Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ім.І.І. МЕЧНИКОВА

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ"

Антибактеріальна та противірусна дія препаратів, сконструйованих на основі похідних флуорену

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Павлій Ростислав Богданович

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті ім. Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Костик Ольга Петрівна,

Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, професор кафедри фтизіатрії та пульмонології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Бірюкова Світлана Василівна,

Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, професор кафедри клінічної імунології та мікробіології;

доктор медичних наук, старший науковий

співробітник Авдєєва Лілія Василівна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідуюча відділом антибіотиків

Захист дисертації відбудеться " 23 ” грудня 2010 р. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 ДУ "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України" (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16, т.731-31-51).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України" (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

Автореферат розісланий " 20 ” листопада 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01

к. мед. н., с. н. с. Бруснік С.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Одним із важливих досягнень медико-біологічної науки є впровадження у медичну практику нових хіміотерапевтичних засобів та антибіотиків широкого спектру дії, що створило перспективи для успішного лікування багатьох захворювань мікробної етіології, особливо вірусних і бактерійних. Проте, поряд з успіхами, широке застосування цих засобів за останні десятиріччя різко знизилося і однією з причин цього, як вважає більшість дослідників, є виникнення і повсюдне поширення стійкості мікроорганізмів до цих препаратів, причому особливо часто полірезистентних штамів бактерій (Ж.А. Ребенок, 2004; Д.В. Иванов, 2005; С.В. Сидоренко, 2006).

Формування та інтенсивне розповсюдження в умовах лікувально-профілактичних закладів антибіотикостійких мікроорганізмів пов'язано з продукуванням в-лактамаз, з наявністю плазмід резистентності, з MLS-резистентним фенотипом, який поширений серед грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів, а також з підвищенням адаптаційних властивостей, адгезивності й вірулентності, конкурентноздатності, що підсумково надає їм селективну перевагу в мікробіоценозах (Н.В. Белобородова и др., 2004; Ю.М. Марков, И.А. Дородная, 2007; С.В. Сидоренко и др., 2008). Важливою проблемою для сучасних лікувальних закладів є зростання рівня клінічно значущих інфекційних ускладнень, спричинених умовнопатогенними мікроорганізмами (В.И. Крапивина и др., 2006; С.Я. Яковлев и др., 2006).

Проблеми боротьби з туберкульозом набули в кінці ХХ і на початку ХХІ століття виключно державного значення. Особливе занепокоєння викликає інтенсивне поширення штамів M. tuberculosis з множинною медикаментозною стійкістю до сучасних протитуберкульозних препаратів (М. Kisa, et al., 2004; Н.Р. Кондратюк та ін., 2006; Ю.І. Фещенко та ін., 2007).

На кафедрі фармацевтичної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького доктором фармацевтичних наук, професором Л.І. Петрух синтезовано новий протитуберкульозний препарат флуренізид, у 2000 р. налагоджено його промисловий випуск на "Київському вітамінному заводі”. Про клінічну ефективність цього препарату свідчать дані літератури (Л.І. Петрух та ін., 2005; О.І. Михалик та ін., 2005).

Серед вірусних інфекцій наймасовішим інфекційним захворюванням з високою смертністю та значними економічними затратами залишається грип (В.Т. Иванова и др., 2004; Д.К. Львов и др., 2004). Для профілактики грипу існують різні класи медикаментозних засобів, які специфічно інгібують репродукцію вірусу грипу - ремантадин, амантадин, озелтамівір. В останні роки виникли серйозні проблеми, що стосуються цих препаратів, бо з'явилися варіанти вірусу, резистентні до них (Е.С. Шевченко и др., 2005; Д.К. Львов и др., 2008).

Для профілактики і лікування вірусних захворювань, що складають велику питому частку інфекційної патології людини, застосовують невеликий арсенал фармакологічних засобів. Багато з того, що застосовується для цієї мети, є імпортованим і дорогим. Відомий ефективний низькомолекулярний індуктор ендогенного інтерферону - аміксин ("Интерхим”, Россия, син. Тилорон "Sigma”, США). За хімічною структурою аміксин належить до похідних флуорену.

Дана робота присвячена пошуку антибактеріальних, протимікобактеріальних та антивірусних засобів серед похідних флуорену, що являється актуальним і перспективним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планових тем науково-дослідних робіт кафедри фтизіатрії та пульмонології і кафедри фармацевтичної хімії ФПДО Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького МОЗ України "Розробити нові методи підвищення ефективності, діагностики, лікування і профілактики туберкульозу легень у дітей та підлітків в умовах впровадження ДОТС - стратегії в Україні" (№ державної реєстрації 0109U000024, шифр теми Т-1-07; здобувач визначав чутливість мікобактерій до похідних флуорену, виділених від хворих на деструктивний та активний форми туберкульозу), "Фармако-технологічне дослідження, розробка фармакопейних методів аналізу та нормативно-аналітичної документації субстанції флуренізиду антимікробної, антивірусної та імуномодуляційної дії" (№ державної реєстрації 01060012667; дисертант вивчав антимікробну та противірусну активність флуренізиду та похідних флуорену). Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої ради медичного факультету № 1 Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (прот. № 6 від 18 березня 2009 року).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - на підставі мікробіологічних та вірусологічних досліджень означити активність нових похідних флуорену щодо актуальних збудників гнійно-запальних процесів.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1) провести вивчення протимікробної активності і спектру дії нових антимікробних похідних флуорену на музейні штами і свіжовиділені ізоляти мікроорганізмів;

2) вивчити вплив нових сполук похідних флуорену на музейному штамі M. tuberculosis H₃₇R_v та виділених з мокротиння хворих мікобактеріях туберкульозу;

3) вивчити антифагову та антивірусну дію нових похідних флуорену;

4) дослідити особливості формування резистентності бактерій до похідних флуорену;

5) в експерименті на лабораторних тваринах дослідити параметри токсичності досліджуваних флуоренових сполук.

Об'єкт дослідження - мікроорганізми, які мають медичне значення, як потенційні інфекційні агенти; гнійно-запальні процеси, викликані різними мікроорганізмами; нові похідні флуорену.

флуорен сполука запальний гнійний

Предмет дослідження - бактерії, фаги, віруси, флуоренові сполуки, токсичність сполук.

Методи дослідження: бактеріологічні, вірусологічні, токсикологічні, математично-статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Означено антимікробну (антистафілококову, антимікобактеріальну та антивірусну) активність 57 нових оригінальних похідних сполук флуорену, серед яких 18 перспективні для подальшого вивчення з метою розробки на їх основі антимікробних засобів медич

ного призначення. Наукова новизна та цінність роботи підтверджена патентами на винахід: Пат. Україна № 81084 "Застосування N- (9-флуоренілі ден) - N-ізонікотин-огідразиду (флуоренізиду) як антивірусного засобу щодо РНК-геномних вірусів”; Пат. Україна № 87364 "Дикалійна сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти, яка виявляє протитуберкульозну дію”; Пат. Україна № 87367 "Динатрієва сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти, яка виявляє протитуберкульозну дію”; Пат. України № 87361 "Калій N- (9-флуореніліден) - N'-м-анісогідрозонату, який виявляє протитуберкульозну дію”; Пат. України № 48570 "Спосіб визначення противірусної дії препаратів на основі флуоренів”.

Вперше розроблено та запропоновано експрес-метод визначення антивірусної дії лікарських препаратів на моделі фаг-бактерія.

Встановлено, що формування резистентності стафілококу до похідних флуорену відбувається порівняно повільно, тому слід очікувати позитивного пролонгованого профілактичного та лікувального ефекту в процесі їх клінічного застосування.

Вперше вивчено гостру токсичність нових синтезованих перспективних субстанцій флуорену в експерименті на лабораторних тваринах.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження антимікобактеріальної, антибактеріальної та антивірусної активності нових похідних флуорену на широкому спектрі музейних та свіжовиділених штамів мікроорганізмів є біологічним обґрунтуванням доцільності медико-біологічних досліджень сполук флуоренів при лікуванні різних інфекцій. Результати експерименту дозволяють рекомендувати подальше наукове вивчення похідних флуорену для використання в медичній практиці.

Одержані результати досліджень застосовуються в навчальних програмах вищих медичних навчальних закладів України - Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького, Державному науково-дослідному контрольному інституті ветпрепаратів та кормових добавок, Вінницькому національному аграрному університеті, Івано-Франківському національному медичному університеті. Розроблені та прийняті до впровадження у практику ветеринарної медицини методичні вказівки "Експрес-метод визначення противірусної дії лікарських препаратів для ветеринарної медицини” (Київ, 2010).

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведені патентний і інформаційний пошуки з використанням пошукових систем Internet. Автор особисто визначив протибактеріальний спектр дії нових похідних флуорену на грампозитивних і грамнегативних музейних та свіжовиділених штамах мікроорганізмів, дослідив антивірусну активність на моделі фаг-бактерія. Розробив експрес-метод визначення противірусної дії медикаментозних препаратів. Вивчив формування резистентності у мікроорганізмів до різних субстанцій флуорену. Разом з науковим керівником обрано тему науково-дослідної роботи, сформульовано мету, завдання і програму дослідження.

Сумісно з О.П. Заргарян (лабораторія Львівського регіонального фтизіопульмонологічного центру) вивчено антимікобактеріальну активність нових похідних флуорену.

Під керівництвом старшого наукового співробітника І.К. Авдосьєвої (лабораторія контролю біологічних препаратів Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок) вивчено антивірусну дію деяких похідних флуорену.

Самостійно провів математично-статистичний аналіз одержаних результатів, узагальнив основні наукові положення.

Апробація результатів дисертації. Основні результати наукових досліджень доповідалися на міжнародних та Всеукраїнських наукових з'їздах, конференціях, симпозіумах, нарадах, зокрема: на підсумкових конференціях молодих вчених Тернопільського державного медичного університету ім.І.Я. Горбачевського (2008; 2009; 2010.); конференціях "Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни”, (Львів, 2006, 2007, 2008, 2010); матеріалах ХІ, ХІІ, ХІІІ Конгресу світової федерації українських лікарських товариств (Полтава-Чікаго, 2006; Івано-Франківськ, 2008; Львів, 2010); міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні питання стратегії, тактики застосування та дослідження антибіотиків, антисептиків, дезінфектантів (Вінниця, 2008); на ХІІ з'їзді Товариства мікробіологів України (Ужгород, 2009), на Х з'їзді ВУЛТ (Євпаторія, 2009); на міжнародній науково-практичній конференції "Сучасні системи біобезпеки та біозахисту у ветеринарній медицині” (Феодосія, 2010).

Публікація результатів досліджень. За результати дисертаційної роботи опубліковано 27 наукових праць (8 одноосібно), з них 9 статей, 5 у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 1 методичні вказівки, 5 патентів на винаходи, 12 тез в матеріалах конференцій, з'їздів та конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, вибору напрямків досліджень, матеріалів і методів, результатів досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел.

Повний обсяг дисертації становить 145 сторінок комп'ютерного тексту, ілюстрована 26 таблицями та 14 рисунками. Список використаної літератури включає 331 джерело, серед яких українською та російською мовами 274 і 57 робіт іноземних авторів.

Основний зміст дисертації

У вступі і огляді літератури проаналізовано стан проблеми боротьби з захворюваннями мікробного ґенезу. Зазначено неухильне зниження ефективності хіміотерапевтичних препаратів та антибіотиків на тлі інтенсивного формування резистентності до них. В зв'язку з цим, в умовах сучасної клініки, суттєво знижується можливість використання навіть самих сучасних препаратів і підвищується актуальність пошуку нових засобів хіміотерапії.

Досить перспективним в останні десятиріччя виявився напрям розробки лікувальних засобів на основі похідних флуоренів. Особливо актуальним є пошук протитуберкульозних та антивірусних засобів серед похідних флуорену з високою активністю, порівняно низькою токсичністю та з повільним формуванням стійкості мікробів до них.

Вибір напрямів досліджень. Матеріал та методи виконання роботи

В роботі використано 57 нових похідних флуорену, синтезованих на кафедрі фармацевтичної хімії ФПДО Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького. В якості мікробних тест-культур досліджено штами, отримані із музею кафедри мікробіології та клінічні ізоляти, вилучені з мокротиння та із слизу верхніх дихальних шляхів хворих на туберкульоз.

Антимікробну активність похідних флуорену вивчали на базі кафедри мікробіології. В бактеріологічній лабораторії Львівського регіонального фтизіо-пульмонологічного лікувально-діагностичного центру досліджували M. tuberculosis H₃₇R_v та клінічні штами, виділені з мокротиння хворих на туберкульоз. Для означення противірусної дії сполук використовували віруси, отримані з Львівського державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок: вірус грипу птахів ГП7-А Росток /34 (H7N1) та вірус хвороби Ньюкасла (штам La Coma).

Антифагову дію досліджених сполук вивчали з використанням стафілококового бактеріофагу виробництва "Иммунопрепарат”, м. Уфа.

Дослідження антимікробного спектру і чутливості клінічних та музейних штамів до нових похідних флуорену проводили за загальноприйнятими методами дифузії в агар та послідовних серійних розведеннях в рідкому середовищі. Швидкість формування резистентності до антибактеріальних препаратів вивчали шляхом тривалого пасажування тест-культури S. аureus 209-p в присутності суббактеріостатичних концентрацій на рідких та щільних поживних середовищах.

Антимікобактеріальну активність досліджуваних сполук вивчали на середовищі Лєвенштейна-Йєнсена згідно з затвердженою Інструкцією з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції (Наказ МОЗ України № 45 від 06.02.2002).

Антифагову дію досліджуваних речовин вивчали шляхом титрування фагу за Граціа. Вірусовмісний матеріал готували на щільному поживному середовищі методом агарових шарів. Параметри вегетативного циклу розвитку фагу вивчали за стандартною методикою.

Антивірусну дію нових похідних флуорену вивчали на культурі клітин-фібробластів ембріонів курей (ФЕК) та на 10-добових курячих ембріонах (КЕ), згідно методичних рекомендацій "Доклинические исследования лекарственных средств”, 2002 г., Киев.

Токсичність досліджуваних сполук визначали на білих мишах, шляхом внутрішньочеревного введення різних концентрацій речовин, розведених в димексиді та дистильованій воді. Розрахунок LD₅₀ здійснювали за методом Кербера (1983 р.). В роботі з тваринами керувалися ГОСТ 421-88 "Тварини лабораторні. Технологічний процес з дотриманням основних положень конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовуються в експериментальних наукових цілях" від 18.03.1986 р., Директиви ЄВС № 609 від 24.11.1986 р. і Наказу МОЗ України № 281 від 01.11.2001 р. В дослідах було використано 130 білих мишей.

Електронно-мікроскопічне дослідження впливу сполуки ХІ на структури S. aureus 209-p здійснювали на ультратонких зрізах за допомогою ультрамікротома УМТП-ЗМ та електронного мікроскопа ЕВМ-100 К (Україна) при інструментальному збільшенні (х 15000-80000).

Статистичну обробку проводили за допомогою методу варіаційної статистики. Ймовірність можливої помилки окремих показників визначено достовірно за t-критерієм Стьюдента на персональному комп'ютері відповідно до проґрами "Statistica” та за допомогою ліцензійного пакету статистичних програм SPSS для Windows XP, версія 11.

Результати власних досліджень викладено у третьому - п'ятому розділах.

Встановлено антимікобактеріальну активність нових похідних флуорену, зокрема, дикалійної солі N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти (XIІ), динатрієвої солі N- (9-флуореніліден) гідразиду о-оксибензоатної кислоти (XIІІ) і калію N- (9-флуореніліден) - N'-м-анісогідразонату (XIV) щодо M. tuberculosis H₃₇R_v та свіжовиділених від хворих ізолятів мікобактерій туберкульозу (як чутливих, так і стійких до ізоніазиду). Мінімальна пригнічувальна доза сполук XII-XIV складає 0,078 мг/мл і рівноефективна з антимікобактеріальною дією ізоніазиду (табл.1).

Таблиця 1. Ступінь впливу сполук XII-XIV щодо мікобактерій туберкульозу, вилучених від хворих на туберкульоз легень

Досліджені сполуки	Мінімальна пригнічувальна концентрація, мг/мл
	штам МБТ, чутливий до ізоніазиду	штам МБТ, стійкий до ізоніазиду
Дикалійна сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти (ХІІ)	0,078	0,078
Динатрієва сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти (XIIІ)	0,078	0,078
Калій N- (9-флуореніліден) - N'-м-анісогідразонат (XIV)	0,078	10,000
Ізоніазид	0,078	-

Сполуки ХІI і ХІIІ рівні за ефективністю і перевершують дію речовини ХІV щодо штаму МБТ, стійкого до ізоніазиду. Встановлено, що деякі з досліджених похідних флуорену, а саме дикалійна сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти (ХІI), динатрієва сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти (ХІІІ) і калій N- (9-флуореніліден) - N'-м-анісогідразонат (ХІV) вельми перспективні фармаколоґічні речовини для подальшого їх вивчення в якості специфічних антимікобактеріальних засобів.

Протимікробні властивості похідних флуорену (всього 57 речовин) вивчали на музейних штамах і ізолятах, виділених з патологічного матеріалу хворих із гнійно-запальними захворюваннями. Нами запропоновано скринінгове дослідження препаратів з використанням трьох видів мікроорганізмів: S. аureus 209-p, E. coli 25922/F-50, C. albicans. В якості контролю застосовано ципрофлоксацин - з широким спектром дії на бактерії, протигрибковий препарат - пімафуцин, та розчинник для досліджуваних сполук - димексид. Внаслідок проведених досліджень відібрано 11 сполук флуорену з достатньо вираженими антимікробними властивостями, які дослідили більш детально (табл.2,3).

Таблиця 2

Антимікробна активність похідних флуорену

Мікроорганізми	Концентрація, мкг/мл	Шифри похідних флуорену
		ІІ	ІІІ	ІV	VII	VIIІ	ІХ	ХІ	ХІІІ
S. aureus 209-p	МПК	125	125	250	125	500	62,5	62,5	250
	МБК	250	250	500	250	>500	125	125	250
S. epidermi-dis	МПК	125	125	250	125	250	62,5	62,5	250
	МБК	250	250	500	250	>500	125	125	500
S. pyogenes	МПК	125	125	250	250	500	62,5	62,5	250
	МБК	250	250	500	>500	>500	125	125	500
B. subtilis 6633	МПК	250	>500	>500	>500	>500	>500	>500	>500
	МБК	>500	>500	>500	>500	>500	>500	500	>500
E. coli 25922/F-50	МПК	>500	>500	>500	>500	>500	>500	>500	>500
	МБК	>500	>500	>500	>500	>500	>500	>500	>500
K. рneumo-niae 1011	МПК	500	>500	250	>500	>500	>500	500	>500
	МБК	>500	>500	500	>500	>500	>500	500	>500
P. aerugino-sa 2134	МПК	>500	>500	>500	>500	>500	>500	>500	>500
	МБК	>500	>500	>500	>500	>500	>500	>500	500
C. albicans	МПК	>500	>500	125	>500	>500	>500	250	>500
	МБК	>500	>500	500	>500	>500	>500	500	>500

Таблиця 3

Антибактеріальна активність похідних флуорену

Мікроорганізми	Концентрація, мкг/мл	Шифри похідних флуорену
		ХVІ	ХVІІ	ХІХ
S. aureus 209-p	МПК	125	250	62,5
	МБК	250	500	125
S. epidermidis	МПК	125	125	62,5
	МБК	250	250	125
S. pyogenes	МПК	>500	500	500
	МБК	>500	>500	>500
B. subtilis 6633	МПК	>500	>500	>500
	МБК	>500	>500	>500
E. coli 25922/F-50	МПК	>500	>500	>500
	МБК	500	>500	>500
K. рneumoniae 1011	МПК	500	>500	>500
	МБК	500	>500	>500
P. aeruginosa 2134	МПК	500	>500	>500
	МБК	500	>500	>500
C. albicans	МПК	500	>500	>500
	МБК	>500	>500	>500

Виражену антибактеріальну дію проявили 8 сполук (ІІ, ІІІ, ІХ, ХІ, ХІІІ, ХVI, XVII, XIX) щодо стафілококів та стрептококів, їх активність проявлялась у межах 62,5-125,0 мкг/мл.

Паралельно вивчено 11 похідних флуорену, що виявляли бактеріостатичну дію на МПБ та уніфікованому середовищі - бульйоні Мюллера-Хінтона (БМХ). Результати досліджень відображено в табл.4.

З наведених даних видно, що на БМХ активність похідних флуорену виявилася у 2-4 рази нижчою в порівнянні з даними, отриманими на МПБ. Варто відмітити, що сполуки II, III, IX, XI, XVI, XIX мають вибіркову дію на кокову мікрофлору і їх активність перебуває в межах 31,25-125 мкг/мл.

Отже, похідні флуорену є перспективними для створення лікарських форм з метою боротьби з стафілококовою і стрептококовою інфекціями.

Однією з причин, яка часто призводить до інактивації хіміотерапевтич-них препаратів в організмі, є зв'язування їх тканинами або сироваткою крові. Встановлено, що за наявності 20 % сироватки крові людини чи коня антибактеріальна дія досліджуваних сполук ІХ, ХІ, ХІХ щодо S. аureus 209-p зменшилася у 2 рази (табл.5).

При виявленні антибактеріальної дії речовин доцільно вивчити швидкість формування стійкості до них у мікроорганізмів. З цією метою проведено 20 пасажів штаму S. aureus 209-р на щільних і рідких поживних середовищах, що включали до свого складу 62,5-125,0 мкг/мл досліджуваних речовин ХІV і ХІХ.

Таблиця 4

Бактеріостатична активність похідних флуорену (мкг/мл) на МПБ і БМХ

Мікро- організми	S. aureus 209-p	S. epidermidis	S. pyogenes	B. subtilis 6633
Сполуки	МПБ	БМХ	МПБ	БМХ	МПБ	БМХ	МПБ	БМХ
II	125	31,25	125	62,5	125	62,5	250	125
III	125	31,25	125	62,5	125	625	>500	500
IV	250	125	250	12,5	250	125	>500	500
VII	125	62,5	12,5	62,5	250	125	>500	500
VIII	500	250	250	12,5	500	250	>500	>500
IX	62,5	31,25	62,5	31,25	62,5	31,25	>500	500
XI	62,5	31,25	62,5	31,25	62,5	31,25	>500	500
XII	250	125	250	125	250	125	>500	>500
XVI	125	62,5	125	62,5	500	500	>500	>500
XVII	250	125	125	62,5	500	250	>500	>500
XIX	62,5	31,25	62,5	31,2,5	500	250	>500	500
Мікро- організми	E. coli 25922/ F-50	K. pneumoniae	P. aeruginosa
Сполуки	МПБ	БМХ	МПБ	БМХ	МПБ	БМХ
II	>500	500	500	500	>500	>500
III	>500	500	>500	>500	>500	>500
IV	>500	500	250	250	>500	>500
VII	>500	500	250	250	>500	>500
VIII	>500	>500	>500	>500	>500	>500
IX	>500	500	>500	>500	>500	>500
XI	500	500	500	500	>500	>500
XII	>500	>500	>500	>500	>500	>500
XVI	500	500	500	>500	500	>500
XVII	>500	>500	>500	>500	>500	>500
XIX	>500	>500	500	500	>500	>500

Встановлено, що бактеріостатична концентрація цих сполук стосовно до музейного штаму S. aureus 209-р має такі ж показники - 62,5 мкг/мл, бактерицидна - 125,0 мкг/мл. Стійкість стафілококу до речовин ХІ та ХІХ розвивається вельми дуже повільно.

Електронно-мікроскопічне дослідження ультратонких зрізів S. aureus 209-р під дією сполуки ХІ в концентрації 62,5-80,0 мкг/мл показало, наявність деструктивних процесів, які свідчать про значне інгібування синтезу пептидоґлікану, а також про активацію ферментів автолізу, що зумовлює пригнічення білок-синтезуючої функції.

Таблиця 5

Антибактеріальна дія похідних флуорену щодо S. аureus 209-p за наявності в поживному середовищі 20 % людської та кінської сироваток

Шифр	Досліджені сполуки	Бактеріостатична концентрація препаратів, мкг/мл
		МПБ контроль	МПБ+20 % кінської сироватки	МПБ+ 20 % людської сироватки
ІХ	N- (9-флуореніліден) - ацетогідразид	62,5	125,0	125,0
ХІ	N- (9-флуореніліден) - о-анісогідразид	62,5	125,0	125,0
ХІХ	Тіосемікарбазон 2,7-дигідроксифлуоренону-9	62,5	125,0	125,0

На основі проведених мікробіологічних дослідів обгрунтовано висновок, що досліджені сполуки виявляють антимікробну дію і доцільно продовжити їх подальше фармакологічне вивчення з метою отримання нових ліків флуоренового ряду з антибактеріальними властивостями.

Первинну оцінку нових сполук на противірусну активність проводять класичними методами in vitro з використанням культур клітин чи in vivo. Ці методи є довготривалими, трудомісткими, вимагають для культивування культури клітин, якісних та дорогих середовищ, сироваток великої рогатої худоби, відповідного лабораторного обладнання та високої кваліфікації фахівців у проведенні досліджень.

Запропонований нами експрес-метод дає можливість швидко виявити противірусну активність нових речовин і в подальшому можливість застосування уніфікованих методів та критеріїв оцінки противірусної активності потенційних засобів.

Сутність експрес-методу полягає у блокуванні репродукції стафілококового бактеріофагу у клітинах бактеріальної культури S. aureus 209-p та відсутності зон лізису на місці нанесення сполук, які володіють антивірусною активністю. Рахуємо за доцільне повністю надати розроблену нами оригінальну методику.

Проведення досліджень: розплавлене та охолоджене до температури 50°-60°С середовище (МПА) розливали по 20 см³ у чашки Петрі діаметром 90 мм і по 25 см³ у чашки Петрі діаметром 100 мм, розкладені на горизонтальній поверхні. Поверхню застиглого середовища підсушували протягом 30-40хв в термостаті. Готові чашки можна зберігати за температури 10°С не довше 7 днів, перед застосуванням їх необхідно підсушити.

Бактеріальну суспензію готували з чистої 24-годинної культури S. aureus 209-p, що виросли на поверхні агарового поживного середовища. Для цього 5-10 ізольованих колоній суспензували у стерильному фізіологічному розчині і розводили до 10 ОД оптичного стандарту мутності НДІ імені Тарасевича.

Після приготування бактеріальну суспензію в об'ємі 1-2 см³ наносили на поверхню агарового середовища і рівномірно розподіляли по всій поверхні середовища шляхом похитування чашки Петрі чи розтирали за допомогою шпателя. Потім чашку нахиляли для стікання надлишку суспензії, який видаляли піпеткою.

Змішували стафілококовий бактеріофаг в кількості 0,5 см³ з 0,5 см³ досліджуваної сполуки. Суміш витримували в термостаті 30 хв. Чашки Петрі з м'ясопептонним агаром, засіяним культурою S. aureus 209-p, підсушували у термостаті. За допомогою піпетки наносили краплю суміші (стафілококовий бактеріофаг + дослідна сполука) на поверхню агару з посівом стафілококової культури. У контролі стафілококовий бактеріофаг наносять краплею на поверхню агару з посівом стафілокока. На одній такій чашці можна перевірити до 5-8 сполук. Культивували у термостаті 24 год і проводили облік результатів.

Противірусну дію сполуки вважали позитивною за відсутності зон лізису на місці нанесення сполуки з фагом. Це свідчило про блокування репродукції фагу у клітинах бактеріальної культури S. aureus 209-р. У контролі відмічали наявність зон лізису під дією фагу на культуру мікроорганізму.

Попередньо в паралельних дослідах встановлено, що сім речовин (флуоренон-9 (І), флуренізид (ІІ), флуренізид-літій (ІІІ), флуренізид - кальцій (VIII), N- (9-флуореніліден) - о-анісогідразид (ХІ), калій N- (9-флуореніліден) - м-анісогідразонат (ХІV), N- (9-флуореніліден) - N'- (3-оксинафтоіл) - гідразин) (ХV) та прототип за дією і структурою аміксин у концентрації 100 мкг/мл у дослідах in vitro зменшували титр стафілококового фагу в разі посіву його на свіжовиділену культуру S. aureus 209-р, в той час, як інші 50 досліджуваних речовин такої дії не виявляли.

Таким чином, система фаг-клітина (стафілококовий фаг і S. aureus), може служити моделлю для первинного скринінгу антивірусної активності орґанічних сполук.

При детальнішому дослідженні протифагової дії цих сполук встановлено, що максимальна антифагова дія їх проявляється в термін до 30 хв, а оптимальна концентрація речовин, які діють віруліцидно на стафілококовий фаг, є 100 мкг/мл (табл.6,7).

У речовин ІІ, ІІІ, VIII, XI зниження титру вірусів складало 4-5 порядків. Дещо нижчий титр фагу відзначено в разі дії речовин I, XIV, XV.

Виявлено, що навіть у міру збільшення часу експозиції, титр фагу після 60 хв. дії речовин незначно збільшувався у зв'язку з лізисом клітин.

Окрім того, доза сполук в 250 мкг/мл, очевидно, в зв'язку з протибактерійною дією речовин, не давала можливості отримати вищі титри фагу після лізису клітин, що було відмічено для концентрації 50 і 100 мкг/мл - вона вища на один порядок.

Таблиця 6

Залежність антифагового ефекту речовин І, ІІ і ХІ від дози та експозиції дії

Екс-по-зиція (хв.)	Флуоренон-9 (І)	Флуренізид (ІІ)	N- (9-флуореніліден) - о- анісогідразид (ХІ)
	50	100	250	50	100	250	50	100	250
15	2.7х108	2.1х107	1.8х108	1.6х108	1.9х106	1.6х109	2.8х108	2.5х107	3.6х107
30	2.7х108	2.6х107	3.5х107	2.8х106	2.7х105	2.8х106	2.6х106	2.6х105	3.4х106
45	4.2х107	2.4х106	2.5х107	2.3х106	2.0х105	2.3х106	3.1х106	4.2х106	4.1х106
60	6.2х108	2.7х106	2.1х108	1.9х106	1.0х106	1.9х106	2.3х106	1.9х106	2.4х106
70	2.4х108	2.6х107	1.9х108	3.4х106	2.9х106	3.4х106	2.1х107	3.1х106	4.3х107
100	2.8х107	3.1х106	4.8х107	6.7х107	2.9х106	6.7х107	3.2х107	2.6х107	4.2х107
120	2.9х108	2.3х106	2.3х108	5.9х106	2.7х107	5.9х106	1.9х107	2.3х107	2.4х107

Таблиця 7

Залежність антифагового ефекту речовин ІІІ, VІІІ, ХІV і ХV від дози та експозиції дії

Експозиція	Флуренізид-літій (ІІІ)	Флуренізид-кальцій (VIII)
	50	100	250	50	100	250
15	2.7х108	1.9х107	1.6х109	1.4х108	4.1х106	3.1х107
30	1.8х107	2.6х105	2.8х106	2.6х108	2.6х106	3.6х108
45	6.0х107	2.0х105	2.3х106	3.2х107	2.6х106	4.8х107
60	1.8х107	1.0х106	1.8х106	2.8х107	3.3х106	2.9х107
70	1.9х107	2.9х106	3.4х106	2.9х107	3.5х106	2.9х107
100	2.9х107	2.9х106	6.7х107	2.1х107	1.9х106	2.8х106
120	2.6х107	2.7х107	5.9х106	2.7х107	2.0х106	2.6х107
Експозиція	Калій N- (9-флуореніліден) м-анісогідра-зонат (XIV)	N- (9-флуореніліден) - N'- (3-оксинафтоїл) - гідразин (XV)
	50	100	250	50	100	250
15	1.9х108	2.6х107	3.1х107	1.8х108	2.5х107	4.2х107
30	2.5х107	2.6х107	3.5х108	2.8х108	2.7х106	3.5х108
45	4.1х108	3.0х107	1.9х107	2.9х108	3.8х107	1.6х107
60	2.9х107	1.0х106	2.3х107	2.4х108	3.1х107	2.9х108
70	4.0х107	2.9х106	2.8х107	1.9х108	2.1х108	2.4х107
100	1.8х107	2.0х106	5.0х107	5.8х107	3.0х106	4.1х107
120	2.4х108	3.1х107	2.1х108	1.7х107	2.4х107	1.9х108

Примітка: вихідний титр фагу - 1.6х10¹⁰ БУО/мл протягом спостережень (120хв) після внесення фізіологічного розчину лишався незмінним (контроль).

При порівнянні дії дослідних похідних флуорену з відомим препаратом аміксином, який є прототипом за дією і структурою, встановили, що аміксин та речовини ІІ, ІІІ в концентрації 100 мкг/мл знижували титр стафілококового фагу на 5 порядків. Сполуки ХІ і ХV зменшували титр фагу на 4 порядки, а речовини І, XI та XIV - на 3 порядки (табл.8).

Таблиця 8

Вплив досліджуваних речовин і аміксину на стафілококовий фаг

Досліджувані речовини	Концентрація, мкг/мл
	50	100	250
Флуренізид (ІІ)	2.6х106	2.7х105	3.5х106
Флуоренон-9 (І)	3.1х108	2.8х107	4.1х107
N- (9-флуореніліден) - N'- (3-оксинафтоїл) - гідразин (XV)	2.6х108	2.2х106	3.4х107
Флуренізид-літій (ІІІ)	1,8х107	2,1х105	2,7х105
Калій N- (9-флуореніліден) - м-анісогідразонат (XIV)	2.5х107	2.6х107	3.5х108
Флуренізид-кальцій (VIII)	2.6х108	2.2х106	3.6х108
N- (9-флуореніліден) - о-анісогідразид (ХІ)	2.7х107	2.6х107	3.2х107
Аміксин	2.7х106	3.5х105	3.1х106

Примітка: вихідний титр фагу (контроль) 1.6х10¹⁰, експозиція - 30 хв.

Отримані результати підтверджують отримані раніше дані, про те дії досліджених речовин ІІ і ІІІ (флуренізиду і флуренізиду-літію) не поступаються дії аміксину і максимально проявляється у дозі 100 мкг/мл.

Встановлено, що флуренізид максимально інгібує репродукцію фагу, якщо його вносити до і під час зараження культури бактерій фагом, і не викликає ніякої дії, якщо він був доданий через 30 хв після інокуляції клітин фагом. Вперше встановлено, що флуренізид інгібує репродукцію стафілококового фагу. Отримані результати цих дослідів послужили основою для подальшого вивчення противірусної дії похідних флуорену. Відібрано три речовини: флуренізид (ІІ) - з високим титром антифагової дії, флуоренон-9 (І) зі слабою протифаговою дією, ІV- (9-флуреніліден) - саліцилогідразид (Х) - з від'ємною протифаговою дією. Прототипом були ремантадин та аміксин.

Встановлено, що при зараженні фібробластів ембріонів курей (ФЕК) флуренізид максимально інгібував репродукцію вірусу пташиного грипу в концентрації 100 мкг/мл, що проявилося зниженням інфікуючого титру вірусу на (3,7 ± 0,11) log ТЦД, в концентрації 50 мкг/мл - на 2,0±0,06 log ТЦД. Сполука І мало знижувала інфекційний титр вірусу в дозі 50 мкг/мл і в дозі 100 мкг/мл (0,1 ± 0,001 та 0,2 ± 0,02 log ТЦД). Сполука Х - не проявила противірусної дії. Вплив ремантадину в концентрації 50 мкг/мл на цей процес був дещо нижчий, ніж у сполуки ІІ і становив (2,1 ± 0,04) logТЦД (табл.9).

Таблиця 9

Вплив досліджуваних флуоренів на репродукцію вірусу грипу птиці

Досліджувані речовини	Концентрація, мкг/мл	Титр у ТЦД-50	Зниження титру вірусу, М±m	Р<
Флуренізид (ІІ) МПК-ФЕК-200 мкг/мл	50 100	7,3 5,7	2,00±0,06 3,7±0,11	0,01 0,01
Флуоренон-9 (І) МПК-ФЕК-200 мкг/мл	50 100	9,2 9,00	0,1±0,01 0,3±0,02	-
Сполука Х МПК-ФЕК-200 мкг/мл	50 100	9,2 9,2	0,1±0,01 0,1 ±0,01	-
Ремантадин МПК-ФЕК-100мкг/мл	50	7,3	2,1±0,04	0,01
Контроль вірусу	-	-	-	-

Цитопатична дія флуренізиду на репродукцію вірусу грипу птахів перевищувала показники антивірусної дії ремантадину - еталону за протигрипозною дією (р<0,01). Отримані нами результати підтвердили доцільність експрес-методу визначення антифагової дії нових орґанічних речовин з метою відбору їх для подальшого антивірусного дослідження.

Експрес-метод дослідження протифагової дії речовин є швидким, доступним для виконання і потребує мало затрат, у той час, коли приготування культури клітин або дослідження на КЕ є громіздким і вимагає тривалого часу для виконання та є суттєво дорожчим.

При порівняльному вивченні впливу на репродукцію вірусу хвороби Ньюкасла флуренізиду та аміксину (як прототипу) на ФЕК встановили, що ЦПД не було виявлено, тоді як у контролі вірусу хвороби Ньюкасла ЦПД з'явилась на 2-3 день з утворенням симпластів (табл.10).

Таблиця 10

Порівняльні дані антивірусної дії флуренізиду та аміксину на репродукцію вірусу хвороби Ньюкасла

Назва препаратів	Концентрація препарату, мг/мл	Ефективність препаратів при інфікуванні ФЕК вірусом хвороби Ньюкасла
		50 ТЦД50	100 ТЦД50
		показник захисту, lgІД50	зниження титру вірусу	показник захисту, lgІД50	зниження титру вірусу
Флуренізид (ІІ)	1,6	3,52	1,98	4,53	0,97
Аміксин	1,6	3,65	1,85	4,72	0,78
Контроль	-	-	-	-	-

Отже, показники антивірусної дії флуренізиду на репродукцію ВХН у системі in vitro перевищують такі для аміксину - прототипу за структурою (100 ТЦД₅₀ зниження титру 0,97 - 0,78).

Встановлено, що при вивченні антивірусної дії флуренізиду та ремантадину на репродукцію вірусу грипу на КЕ загибелі курячих ембріонів протягом 96 год не відбулося, а в контролі вірусу - всі ембріони загинули (табл.11).

Таблиця 11

Порівняльна антивірусна дія флуренізиду та ремантадину на репродукцію вірусу грипу

Назва препаратів	Концентра- ція препарату, мг/ембріон	Ефективність препаратів
		50 ЕІД50	100 ЕІД50
		показник захисту, lg50	зниження титру Вірусу	показник захисту, lg50	зниження титру Вірусу
Флуренізид	1,6	3,5	2,3	4,72	1,04
Ремантадин	2,5	3,7	2,1	4,76	1,08

Показник захисту (lg) в дозі 50 ЕІД₅₀ для флуренізиду становив 3,5, а для ремантадину - 3,7.

В результаті досліджень антивірусної дії флуренізиду та аміксину встановлено, що при зараженні КЕ вірусом хвороби Ньюкасла (ВХН) всі ембріони залишилися живими, окрім контрольних. Флуренізид та аміксин виявили властиву їм противірусну дію (табл.12).

Таблиця 12

Антивірусна дія флуренізиду та аміксину на репродукцію ВХН

Назва препаратів	Концентрація препарату, мг/мл	Ефективність препаратів
		50 ЕІД50	100 ЕІД50
		показник захисту, lg ІД50	зниження титру вірусу	показник захисту, lg ІД50	зниження титру вірусу
Флуренізид	1,6	3,35	2,15	4,78	0,72
Аміксин	1,6	3,40	2,10	4,82	0,68

Показники антивірусної дії флуренізиду на репродукцію ВХН не поступалися аміксину і навіть дещо перевищували їх: lg ID_{50 -} 3,35 для флуренізиду і lg ID_{50 -} 3,40 - для аміксину.

Отже, в результаті вивчення антивірусної активності похідних флуорену встановлено сім речовин з антифаговою дією в концентрації 100 мкг/мл. Запропонований експрес-метод антифагової дії нових орґанічних речовин дає змогу відібрати їх для вивчення інгібуючої дії на віруси людей та тварин. Флуренізид виявив антивірусну дію на вірус грипу птиці в культурі клітин ФЕК в концентрації 50 - 100 мкг/мл, і на КЕ - в концентрації 1,6 мг/мл. Флуренізид інгібував репродукцію ВХН як в КЕ, так і на ФЕК в дозі 1,6 мг/мл. Показники антивірусної дії флуренізиду перевищували такі для аміксину та ремантадину (прототипу). Винахід засвідчує патент.

Вивчення параметрів гострої токсичності при внутрішньочеревинному введенні синтезованих сполук проводили на безпородних білих мишах-самцях (інфікуюча доза 0,2 мл). Відбирали по 6 мишей на кожну сполуку, за мишами спостерігали 14 діб.

В результаті досліджень встановлено, що LD₅₀ для калій N- (-9-флуреніліден) - N'-м-анісогідразонат становила >8000мг/кг; для дикалійної солі N- (-9-флуореніліден) - гідразиду-о-оксибензоатної кислоти, для динатрієвої солі N- (-9-флуореніліден) - гідразиду-о-оксибензоатної кислоти - 6000 мг/кг.

За класифікацією К.К. Сидорова (1973 р.) вказані сполуки віднесено до практично нетоксичних речовин.

Порівняння LD₅₀ нових синтезованих сполук флуорену, що мають антимікобактеріальну дію, з ізоніазидом, а також проявляючих противірусну активність - з ремантадином і аміксином, представлені в табл.13.

Таким чином, синтезовані нові сполуки калій N- (9-флуреніліден) - N'-м-анісогідразонат, дикалійна сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти, динатрієва сіль N- (9-флуориніден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти належать до фармакологічних субстанцій високої специфічної дії і є безпечними для організму.

Таблиця 13

Порівняльні дані LD₅₀ для нових синтезованих сполук, що мають антимікобактеріальну дію та ізоніазиду

Досліджувані речовини	Спосіб введення	LD50 для білих мишей, мг/кг
КалійN- (9-флуреніліден) - N'-м-анісогідразонат	Внутрішньочеревинно	>8000,0
Дикалійна сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти	Внутрішньочеревинно	6000,0
Динатрієва сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти	Внутрішньочеревинно	6000,0
Ізоніазид	Внутрішньочеревинно	195,0

Синтезовані сполуки безпечні для організму, в порівнянні з ізоніазидом в 41-30,7 раза менш токсичні.

За безпечністю для макроорганізму флуренізид перевищує ремантадин у 32,4 рази. Аміксин у 50,9 разів менш безпечний, ніж флуренізид.

Висновки

У дисертаційній роботі на підставі мікробіологічних та вірусологічних досліджень вперше означено нові похідні флуорену, які мають антимікобактеріальні, антибактеріальні і противірусні властивості.

1. Виявлено три сполуки, похідні флуорену: калій N- (9-флуоре-ніліден) - N`-м-анісогідразонат, дикалійна сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-окси-бензоатної кислоти та динатрієва сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти, для яких характерні виражені антимікобактеріальні властивості в концентрації 0,078 мг/мл.

2. При вивченні спектру протимікробної дії 57 вперше синтезованих похідних флуорену на стандартних середовищах (БМХ) виявлена антистафілококова та антистрептококова дія сполук ІІ, ІІІ, ІХ, ХІ, ХVI, ХІХ в концентрації 31,25 - 125 мкг/мл.

3. Резистентність S. aureus 209-р до сполук ХІ і ХІХ формувалась повільно - після 20 пасажів не вдалося отримати стійких варіантів.

4. Дослідження електронною мікроскопією впливу сполуки ХІ на клітини S. aureus 209-р вказує на деструктивні процеси, що проходять в клітинах і свідчить про значне інгібування синтезу пептидоглікану, а також про активацію ферментів автолізу, що зумовлювало пригнічення білково-синтезуючої функції.

5. Для визначення антивірусної дії синтезованих сполук розроблена скринінгова система фаг-клітина (стафілококовий бактеріофаг і S. aureus 209-р), її доцільно використовувати і для дослідження інших нових сполук.

6. Доведено антивірусну дію препарату ІІ (флуренізиду) на РНК-вмісні віруси: вірус грипу птахів А (Росток/34 (H7N1)) і вірус хвороби Ньюкасла (штам Лa Coтa). Флуренізид перевищував показник антивірусної дії ремантадину (Р<0,01) на репродукцію вірусу грипу птахів, не поступався аміксину, а навіть дещо перевищував його щодо дії на вірус хвороби Ньюкасла.

7. Досліджувані препарати: калій N- (9-флуореніліден) - N`-м-анісо-гідразонат, дикалійна сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти та динатрієва сіль N- (9-флуореніліден) - гідразиду о-оксибензоатної кислоти відносяться до нетоксичних речовин: LD_50, відповідно сполук становить >8000,0; 6000,0; 6000,0 мг/кг при внутрішньочеревному введенні білим мишам.

8. Виражена протимікробна та антивірусна дія похідних флуорену дозволяє вважати їх перспективними щодо розробки на їх основі ефективних лікувальних засобів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Флуорени - новий клас протимікробних препаратів / О.А. Ткач, Р.Б. Павлій, С.Й. Павлій, О.І. Михалик, О.П. Заргарян // В кн. "Флуорени як туберкулостатики. Флуоренізид: мікробіологічні, фармакологічні та клінічні аспекти”. - Львів, 2008. - С.128-133. (Здобувач провів дослідження антимікробних властивостей похідних флуорену).

2. Павлій Р.Б. Вивчення антивірусної дії деяких похідних флуорену / Р.Б. Павлій, О.І. Михалик, І.К. Авдосьєва // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: зб. наук. статей. - Запоріжжя, 2006. - Вип. ХV, Т.3. - С.604-605. (Здобувач провів дослідження антивірусної активності нових похідних флуоренів на КЕ та ФЕК).

3. Костик О.П. Антимікобактеріальна активність нових похідних флуорену / О.П. Костик, Р.Б. Павлій // Практична медицина. - 2009. - № 4. - С.10-13 (Здобувач дослідив антимікобактеріальну дію похідних флуорену).

4. Павлій Р.Б. Антимікробний спектр похідних флуорену / Р.Б. Павлій // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: зб. наук. статей. - Запоріжжя, 2009. - Вип. ХХІІ. - Т.2. - С.131-133. (Здобувач провів дослідження щодо вивчення антимікробної дії похідних флуорену.

5. Павлій Р.Б. Кореляція методів визначення противірусної дії нових сполук похідних флуорену / Р.Б. Павлій // Практична медицина. - 2009. - № 6. - С.12-16. (Здобувач провів паралельні дослідження антифагової та антивірусної дії нових похідних флуорену).

6. Павлій Р.Б. Антибактеріальна ефективність похідних флуорену / Р.Б. Павлій // Biomedical and biosocial anthropology. - 2008. - № 11. - С.94-96. (Здобувач провів дослідження щодо вивчення антибактеріальної дії похідних флуорену).

7. Оцінка противірусної дії деяких похідних флуорену / Р.Б. Павлій, О.І. Михалик, І.К. Авдосьєва, І.Л. Мельничук, В.В. Регенчук, О.Б. Басараб, Л.І. Калиновська // Вісник Сумського національного аграрного університету. - 2006. - Вип.1-2 (15-16). - С.143-145. (Здобувач провів дослідження антивірусної дії нових похідних флуорену).

8. Експрес-метод визначення противірусної дії препаратів для ветеринарної медицини / І.К. Авдосьєва, Р.Б. Павлій, В.В. Регенчук, О.Б. Басараб, І.М. Мельничук // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин і Держ. наук. - досл. контр. інституту вет. препаратів та корм. добавок. - Львів, 2008. - Вип.9, № 4. - С.292-296. (Здобувач запропонував використовувати для експрес-визначення противірусної дії досліджуваних препаратів скринінгову систему фаг-клітина).