контролем відбуваються і з вмістом заліза, який у перші три стадії підвищується у зв'язку з уповільненням реорганізації посттравматичної гематоми. Якщо проаналізувати зміни вмісту заліза відповідно до стадій репаративної регенерації, то кількість заліза стрімко знижується, тому що у першій стадії регенерат майже повністю зайнятий гематомою, яка у подальшому заміщується сполучною тканиною. Так, при середньому ступені клітинної дегідратації кількість заліза зменшується від 287,70±4,23 мкг на 3-тю добу до 5,06±0,07 мкг на 24-ту добу. Разом зі зниженням вмісту досліджуваних мікроелементів зменшується і загальна кількість мінеральних речовин. Але при легкому ступені загальної та клітинної дегідратації та при середньому ступені загальної дегідратації ці зміни незначні. При важкому ступені зневоднення на 15-ту добу вміст мінеральних речовин нижчий за контрольні показники на 14,81% (p<0,01) при загальній, на 22,47% (p<0,001) при клітинній і на 26,87% (p<0,001) при позаклітинній дегідратації.

Двофакторний дисперсний аналіз вмісту хімічних елементів кісткового мозоля ВГК свідчить про найбільший вплив на результуючі ознаки в усі терміни спостереження фактора ступеня дегідратації. Лише можна зазначити, що на 3-тю добу експерименту він несуттєво впливає на вміст магнію, а потім відбувається стрімке зростання цього фактора (від 3,22% на 3-тю добу до 23,70% на 10-ту добу). З 10-ї до 15-ї доби не відбувається змін у впливі ступеня дегідратації на вміст магнію, а з 15-ї доби він знижується до 15,06%. Стосовно цинку відбувається така картина: вид дегідратації впливає на кількість цинку від 3-ї до 15-ї доби на рівні між 26,13% та 28,30%, а взаємодія факторів - між 3,25% і 1,30%. На 15-ту добу вплив взаємодії факторів підвищується до 22,6%, тоді як вплив виду дегідратації зменшується до 8,60%.